专利名称：极端嗜盐菌、及复合嗜盐菌菌剂和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体地涉及极端嗜盐菌、复合嗜盐菌菌剂和应用。
背景技术：
随着我国工业化进程的加快，诸多生产领域会产生高含盐废水，如印染、造纸、化 工、农药、采油、海产品加工等，此类废水通常会含有高浓度有机污染物，直接排放会对环境 造成严重污染。而且，高含盐有机废水因盐分对普通微生物的毒害作用而不适于常规生物 处理。这主要是因为(一)盐浓度过高时，水体的渗透压高，易使微生物细胞脱水，引起细 胞原生质分离；(二)在含盐浓度高的情况下，盐析作用会使脱氢酶活性降低；(三)高氯离 子浓度对细菌有毒害作用；(四)由于水的密度增加，活性污泥容易上浮流失，难于达到泥 水分离。 国内现存的高盐废水处理方法有多效蒸发、反渗透、电渗析等，然而这些方法普遍 存在着能耗高、经济效益差、存在二次污染的缺点，这与国家积极倡导的"节能减排"、"循环 经济"原则相违背，如何实现高盐有机废水的资源化治理成为当今水污染防治的一个难点。
近年来，国内对于高含盐有机废水的生物处理大多局限于实验室小试、并且多集 中于活性污泥的盐度驯化。当高盐废水的盐度高于5%时，处理效果开始恶化。嗜盐菌是一 类极端微生物，盐分是其生长、繁殖的必要条件，直接利用其处理高含盐有机废水逐渐受到 人们的关注，然而现阶段，嗜盐菌的现场实验研究以至高盐废水净化回用工程案例，尚未见 报道。 何健，李顺鹏，崔中利等在"含盐工业废水生化处理耐盐污泥驯化及其机制"(中 国环境科学，2002，22(6) :546 550)中该研究所用的微生物是普通的微生物，不是嗜盐 菌。将普通的微生物用于高盐废水是有难度的，微生物不能直接用于高盐废水处理，废水的 盐度只能让普通微生物不断适应，但这种适应是很有限度一般含盐可到到5%。
胡训杰，杨玉楠，刘红等在"嗜盐菌强化生物活性炭处理不同盐度采油废水的研 究"(环境科学，2007，28(10) :2213 2217)中本实验采用生物活性炭处理方法，通过投 加嗜盐菌(但没有公开是那种嗜盐菌)进行生物强化，研究生物膜(嗜盐菌被固定在活性 炭上形成的生物膜)对于不同水质、不同盐浓度采油废水的适应性及处理效果，以期为胜 利油田不同地区含盐量不同的采油废水的处理提供可靠的参考；该嗜盐菌只能耐受2% 6%盐浓度，所处理的废水含盐浓度最高达到3. 3%。 解庆林，李艳红，朱义年等在"高盐度污水生物处理技术研究"(环境工程2004， 22(2) :15 16)中，针对废水盐度高和可生化性较好的特点，首先分别从城市污水处理厂 取活性污泥和消化污泥，进行驯化，然后进行废水生物化学处理实验；在室内实验的基础 上，再将实验装置搬运至污水站进行现场试验，首先利用UASB厌氧反应器和SBR好氧反应 器分别处理废水，再采用UASB厌氧反应器与SBR好氧反应器联合生化进行废水处理；其提 到工艺流程，对嗜盐菌的描述不多，从其处理的油污水来看，嗜盐菌的嗜盐度大约在1 % 3%。
王钱福在"嗜盐菌的分离及其多相分类学研究"(兰州大学生命科学学院，2007)中主要讲述了嗜盐菌的富集培养和分离，从青岛和甘肃河西走廊地区的高盐环境采集到样品，进行嗜盐微生物的分离和多相分类研究，该嗜盐微生物耐盐度仅达到20% ，但并没有应用到废水的处理。 因此，现有技术存在现有普通微生物或耐盐菌的其耐盐度仅在6%以下；和未进行其应用研究，如工业废水处理的研究等缺陷。 处理高含盐有机废水的关键在于首先要筛选分离出能耐受高含盐有机废水的极端嗜盐菌；要将所筛选分离出极端嗜盐菌进行选优、组合培养；并将极端嗜盐菌用于高含盐有机废水生物处理系统的启动、调试等。 至今还没有一种即高效又经济实用的处理高盐有机废水中的治理方法。
发明内容
本发明的发明人为了解决上述高盐废水处理中存在的缺陷提出并完成了本发明。
因此本发明的目的是筛选极端嗜盐菌。 本发明的再一目的是提供包含上述极端嗜盐菌的复合嗜盐菌菌剂。
本发明的再一 目的是提供制备上述复合嗜盐菌菌剂的方法。
本发明的另一目的是提供处理高盐生产废水的方法。
本发明的另一目的是提供上述极端嗜盐菌的应用。 根据本发明的极端嗜盐菌，可以为盐单胞菌(Halomonas sp)，其保藏编号为CGMCC No. 3081。 根据本发明的极端嗜盐菌，可以为假单胞菌(Pseudomonas sp)，其保藏编号为CGMCC No. 3082。 根据本发明的极端嗜盐菌，可以为芽孢杆菌(Bacillus sp)，其保藏编号为CGMCCNo.3083。 根据本发明的复合嗜盐菌菌剂包括上述极端嗜盐菌CGMCC No. 3081、CGMCCNo. 3082、 CGMCC No. 3083中任意两种或三种。 优选，根据本发明的复合嗜盐菌菌剂包括上述三种极端嗜盐菌，其中，所述嗜盐菌
CGMCC No. 3081 :CGMCC No. 3082 :CGMCC No. 3083为3 : 3 : 1。 根据本发明的制备上述复合嗜盐菌菌剂的方法包括以下步骤 1)将上述嗜盐菌CGMCC No. 3081、 CGMCC No. 3082、 CGMCC No. 3083中的一种或多
种在复合菌剂培养基中、在25-35t:培养7天-10天； 2)将上述培养的复合极端嗜盐菌剂在扩大培养基中进行扩大培养，得复合嗜盐菌菌剂，其中，在所述步骤l)和2)中，所使用的培养基配方为酵母浸膏10g/L，蛋白嗜盐15g/L， MgS04 7H20 20g/L， KCL 2g/L， NaCL 180g/L， pH 7. 0。 本发明还提供了一种处理高盐生产废水的方法，所述方法包括向生产废水处理系统中投加上述复合嗜盐菌菌剂的步骤，其特征在于，生产废水的COD浓度为3000mg/L-3500mg/L，按系统的1/10-1/20容积比逐级进行培养，最终达到处理系统完全完成培养。
本发明还提供了上述极端嗜盐在处理高盐生产废水中的应用。
如图1所示，使用本发明的三株极端嗜盐菌的组合处理三聚氯氰生产废水的工艺流程主要以下分两个阶段( — )启动阶段 1 、复合极端嗜盐菌剂的制备 将上述三株极端嗜盐菌进行组合，制备极端嗜盐菌复合菌剂；
2 、极端嗜盐菌复合菌剂的现场应用 将极端嗜盐菌复合菌剂按现场所需要进行扩大培养；然后再将极端嗜盐菌复合菌剂投加于处理三聚氯氰生产废水处理系统中，定期加入极端嗜盐菌复合菌剂，使三种极端嗜盐菌复合菌剂在处理系统能良好生长并形成生物膜，完成了启动阶段。
( 二 )驯化阶段 启动阶段完成后，进入驯化阶段，即逐渐减少极端嗜盐菌复合菌剂的投加量，并逐渐增加三聚氯氰生产废水的量，直到极端嗜盐菌复合菌剂的投加量为0，三聚氯氰生产废水的量增加到100% ; 启动及驯化完成后，就进入整个生物系统与设备调试、运行，最终使得高盐三聚氯氰废水的出水达到净化回用标准。 根据本发明的极端嗜盐菌CGMCC No. 3081，该盐单胞菌在处理高盐三聚氯氰生产废水中去除总有机碳(T0C)效果为80. 01% ; 根据本发明的极端嗜盐菌CGMCC No. 3082，该假单胞菌在处理高盐三聚氯氰生产废水中去除总有机碳(T0C)效果为69. 71% ; 根据本发明的极端嗜盐菌CGMCC No. 30823，该芽孢杆菌在处理高盐三聚氯氰生产废水中去除总有机碳(TOC)效果为74. 66% ; 上述三株极端嗜盐菌组合后，在处理高盐三聚氯氰生产废水中去除TOC效果为94. 86%。 本发明的三株极端嗜盐菌组合后的复合极端嗜盐菌菌剂之所以能将高盐三聚氯氰生产废水进行有效的处理，其原理为该三株极端嗜盐菌可将高盐三聚氯氰生产废水中的高盐和有机物作为营养物，营养物越多极端嗜盐菌生长越好，当废水中营养物质越来越少、并少到无法利用的量的时候，该极端嗜盐菌就处于生长缓慢、不生长甚至休眠状态；即使得高盐三聚氯氰生产废水达到合格出水标准；一旦再有新的高盐三聚氯氰生产废水进入处理系统时，该三株极端嗜盐菌又会处于快速生长的状态。因此，根据本发明的方法，好氧预挂生物膜的成功运用解决了厌氧反应启动慢、难于与好氧反应同步进行的难题，实现了厌氧反应的快速启动；同时解决了高盐废水泥水难于分离的难题，并维持了装置内的微生物浓度，增加了容积负荷。本发明分离得到了耐盐度在15_25%的3株极端嗜盐菌菌株，三株极端嗜盐菌组合后的复合极端嗜盐菌菌剂能将高盐三聚氯氰生产废水进行有效的处理，与其他处理技术相比，本发明的方法更符合"循环经济"、"节能减排"的国家政策，能为企业节约大量的运行成本，实现废水的资源化处理。
图1为本发明的三株极端嗜盐菌组合用于处理高盐三聚氯氰生产废水工艺流程图。 图2为盐单胞菌(Halomonas)CGMCC No. 3081的脂肪酸图谱。
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图3为芽孢杆菌(Bacillus)CGMCC No. 3083的脂肪酸图谱。
图4所示为假单胞菌(Halomonas) CGMCC No. 3082的脂肪酸图谱。极端嗜盐菌[OO46] (1)盐单胞菌(Halomonas sp)，保藏编号为CGMCC No. 3081，保藏日期2009年6月1曰； (2)假单胞菌(Pseudomonas sp)，保藏编号CGMCC No. 3082，保藏日期2009年6月1曰； (3)所示为芽孢杆菌(Bacillus)，保藏编号CGMCC No. 3083，保藏日期2009年6月1日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101。
具体实施例方式
实施例1筛选极端嗜盐菌
1、极端嗜盐菌菌株的分离 1. 1)原位多点法采集盐化工企业的污泥池及污水排污口处的污泥样泥； 1. 2)将所采集的污泥样泥在含盐16wt% _26^%的液体富集培养基中25_35°〇进
行富集培养3-10天； 1. 3)再将经富集培养后的污泥样泥在分离培养基中、25-35t:下进行分离培养，得到分离单菌株；再将分离得到的单菌株在纯化分离培养基中进行2-6次纯化分离培养，从而选出耐盐度在15-25%的23株极端嗜盐菌菌株；所使用的纯化分离培养基与上述分离培养基的组分及各组分含量相同； 所述液体富集培养基组分及各组分含量如下蛋白胨15g/L， MgS04 7H20 20g/L，KCL 2g/L， NaCL 150_250g/L， pH 7. 0 ; 所述分离培养基组分及各组分含量与所述纯化分离培养培养基组分及各组分含量相同，均为酪素水解物5g/L，酵母浸膏10g/L，蛋白胨15g/L， MgS04 7H20 20g/L， KCL2g/L， ， NaCL 150_250g/L， pH 7. 0 ;
2、分离筛选极端嗜盐菌 将分离得到的耐盐度在15_25%的23株极端嗜盐菌菌株进行逐株筛选 将每一株极端嗜盐菌菌株在含盐18wt% _20^%的高盐三聚氯氰废水中进行处
理效果试验 2. 1)选出去除T0C效果为80.01 %的一株菌株，进行测定，定为盐单胞菌(Halomonas sp)(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3081); 其鉴定技术为采用微生物生理生化反应与MIDI Sherlock Mis相结合进行鉴定；MIDI Sherlock Mis鉴定系统软件可以操控Agilent公司的6850、6890和7890型气相色谱，通过对气相色谱获得的短链脂肪酸的种类和含量的图谱进行比对，从而快速准确地对微生物种类进行鉴定。 图2为盐单胞菌(Halomonas) CGMCC No. 3081的脂肪酸图谱，该盐单胞菌(Halomonas)的耐盐度为15% -25%。 2.2)选出去除TOC效果为74.66%的一株菌株菌株，进行测定，定为芽孢杆菌(Bacillus sp)(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo. 3083); 其鉴定方法与鉴定盐单胞菌(Halomonas)的方法相同；图3所示为芽孢杆菌(Bacillus)CGMCC No. 3083的脂肪酸图谱，该芽孢杆菌(Bacillus sp)的耐盐度为15% -25%。 2. 3)选出去除TOC效果为69. 71 %的一株菌株菌株，进行测定定为假单胞菌(Pseudomonas sp)(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 3082); 其鉴定方法与鉴定盐单胞菌(Halomonas)的方法相同；图4所示为假单胞菌(Halomonas) CGMCC No. 3082的脂肪酸图谱，该假单胞菌(Halomonas)的耐盐度为15% -25%。 通过将上述三株极端嗜盐菌分别、以及组合后处理高盐三聚氯氰废水的试验，得出极端嗜盐菌CGMCC No. 3081，去除总有机碳(TOC)效果为80. 01 % ;极端嗜盐菌CGMCCNo. 3082去除总有机碳(TOC)效果为69. 71% ;极端嗜盐菌CGMCCNo. 30823去除总有机碳(TOC)效果为74. 66% ;上述三株极端嗜盐菌组合后处理高盐三聚氯氰废水的去除TOC效果为94. 86% ; 实施例2制备复合嗜盐菌剂 1)将上述三株极端嗜盐菌在复合菌剂培养基中25-35t:培养7天-10天，其中，所述菌株CGMCC No. 3081 :CGMCC No. 3082 :CGMCC No. 3083为3 : 3 : l，得复合极端嗜盐菌剂； 所述复合菌剂培养基组分及各组分含量为酵母浸膏10g/L，蛋白嗜盐15g/L，MgS04 7H20 20g/L， KCL 2g/L， NaCL 180g/L， pH 7. 0。
2)将上述复合极端嗜盐菌剂进行扩大培养 将上述复合极端嗜盐菌剂在复合嗜盐菌剂扩大培养基中25-3(TC，进行扩大培养7-10天，得复合嗜盐菌剂； 所述复合菌剂扩大培养基组分及各组分含量为酵母浸膏10g/L，蛋白胨15g/L，MgS04 7H20 20g/L， KCL 2g/L， NaCL 180g/L， pH 7. 0。 实施例3使用本发明的三株极端嗜盐菌组合处理"德固赛三征(营口 )精细化工有限公司"的三聚氯氰生产废水的模拟实验 使用本发明的三株极端嗜盐菌组合用于处理"德固赛三征(营口 )精细化工有限"的含盐18wt^的高盐三聚氯氰生产废水
1 、首先制备复合试验菌剂 将本发明的上述三株极端嗜盐菌在复合菌剂培养基中25t:培养10天，得复合嗜盐菌剂； 所述复合菌剂培养基组分为酵母浸膏10g/L，蛋白嗜盐15g/L， MgS04 7H20 20g/
L， KCL 2g/L， NaCL 180g/L， pH 7. 0 ; 将上述复合嗜盐菌剂进行扩大培养 将上述复合极端嗜盐菌剂在复合菌剂扩大培养基中、25t:进行扩大培养10天，得扩大培养后复合嗜盐菌剂；
所述复合菌剂扩大培养基组分为酵母浸膏10g/L，蛋白胨15g/L，MgS04 *7H2020g/ L， KCL 2g/L， NaCL 180g/L， pH 7. 0 ; 2、向高盐三聚氯氰生产废水的处理系统投加上述复合菌剂，按生物处理系统体积 的1/10投加极端嗜盐菌剂。将该公司的含盐18wt^的高盐三聚氯氰生产废水进行预处理 (所述预处理为本领域的公知技术)后，进入所述处理系统，经厌氧处理和好氧处理处理 后，TOC含量可达到lOmg/L以下、氨氮含量达到4mg/L以下，氰化物含量达到0. 054mg/L以 下，基本达到该企业废水回用标准。 实施例4使用本发明的三株极端嗜盐菌组合处理"河北临港化工有限公司"的三 聚氯氰生产废水的模拟实验 使用本发明的三株极端嗜盐菌组合用于处理"河北临港化工有限公司"含盐 18wt% _20^%的高盐三聚氯氰生产废水；其工艺与实施例1工艺流程基本相同。
1 、首先制备复合试验菌剂 将本发明的上述三株极端嗜盐菌在复合菌剂培养基中3(TC培养80天，得复合嗜 盐菌剂； 所述复合菌剂培养基组分为酵母浸膏10g/L，蛋白嗜盐15g/L， MgS04 7H20 20g/
L， KCL 2g/L， NaCL 180g/L， pH 7. 0 ; 将上述复合嗜盐菌剂进行扩大培养 将上述复合极端嗜盐菌剂在复合菌剂扩大培养基中3(TC，进行扩大培养8天，得 扩大培养后复合嗜盐菌剂； 所述复合菌剂扩大培养基组分为酵母浸膏10g/L，蛋白胨15g/L，MgS04 *7H2020g/ L， KCL 2g/L， NaCL 180g/L， pH 7. 0 ; 2、向高盐三聚氯氰生产废水的处理系统投加上述复合菌剂，按生物处理系统体积 的1/10-1/20投加极端嗜盐菌剂。将该公司含盐18wt% _20^%的高盐三聚氯氰生产废水 进行预处理后，进入本实施例的高盐三聚氯氰生产废水的生物处理系统，在这个系统中有 厌氧和好氧处理，经生物系统处理后，TOC含量可达到lOmg/L以下，氨氮含量达到4mg/L以 下，氰化物含量达到0. 054mg/L以下，基本高盐三聚氯氰生产废水达到企业回用要求。
实施例5使用本发明的三株极端嗜盐菌组合处理"德固赛三征(重庆)精细化工 有限公司"的三聚氯氰生产废水的模拟实验 使用本发明的三株极端嗜盐菌组合用于处理"德固赛三征(重庆)精细化工有限 公司"含盐13wt% _15^%的高盐三聚氯氰生产废水，流程与上述两个实例基本相同。
1 、首先制备复合试验菌剂 将本发明的上述三株极端嗜盐菌在复合菌剂培养基中35t:培养7天，得复合嗜盐 菌剂； 所述复合菌剂培养基组分为酵母浸膏10g/L，蛋白嗜盐15g/L， MgS04 7H20 20g/
L， KCL 2g/L， NaCL 180g/L， pH 7. 0 ; 将上述复合嗜盐菌剂进行扩大培养 将上述复合极端嗜盐菌剂在复合菌剂扩大培养基中35t:，进行扩大培养7天，得 扩大培养后复合嗜盐菌剂； 所述复合菌剂扩大培养基组分为酵母浸膏10g/L，蛋白胨15g/L，MgS04 *7H2020g/L， KCL 2g/L， NaCL 180g/L， pH 7. 0 ; 2、向高盐三聚氯氰生产废水的处理系统投加上述复合菌剂，按生物处理系统体积 的1/20投加极端嗜盐菌剂。将该公司含盐18wt% _20^%的高盐三聚氯氰生产废水进行 预处理后，进入本实施例的高盐三聚氯氰生产废水的生物处理系统，在这个系统中有厌氧 和好氧处理，经生物系统处理后，TOC含量可达到30-40mg/L以下，氨氮含量达到10mg/L以 下，氰化物含量达到0. 05mg/L以下，达到高盐三聚氯氰生产废水达到企业回用要求。
权利要求
一种极端嗜盐菌，其特征在于，所述嗜盐菌为盐单胞菌，其保藏编号为CGMCC No.3081。
2. —种极端嗜盐菌，其特征在于，所述嗜盐菌为假单胞菌，其保藏编号为CGMCC No.3082。
3. —种极端嗜盐菌，其特征在于，所述嗜盐菌为芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.3083。
4. 一种复合嗜盐菌菌剂，其特征在于，所述复合嗜盐菌菌剂包括权利要求1 、2或3所述 的极端嗜盐菌中任意两种或三种。
5. 根据权利要求4所述的复合嗜盐菌菌齐U，其特征在于，所述复合嗜 盐菌菌剂包括权利要求1、2和3所述的极端嗜盐菌，其中，所述菌株CGMCC No.3081 : CGMCCNo.3082 : CGMCC No. 3083为3 :3:1。
6. —种制备权利要求4所述的复合嗜盐菌菌剂的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步骤1) 将权利要求1、2、3所述的嗜盐菌中的一种或多种在复合菌剂培养基中、在25-35°C 培养7天-10天；2) 将上述培养的复合极端嗜盐菌剂在扩大培养基中进行扩大培养，得复合嗜盐菌菌剂。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述步骤1)和2)中，所使用的培养基 配方为酵母浸膏10g/L，蛋白嗜盐15g/L， MgS04 7H20 20g/L， KCL 2g/L， NaCL 180g/L， pH 7. 0。
8. —种处理高盐生产废水的方法，其特征在于，所述方法包括向生产废水处理系统 中投加权利要求4所述的复合嗜盐菌菌剂的步骤，其中，生产废水的COD浓度为3000mg/ L-3500mg/L，按系统的1/10-1/20容积比添加。
9. 权利要求1、2或3所述的极端嗜盐在处理高盐生产废水中的应用。
全文摘要
本发明涉及微生物领域，具体地涉及极端嗜盐菌、复合嗜盐菌菌剂和应用。本发明筛选得到极端嗜盐菌分别为盐单胞菌CGMCC No.3081；假单胞菌CGMCCNo.3082；芽孢杆菌CGMCC No.3083。本发明还提供了包含上述嗜盐菌的复合嗜盐菌菌剂。本发明分离得到了耐盐度在15-25％的3株极端嗜盐菌菌株，三株极端嗜盐菌组合后的复合极端嗜盐菌菌剂能将高盐三聚氯氰生产废水进行有效的处理，与其他处理技术相比，本发明的方法更符合“循环经济”、“节能减排”的国家政策，能为企业节约大量的运行成本，实现废水的资源化处理。
文档编号C12N1/20GK101712945SQ20091026619
公开日2010年5月26日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年6月30日
发明者李捍东 申请人:中国环境科学研究院