专利名称：一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法
技术领域：
本发明属于生物技术与组织工程领域，涉及到一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法，特别涉及到一种使用同一份脐带血的血清来同时获得脐带血造血干细胞与间充质干细胞的方法。
背景技术：
造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)可以广泛应用于基因治疗、肿瘤净化和骨髓移植等方面(Bellantuono I. The International Journal of Biochemstry & CellBiology, 2004， 36 (4) :607-620)，尤其是造血干细胞移植已成为癌症患者放化疗后造血功能重建的常规方法，但细胞数量有限极大地限制了其在临床上的应用。解决此问题的有效方法是实施HSCs的体外大规模扩增。尽管造血干细胞移植能够显著地改善癌症患者放化疗之后的生命质量，但绝大多数患者不可避免的要承受短期内的严重嗜中性粒细胞减少症和血小板减少症的痛苦，因此有必要提出新的治疗方案来降低这些并发症的发生。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)已被证明在体外具有支持造血发生的功能，同时在N0D/SCID小鼠体内实验中，也证明了同时移植HSCs和MSCs加速了小鼠造血功能的重建(Kim D H， et al. Journal of Korean Medical Science, 2006， 21 (6) : 1000-1004)。而对于临床上乳腺癌患者化疗后的造血干细胞移植，联合移植入自体的MSCs同样具有促进造血重建的功能，同时降低了伴随造血干细胞移植并发症的发病率。另外，MSCs也可作为细胞治疗的种子细胞和基因治疗的载体细胞。因此，能够在同一个培养体系内同时培养与收获HSCs和MSCs两种干细胞，具有重要的临床应用价值。
脐带血(Umbilical cord blood， UCB)作为HSCs的来源之一，同时含有MSCs。相对于骨髓及外周血，脐血造血干细胞(CBSC)具有富含更早期的造血干/祖细胞、免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34+CD38—与〔034+ CD33—的比例较高、在移植过程中可以减少移植物抗宿主病(GVHD)发生率、来源广泛等一系列优点，使得与脐带血有关的造血干/祖细胞研究成为热点。然而HSCs和MSCs分别具有悬浮生长和贴壁生长的生物学特性，体外必须同时提供悬浮培养环境与动态贴附表面，才有可能在模拟体内微环境的条件下实现HSCs和MSCs的共培养。微载体与适宜生物反应器相结合是解决此问题的可行方法。变性胶原包被的交联葡聚糖(cytodex-3)微载体以其良好的表面贴附特性，在贴壁细胞三维动态培养方面倍受关注。
另外，相对于普遍应用的胎牛血清，使用同一份脐带血中的自体血清可以为细胞提供更好的营养物质，同时，在细胞以后的临床应用中，也可以避免胎牛血清带来的免疫反应。
因此，用同一份脐带血的血清代替胎牛血清、不添加细胞因子及无基质细胞支持，采用微载体与生物反应器相结合的策略，实现脐带血来源造血干细胞与间充质干细胞的共培养。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时培养出脐带血造血干细胞与间充质干细胞的方法。
本发明的技术方案包括以下步骤
1、 分离人脐带血单核细胞脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，每次脐带血采集量平均为50 100mL。脐带血采集后，按体积比l: 1与PBS缓冲盐溶液混合均匀，用密度为l. 077g. mL—^勺Ficoll细胞分离液以2500rpm， 25分钟密度梯度离心后获得单核细胞(Mononuclear cells,丽Cs) ， Ficoll细胞分离液与脐带血的体积比为l: 1 1:2。分离后的细胞用頂DM基础培养基离心洗涤两次(1000rpm，5分钟)，调整细胞密度备用。
2、 获得同一份脐带血血清本专利所使用的人自体血清为与细胞同一来源的脐带血血清，其获得方法为脐带血采集后，按体积比l: 1与PBS缓冲盐溶液混合均匀，用密度为1.077g.mL—^勺Ficoll细胞分离液以2500rpm、 25分钟密度梯度离心，收获单核细胞；然后用滴管吸取第一层血清液，置入无菌离心管中备用。
3、 cytodex-3微载体的预处理将干燥的cytodex-3微载体置于硅化处理的玻璃瓶中，并用不含Ca^、 Mg^的PBS缓冲盐溶液在室温下浸泡4小时(50 100mL—1 cytodex-3微载体)以上，其间要偶尔搅拌一下。用新鲜的不含"2+、 Mg2+的PBS缓冲盐溶液冲洗两次后，高压灭菌(115°C， 15分钟，l大气压)备用。
4、 共培养UCB-HSCs与UCB-MSCs:将新鲜分离得到的UCB-丽Cs以2 X 106cells. mL—^勺密度接种到提前铺满cytodex-3微载体的24孔板中，添加20%的脐带血血清。采用自然沉降的方法将悬浮的UCB-HSCs和粘附在GCSC微载体上的UCB-MSCs分离并收获。
本发明的效果和益处是(1) 利用人自体血清，不仅能够支持UCB-HSCs、 UCB-MSCs在三维条件下良好扩增，完全替代胎牛血清的作用，还能避免异体间的免疫排斥反应。
(2) cytodex-3微载体能够为贴壁生长特性的UCB-MSCs提供黏附表面，使UCB-MSCs在在三维动态环境中实现贴壁悬浮培养成为可能。
(3) 采用自由沉降的方法，将悬浮的UCB-HSCs和黏附在GCSC微载体上的UCB-MSCs两种干细胞轻易地分离并收获。
(4) 利用本发明的方法，在添加脐带血血清、不添加细胞因子及滋养层细胞支持的条件下，采用微载体培养的策略，在孔板中共培养UCB-HSCs和UCB-MSCs。结果表明，同一份脐带血来源的血清，可以很好的支持UCB-HSCs和UCB-MSCs的体外扩增，UCB-MSCs在cytodex-3微载体上的贴附生长状态良好。
图1是本发明所述的UCB-HSC s与UCB-MSC s共培养的流程图。图2是实施例1中密度梯度离心后的分层示意图。
图3是实施例2中UCB-MSCs在cytodex-3微载体表面上黏附的光镜观察结果。
图4是实施例3中cytodex-3微载体自然沉降后与细胞悬液的分层示意图。
具体实施例方式
以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。实施例l
本实施例为在同一份脐带血中同时获得培养用血清及单个核细胞。
脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，脐带血采集量120mL。脐带血采集后，按体积比l: 1与PBS混合均匀，用密度为1.077g.mL—^勺Ficoll细胞分离液以2500rpm，25分钟密度梯度离心，Ficoll分离液与脐带血的体积比例为l:l l:2。离心后，如图2所示，上层为血清，采集后置入无菌离心管中备用；取中间白膜层获得单核细胞(Mononuclearcells,丽Cs)，分离后的细胞用頂DM基础培养基离心洗涤两次(1000rpm，5分钟)，调整细胞密度备用。
实施例2
本实施例为UCB-HSCs与UCB-MSCs在静态条件下的共培养。
将新鲜分离得到的UCB-MNCs以2 X 106cellS. mL—^勺密度接种到提前铺满cytodex-3微载体的6孔板中，添加20%的同一份脐带血来源的血清，在37。C、 5%C02、 20%02及饱和湿度条件下共培养12天。每隔24小时计数，光镜观察。
实验结果同一份脐带血来源的血清，可以很好的支持UCB-HSCs和UCB-MSCs的体外扩增，由图2可以看出UCB-MSCs在cytodex-3微载体上的贴附生长状态良好。
实施例3
本实施例为UCB-HSCs与UCB-MSCs在静态条件下的共培养后，两种细胞的分离。培养结束后，用滴管将cytodex-3微载体吹起成悬液，将悬液吸出置于无菌的离心管中
，静置5分钟后，cytodex-3微载体沉降在底层，如图4所示。吸出上层细胞悬液，用5mL頂DM
冲洗cytodex-3微载体，再次静置，反复三次。
析出的上层细胞悬液，离心后可获得UCB-HSCs，将贴附于cytodex-3微载体上的
UCB-MSCs用O. 125%胰酶及0. 02"/。EDTA消化收获。
权利要求
1.一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法，其特征在于以下步骤(1)分离人脐带血单核细胞脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，每次脐带血采集量平均为50～100mL；脐带血采集后，按体积比1∶1与PBS缓冲盐溶液混合均匀，用密度为1.077g.mL-1的Ficoll细胞分离液以2500rpm、25分钟密度梯度离心后获得单核细胞，Ficoll细胞分离液与脐带血的体积比为1∶1～1∶2；分离后的细胞用IMDM基础培养基1000rpm、5分钟离心洗涤两次，调整细胞密度备用；(2)获得同一份脐带血血清脐带血采集后，按体积比1∶1与PBS缓冲盐溶液混合均匀，用密度为1.077g.mL-1的Ficoll细胞分离液以2500rpm、25分钟密度梯度离心后，收获单核细胞；然后用滴管吸取第一层血清液，置入无菌离心管中备用；(3)cytodex-3微载体的预处理将干燥的cytodex-3微载体置于硅化处理的玻璃瓶中，并用不含Ca2+、Mg2+离子的PBS缓冲盐溶液在室温下浸泡4小时以上，偶尔搅拌；用新的不含Ca2+、Mg2+离子的PBS缓冲盐溶液冲洗两次后，高压灭菌备用；(4)共培养UCB-HSCs与UCB-MSCs将分离得到的UCB-MNCs以2×106cells.mL-1的密度接种到提前铺满cytodex-3微载体的24孔板中，添加20％的脐带血血清；采用自然沉降的方法将悬浮的UCB-HSCs和粘附在GCSC微载体上的UCB-MSCs分离并收获。
全文摘要
本发明公开了一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法，属于生物技术与组织工程领域。用同一份脐带血的血清代替胎牛血清、不添加细胞因子及无基质细胞支持，采用微载体与生物反应器相结合的策略，实现脐带血来源造血干细胞与间充质干细胞的共培养。本发明能够支持UCB-HSCs、UCB-MSCs在三维条件下良好扩增，完全替代胎牛血清的作用，还能避免异体间的免疫排斥反应；cytodex-3微载体能够为贴壁生长特性的UCB-MSCs提供黏附表面，使UCB-MSCs在在三维动态环境中实现贴壁悬浮培养成为可能；采用自然沉降的方法，将悬浮的UCB-HSCs和黏附在微载体上的UCB-MSCs两种干细胞分离并收获。
文档编号C12N5/08GK101525596SQ200910301568
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月15日 优先权日2009年4月15日
发明者水 关, 刘天庆, 崔占峰, 李香琴, 殷轶群, 丹 葛, 马学虎, 鲍春雨 申请人:大连理工大学