专利名称：一种用安全标记基因筛选转基因植物的方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因植物安全筛选方法，特别是涉及一种用安全标记基因筛选转基因 植物的方法。
背景技术：
随着转基因作物种植面积的扩大和商业化程度的加深，转基因作物的安全性也受到了人 们的关注。比如广泛使用的抗生素抗性基因可能转移到微生物中，使病原菌获得抗性，从而 导致目前临床使用的抗生素失效；转基因有可能随花粉扩散，会传播到野生亲缘种中，使杂 草获得这种抗性，变成现有除草剂无法杀灭的"超级杂草"，破坏生态平衡。因此建立一种 用安全标记基因筛选转基因植物的方法极为重要。
到目前为止被广泛用于转基因植物筛选的标记基因主要有两大类 一类是抗生素类，包 括潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、新霉素磷酸转移酶基因II(nptII)等；另一类是抗除草剂类 ，包括草丁膦抗性基因(bar)、草甘膦抗性基因(印sps)等。当用这些标记基因获得转化株后 ，特别是在转基因产品的产业化过程中，抗性标记基因的存在是多余的，甚至是有害的。因 此目前大多数国家都开始重视对无争议的生物安全标记进行研究。
解决选择标记基因的生物安全性问题主要有三种途径 一是在转化时仍使用标记基因， 但获得转基因植株后再将其去除；二是利用无选择标记基因的转化系统，三是利用无争议的 生物安全标记基因。前两种途径选择效率低、操作步骤繁琐，因此采用无争议的生物安全标 记基因是解决有关转基因作物生物安全性问题的最佳方案。近年来发现的生物安全标记基因 主要有糖类代谢酶基因(pmi和xylA)、干扰氨基酸代谢酶基因(ASA2和AtTSBl)、绿色荧光蛋 白基因(GFP) 、 6 -葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、核糖醇操纵子(rtl)和谷氨酸-l-半醛转氨酶基 因(hemL)等。但现今所使用的安全标记基因只限于在筛选过程中起作用，在转基因植株中不 具备提高植物品质的优势。
植物在整个生长发育过程中受到各种不良环境的影响，如大气污染物(二硫化物、臭氧 等)、金属(铜、镉、铝等)、离子辐射、极端温度(高温或低温)、水分胁迫(尤其是在强光下 )、强光、盐渍和病原菌侵染等，这些胁迫均能使植物产生过量的活性氧和自由基。在植物 中活性氧会引起植物代谢失活、细胞死亡、光合作用速率下降、同化物的形成减少，甚至造 成植物品质下降和产量降低等严重后果。在氧胁迫下酶保护系统和非酶保护系统的成员协同作用使细胞内的活性氧维持在较低水平，确保植物正常生长和代谢。超氧化物歧化酶(SOD )是清除活性氧过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，在抗氧化酶类中处于核心地位。到目前 为止，不同类型的SOD基因已经被转化到多种植物中，在提高植物抗逆性过程中起到重要作 用。比如将SOD在小麦中过量表达，增强了其对干旱和盐的耐性，将来自0ryza sativa的胞 质Cu/Zn-SOD在烟草中过量表达，提高了对百草枯和聚乙二醇的抗性，转基因植株对盐和干 旱的耐性也明显提高。大量实验结果表明SOD在转基因植株中的过量表达能不同程度地提高 植物对环境胁迫的抵抗能力。
因此，研究探索获得一种既可作为选择标记高效筛选转基因植株，并且在将来转基因作 物大规模推广生产中可显著提高作物抗逆性的安全标记基因可谓一举两得。
百草枯是一种广泛应用且无选择性的除草剂，它作为一种电子受体，作用于细胞内的氧 化还原反应，生成大量活性氧自由基，引起细胞膜脂质过氧化，造成组织细胞的氧化性损害 。至今未有选用SOD作为安全标记，以百草枯作为选择剂进行植物转基因筛选的文献。
发明内容
本发明的目的是提供一种用安全标记基因筛选转基因植物的方法，该方法不仅能高效筛 选出转基因植株，提高了植物的转化效率，将从根本上解决抗生素标记基因和除草剂类抗性 基因的安全性问题，而且筛选标记基因本身就是很好的目的性状基因，可以提高植物对多重 胁迫的耐受性，不会影响转化植物的代谢平衡，大大提高了转基因植物品质。
本发明的技术方案概述如下
一种用安全标记基因筛选转基因植物的方法，其特征是用超氧化物歧化酶基因作为筛选 转基因植物品系的安全标记基因，选择剂为百草枯。
所述用超氧化物歧化酶基因作为筛选转基因植物品系的安全标记基因的步骤为在基本 植物表达载体中插入所述超氧化物歧化酶基因构建植物表达载体，用所述植物表达载体转化 农杆菌，获得含有植物表达载体的工程菌，再用此工程菌感染植物外植体，用选择剂进行筛 选。
所述用超氧化物歧化酶基因作为筛选转基因植物品系的安全标记基因的优选步骤为在 基本植物表达载体pBI 121的多克隆位点MCS处插入所述超氧化物歧化酶基因构建植物表达载 体，用所述植物表达载体转化农杆菌，获得含有植物表达载体的工程菌，再用此工程菌感染 植物外植体，用选择剂进行筛选。
所述超氧化物歧化酶基因为乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-SOD基因。
植物表达载体中的超氧化物歧化酶(S0D)基因可以是自然界中分离得到，也可以是氨
4基酸序列发生取代、删除、插入等的突变体。
本发明所用超氧化物歧化酶基因具有双重功效， 一方面作为筛选转基因植物品系的安全 标记基因，另一方面提高了植物对多重逆境胁迫的耐受性，可以将超氧化物歧化酶基因和其 它重要的目的性状基因，如抗虫、抗除草剂、抗病毒等基因连锁起来转化植物，将可以培育 出既耐受多重逆境胁迫的又高产、抗虫、抗除草剂、抗病毒的作物新品种。
本发明的方法可以应用于大豆、玉米、水稻、小麦和其它植物转基因的研究。
本发明的优点用SOD基因作为筛选转基因植物品系的安全标记基因可用于多个基因转 化，有利于得到具有多重优良品质的转基因植物；可以縮短筛选时间，有利于最大化高通量 筛选得到转基因株系，通过灵活地增加选择压力，避免耗费人力的植物组织转移；选用百草 枯除草剂作为选择剂，可以从分离群体中通过简单大田除草剂喷洒排除非转基因植物，这对 于大规模商业化生产转基因植物非常重要。
图l为乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-SOD PCR产物琼脂糖凝胶电泳； 图2为PUC18NS载体示意图3为含有乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-S0D的pBI121S植物表达载体示意图； 图4为乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-S0D的特异性检测引物进行PCR检测扩增的结果示意图； 图5为转基因烟草对百草枯的抗性实验示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 实施例l乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-SOD基因的克隆
提取乳酸克鲁维酵母基因组，并以其为模板，以SOD-up和SOD-dn为引物，通过PC財广增 得到465bp片段，所述引物序列为
SOD-up-5' GGGGGATCCATGGTTAATGCAGTTGCAG3' (BamHI)
SOD-dn-5' GGGCCCGGGCCCGAATTCAGCGTTAGAGATACCAATA3' (Apal+EcoRI)
电泳结果如图l。
实施例2植物表达载体构建
通过PC財广增得到pBI121载体中N0S promoter片段，所述引物序列为 up-GGGCTGCAGGATCATGAGCGGAGAATTA(Pstl) dn-GGGCCCGGATCCAGATCCGGTGCAGATTATT(BamHI)
用PstI和BamHI将得到的NOS promoter片段和PUC18载体进行双酶切，酶切体系见表l，
5用T4DNA连接酶连接(连接反应体系见表2)得到PUC18N载体。将实施例l中克隆得到的乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-SOD基因片段用BamHI和EcoRI进行双酶切，用相同的限制性内切酶双酶切PUC18N载体，通过T4DNA连接酶连接得到PUC18NS载体(见图2)。
用Bmtl和Apal将上述得到的PUC18NS载体进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用QIAGEN Gel Extraction Kit回收N0S promtor+SOD 570 bp左右片段；用相同的限制性内切酶双酶切pBI121载体，回收较大片段条带，得到去除抗卡那霉素基因的pBI121空表达载体。然后用T4DNA连接酶连接带有缺口的pBI121载体和上述N0S promtor+S0D片段，得到pBI121S载体，见图3。该表达载体pBI121S上含有乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-S0D基因和GUS基因，但不含可在植物中表达的抗生素抗性基因。
表l Pstl+ BamHI双酶切反应及电泳体系
N0S promoter基因片段 ；〗5.0 yl
Pstl (10U/yl) ;〗.0 y 1
BamHI (10U/yl) ;〗.0 y 1
10X反应缓冲液 f0 y 1
ddH20 ;〗5.0 yl
表2连接反应体系DNA片段14. 0 y 1
DNA片段24. 0y 1
ddH209. 0 y 1
T4 Ligase缓冲液(10X)2. 0 y 1
T4 Ligase (5 U/y 1)1. 0 y 1
实施例3大肠杆菌转化子的获得
E. coli DH5a感受态细胞制备将DH5 a的单菌落接入5 ml LB液体培养基中，37。C过夜摇培，250 rpm;按l %的接种量将液培管中的菌液接种到LB摇瓶中，37。C摇培至0D60^0. 4;摇瓶在冰水中迅速冷却至(TC，分装至冰预冷的离心管，冰置数分钟；4°C， 4000 rpm离心10min回收细胞，将残留液空干(迅速)；冰预冷的10 ml 0.1 MCaCl2重悬细胞，4°C， 4000rpm离心10 min回收细胞；10 ml 0.1 M的CaCl2重悬细胞，冰浴l h以上；4°C， 4000 rpm离
6心10 min回收细胞；每50 ml原培养物用2 ml含15X甘油的CaCl2 (0.1 M)来重悬，分装于 1.5ml离心管，200 yl每管。一8(TC保藏；
将实施例2中的连接产物(植物表达载体pBI121S) 1-10 yL质粒和l ml DH5 a感受态细 胞混匀，置于冰上30 min; 42。C水浴保温90 s，热休克，置于冰上冷却2 min;加入2倍体积 的液体LB， 37。C振荡培养45 min，离心浓縮菌体，弃上清；用液体LB悬浮菌体，然后涂布在 含有百草枯(0.5 uM)的LB平板上，37。C恒温培养12小时。挑取单菌落，摇菌过夜，采用 CTAB法提取质粒，经PCR和酶切验证后，挑取阳性转化子，并保存相应的菌落。此转化子可 用于扩增和大量提取植物表达载体pBI121S。
实施例4根癌农杆菌的转化
根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备(1)从含有利福平(Rif)和链霉素(Str)YEB培 养基平板上挑取LBA4404单菌落，接种到3ml LB液体培养基中，220 rpm 28。C振荡培养至 0D60q =0.5。
(2)吸取l. 5ml菌液于离心管中，冰浴IO min; 5000 rpm离心30 s，弃去上清 液；(3)沉淀用1.5 ml 0.5 M NaCl悬浮，冰浴20 min; 5000 rpm离心30 s，弃去上清液； (4)每管用IOO yl 20 mM CaCl2悬浮，用于转化。
取50 u 1农杆菌感受态细胞中加入实施例3中提取的质粒DNA 0. 1 1 yg，之后冰浴30 min;放入液氮中5 min，然后立即放入37。C水浴锅中水浴5 min;取出离心管，加入O. 5 mlYEB培养基，混匀，28°C、 220 rpm振荡培养3 5 hr; 5000 rmp离心30 s，弃上清，加入 100 yl YEB混匀，涂布在添加Rif、 Str和百草枯(0. 5yM)的YEB平板上，在培养箱中28。C 条件下倒置培养。2天左右菌落可见。挑取单菌落经PCR和酶切检测，确认含有植物表达载体 ，摇菌过夜至0D6(K) =0.3 0.6，用于感染外植体。
实施例5含有表达载体的工程菌介导的烟草转化及抗性植株的获得
将烟草叶片用6 mm打孔器凿成圆盘作为外植体，用28"C过夜培养的根癌农杆菌 LBA4404感染10 min，用MS培养基冲洗，用经高压灭菌的滤纸吸干，移入到 MS+2， 4-D(2， 4-dichlorophenoxyacetic acid， 2，4-二氯苯氧乙酸)0. 3mg/L+3。/。蔗糖+0. 7%琼 脂的培养基中暗处共培养48 h。无菌水冲洗三遍，用无菌滤纸吸干，然后移入含有选择剂百 草枯的分化培养基中[MS+NAA (naphthaline acetic acid，萘乙酸)O. 1 mg/L +6-BA(6-benzylaminopuri-ne， 6-节氨基嘌呤)1 mg/L+百草枯(1.0 y M)]，培养两周后，再 转入生根培养基中[MS+NAA(0. lmg/L)+百草枯(1.0 y M)]，继续培养两周后，不定根生成。 这些根继续在含有选择剂百草枯的生根培养基中筛选。将选择剂百草枯存在下获得并生根的 再生根，打开瓶盖炼苗，转移到温室中，保持在25'C， 12 h光照，观察，得到To代转基因植
7株。
实施例6转基因植株的分子生物学鉴定
取待测烟草植株(小苗生长至4-5叶期)叶片，采用CTAB (十六烷基三甲基溴化胺)法 提取DNA。具体方法是称取1.5 g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片磨碎 。取l g粉末加入400 ml预冷的CTAB缓冲液(50 mmol/L Tris-HC1 pH8. 0， 0.7 mmol/L NaCl， 10 mmol/L EDTA pH 8.0)，轻轻转动混匀。于65。C保温30 min。加入等体积的氯仿 -异戊醇，轻轻颠倒混匀，室温下4000 rpm离心IO min。将上层液相转移到一灭菌的 E卯endorf管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温下放置20 min， 2000 rmp离心10 min，小心倒去上清，在室温下使DNA沉淀干燥。用70。/。乙醇洗涤DNA沉淀，干燥后加入20 ml 双蒸水溶解。
加入Cu/Zn-SOD基因的特异性检测引物按照表3和表4体系进行PCR检测。 表3 PCR反应液
无菌水35.25 yl
10X Buffer5 y 1
MgCl2 (25mM)3 y 1
dNTP (10mM)4 y 1
上引(1.5X10—UM)1 ul
下引(1.5X10—UM)1 ul
DNA模板(O. l 2y g)0. 5 y 1
Taq Polymerase (5u/y 1)0.25 yl
表4 PCR程序
1预变性94 。C4min
2变性94 。C30 s
3退火50-60。C30 s
4延伸72 。C30 s
5循环重复步骤2-430次
6延伸72 。C10 min
87停止4。CPause
反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。检测结果如图4所示。其中M为DNAladderIII， +代表阳性对照，-代表空白对照，图中l， 2为加入Cu/Zn-S0D特异引物后的检测结果。从中可以看出，在470bp左右处出现了扩增条带。图4中，从乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-SOD基因作为标记基因筛选出的转化苗中任意挑取的两株，其PCR检测结果表明，该基因已经整合到植物基因组DNA中。
实施例7转基因烟草对百草枯的抗性检测
取实施例5中获得的转基因烟草幼苗的叶片，剪成0.5X0.5 cm大小，平铺于含有O. 1，0.5， 1.0， 3.0，和6.0 yM百草枯的MS+6-BA(l mg/L) +3%蔗糖+0. 7%琼脂的分化培养基中，28'C恒温下，16 h光照条件下培养。以未经转化的野生型烟草作为对照，检测转基因烟草对百草枯的抗性。结果表明转基因植株的叶片在含3.0 UM百草枯的培养基上仍能分化出芽，而对照植株在含0.5 UM百草枯的培养基上时已没有芽分化出来，表明获得的转基因烟草植株具有很好的百草枯抗性。
将诱导得到的抗性芽和空白对照分化出来的芽生根培养，转移到MS+NAA(0. lmg/L) +3%蔗糖+0.7%琼脂+百草枯(1.0 UM)的生根培养基中，28'C恒温下，16 h光照条件下培养。观察生根的情况。结果表明，转基因植株在含l.O UM百草枯的生根培养基中正常生根，而对照植株不生根或很少生根，叶片变为褐色，并出现玻璃化现象，见图5。图5中A为对照植株的生长情况，B为转基因烟草的生长情况。
将转基因植株在含百草枯的生根培养基上生根后，炼苗，将其移栽至温室中，直接用浓度稀释至IOO UM百草枯直接喷洒，观察其生长状况。 一周后，观察到转基因植株基本未受到损伤，但对照植株叶片部分变黄；第二次喷洒后， 一周后观察，转基因植株少数叶片上出现了黄色或褐色斑点，但仍长出新叶，而对照全部死亡。
将对百草枯具有良好抗性的To代转基因植株开花结实，得到^代自交种子。将此转基因植株h代和野生型种子表面灭菌，在3.0 UM百草枯浸湿的滤纸上萌发，两周记录一次萌发和待萌发种子数目。结果表明h代种子65。/。萌发，而对照种子则15%能够萌发。将生根后T!代植株转移至温室中，用无百草枯的MS培养基上萌发的种子作为对照，将浓度稀释至IOO yM百草枯直接喷洒，观察其生长状况。两周后，观察到转基因植株基本未受到损伤，但对照植株叶片部分变黄或变成褐色，并逐渐死亡。
实施例8转基因烟草抗逆性测试
9取实施例5得到的转基因烟草小苗在MS培养基上以16 h光照的条件生长两周，转移到温 室中生长三周后。用150 mM的NaCl溶液浇灌转基因植株，每两天灌溉一次。持续8到10天后 ，植物在不含盐的水中保持10天以恢复。对照在盐处理四天后萎蔫，转基因植株8天后生长 状态仍然良好。8天后转基因植株也开始萎蔫。转基因植物的湿重和干重都比对照植物要高
将生长15天的生长一致的转基因小苗和对照植株每天正常灌溉。在干旱处理前两天停止 灌溉，以保证土壤干旱。100 h的干旱处理后浇灌一次，继续IOO h的干旱处理。处理后的转 基因植株未出现枯黄，但未转基因对照植株则完全萎蔫干枯。
权利要求
权利要求1一种用安全标记基因筛选转基因植物的方法，其特征是用超氧化物歧化酶基因作为筛选转基因植物品系的安全标记基因，选择剂为百草枯。
2.根据权利要求书l所述的一种用安全标记基因筛选转基因植物的方 法，其特征是所述用超氧化物歧化酶基因作为筛选转基因植物品系的安全标记基因的步骤为 :在基本植物表达载体中插入所述超氧化物歧化酶基因构建植物表达载体，用所述植物表达 载体转化农杆菌，获得含有植物表达载体的工程菌，再用此工程菌感染植物外植体，用选择 剂进行筛选。
3.根据权利要求书l所述的一种用安全标记基因筛选转基因植物的方法，其特征是所述用超氧化物歧化酶基因作为筛选转基因植物品系的安全标记基因的优选步骤为在基本植物表达载体pBI121的多克隆位点MCS处插入所述超氧化物歧化酶基因构建植 物表达载体，用所述植物表达载体转化农杆菌，获得含有植物表达载体的工程菌，再用此工 程菌感染植物外植体，用选择剂进行筛选。
4.根据权利要求书1至3之一所述的一种用安全标记基因筛选转基因 植物的方法，其特征是所述超氧化物歧化酶基因为乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-SOD基因。
全文摘要
本发明公开了一种用安全标记基因筛选转基因植物的方法，是用超氧化物歧化酶基因作为筛选转基因植物品系的安全标记基因，选择剂为百草枯。本发明用SOD基因作为筛选转基因植物品系的安全标记基因可用于多个基因转化，有利于得到具有多重优良品质的转基因植物；可以缩短筛选时间，有利于最大化高通量筛选得到转基因株系，通过灵活地增加选择压力，避免耗费人力的植物组织转移；选用百草枯除草剂作为选择剂，可以从分离群体中通过简单大田除草剂喷洒排除非转基因植物，这对于大规模商业化生产转基因植物非常重要。
文档编号C12Q1/68GK101463393SQ200910300138
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月12日 优先权日2009年1月12日
发明者静 季, 李文凤, 罡 王 申请人:天津大学