专利名称：：一种简单易行的菌体浓缩方法
技术领域：
：—种简单易行的菌体浓縮方法，涉及浓縮方法，属于应用微生物
技术领域：
。种工农业或养殖业应用的微生物制剂菌体
背景技术：
：随着微生物在各行各业应用的普及和逐年来的不断升温，人们对于有益微生物在实际中的应用研究不止集中在筛选或构建优良菌种，同时还包括对发酵所得的菌体进行不同程度的浓縮，从而降低运输贮藏和使用成本，提高单位浓度有效微生物的作用效果。对于大多数微生物发酵液来说，由于发酵液中菌体细小、组分复杂，因此絮凝浓縮负荷大，采用一般的絮凝剂絮凝发酵液效果不是很好。1970年，Gasner和Wang[GasnerLL，WangDIC.MicrobialCellRecoveryCnhancementthroughFlocculation.BiotechnolBioeng，1970,12(6):873.]对复杂组分发酵液的絮凝研究表明，用做絮凝剂的聚电解质，其电荷密度越高，分子量越大，絮凝能力越强。1990年，J.Hughes[HughesJ，RamsdenDK，Symcsk.TheFlocculationofBacteriaUsingCationicSyntheticFlocculantsandChitosan.BiotechnolTech，1990,4(1):55.]报道了用有高电荷密度的壳聚糖以及分子量为12千万的阳离子聚丙烯酰胺对细菌发酵液的絮凝，除菌率可达到90%以上。虽然高电荷密度和高分子量的聚电解质絮凝剂对细菌发酵液的絮凝有较好的效果，但是目前此类絮凝剂的制造成本较高，国产的聚电解质类絮凝剂分子量一般较低，无法在成本允许范围内达到良好的絮凝浓縮效果。以污染水体水质净化用微生物制剂为例，人们不可能接受过高的成本，但考虑到实际应用，浓縮菌液的需求又有着广大的市场。因此开发一种简单易行且低成本无毒害的菌体浓縮方法是必要的。
发明内容本发明的目的在于开发一种简单易行且无毒副作用的菌体浓縮方法，研究了阳离子聚丙烯酰胺、羧甲基纤维素钠和柠檬酸三铵在菌体絮凝浓縮中的联合作用，利用几种对微生物菌体具有絮凝作用的生物化学成分，经过合理组配，制备成絮凝剂，对于几种微生物发酵液均具有较好的絮凝浓縮作用。本发明的技术方案一种菌体浓縮的方法，将以下物质作为絮凝物质羧甲基纤维素钠为第一种絮凝物质，阳离子聚丙烯酰胺为第二种絮凝物质、及拧檬酸三铵为第三种絮凝物质；用到的絮凝物质为单种，或是以下复配絮凝物质中的一种A、羧甲基纤维素钠与柠檬酸三铵的质量配比为1.52.5:0.51.5;B、羧甲基纤维素钠与阳离子聚丙烯酰胺的质量配比为0.51.5:1.52.5;C、羧甲基纤维素钠、阳离子聚丙烯酰胺和柠檬酸三铵的质量配比为0.51.5:1.52.5:0.51.5;浓縮方法为(1)以单种絮凝物质进行菌体浓縮3将质量体积比为0.1%1%的上述第一种絮凝物质加入到100500mL的微生物发酵液中，20-25。C下100300rpm搅拌520分钟，再加入质量体积比为0.1%1%的第二种絮凝物质，20-25t:下100300rpm搅拌520分钟，再加或不加第三种絮凝物质，加质量体积比为0.1%1%的第三种絮凝物质时同样在20-25°CT100300rpm搅拌520分钟，自然静置1024小时待其自然沉淀至不再有沉淀时将上清吸去，收取沉淀即得浓縮的微生物菌体；或(2)以A或B或C中的一种复配絮凝物质进行菌体浓縮将质量体积比为0.2%2%的上述复配絮凝物质之一加入到100500mL的微生物发酵液中，20-25。C下100300rpm搅拌530分钟，自然静置1024小时待其自然沉淀至不再有沉淀时将上清吸去，收取沉淀即得浓縮的微生物菌体。阳离子聚丙烯酰胺、羧甲基纤维素钠和柠檬酸三铵均采用市售产品。(1)观察絮凝浓縮效果取100-500mL发酵液于三角瓶中，调节发酵液pH值至4-5，然后加入定量絮凝物质。反应5-60分钟，静置，观察絮凝浓縮效果。用量筒测出絮体体积，并取上清液，在600nm波长下测量吸光度；以离心过的发酵液(8000r/min，离心30min)为空白对照a，在600nm波长下测量吸光度；以发酵液原液为对照b，在600nm波长下测量吸光度；以OD(光密度)值变化作为衡量絮凝后菌体浓縮的指标。絮凝后沉淀中菌体同样保持活性，浓縮达到10倍以上。(2)待浓縮发酵液制备a)摇床培养将斜面保存的几个菌种接入250mL或500mL三角瓶中，培养基量为三角瓶容量的1/3，接种量以标准接种环挑满为准；摇床培养14-18h，控制培养温度28-32°C，pH7.0-7.5，转速150-220rpm;b)种子发酵接种量6-20mL/L，从摇床培养的三角瓶中接种进50-200L种子发酵罐，通用培养基，控制发酵温度28-32°C，pH7.0-7.5，种子发酵罐搅拌转速150-220rpm，发酵时间24-32小时；发酵产物直接制备成制剂或作为种子进一步进行发酵罐发酵；(3)待浓縮发酵液为100-500毫升，所加絮凝剂以克计算。实验结果显示絮凝浓縮效果良好的维持时间长达24小时。本发明中各组分的作用原理如下1、羧甲基纤维素钠是天然纤维素经化学改性后得到的纤维素衍生物，无臭、无味、无毒，是重要的水溶性聚合物之一。具有增稠、分散、悬浮、粘合、成膜、保护胶体和保护水分等优良性能，广泛应用于食品、医药、牙膏等行业。它能够吸水膨胀，在水中溶胀时，可以形成透明的粘稠胶液，在酸碱度方面表现为中性，在絮凝表面带负电荷的微生物菌体方面具有良好效果。2、阳离子聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺简称PAM，由丙烯酰胺单体聚合而成，是一种水溶性线型高分子物质。PAM的平均分子量从数千到数千万以上，在水中可大部分电离，属于高分子电解质。在溶液中主要依靠以下几个作用进行絮凝1)絮凝性PAM使悬浮物质通过电中和，架桥吸附作用，起絮凝作用。2)粘合性能通过机械的、物理的、化学的作用，起粘合作用。3)增稠性PAM在中性和酸条件下均有增稠作用，当pH值在10以上PAM易水解。呈半网状结构时，增稠将更明显。阳离子聚丙烯酰胺在酸性或碱性介质中均呈现阳电性，它通常会比阴离子或非离子型聚丙烯酰胺分子量低，其澄洁污水的性能主要是通过电荷中和作用而获得。这类絮凝剂的功能主要是絮凝带负的电荷，具有除浊、脱色功能。尤其在废水处理中，阳离子聚丙烯酰胺要比用阴离子聚丙烯酰胺，非离子聚丙烯酰胺或无机盐效果要高数倍或数十倍，因为这类废水普遍带有负电荷。微生物菌体表面通常带负电荷，故使用阳离子聚丙烯酰胺效果较好。据研究，大多数细菌等电点的pH值为25(革兰氏阳性菌为23，革兰氏阴性菌为45)，而水中细菌细胞表面电荷的性质受pH值控制，即水的pH值低于细菌等电点时，细菌细胞表面带正电荷，反之则带负电荷。一般，细菌的培养、染色、试验过程均在偏碱性(77.5)、中性、偏酸性(67)条件下，都高于细菌的等电点，故均带有负电荷。3、柠檬酸三铵通过电荷作用具有对微生物菌体的絮凝作用。本发明的有益效果本发明所用试剂均为无毒副作用的化学物质，絮凝得到的菌体不仅保持原有活性，应用到水体水质改良和其他领域均不会产生任何危害，是环境友好产品。将悬浮的微生物沉淀后，仅需吸出上清达到浓縮的效果，其安全性好，成本低廉。整个工艺流程简便，效率高。具体实施例方式实施例中所述的发酵液涉及的菌株均已公开，详见[吴伟，周国勤，杜宣.复合微生态制剂对池塘水体氮循环细菌动态变化的影响.农业环境科学学报，2005，24(4):790-794.]实施例1:以培养好的施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)发酵液作为待试溶液。按照方法中提到的培养方法准备发酵液。以复配絮凝物质A进行菌体浓縮实验，絮凝剂加入比例为0.2%2X，pH调节为45，100300rpm搅拌时间10-30分钟，之后自然沉淀10-24小时，观察絮凝沉淀效果。用量筒测出絮体体积，并取上清液，在600nm波长下测量吸光度；以离心过的发酵液(8000r/min，离心30min)为空白对照a，在600nm波长下测量吸光度；以发酵液原液为对照b，在600nm波长下测量吸光度；以OD(光密度)值变化作为衡量絮凝后菌体浓縮的指标，结果见表l。同时采用血球计数板对上清液进行细菌计数，采用稀释倾倒平板法对浓縮絮凝体进行活菌计数。表1数据显示，采用复合絮凝物质A对施氏假单胞菌体发酵液进行浓縮后，三次实验均获得较好浓縮效果，根据上清液OD值和发酵液OD值比值计算得出浓縮比例分别为12.8、15.3和8.8倍，这与根据浓縮液中的活菌数计算得出的比例差异不大，浓縮倍数平均约为11倍。可以认定为，絮凝沉淀后的浓縮液中绝大多数细菌保持活性，并且易于复苏，不需要特殊条件温度营养合适即可繁殖。表1絮凝物质A对施氏假单胞菌发酵液的浓縮效果5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>对照a:以离心过的发酵液(8000r/min，离心30min)为空白对照。对照b:发酵液原液计数工对移去絮凝体的上清液进行细菌计数。计数2:对絮凝体中的细菌进行计数。以下的表同此说明。实施例2:以培养好的施氏假单胞菌株发酵液作为待试溶液。按照方法中提到的培养方法准备发酵液。以复配絮凝物质B进行菌体浓縮实验，絮凝剂加入比例为0.2%2X，pH调节为45，100300rpm搅拌时间10-30分钟，之后自然沉淀10-24小时，观察絮凝沉淀效果。用量筒测出絮体体积，并取上清液，以离心过的发酵液(8000r/min，离心30min)为空白对照a，发酵液原液为对照b，在600nm波长下测量吸光度，以发酵液OD(光密度)值变化作为衡量絮凝后菌体浓縮的指标，结果见表2。同时采用血球计数板对上清液进行细菌计数，采用稀释倾倒平板法对浓縮絮凝体进行活菌计数。表2数据显示，采用复合絮凝物质B对施氏假单胞菌体发酵液进行浓縮后，三次实验均获得较好浓縮效果，根据上清液OD值和发酵液OD值比值计算得出的浓縮比例分别为10、16和13倍，这与根据浓縮液中的活菌数计算得出的比例差异不大，浓縮倍数平均约为13倍。可以认定为，絮凝沉淀后的浓縮液中绝大多数细菌保持活性，并且易于复苏，不需要特殊条件温度营养合适即可繁殖。表2絮凝物质B对施氏假单胞菌发酵液的浓縮效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3:以培养好的施氏假单胞菌株发酵液作为待试溶液。按照方法中提到的培养方法准备发酵液。以单种絮凝物质进行菌体浓縮将质量体积比为0.1%1%的上述第一种絮凝物质加入到100500mL的微生物发酵液中，20-25。C下100300rpm搅拌520分钟，再加入质量体积比为0.1%1%的第二种絮凝物质，20-25。C下100300rpm搅拌520分钟，再加质量体积比为O.1%1%的第三种絮凝物质时同样在20-25"下100300rpm搅拌520分钟，自然静置1024小时，观察絮凝沉淀效果。用量筒测出絮体体积，并取上清液，以离心过的发酵液(8000r/min，离心30min)为空白对照a，发酵液原液为对照b，在600nm波长下测量吸光度，以发酵液OD(光密度)值变化作为衡量絮凝后菌体浓縮的指标，结果见表3。同时采用血球计数板对上清液进行细菌计数，采用稀释倾倒平板法对浓縮絮凝体进行活菌计数。表3数据显示，采用复合絮凝物质C对施氏假单胞菌体发酵液进行浓縮后，三次实验均获得较好浓縮效果，根据上清液OD值和发酵液OD值比值计算得出浓縮比例分别为12.5、23和10.8倍，这与根据浓縮液中的活菌数计算得出的比例差异不大，浓縮倍数平均约为15倍。可以认定为，絮凝沉淀后的浓縮液中绝大多数细菌保持活性，并且易于复苏，不需要特殊条件温度营养合适即可繁殖。表3絮凝物质C对施氏假单胞菌发酵液的浓縮效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4:以培养好的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)发酵液作为待试溶液。按照方法中提到的培养方法准备发酵液。以单种絮凝物质进行菌体浓縮将质量体积比为0.1%1%的上述第一种絮凝物质加入到100500mL的微生物发酵液中，20-25。C下100300rpm搅拌520分钟，再加入质量体积比为0.1%1%的第二种絮凝物质，20-25。C下100300rpm搅拌520分钟，不加第三种絮凝物质，自然静置1024小时，观察絮凝效果。用量筒测出絮体体积，并取上清液，以离心过的发酵液(8000r/min，离心30min)为空白对照a，发酵液原液为对照b，在600nm波长下测量吸光度，以发酵液OD(光密度)值变化作为衡量絮凝后菌体浓縮的指标，结果见表4。同时采用血球计数板对上清液进行细菌计数，采用稀释倾倒平板法对浓縮絮凝体进行活菌计数。表4数据显示，采用复合絮凝物质A对枯草芽孢杆菌体发酵液进行浓縮后，三次实验均获得较好浓縮效果，根据上清液OD值和发酵液OD值比值计算得出的浓縮比例分别为20、22.2和14.9倍，这与根据浓縮液中的活菌数计算得出的比例差异不大，浓縮倍数平均约为19倍。可认定为，絮凝沉淀后的浓縮液中绝大多数细菌保持活性，并且易于复苏，不需要特殊条件温度营养合适即可繁殖。表4絮凝物质A对枯草芽孢杆菌发酵液的浓縮效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例5:以培养好的枯草芽孢杆菌发酵液作为待试溶液。按照方法中提到的培养方法准备发酵液。以复配絮凝物质C进行菌体浓縮实验，絮凝剂加入比例为0.2%2%，pH45，100300rpm搅拌时间10-30分钟，自然沉淀10-24小时，观察絮凝效果。用量筒测出絮体体积，并取上清液，以离心过的发酵液(8000r/min，离心30min)为空白对照a，发酵液原液为对照b，在600nm波长下测量吸光度，以发酵液0D(光密度)值变化作为衡量絮凝后菌体浓縮的指标，结果见表5。同时采用血球计数板对上清液进行细菌计数，采用稀释倾倒平板法对浓縮絮凝体进行活菌计数。表5数据显示，采用复合絮凝物质C对枯草芽孢杆菌体发酵液进行浓縮后，三次实验均获得较好浓縮效果，根据上清液0D值和发酵液0D值比值计算得出的浓縮比例分别为21.7、28.6和37倍，这与根据浓縮液中的活菌数计算得出的比例差异不大，浓縮倍数平均约为29倍。可认定为，絮凝沉淀后的浓縮液中绝大多数细菌保持活性，并且易于复苏，不需要特殊条件温度营养合适即可繁殖。表5絮凝物质C对枯草芽孢杆菌发酵液的浓縮效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实验编号絮凝物质"％)絮体占总发酵液的体积%血球计数板法计数工稀释倾倒平板法计数2以絮凝上清液或仅离心后的清液的0D,值与发酵液原液0D6。。比值10.8-1.2281.8X1063.6X10100.04620.8-1.2332.2X1064.1X101CI0.03530.8-1.2523.0X1064.9X10100.027实施例6:以培养好的水生假丝酵母(Candidaaquatica)发酵液作为待试溶液。按照方法中提到的培养方法准备发酵液。以复配絮凝物质B进行菌体浓縮实验，絮凝剂加入比例为0.2%2%，pH45，100300rpm搅拌时间10-30分钟，自然沉淀10-24小时，观察絮凝沉淀效果。用量筒测出絮体体积，并取上清液，以离心过的发酵液(8000r/min，离心30min)为空白对照a，发酵液原液为对照b，在600nm波长下测量吸光度，以发酵液OD(光密度)值变化作为衡量絮凝后菌体浓縮的指标，结果见表6。同时采用血球计数板对上清液进行细菌计数，采用稀释倾倒平板法对浓縮絮凝体进行活菌计数。表6数据显示，采用复合絮凝物质B对水生假丝酵母发酵液进行浓縮后，三次实验均获得较好浓縮效果，根据上清液OD值和发酵液OD值比值计算得出的浓縮比例分别为12.5、17.8和22.2倍，这与根据浓縮液中的活菌数计算得出的比例差异不大，浓縮倍数平均约为17.5倍。可以认定为，絮凝沉淀后的浓縮液中绝大多数细菌保持活性，并且易于复苏，不需要特殊条件即可繁殖。表6絮凝物质B对水生假丝酵母发酵液的浓縮效果实验编号絮凝物质B(X)絮体占总发酵液的体积%血球计数板法计数工稀释倾倒平板法计数2以絮凝上清液或仅离心后的清液的OD,值与发酵液原液0D6。。比值对照a1X1053.9X1040对照b2.5X1091.8X109110.6-1.2405.2X1071.7X10100.0820.6-1.2423.0X1072.2X10100.05610<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例7:以培养好的水生假丝酵母发酵液作为待试溶液。按照方法中提到的培养方法准备发酵液。以复配絮凝物质C进行菌体浓縮实验，絮凝剂加入比例为0.2%2X，pH调节为45，100300rpm搅拌时间10-30分钟，之后自然沉淀10-24小时，观察絮凝沉淀效果。用量筒测出絮体体积，并取上清液，以离心过的发酵液(8000r/min，离心30min)为空白对照a，发酵液原液为对照b，在600nm波长下测量吸光度，以发酵液OD(光密度)值变化作为衡量絮凝后菌体浓縮的指标，结果见表7。同时采用血球计数板对上清液进行细菌计数，采用稀释倾倒平板法对浓縮絮凝体进行活菌计数。表7数据显示，采用复合絮凝物质C对水生假丝酵母发酵液进行浓縮后，三次实验均获得较好浓縮效果，根据上清液OD值和发酵液OD值比值计算得出的浓縮比例分别为16.7、18.2和11倍，这与根据浓縮液中的活菌数计算得出的比例差异不大，浓縮倍数平均约为15.3倍。可以认定为，絮凝沉淀后的浓縮液中绝大多数细菌保持活性，并且易于复苏，不需要特殊条件温度营养合适即可繁殖。表7絮凝物质C对水生假丝酵母发酵液的浓縮效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求一种菌体浓缩的方法，其特征在于将以下物质作为絮凝物质羧甲基纤维素钠为第一种絮凝物质，阳离子聚丙烯酰胺为第二种絮凝物质、及柠檬酸三铵为第三种絮凝物质；用到的絮凝物质为单种，或是以下复配絮凝物质中的一种A、羧甲基纤维素钠与柠檬酸三铵的质量配比为1.5～2.5∶0.5～1.5；B、羧甲基纤维素钠与阳离子聚丙烯酰胺的质量配比为0.5～1.5∶1.5～2.5；C、羧甲基纤维素钠、阳离子聚丙烯酰胺和柠檬酸三铵的质量配比为0.5～1.5∶1.5～2.5∶0.5～1.5；浓缩方法为(1)以单种絮凝物质进行菌体浓缩将质量体积比为0.1％～1％的上述第一种絮凝物质加入到100～500mL的微生物发酵液中，20-25℃下100～300rpm搅拌5～20分钟，再加入质量体积比为0.1％～1％的第二种絮凝物质，20-25℃下100～300rpm搅拌5～20分钟，再加或不加第三种絮凝物质，加质量体积比为0.1％～1％的第三种絮凝物质时同样在20-25℃下100～300rpm搅拌5～20分钟，自然静置10～24小时待其自然沉淀至不再有沉淀时将上清吸去，收取沉淀即得浓缩的微生物菌体；或(2)以A或B或C中的一种复配絮凝物质进行菌体浓缩将质量体积比为0.2％～2％的上述复配絮凝物质之一加入到100～500mL的微生物发酵液中，20-25℃下100～300rpm搅拌5～30分钟，自然静置10～24小时待其自然沉淀至不再有沉淀时将上清吸去，收取沉淀即得浓缩的微生物菌体。全文摘要一种简单易行的菌体浓缩方法，属于应用微生物
技术领域：
。本发明将羧甲基纤维素钠，阳离子聚丙烯酰胺及柠檬酸三铵作为絮凝物质；浓缩用到的絮凝物质为单种，或是以上述物质的复配絮凝物质中的一种，按照一定比例进行组配，然后取一定量加入培养完成的微生物发酵液中，作用一定时间，发酵液中的菌体即被絮凝从而沉淀下来达到浓缩的效果。本发明所用试剂均为无毒副作用的化学物质，絮凝得到的菌体不仅保持原有活性，应用到水体水质改良和其他领域均不会产生任何危害，是环境友好产品。将悬浮的微生物沉淀后，仅需吸出上清即达到浓缩的效果，其安全性好，成本低廉，整个工艺流程简便，效率高。文档编号C12R1/125GK101748066SQ20091026475公开日2010年6月23日申请日期2009年12月30日优先权日2009年12月30日发明者王小娟,许骄阳申请人:无锡绿水之源生物科技有限公司