专利名称：一种检测兔i型胶原蛋白基因的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及一种检测兔I型胶原蛋白基因的方法及试剂
背景技术：
胶原蛋白是人体和动物的结缔组织的主要蛋白，是哺乳动物含量最多，分布最广的蛋白质，含量能够占总蛋白的25% 35%，体内具有广泛的生物学活性。在肌肉组织中它是肌内膜的主要成份，I型胶原蛋白是人体中含量最多的胶原蛋白，瘢痕组织中含量丰富，它也是组织愈合和修复的产物。肌腱、皮肤、动脉血管壁、软骨以及部分的器官和牙齿中也含有I型胶原蛋白。I型胶原蛋白合成紊乱会导致骨折、轻微脊柱弯曲、关节松弛、皮肤弹性过度综合征(cutis hyperelastica)、婴儿骨外层肥厚(infantile corticalhyperostosis)等疾病。 目前，基因表达水平检测主要是通过聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction, PCR)来完成，PCR是一项广泛应用于分子生物学的实验技术，通过热稳定的TaqDNA polymerase,能够使模板中的单个或几个拷贝的基因片断在经过几十个热循环后进行指数扩增，达到数以百万计的拷贝。PCR产物经过电泳检测目的基因的表达量。这种方法是目前比较常用的基因表达相对定量检测方法，这种方法属于终点检测方法，由于不能够实时的监测反应的进行，所以实验的重复性、可靠性相对较差。 随着分子生物学技术的不断发展，以及光电子技术的进步，近些年来实时荧光定量PCR(Realtime PCR)技术得到了很大的发展。此技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。应用实时荧光定量PCR技术来检测基因的表达水平比以往的技术有了很大的进步，实时荧光定量PCR技术能够全程实时检测PCR反应的进行，因此具有良好的实验可靠性，重复性。实时荧光定量PCR有分为荧光染料掺入法和探针法。荧光染料掺入法是在PCR反应体系中加入荧光染料SYBR Green， SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光。变性时，DNA双链分开，无荧光信号，因此必须在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBR Green也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析产物的特异性。 T叫man探针法T叫man探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5'端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3'端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移，FRET)，因此探针完整时，检测不到该探针5'端荧光基团发出的荧光。随着引物的退火，产物的不断扩增，报告荧光基团能够被DNA聚合酶从探针上剪切下来，探针被打碎，这样报告荧光基团不再被淬灭，从而不断发射出荧光信号。因此应用T叫man探针法能够快速准确的检测组织和细胞中基因的表达变化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强的检测兔I型胶原蛋白基因的方法。 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案 —种检测兔I型胶原蛋白基因的方法，包括如下步骤 (i)用核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的下游引物扩增生物样品； (ii)用探针对扩增产物进行检测，所述探针序列如SEQ ID NO. 3所示。
优选地，步骤(i)所述扩增与步骤(ii)所述检测同时进行。 更优选地，采用实时荧光定量PCR法进行步骤(i)所述扩增与步骤(ii)所述检测。所述实时荧光定量PCR法反应程序优选为95。C lOmin ;95。C 30sec ;58。C lmin ;72。Clmin为一个循环，设定45个循环。 更优选地，步骤(ii)所述探针为T叫Man探针。所述T叫Man探针其5'端标记6-FAM、 TET、 HEX、 TAMRA、 R0X、 CY5、 CY3、 J0E、 Texas Red其中一种，3'端标记TAMRA、 BHQ-1、Eclipse、 IowaBlack其中——禾中。 本发明还提供一种检测兔I型胶原蛋白基因的试剂盒，包含用于扩增核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的核酸片段的引物。 优选地，本发明所述试剂盒中的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示的核酸片段、核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的核酸片段中的至少一种。 更优选的，本发明所述试剂盒还包含核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的探针。
更优选的，本发明所述试剂盒还包含用于检测兔GAPDH基因的引物和探针；其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，探针序列如SEQ ID NO. 6所示。 本发明还提供一种用于检测兔I型胶原蛋白基因的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO. l所示。 本发明还提供一种用于检测兔I型胶原蛋白基因的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 2所示。 本发明的术语"引物"指作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与待复制的核酸链互补，长度和序列必须适合于延伸产物的合成。 本发明术语"探针"指单链寡核苷酸，用于与核酸片段特异性杂交。"特异性杂交"
指所述探针与核酸的整个区域或一部分在特定的实验条件下形成双链体，且在这些条件
下，所述探针不与待检测样品中存在的其他核酸或核酸的其他区域形成双链体。 本发明所述"T叫Man探针"是一种寡核苷酸探针，是在寡核苷酸两端分别标记一个
报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，报告荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭荧光基团
则在3'末端。 所述TaqMan探针的5，端标记6_FAM、 TET、 HEX、 TAMRA、 R0X、 CY5、 CY3、 JOE、 Texas
Red其中一种，探针的3'端标记TAMRA、BHQ-l、Eclipse、 Iowa Black其中一种 探针和核酸片段杂交后，可以通过任意合适的方式，进行杂交的检测，例如可以检
测的标记探针和/或核酸片段，为了辅助检测，优选实时荧光PCR法扩增。 本发明试剂盒还包含PCR缓冲液、dNTPs、 Taq酶、R0X、对照品。对照品分阴性对
照和阳性对照，阴性对照为无菌三蒸水，阳性对照为兔肌肉组织的cDNA样品。
本发明所述试剂盒保存条件为-20°〇，尽量避免反复冻融。
本发明所述试剂盒的使用方法是 将待测样品兔组织或体外培养细胞用Trizol提取总RNA，提取的总RNA经过逆转录为cDNA，建立25ii 1的PCR反应体系如下2. 5ii 1 10XPCR Buffer、0. 3ii 1的R0X、2ii 1的10mM dNTPs、0. 5ii 1的5 y M上游引物0. 5 y 1的5 y M下游引物、兔cDNA2 y 1、0. 5iU的5iiM特异性Taqman探针、Taq酶lU、补充无核酶水至25ii1。反应条件为95。C 30sec ;58。Clmin ;72°C lmin ;45个循环。 每个样品分别做3个骨形态蛋白2和GAPDH反应，并且每次实验做兔I型胶原蛋白基因和GAPDH阴性对照和阳性对照实验，将兔cDNA模板以5倍稀释不同浓度梯度，绘制骨形态蛋白2兔实时定量PCR标准曲线，根据标准曲线以及实验所用的相应软件相对定量样品中兔I型胶原蛋白基因。 术语"Ct值":为了便于对所检测样本进行比较，在实时荧光PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值， 一般这个域值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。 Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 本发明所述检测兔I型胶原蛋白基因的方法，对比现有技术的优点在于 (1)检测速度快，效率高，能够实时检测PCR反应的结果，不需要电泳和染色过程，
比普通的PCR方法相比步骤简单、实验周期短、重复性好； (2)灵敏度高，灵敏度范围是10-1(^拷贝，可检测到基因的最小浓度为IO个拷贝； (3)特异性强，与SYBR Green荧光染料嵌入式Real-time PCR方法相比，Taqman探针法能够特异性与目的基因结合，不会与非特异性PCR产物和引物二聚体结合，因此具有良好的特异性和可靠性；
(4)操作简单，结果稳定。
图1为本发明所述实时定量PCR方法检测兔I型胶原蛋白基因的标准曲线；
图2为本发明所述实时定量PCR方法检测兔GAPDH基因的标准曲线；
图3为对实施例3标准品扩增产物鉴定的电泳 泳道1 :标准品扩增产物(488bp)
泳道2 :100bp DNA Marker 图4为本发明所述方法检测不同接枝率骨修复材料中的兔I型胶原基因的柱形图； 图5为本发明所述方法检测不同接枝率骨修复材料兔成骨细胞中的兔I型胶原基因的柱形图。
具体实施例方式实施例1 :设计和制备引物、探针序列 兔I型胶原蛋白基因的GENEBANK登录号为gi_984641，应用引物设计软件Beacon
designer 7设计了兔I型胶原蛋白基因和兔GAPDH基因的实时定量PCR引物和探针，经过
软件Beacon designer 7分析排除了引物间/内二聚体以及发夹结构，并经BLAST验证引
物的特异性和与相近基因的同源性，设计出下列引物和探针。 兔I型胶原蛋白基因特异性引物分为上游引物和下游引物 上游引物序列5' -CCACTGGCAAACATGGAAACC-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1
所示) 下游引物序列5' -GGATGCCTTGTGGACCACTAG-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示) 兔I型胶原蛋白基因特异性Taqman探针序列为5' 6-FAMCCTCTTG-GACCAGCAGCACCGACG 3' TAMRA(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示)。 为了避免由于样品间加入的核酸总量的差别，以及样品在RNA抽提以及逆转录过程中效率的不同而导致的样品间基因表达量的差别，通常采用管家基因进行校正来消除这些客观的差异。 一些基因在外界因素改变时表达相对比较恒定，我们把这些基因用来实时定量PCR的校正，GAPDH是最通用的管家基因，本发明采用GAPDH基因作为管家基因对每个待测样品进行校正。 以兔GAPDH基因为内参，GAPDH基因GENEBANK登录号为NM-001082253，设计上游引物为 5' -GATGGTGAAGGTCGGAGTG-3'(其核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示)
兔GAPDH基因下游引物为 5' -TGTAGTGGAGGTCAATGAATGG-3'(其核苷酸序列如SEQ IDNO. 5所示)
兔GAPDH特异性Taqman探针序列 5' 6-FAM CAGCCTTGACCGTGCCGTGGAACT 3' TAMRA (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示)。 实施例2 : 制备本发明所述试剂盒本发明所述试剂盒组成为1. 25ml 10 X PCR Buffer、200ii 1的2 y M的ROX、 lml的
10mM dNTPs、250 的5 y M上游引物、250 的5 y M下游引物、250 的5 y M荧光标记
的Taqman探针、Taq酶500U、无核酶水2ml，标准品(IO1。拷贝)20 iU。 所述引物包括实施例1制备的兔I型胶原蛋白基因的上游引物和下游引物、兔
GAPDH基因的上游引物和下游引物；所述探针包括兔I型胶原蛋白基因的探针和兔GAPDH
基因的探针。 对照品分阴性对照和阳性对照，阴性对照为无核酶水，阳性对照为兔肌肉组织的cDNA样品。 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，如将试剂盒的组分等比例增加，也应视为在本发明要求保护的范围之内。
实施例3 : 本发明所述方法检测不同接枝率骨修复材料中的兔I型胶原基因的表达 骨修复材料从兔腿部取出，称取lOOmg材料，在研钵中加入液氮捣碎，用Trizol提
取材料中的总RNA，取lug总RNA进行逆转录成cDNA，用这些cDNA和实施例1所述I型胶
原引物和GAPDH引物进行Real-time PCR反应，实验设置GAPDH为内参组，用以校正每个样
品起始模板量的差异对实验带来的误差。反应组份如表1 : 表1
名称体积
lOXPCRBuffer2. 5u 1
ROX (2 u M)0. 3u 1
dNTPs(10mM)2u 1
上游引物(5uM)0. 5u 1
下游引物(5uM)0. 5u 1
Taqman探针(5 u M)0. 5u 1
cDNA2u 1
T叫酶(4U/ u 1)0. 25u 1
H2016. 45 u 1 兔I型胶原蛋白基因的GENEBANK登录号为gi_984641，根据NCBI搜索选取其特异性基因序列为兔I型胶原蛋白基因的253-740片段，共488bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。以兔I型胶原蛋白基因的253-740片段为标准品，兔I型胶原蛋白基因的253-740片段核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，标准品浓度为10"拷贝/iU，将标准品稀释后，分为10"拷贝/111、108拷贝/111、106拷贝/111、104拷贝/111、102拷贝/yl，104考贝/iU进行Real-time PCR反应，反应条件是95。C预变性10min，然后95。C 30秒、58。C 60秒、72。C 60秒共进行45个循环，结果制作标准曲线，见图1。将标准品扩增产物进行电泳，紫外灯检测并拍照，结果见图3，可见在接近400bp出有一明显的条带，即为目的基因兔I型胶原蛋白基因的253-740片段(488bp)。可知本发明所述方法可扩增兔I型胶原蛋白基因，灵敏度范围是10-l(T拷贝。 本发明所用Trizol试剂购自Invitrogen， 01igo-dT、 dNTP、 M-MLV逆转录酶、Taq酶和RNA酶抑制剂购自Promega公司，Brilliant QPCRMaster Mix和ROX购自Stratagene公司。
7
设定Real-time PCR反应条件95。C预变性10min，然后95°C 30秒、58。C 60秒、72°C 60秒共进行45个循环，样品在Stratagen Mx3005P机器上运行，结束后软件分析结果见图4。 实施例4 : 实时荧光定量法检测种植在不同接枝率HA与PLGA共混材料上的兔成骨细胞中兔I型胶原蛋白基因的表达。 取3天新生兔的颅骨，颅骨剪碎后加DMEM+10% FBS培养基培养兔成骨细胞。单纯的PLGA和不同接枝率HA与PLGA共混材料，共混材料中HA与PLGA质量百分比分别是80 %和20 % 。用于成骨细胞培养的复合材料分别为PLGA、 PLGA+HA、 PLGA+HA (1 % )、PLGA+HA (3% ) PLGA+HA (5% ) 、 PLGA+HA (7% ) 、 PLGA+HA (10% )。材料用氯仿溶解后在硅化的盖玻片上铺膜。成骨细胞种植于涂有不同复合材料的薄膜上。培养l周后，提取总RNA，逆转录，Real-time PCR检测I型胶原蛋白表达。
材料、引物合成、检测方法同实施例3。 成骨细胞用Trizol提取总RNA，取lug总RNA进行逆转录成cDNA，用这些cDNA和I型胶原引物和GAPDH引物进行Real-timePCR反应，反应组份如表2 :
表2
名称体积
lOXPCRBuffer2. 5u 1
ROX(2 u M)0. 3u 1
dNTPs(10mM)2u 1
上游引物(5uM)0. 5u 1
下游引物(5uM)0. 5u 1
T叫man探针(5 u M)0. 5u 1
cDNA2u 1
Taq酶(4U/ u 1)0. 25u 1
H2016. 45u 1 Real-time PCR反应条件是，95 °C预变性10min，然后95。C 30秒、58。C 60秒、72°C 60秒共进行45个循环，样品在Stratagen Mx3005P机器上运行，结束后软件分析结果见图5。从图5可以看出成骨细胞在不同复合材料上培养1周后，材料PLGA+HA(5% )中I型胶原蛋白基因表达量最高，因此材料PLGA+HA(5% )更有利于体外培养的兔成骨细胞中I型胶原蛋白基因的表达。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
0080]SEQUENCE LISTING
0081]〈110〉中国科学院长春应用化学研究所
0082]〈120〉 一种检测兔I型胶原蛋白基因的方法及试剂盒
0083]〈130>MP097633
0084]〈160>7
0085]〈170>PatentIn version 3.3
0086]〈210>1
0087]〈211>21
0088]〈212>DNA
0089]〈213〉兔I型胶原蛋白基因的上游引物
0090]〈400>1
0091]CC3CtggC朋3C3tgg朋3C c
0092]〈210>2
0093]〈211>21
0094]〈212>DNA
0095]〈213〉兔I型胶原蛋白基因的下游引物
0096]〈400>2
0097]ggatgccttg tggaccacta g
0098]〈210>3
0099]〈211>24
0100]〈212>DNA
0101]〈213〉兔I型胶原蛋白基因探针
0102]〈400>3
0103]cctcttggac cagcagcacc gacg
0104]〈210>4
0105]〈211>19
0106]〈212>DNA
0107]〈213〉兔GAPDH基因上游引物
0108]〈400>4
0109]g3tggtg朋g gtCgg3gtg
0110]〈210>5
0111 ]〈211>22
0112]〈212>DNA
0113]〈213〉兔GAPDH基因下游引物
0114]〈400>5.0115] tgtagtggag gtcaatgaat gg 22
:0116] 〈210>6
:0117] 〈211>24
:0118] 〈212>DNA
:0119] 〈213〉兔GAPDH基因探针
:0120] 〈400>6
.0121] cagccttgac cgtgccgtgg aact 24 〈210>7 〈211>488 〈212>DNA 〈213〉兔I型胶原蛋白基因序列的253-740片断 〈400>7
.0127] ggtcgtgatg gcaaccctgg gagcgatggt cctccaggtc gcgatggtca gcctggacac
:0128] 60
.0129] aagggagaac gtggttaccc tggcaatgct ggtcctgttg gtgctgcagg agcacctggt
:0130] 120
.0131] cctcaaggct ccgtgggccc cactggcaaa catggaaacc gtggtgaacc tggccctgct
:0132] 180
.0133] ggttctattg gtcccgtcgg tgctgctggt ccaagaggcc ctagtggtcc acaaggcatc
:0134] 240
.0135] cggggtgaca agggagagcc tggtgacaag gggcccagag gtcttcctgg cataaaggga
:0136] 300
.0137] cacaacggat tgcaaggtct tcccggtctc gctggtcaac atggtgatca aggtgctccc
:0138] 360
.0139] ggcgctgtgg gtcccgctgg ccccaggggc cctgctggtc ctaccggccc tgctggcaaa
:0140] 420
.0141] gacggccgct ctggacatcc cggcacagtt ggacctgctg gccttcgagg ttctcagggt
:0142] ■
.0143] agccaagg
:0144] 488
权利要求
一种检测兔I型胶原蛋白基因的方法，包括如下步骤(i)用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQID NO.2所示的下游引物扩增生物样品；(ii)用探针对扩增产物进行检测，所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)所述扩增与步骤(ii)所述检测同时进行。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用实时荧光定量PCR法进行步骤(i)所述扩增与步骤(ii)所述检测。
4. 根据权利要求l-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(ii)所述探针为T叫Man探针。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应程序为95°ClOmin ;95。C 30sec ;58。C lmin ;72。C lmin为一个循环，设定45个循环。
6. —种检测兔I型胶原蛋白基因的试剂盒，其特征在于，包含核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的引物中的至少一种。
7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包含核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的探针。
8. 根据权利要求6所述的试剂盒，还包含用于检测兔GAPDH基因的引物和探针；其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，探针序列如SEQ ID NO. 6所示。
9. 根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述探针为TaqMan探针，其5'端标记6-FAM、 TET、 HEX、 TAMRA、 ROX、 CY5、 CY3、 JOE、 Texas Red其中一种，3'端标记TAMRA、BHQ-l、Eclipse、 Iowa Black其中一种。
10. 检测兔I型胶原蛋白基因的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ IDNO. l所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体提供一种检测兔I型胶原蛋白基因的方法，包括用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQID NO.2所示的下游引物扩增生物样品，以及用序列如SEQ ID NO.3所示的探针进行检测步骤。本发明还提供一种检测兔I型胶原蛋白基因的试剂盒。本发明所述方法检测兔I型胶原蛋白基因灵敏度高，可检测到基因的最小浓度为10个拷贝，特异性强，操作简单，样本范围广，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/11GK101775438SQ200910266200
公开日2010年7月14日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者崔立国, 王宇, 王宗良, 章培标, 陈学思 申请人:中国科学院长春应用化学研究所