甘蓝型油菜BnGLABRA2启动子及制备方法和应用的制作方法

专利名称：甘蓝型油菜BnGLABRA2启动子及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜BnGLABRA2启 动子，还涉及油菜BnGLABRA2启动子的制备方法，同时还涉及油菜BnGLABRA2启动子在油菜 基因工程中的应用。
背景技术：
植物基因启动子在基因的表达调控中起着关键作用。基因的表达调控是多种因素 综合作用的结果。一般按照一个事件的先后顺序，基因的调控分为转录水平的调控、翻译水 平的调控以及蛋白质加工水平的调控等。基因编码的蛋白质和RNA及其次级代谢产物对于 维持生物体的整个生命活动极其重要。任何基因表达调控的错误都会对生命造成严重后 果。因此，对于基因表达调控的机理研究一直是分子生物学研究的热点。转录水平的调控 最为重要。启动子是转录水平调控的重要元件，也是基因工程表达载体的一个重要组成部 分。在某种程度上，启动子决定了基因表达的时空顺序以及表达强度。所以，研究启动子的 功能序列对于基因表达调控机制以及日渐成熟的植物基因工程具有非常重要的意义。构建能够高水平表达异源表达载体，启动子起到关键作用。它决定了外源基因 的转录效率和基因的表达水平。植物转基因育种所用的启动子可分为组成型和特异型 两类。组成型启动子驱动的外源基因在转基因的所有时期和组织中稳定的表达。对许 多双子叶植物的转化，通常都使用含花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子或胭脂氨酸 合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白 Act启动子，玉米泛素Ubi启动子及35S启动子的质粒载体(关丽英等，转基因植物中外 源基因的有效表达及其安全评价首都师范大学学报2002，23(2) :52-56)。但是很多时 候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且在所有组 织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题(Jia S-R(贾士 荣)· Environment andfoodbiosafty assessment of transgenic plants. Advanced of Bioengineer. 1997,17(6) 37-42 ；Morris S H, Adley C.C. Irish public perceptions andattitudes to modern biotechnology :an overview with a focus on GM foods. Trends in Biotechnology, 2001,19 (2) :43_48)。因此，诱导型启动子和组织特异性启动子 的研究和应用日益受到育种工作者的重视。在转基因植物中鉴定的诱导型启动子包括热激 启动子，来源于菠菜硝酸还原酶的诱导型启动子等等。(关丽英等，转基因植物中外源基因 的有效表达及其安全评价.首都师范大学学报.2002，23 (2) :52-56)。诱导型启动子的应 用也具有一定限制，对受体植物进行的外在条件处理，如热激，激素处理等可能引起生物体 内一系列的生理生化反应而不利于植株的正常生长。而且化学调控系统中用作诱导物的甲 基脱氢皮质醇(dex，dexamethasone)、雌二醇(estradiol)和四环素(tetracycline)都对 生态环境有害，不宜用于生产实践。而使用植物体内本身的组织特异性启动子就可以避免 这种问题。显然，转基因的组织特异性表达必将有效提高转基因作物的生物安全性。近年 来在这方面已经取得很大成就。在不同组织特异性表达的各类启动子已不断得到研究(宋扬等，植物组织特异性启动子研究生物技术通报2007，(4) :21-24)。油菜作为中国主要的油料作物，在长江流域广泛种植，对国计民生具有重要影响。 因此提高油菜的品质，一直是科研工作者追求的目的。随着转基因技术的成熟，油菜必然会 面临转基因安全风险的舆论。用不在油菜种子中表达的启动子来启动目的基因的表达是解 决这个问题的一个可行方法。既可以达到提高油菜各方面品质，又不引起食用油安全风险。因此，本实验开发了一系列甘蓝型油菜的内源启动子。通过检测报告基因⑶S的 表达特征证明各启动子的时空表达模式。我们的结果预示着这些启动子在转基因油菜中具 有相当的应用前景。

发明内容
本发明的目的在于提供了一种甘蓝型油菜BnGLABRA2(简称BnGL2)启动子GP2。 该启动子的时空表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织 特异性启动子能够精确定位所调控的基因，可应用于植物基因工程研究及籽用油菜安全转 基因研究。本发明的另一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜GL2启动子GP2的制备方法。 该方法通过对功能区进行适当的缺失以及检测所调控的GUS基因活性部位来验证启动子 的功能元件。其优点在于操作简单，结果稳定可靠。本发明的再一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子SEQ ID NO :1在叶片表皮毛以及种子中的应用；一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQ ID NO: 1 (1555 2882)在根部以及整个叶脉中的应用；一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动 子SEQ ID NO: 1(2098 2882)在叶片表皮毛以及中柱叶脉中的应用。全长启动子GP2的 表达模式能够反映油菜GL2基因的功能，即在发育过程中具有重要功能；缺失启动子GP2C 和GP2D因所调控的GUS基因表达组织各有特点，而且均不在种子中表达，可以用于籽用油 菜转基因研究和育种应用，优点是具有生物安全性和开发应用价值。为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案一种甘蓝型油菜GL2启动子GP2的制备方法，其步骤是1、基因组步移克隆启动子序列利用SDS裂解法提取基因组DNA，按照基因组步移试剂盒(购自Clontech公司) 操作程序，进行基因组步移，每次步移扩增两轮PCR克隆油菜。具体步骤为提取基因组DNA 25口1^(0.148/^0，分别用核酸内切酶0仪I.EcoR I.Pvu II和Stu I酶切，纯化后加入接 头形成四个不同的基因组DNA库，用作首次基因组步移第一轮PCR模板，根据目的基因保守 序列设计特异性引物GSPl (表1)与试剂盒内上游接头引物APl (表1)进行扩增。第二轮PCR 以第一轮PCR产物的50倍稀释液(水稀释液)为模板，同样方法设计的特异性引物GSP2和 接头引物AP2(表1)进行扩增，随后进行第二轮基因组步移。所有PCR反应均为50μ L扩 增体系模板 lyL，dNTPs 0. 2mM，引物 0. 5mM，LA Taq 酶 1· 25 单位，10 X LA-PCR buffer (含 MgCl2) 5 μ L，补水至50 μ L。反应条件均为94°C预变性Imin ；98°C 10s，72°C 6min7个循环； 980C 10s，67°C6min 33个循环；72延伸lOmin。PCR产物经1. 0% (质量体积比，以下相同) 琼脂糖凝胶电泳检测，Gel Extraction Kit (购自天根生化科技北京有限公司)纯化回收 后，连接到PMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，转化gold(购自大连宝生物生物制品公司)感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切验证后测序，得到目的基因上游的侧翼序列。2、启动子序列生物信息学分析将所克隆序列用BLASTN(http://www. . ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)进行同源比 对。启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件http://WWW. fruitfly. org/ seq—tools/promoter. btml 禾口 PIJVCE(Higo et al. , Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE)database (J). NucleicAcids Research. 1999,27 297 300)http:// www. dna. affrc. go. jp/PLACE/进行预测。得到可能的核心启动子序列和上游启动子元件。3、全长启动子、缺失启动子的扩增以及pMDIS-T-GP载体的构建以基因组DNA为模板，根据前期得到的启动子序列，设计扩增各缺失片段的引物 进行PCR扩增。所有引物的5'端含有Hind III酶切位点，3'端含有Xba I酶切位点。反 应体系为 25 μ L 内含1 XPCR buffer. , MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L(毫摩尔每升)、 引物浓度为0. 5mol/L, Pfu酶1. 5单位，模板约lOOng，根据具体情况设置循环参数。PCR 产物1.0% (质量体积比，以下相同))琼脂糖凝胶检测，回收试剂盒回收各目的缺失片段。 按各回收的缺失片段载体(0. 3pmol缺失片段0. Ipmol载体片段)=3 1的比例混 合样品，加入T4DNA连接酶5单位，IX反应缓冲液，无菌水补充体积至25ml，16°C过夜连 接反应。冻融法转化大肠杆菌gold菌(前面已述)感受态细胞(J.萨姆布鲁克.D. W.拉 塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，96-99页)。涂布于含有 Amp的LB固体平板上，37°C培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测，将阳性重组子接 种于含Amp 50 μ g/mL的液体LB培养基，37°C 200r/min振荡培养过夜，小量碱法提取质粒 (J.萨姆布鲁克.D. W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)， Hind ΙΙΙ/Xba I酶切质粒1 μ g，0. 8% (质量体积比)琼脂糖凝胶检测。检测正确的阳性 重组克隆，分别命名为PMD18-X (将目的片段连入pMDIS-T载体构建而成，以下相同)(X可 为1、2、3、4、5等)，为了确保载体中各启动子的序列信息，分别以M13F/M13R为引物(M13 R5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，；M13R5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，)，将 pMD18_X(前面 已述)进行序列测定，分析结果，一种分离的启动子，得到了一种甘蓝型油菜BnGL2基因全 长启动子SEQ ID NO :1。4、植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105(购于上海沪尚生物科技有限 公司以下相同)的转化构建的重组载体是将质粒pBI121 (购于大连宝生物工程有限公司以下相同)上的 35S启动子用前期克隆得到的目的基因的启动子片段替换而来。为完成此目的，首先用Xba I/Hind III双酶切克隆载体pMD18-X(前面已述)的启动子片段，同时用Xba I/Hind III 酶切pBI121(前面已述)质粒。酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用 琼脂糖胶电泳检测。将克隆载体上切下的小片段和PBI121(前面已述)上切下的大片段用 DNA凝胶回收试剂盒回收。按各pMD18-X(前面已述)上的启动子片段片段pBI121(前 面已述)载体(150ng缺失片段、50ng载体片段)=3:1的比例(摩尔浓度比)混合样 品，加入T4 DNA连接酶5单位，10 X反应缓冲液，无菌水补充体积至20 μ L，16°C连接过夜。 转化后，在Kan平板上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为 PBI121-X.然后利用冻融法将pBI121-X(前面已述)和pBI121 (阳性对照)转入根癌农杆 菌EHA105 (前面已述)，Km+Rif抗性平板筛选，挑斑，菌落PCR检测验证。
5、拟南芥的遗传转化及转基因植株筛选参照文献中的方法进行拟南芥转化(Zhang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using thefloral dip method. Nature,2006, 1 :1-6)。制备含有构建好的载体的根癌农杆菌EHA105(购自大连宝生物生物制品公司)菌 液，在转化前一天转入含有卡那霉素50μ g/ml、利福平50μ g/ml的LB大瓶培养基中，28 °C 过夜培养。第二天，当菌液浓度为1.6-2.0之间时取出。4000g室温(20-25°C以下相同) 离心lOmin，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5% (质量体积比，以下相同)蔗糖中。将浑浊的 蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02% (体积比)的Silwet 1-77。混 勻后把待转化的拟南芥的整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15s，取出植株。同一个载体 用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔 一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化 收获的TO代种子用70% (体积比)酒精和0. 01% (体积比)的升汞表面消毒后用蒸馏水 洗涤数次(5 7次)，然后均勻地吹打到IAMSG^蔗糖，0. 8%琼脂，pH 5. 8，大量元素减 半，其余营养成分与MS培养基相同)固体筛选培养基表面。4°C春化4-6天，放入恒温培养 箱培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。叶片长到足够大小时，取少 许绿苗叶片进行PCR阳性检测。所用试剂配方如下(I)LB液体培养基分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠依次溶解于蒸馏水中，定 容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X104Pa下高压消毒15分钟。4°C 冷藏备用。(2) LB固体培养基分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸 馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121°C，6.859X104Pa下高压消毒15 分钟。4°C冷藏备用。(3) 1/2MS固体筛选培养基硝酸铵(NH4NO3)硝酸钾磷酸二氢钾硫酸镁氯化钙蔗糖琼脂加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5 分装到500ml三角瓶(250ml/瓶)，封口灭菌。6、启动子功能分析用GL2基因启动子GP2替换pBI121(前面已述)质粒上的35S启动子序列，形成 pBI121-GP2(前面已述)重组植物表达载体，其中的⑶S基因受BnGL2启动子的调控。利用 根癌农杆菌EHA105(前面已述)介导的花序侵染法转化拟南芥。Tl代利用卡那霉素抗性和
8
1. 65g 1.9g 0. 17g 0. 37g 0. 44g 30g 8g
，煮沸(100°C)并定容至1000ml，PCR检测筛选得到阳性植株。将PCR验证是阳性的Tl代转基因植株种子在1/2MS (前面已述)培养基上播种， 4°C春化后在生长箱中萌发，出苗后5-7天开始取样染色。染色过程如下将样品浸泡在GUS 染液(X-gluc 0. 5mg/mL，磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0. 5mmol/L，EDTA 10mmol/L, Triton-χ-ΙΟΟ 0. 001% (体积比)，甲醇20% (体积比)真空抽气5分钟，37°C 过夜。第二天用酒精-乙酸(体积比为1 1)进行脱色，直至叶片变白，之后用蒸馏水漂 洗数次(5 7次)，体式显微镜(OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同时间段的整个植株； 生殖生长期，叶片取嫩叶和成熟叶片；花取开过的花朵和未开的花蕾的花序；角果取不同 时期的角果；种子去开花后10天左右的种子。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的 部位。通过检测不同时空下GUS基因的表达部位和表达强度来探索各目的启动子的时空表 达模式，从而分析调空基因在特定部位表达的功能作用元件。T2代转基因植株GUS组织化学染色结果表明，油菜BnGL2启动子具有如下生物学 功能全长启动子GP2在不同组织中均有表达，在叶片表皮毛和开花后10天左右的种子中 表达量最高(图5，GP2)。这就预示着在BnGL2全长启动子的启动下，基因主要在毛状体 发育和种子成熟过程中发挥作用。缺失启动子GP2C(1555 2882)能调控⑶S基因主要 在苗期根部和叶脉中活跃表达，而在种子中没有表达(图5GP2C)，因此推断该启动子主要 参与根的发育和营养输送的功能。缺失启动子GP2D能调控GUS基因在中柱叶脉和幼嫩的 叶片表皮毛中表达(图5GP2D)，但在种子中没有检测到⑶基因的活性(图5GP2D)，因此 GP2D(2098 2882)启动的基因主要在输送营养和表皮毛发育中扮演角色。也就是说GP2 D启动的基因的功能在输送营养和表皮毛发育中扮演主要角色。一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子SEQ ID NO :1在叶片表皮毛以及种子中 功能性表达的应用过程是利用基因组步移法克隆得到甘蓝型油菜GL2基因的5'上游序 列，经启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件http://WWW. fruitfly. org/ seq—tools/promoter. html 禾口 PIJVCE(Higo et al. , Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE)database (J). NucleicAcids Research. 1999,27 297 300)http:// www. dna. affrc. go. jp/PLACE/进行预测。得到可能的核心启动子序列和上游启动子元件。 根据分析预测结果，确定BnGL2启动子序列长度。构建由该启动子调控的报告基因GUS的 植物表达载体PBI121-GP2 (前面已述)。采用农杆菌EHA105介导的花期侵染法转化拟南芥 (前面已述)Tl代在加有卡那霉素的1/2MS(前面已述)培养基上初步筛选转基因植株，待 生长到一定阶段(播种后一个月)进行PCR检测，利用分子手段鉴定阳性株。T2代选择多 个转基因株系进行GUS染色。GUS组织化学法染色表明，BnGL2调控下的GUS基因具有一定 时空表达特性，主要在拟南芥的幼嫩组织中表达，如幼嫩叶片的早期表皮毛以及开花后10 天左右的种子。这说明GL2全长启动子具有驱动下游报告基因GUS在受体植物中表达(图 5)的功能。在该启动子的调控下，GUS基因能够主要在转基因植株的幼嫩组织如根尖、叶原 基、发育早期的表皮毛以及开花后10天左右的种子中精细表达。一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQ ID NO 1 (2098 2882)在根 部以及整个叶脉中的应用过程是BnGL2启动子的缺失序列(2098 2882)片段是以连有 GLABRA2全长启动子的pMD18_T_GP2 (前面已述)载体为模板，依据BnGL2启动子序列设计 特异性引物进行PCR扩增获得，命名为GP2C。将GP2C与报告基因GUS相连构建植物表达载体PBI121-GP2C。用同样方法转化拟南芥，筛选转基因植株。T2代取不同发育时期不同组 织进行GUS组织化学染色。GUS染色结果表明，BnGP2C启动子调控制下的GUS基因在根部 的整个细胞高水平表达；在早期的所有叶脉中表达也较为强烈；但是在种子的整个成熟时 期都没有表达。这说明BnGP2C启动子具有启动下游基因在根和早期叶脉等非种子组织中 表达的功能(图5)，可以运用于转基因安全(食用性安全)。一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQ ID NO :1 (1555 2882)在叶片 表皮毛以及中柱叶脉中的应用过程是BnGL2启动子的缺失序列(1555 2882)片段是以 连有GLABRA2全长启动子的(前面已述)18-T-GP2载体为模板，依据BnGLABRA2启动子序 列设计特异性引物进行PCR扩增获得，命名为GP2D。将GP2D与报告基因GUS相连构建植物 表达载体PBI121-GP2D (前面已述)。用同样方法转化拟南芥，筛选转基因植株。T2代取不 同发育时期不同组织进行GUS组织化学染色。结果显示，BnGP2D调控下的GUS基因的表达 部位以及强度又表现出它特有的形式主要在幼嫩的叶片表皮毛以及中柱叶脉中表达，这 说明BnGP2D启动子具有启动下游基因在幼嫩的叶片表皮毛以及中柱叶脉等中非种子组织 中表达的功能(图5)，可以运用于转基因安全(食用性安全)。本发明的优点1所提供的启动子克隆方法能够通过对GUS基因的调控和组化分析，获得具有组 织特异性表达功能的油菜启动子。2克隆到油菜来源的GL2基因的启动子GP2，并人工构建了两个组织特异性启动 子GP2C和GP2D。从油菜食用油安全性来考虑，这三种启动子具有应用潜力。GP2C在根部 的表达强度启示申请人可以用此启动子来代替CaMV35S强启动子来启动与根发育相关的 基因的表达，而不引起油菜转基因食用安全问题。而GP2D和GP2启动子在叶脉中的表达也 就预示着它们可调控与营养输送相关的基因的功能分析，从而达到改良油菜品质目的，而 又不存在食用油安全风险。3克隆得到的甘蓝型油菜GL2基因的启动子能调控基因在油菜的毛状体发育中 起作用。4人工构建得到油菜GL2缺失型启动子，带有2098 2882区段的启动子GP2C包 含多个在根部和叶脉强烈表达的顺式作用元件；带有1555 2071区段的启动子GP2D有调 控基因在叶片表皮毛中表达的应答元件。


图1为一种基因组步移扩增BnGL2启动子GP2片段电泳图GL2A和GL2B是步移得到的两个不同的BnGLABRA2基因上游序列图2为一种油菜BnGL2启动子的PCR扩增及重组载体pBI121_GP的酶切鉴定图A图PCR扩增GP2C、GP2D、GP2片段电泳图B图用Apa I/Hind III双酶切重组载体鉴定3为一种转基因植株PCR阳性鉴定图M :DL2000 marker ；1 :pBI121_GP2D 阳性质粒；2、7、12 野生型拟南芥；3-5 PBI121-GP2D 阳性株；6 :pBI121_GP2 阳性质粒；8-10 :pBI121_GP2 阳性株；11 :pBI121_GP2C 阳性质粒；13-14 :pBI121-GP2C阳性株。
图4为一种BnGL2启动子序列生物信息学分析结果双实线TATA-boX ；单实线CAAT-boX ；黑三角可能的TSS位点；黑箭头翻译起 始位点；黑框G-box ；灰框叶肉细胞组织特异性基因表达的顺式作用元件.双波浪线种 子中受赤霉素调控的蛋白激酶表达的应答元件。单波浪线远距离调控启动子活性的应答 元件。虚框在根特异性表达的应答元件。此外，用PLACE软件分析发现在正负链上有1份 生长素应答元件，20多份MYB结合位点，1份茉莉酸(SA)诱导的应答元件，13份光诱导和组 织特异性表达的应答元件，26份MYB、BZIP、BHLH转录因子的结合位点。所有编号参照翻译 起始位点。图5为一种⑶S组织化学染色结果⑶S组织化学染色结果A 子叶期；B 真叶萌发期C 第一对真叶生长期；D 第二 对真叶生长期；E 轮座期；F 开花后10天左右的种子。
具体实施例方式实施例1.一种油菜BnGL2启动子的制备步骤是1、油菜BnGL2基因启动子GL2B的克隆利用SDS裂解法提取甘蓝型油菜DNA(J.萨姆布鲁克.D. W.拉塞尔著，黄培堂等 译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)，按照基因组步移试剂盒(购于Clontech 公司)操作程序，进行两次基因组步移，每次步移扩增两轮PCR克隆油菜GL2基因启动子 GL2B(2882bp)。两次步移所用引物如下表。表1基因组步移克隆甘蓝型油菜GL2基因启动子GP2所用引物
步移步骤引物名称引物序列
一次步移 第一轮 PCR APl5-GTMTACGACTCACTATAGGGC-3
GSPl (1) 5-CTGCCGGAGGATGCATTCCGMATATC-3 第二轮 PCR AP25-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3
GSP2⑴ 5-GAGGGAGAGGGCTGGAGAGGAGAAGAAGTC-3 二次步移 第一轮 PCR APl5-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3
GSPl (2) 5-TTCAAACAAC ATCCAAGAAT CTTGCGTATA-3 第二轮 PCR AP25-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3
GSP2(2) 5-ATTGTGAAGGCCGGAGAAGA GTTGTTG-32、油菜GL2启动子GL2B序列的生物信息学分析利用BLASTN比对拟南芥GL2基因启动子序列(约2Kb) (GenBank登录号 NM_106633)和油菜GL2基因的启动子GL2B序列，发现二者同源性很低，只有四个片段一致 性在90%左右。通过在线软件
http//www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html 预测发现其中起始密码 子上游2. 2Kb的序列已具有启动子的基本特征。包含有预测到的可能的转录起始位点，通 过PLACE软件预测分析的可能的核心启动子元件和顺式作用元件。预测结果还发现其正 负链上有多处光、茉莉酸(SA)诱导和组织特异性表达的应答元件，存在26个MYB、BZIP、 BHLH(Higo et al. , Plant cis-acting regulatory DNAelements(PLACE)database (J). Nucleic Acids Research. 1999，27 :297 300)转录因子的结合位点。因此本发明以此 2. 2Kb的序列，将其命名为GP2，作为GL2基因全长启动子GP2进行功能和应用研究。3、油菜GL2基因启动子全长和缺失片段(GP2和GP2C、GP2D)的扩增和 pMD18-T-GP2(前面已述)和pMD18_T_GP2C (前面已述)、pMD18_T_GP2D (前面已述)载体 的构建根据前期克隆得到的序列信息，设计扩增全长和缺失的引物(加入Xba I和Hind III酶切位点)，以油菜基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应为25 μ L体系1 XPCR buffer, MgCI 2. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L、引物浓度为 0. 5mol/L, Pfu 酶 1. 5 单位，模板约 lOOng，补 ddH20 至 25uL。反应条件95°C预变性 5min，94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 3min 扩增 33个循环，72°C延伸IOmin0表2全长启动子和缺失启动子片段模式和引物设计
启动子片段名称各片段模式图引物序列
GP2C(0.9 Kb) bbhh^^5-GACA tc iag-aACGCTCCGAAATCTTAATTTG-3
5-ChGaagc tiTGAGTCTATCCCAGTATCTAACAGTCA-3 GP2D (1. 4 Kb) ββββ·^^ 5-GACA tc ia卵ACGCTCCGAMTCTTAATTTG-3
b-CkQaagc t iTCTTCTCCGGCCTTCACM-3 GP2(2. 2Kb) ββΒβββ^β^^ 5-GACA tcia^aACGCTCCGAAATCTTAATTTG-3
5-CAGaa^ciiTTCCTTCCCTACACCTTCCTCTA-3按照操作程序中的方法用将回收的各启动子片段与pMDIS-T(前面已述)载体按 照(0.3pmol缺失片段0. Ipmol载体片段)=3 1的比例进行连接反应。冻融法转 化大肠杆菌(前面已述)gold (前面已述)感受态细胞中。涂布于含有氨苄青霉素50mg/ L(质量体积比，下面相同)的LB固体平板上，37 °C培养过夜。小量碱法提取质粒(前面已 述)，Hind ΙΙΙ/Xba I酶切质粒1 μ g，琼脂糖凝胶检测。检测正确的阳性重组克隆，将 pMD18-GP2(前面已述)和pMD18-GP2X(前面已述)进行序列测定，分析结果。一种分离的 启动子，其序列为SEQ ID NO :1所示的基因启动子。4、油菜GL2基因启动子GP2各片段重组表达载体的构建及根癌农杆菌转化用Xba I/Hind III双酶切连接有GL2启动子GP2的pMD18_GP2 (前面已述)和 pBI121(前面已述)质粒。凝胶回收酶切下来的各个启动子片段和pBI121(前面已述) 片段，T4DNA连接酶16°C过夜连接这两个片段，构建成植物表达载体pBI121-GP2(前面已 述)和pBI121-GP2X(X代表A-D)(前面已述)。最后用冻融法将该载体转入根癌农杆菌EHA105(前面已述)，卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L，质量体积比，下面相同)抗性平 板上挑选阳性克隆后，酶切验证。5、拟南芥转化及PCR检测按照上述文献(Zhang X R. et al. Agrobacterium-mediated trans format ionof Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1 :1-6)中转化方 法转化拟南芥。根据转基因植株所特有的卡那霉素抗性在1/2MS(前面已述)培养基上为 绿苗的初步认为是阳性苗。待叶片长到足够大时取少许做PCR阳性鉴定。结果表明在三 个表达载体已经成功转入拟南芥。pBI121-GP2(前面已述)、pBI121-GP2C(前面已述)、 PBI121-GP2D (前面已述)分别得到6、5、10株阳性苗。所用试剂配方如下(I)LB液体培养基分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠依次溶解于蒸馏水中，定 容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X104Pa下高压消毒15分钟。4°C 冷藏备用。(2) LB固体培养基分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸 馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121°C，6.859X104Pa下高压消毒15 分钟。4°C冷藏备用。(3) 1/2MS固体筛选培养基硝酸铵(NH4NO3)1. 65g硝酸钾1. 9g磷酸二氢钾0. 17g硫酸镁0. 37g氯化钙0. 44g蔗糖30g琼脂8g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8，煮沸(100°C )并定容至1000ml， 分装到500ml三角瓶(250ml/瓶)，封口灭菌。6、油菜GL2基因启动子功能分析本发明首次克隆得到甘蓝型油菜GLABRA2基因的启动子GP2序列，并对其进行一 系列缺失片段进行功能分析。从实施案例1. 5中筛选得到阳性苗Tl代，自交收获种子(即T2代)。T2代取 多个株系的不同时期组织进行GUS染色。染色过程如下将样品浸泡在GUS染液(X-gluc 0. 5mg/mL,磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0. 5mmol/L, EDTA 10mmol/L, Triton-x-1000.001 %，甲醇20% (体积比)真空抽气5分钟，37 °C过夜。第二天用酒 精-乙酸(体积比为1 1)进行脱色，直至叶片变白，之后用蒸馏水漂洗数次，体式显微镜 (OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同时间段的整个植株；生殖生长期，叶片取嫩叶和成熟叶 片；花取开过的花朵和未开的花蕾的花序；角果取不同时期的角果；种子去开花后10天左 右的种子。植株被染成蓝色的部位就是⑶S基因表达的部位。
染色结果发现，三个启动子序列都可以启动⑶S基因的表达，并呈现出不同的组 织偏好性。全长启动子GP2在整个生长时期都具有⑶S活性。主要集中在拟南芥的幼嫩组 织中表达。如早期的子叶、叶原基、叶片、根尖、茎以及开花后10天左右的种子中都有不同 程度的⑶S活性(表三)。缺失启动子GP2C中包含GL2基因5'上游序列近800bp的序列， GUS染色表明该序列也可以启动GUS基因表达。表达的部位重要在苗期的整个根部组织， 其强度等同于阳性对照35S启动子调控下的GUS基因的表达。另外在幼嫩的子叶、真叶的 叶脉中也有较强表达，但随植株发育成熟，在成熟的叶片以及其他组织中中不再检测到GUS 的活性(表四)。缺失启动子GP2D中包含了 GL2基因5'上游序列近1. 4Kb的序列。在此 片段的调控下GUS基因在苗期的子叶、真叶、根部同样有GUS表达，而且种子中也没有检测 到⑶S的活性(表五)。但是与GP2C的表达情况相比，GP2D在根部的表达更为精细，后者 主要集中在根尖表达，而且在叶脉中的表达也只集中在中柱叶脉。实验结果表明，油菜BnGL2启动子具有如下生物学功能全长启动子GP2在不同组 织中均有表达，在叶片表皮毛和开花后10天左右的种子中表达量最高(图5，GP2 ；表三)。 这就预示着在BnGL2全长启动子的启动下，基因主要在毛状体发育和种子成熟过程中发挥 作用。而在缺失启动子GP2C调控下GUS基因主要活跃在苗期根部和叶脉中，而在种子中没 有表达(图5 GP2C，表四)。因此推断该启动子的调控下的基因主要参与根的发育和营养 输送的功能。GP2D启动子调控下的⑶S基因主要在中柱叶脉和幼嫩的叶片表皮毛中表达， 但在种子中没有检测到GUS基因的活性(图5 GP2D，表五)，因此GP2D启动的基因的功能 主要在输送营养和表皮毛发育中扮演角色。本发明首次克隆得到甘蓝型油菜BnGL2基因的启动子GP2序列，并对其进行一系 列缺失片段进行功能分析。申请人感兴趣的是GP2、缺失片段GP2C、缺失片段GP2D这三个 启动子的表达差异，尤其是缺失启动子GP2C和GP2D的转基因植株在种子的整个发育时期 都没有检测到活性。表三、GL2全产启动子GP2转基因T2代株系的⑶S染色统计表
权利要求
1.一种分离的启动子，其序列为SEQ ID NO :1所示的基因启动子。
2.权利要求1所述的一种甘蓝型油菜GL2启动子GP2的制备方法，其步骤是A、基因组步移克隆启动子序列利用SDS裂解法提取基因组DNA，按照基因组步移试剂盒操作程序，进行基因组步移， 每次步移扩增两轮PCR克隆油菜，具体步骤为提取基因组DNA 25 μ L，分别用核酸内切酶 Dra I.EcoR I.Pvu II和Stu I酶切，纯化后加入接头形成四个不同的基因组DNA库，用作 首次基因组步移第一轮PCR模板，根据目的基因保守序列设计特异性引物GSPl与试剂盒 内上游接头引物APl进行扩增，第二轮PCR以第一轮PCR产物的50倍稀释液为模板，设计 引物GSP2和接头引物ΑΡ2进行扩增，进行第二轮基因组步移，所有PCR反应均为50 μ L扩 增体系模板 1 μ L, dNTPs 0. 2mM，引物 0. 5mM, LA Taq 酶 1. 25U, 10 X LA-PCR buffer5 μ L, 补水至50 μ L，反应条件均为94°C预变性Imin ；98°C 10s，72°C 6min 7个循环；98°C 10s, 67°C 6min33个循环；72延伸lOmin，PCR产物经1. 0%质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测， GelExtraction Kit纯化回收后，连接到pMD18_T载体，转化gold感受态细胞，挑取阳性克 隆，酶切验证后测序，得到目的基因上游的侧翼序列；B、启动子序列生物信息学分析将所克隆序列用BLASTN进行同源比对，启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动 子预测软件进行预测，得到核心启动子序列和上游启动子元件；C、全长启动子、缺失启动子的扩增以及pMDIS-T-GP载体的构建以基因组DNA为模板，根据得到的启动子序列，设计扩增各缺失片段的引物进行PCR 扩增，所有引物的5'端含有Hind III酶切位点，3'端含有Xba I酶切位点，反应体系为 25 μ L 内含=IXPCR buffer.，MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L、引物浓度为 0. 5mol/L, Pfu酶1. 5单位，模板约lOOng，设置循环参数，PCR产物1. 0%质量体积比琼脂糖凝胶检测， 回收试剂盒回收各目的缺失片段，按各回收的缺失片段载体=3 1的比例混合样品， 加入T4DNA连接酶5单位，IX反应缓冲液，无菌水补充体积至25ml，16°C过夜连接反应，冻 融法转化大肠杆菌gold菌感受态细胞中，涂布于含有Amp的LB固体平板上，37°C培养过 夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测，将阳性重组子接种于含Amp 50 μ g/mL的液体LB培 养基，37°C 200r/min振荡培养过夜，小量碱法提取质粒，Hind ΙΙΙ/Xba I酶切质粒1 μ g， 0. 8%质量体积比琼脂糖凝胶检测，检测正确的阳性重组克隆，为pMDIS-X，以M13F/M13R为 引物M13 R5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，；M13R5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，，将 pMD18-X 进行序列测定，得到了一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子。
3.权利要求书1中所述一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQID NO :1在 根部中的应用。
4.权利要求书1中所述一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQID NO :1在 整个叶脉中的应用。
5.权利要求书1中所述甘蓝型油菜BnGL2基因缺失启动子SEQID NO=I在叶片表皮 毛中的应用。
6.权利要求书1中所述甘蓝型油菜BnGL2基因缺失启动子SEQID NO=I在中柱叶脉 中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种甘蓝型油菜BnGLABRA2启动子及制备方法和应用，其步骤是A、基因组步移克隆启动子序列利用SDS裂解法提取基因组DNA，进行基因组步移，每次步移扩增两轮PCR克隆油菜。B、启动子序列生物信息学分析将所克隆序列用BLASTN进行同源比对。启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件，得到启动子序列和上游启动子元件；C、全长启动子、缺失启动子的扩增以及pMD18-T-GP载体的构建以基因组DNA为模板，根据前期得到的启动子序列，设计扩增各缺失片段的引物进行PCR扩增。一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子SEQ ID NO1在叶片表皮毛、种子、根部、整个叶脉、中柱叶脉中的应用，操作简单，结果稳定可靠。具有生物安全性和开发应用价值。
文档编号C12N15/82GK102102099SQ20091027332
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月18日 优先权日2009年12月18日
发明者刘胜毅, 刘越英, 柴国华, 白泽涛, 董彩华, 黄军艳 申请人:中国农业科学院油料作物研究所