专利名称：一种从灵芝发酵液中制备三萜类物质赤芝酮c的方法
技术领域：
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种从灵芝发酵液中制备三萜类物质赤芝酮C 的方法。
背景技术：
灵芝(Ganoderma lucidum)，别名赤芝，是我国著名的药用真菌。由于它能预防和治 疗许多疾病，在古代曾被称为"仙草"。近年来包括我国在内的东南亚国家以及美国和加拿 大的许多学者对灵芝进行了深入的研究。
现代药理学研究证明，灵芝的关键有效成分是灵芝多糖和灵芝三萜。其中灵芝三萜具有 抗肿瘤、消炎止痛、镇静、解毒、保肝、抗艾滋病病毒等功能，是灵芝发挥药效的重要物质 基础。
灵芝三萜类化合物分为四环三萜和五环三萜。自1982年Kubota等人首次从灵芝子实体中 分离得到几种三萜化合物以来，目前已先后从灵芝子实体、灵芝孢子粉和灵芝菌丝体中分到 了近120种三萜类成分，其中绝大多数为灵芝四环三萜类化合物，其结构属于高度氧化的羊 毛甾烷衍生物。
灵芝三萜赤芝酮C是一种四环三萜类化合物，具有很强的药理活性，如抗肿瘤活性等， 分离自灵芝子实体中，在灵芝孢子粉、菌丝体和发酵液中未分离出。由于其具有更显著的药 理活性，故是潜在的高价值三萜药物。但赤芝酮C在灵芝子实体中的含量非常低，如从灵芝 子实体中提取、分离制备赤芝酮C的难度较大，且成本很高。
目前已有灵芝三萜的发酵生产技术主要是生产灵芝三萜的混合物，即只按总三萜的方法 提取三萜混合物成分，而无分离制备赤芝酮C的相关技术。李平作，徐柔，夏结红，章克昌. 灵芝深层发酵生产四环三萜酸的研究.工业微生物，2000， 30 (1) : 15-17.该方法初步摸索 了深层发酵生产四环三萜酸类化合物的基本工艺。Tang YJ，Zhong JJ. Fed—batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and anoderic acid .Enzyme and Microbial Technology,2002，31:20-28。
该方法采用补加乳糖的流加发酵技术生产灵芝酸(灵芝三萜)。其产物仍是灵芝三萜酸 的混合物。
中国专利00111953. 2提出了液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝三萜的技术。采用液体 好氧发酵、液体好氧发酵-静置培养或液体静置培养的发酵方法生产灵芝三萜，其产物为灵芝三萜酸的混合物。
发明人通过大量的筛选实验，探索出一种从灵芝发酵液中生产赤芝酮C的方法，并进一步 获得了赤芝酮C的提取、分离和纯化技术，形成了一种能在灵芝发酵液中制备单一化合物赤
芝酮c的简单、低成本的方法。目前国内外尚无生产纯品赤芝酮c的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有灵芝三萜赤芝酮c从灵芝子实体中制备时难度大、产率低、
成本高的缺点，以及目前缺乏制备灵芝单一三萜化合物的技术现状，提供了一种能从灵芝发
酵液中制备灵芝三萜赤芝酮c的低成本工业化生产的方法。
本发明的原理当在灵芝发酵过程中补加蜣螂提取物后，在灵芝发酵培养液中可产生灵
芝三萜类化合物赤芝酮c。而赤芝酮c原本不能在正常培养的灵芝菌丝体和发酵液中形成，补 加蜣螂提取物后，诱导了生成赤芝酮c合成的相关酶而使赤芝酮c过量表达。赤芝酮c在灵芝 发酵液中的含量较高。分离和制备原理主要基于赤芝酮c是三萜类物质，具有紫外吸收特性
，且有一定极性，采用反相液相色谱技术(C-18柱)将其逐步分离纯化出来。 本发明的技术方案包括以下步骤
1) 中药蜣螂乙醚提取物的制备取蜣螂虫的腹部部分，烘干后粉碎制成40-60目粉，用 50倍体积的乙醚-乙酸乙酯混合溶液于25。C提取l-3h，过滤，滤液减压挥去溶剂后获得蜣螂 乙醚提取物；上述乙醚-乙酸乙酯混合溶液的乙醚与乙酸乙酯体积比为3: 7-9: 1。
2) 灵芝液体培养采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ganoderma lucidum)，保藏号为CCGMC 5.616。将灵芝接种于装有300mL培养基的lL摇瓶中，在温度为 26-30°C、转速为130-180r/min条件下回转式发酵25-80h;补加蜣螂的乙醚提取物150-400 mg/L后，在温度为25-3CTC、转速为100-180r/min条件下回转式发酵72-144h结束；
上述液体培养基组成为玉米粉8g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨3g/L、豆饼粉3g/L、 KH2P04 1.5 g/L、 MgS04 0. 75 g/L。
3) 发酵液中赤芝酮C的提取发酵液离心后浓縮至原体积的3/5，加入4倍体积的工业酒 精除去多糖和蛋白质，取上清液旋转蒸去水后，用40倍体积的正丁醇回流提取2小时，提取 物挥去正丁醇后，再用氯仿于5(TC下振摇提取2小时，提取物挥去氯仿后，获得粗提物。
4) 赤芝酮C的分离和纯化粗提物用甲醇溶解，先用大孔树脂柱吸附，采用3-4倍柱体 积的甲醇洗脱，流速0.6-1.0mL/min。再用硅胶柱进行分离，采用紫外检测器设置255 nm检 测，用2-3倍柱体积的甲醇洗脱，流速0.6-1.0 mL/min。然后用碳18柱，采用2-3倍柱体积的50%、 70%和90%的甲醇溶液进行梯度洗脱，流速O. 5-1.0 mL/min。收集50%甲醇溶液的洗脱组 份；再换用碳18柱，用2-3倍柱体积的30%、 40%和50%的甲醇溶液洗脱，流速O. 5-0. 8 mL/min;收集50%甲醇溶液的洗脱组份，挥去溶剂后，用氯仿溶解，过滤去渣，滤液挥去氯 仿后，得白色赤芝酮C产品。
所述4)步骤中使用的大孔树脂柱规格为①2. 5cmX50cm，硅胶柱规格为①1. 6cmX 50cm ，碳18柱规格分别为01. 6cmX50cm和O1. 6cmX60cm。
本发明方法的优点如下
1) 首次提出了一种制备纯品赤芝酮C的生物技术，目前国内外尚无生产赤芝酮C的相关 技术。
2) 由于赤芝酮C在灵芝子实体中的含量非常低，传统方法从灵芝子实体中分离制备赤芝 酮C的难度较大、成本很高，本发明通过在灵芝发酵液中补加蜣螂的乙醚提取物来促进赤芝 酮C的形成，从灵芝发酵物中制备赤芝酮C比从灵芝子实体中制备更经济。
3) 与传统方法采用灵芝子实体作为原料相比，本发明采用的灵芝原料来源不受时间、 季节等限制，且原料成本较低，更适于规模化生产。
具体实施方式
实施例l:
首先制备中药蜣螂乙醚提取物取蜣螂虫的腹部部分，粉碎制成60目粉，用50倍体积的 乙醚-乙酸乙酯(60: 40 (v/v))混合溶液于25。C提取2. 5h，过滤，滤液减压挥去溶剂后获 得蜣螂乙醚提取物。
然后采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ganoderma lucidum)， 保藏号CCGMC 5.616。将其接种于装有300mL培养基的lL摇瓶中，在温度为28。C、转速为 160r/min条件下回转式发酵40h;补加蜣螂乙醚提取物190 mg/L后，在温度为28。C、转速为 140r/min条件下回转式发酵144h结束。发酵液离心后浓縮至原体积的3/5，加入4倍体积的工 业酒精除去多糖和蛋白质，取上清液旋转蒸发去水后，用40倍体积的正丁醇回流提取2小时 ，提取物挥去正丁醇后，再用氯仿于5(TC下振摇提取2小时，提取物挥去氯仿后，获得三萜 样品。三萜样品用甲醇溶解，先用大孔树脂柱(①2.5cmX50cm)吸附，采用4倍柱体积的甲 醇洗脱，流速0.8 mL/min。再用硅胶柱(①1. 6cmX 50cm)进行分离，采用紫外检测器设置 255nm检测，2倍柱体积的甲醇洗脱，流速O. 7mL/min。然后用碳18柱(①1. 6cmX50cm)，采 用2倍柱体积的50%、 70%和90%的甲醇溶液进行梯度洗脱，流速0.8mL/min。收集50%甲醇溶液的洗脱组份；再换用碳18柱(cD1.6cmX60cm)，用3倍柱体积的30%、 40%和50%的甲醇溶 液洗脱，流速0.7mL/min。收集50%甲醇溶液的洗脱组份，挥去溶剂后，用氯仿溶解，过滤 去渣，滤液挥去氯仿后，得白色赤芝酮C产品，纯度为93.72%，得率为2. 7 mg/L发酵液。 灵芝发酵的培养基组成为玉米粉8g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨3g/L、豆饼粉3g/L、 KH2P04 1.5 g/L、 MgS04 0. 75 g/L。
实施例2:
中药蜣螂乙醚提取物的制备取蜣螂虫的腹部部分，粉碎制成40目粉，用50倍体积的乙 醚-乙酸乙酯(体积比为l: 1)混合溶液于25。C提取3h，过滤，滤液减压挥去溶剂后获得蜣 螂乙醚提取物。
然后采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ganoderma lucidum)， 保藏号CCGMC 5.616。将其接种于装有300mL培养基的lL摇瓶中，在温度为30。C、转速为 130r/min条件下回转式发酵28h;补加蜣螂乙醚提取物370 mg/L后，在温度为28。C、转速为 160r/min条件下回转式发酵140h结束。发酵液离心后浓縮至原体积的3/5，加入4倍体积的工 业酒精除去多糖和蛋白质，取上清液旋转蒸发去水后，用40倍体积的正丁醇回流提取2小时 ，提取物挥去正丁醇后，再用氯仿于5(TC下振摇提取2小时，提取物挥去氯仿后，获得三萜 样品。三萜样品用甲醇溶解，先用大孔树脂柱(①2.5cmX50cm)吸附，采用4倍柱体积的甲 醇洗脱，流速l.O mL/min。再用硅胶柱(①1. 6cmX 50cm)进行分离，采用紫外检测器于255 nm处检测，2. 5倍柱体积的甲醇洗脱，流速O. 8mL/min。然后用碳18柱(①1. 6cmX50cm)， 采用2. 5倍柱体积的50%、 70%和90%的甲醇溶液进行梯度洗脱，流速0.6 mL/min。收集50%甲 醇溶液的洗脱组份；再换用碳18柱(cD1.6cmX60cm)，用3倍柱体积的30%、 40%和50%的甲 醇溶液洗脱，流速0.8mL/min。收集50%甲醇溶液的洗脱组份，挥去溶剂后，用氯仿溶解， 过滤去渣，滤液挥去氯仿后，得白色赤芝酮C产品，纯度为95. 17%，得率为2. 1 mg/L发酵液
灵芝发酵的培养基组成为玉米粉8g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨3g/L、豆饼粉3g/L、 KH2P04 1.5 g/L、 MgS04 0. 75 g/L。
实施例3:
中药蜣螂乙醚提取物的制备取蜣螂虫的腹部部分，粉碎制成60目粉，用50倍体积的乙 醚-乙酸乙酯(体积比为4:1)混合溶液于25。C提取1. 5h，过滤，滤液减压挥去溶剂后获得蜣螂乙醚提取物。
然后采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ganoderma lucidum)，保 藏号CCGMC 5.616。将其接种于装有300mL培养基的lL摇瓶中，在温度为26。C、转速为 170r/min条件下回转式发酵70h;补加蜣螂乙醚提取物320 mg/L后，在温度为28。C、转速为 150r/min条件下回转式发酵126h结束。发酵液离心后浓縮至原体积的3/5，加入4倍体积的工 业酒精除去多糖和蛋白质，取上清液旋转蒸发去水后，用40倍体积的正丁醇回流提取2小时 ，提取物挥去正丁醇后，再用氯仿于5(TC下振摇提取2小时，提取物挥去氯仿后，获得三萜 样品。三萜样品用甲醇溶解，先用大孔树脂柱(①2.5cmX50cm)吸附，采用3. 2倍柱体积的 甲醇洗脱，流速0.8 mL/min。再用硅胶柱(①1. 6cmX 50cm)进行分离，采用紫外检测器于 255nm处检测，3倍柱体积的甲醇洗脱，流速O. 7mL/min。然后用碳18柱(①1. 6cmX50cm)， 采用2.8倍柱体积的50%、 70%和90%的甲醇溶液进行梯度洗脱，流速O. 7mL/min。收集50%甲 醇溶液的洗脱组份；再换用碳18柱(cD1.6cmX60cm)，用2. 3倍柱体积的30%、 40%和50%的 甲醇溶液洗脱，流速0.6 mL/min。收集50%甲醇溶液的洗脱组份，挥去溶剂后，用氯仿溶解 ，过滤去渣，滤液挥去氯仿后，得白色赤芝酮C产品，纯度为92.53%，得率为2.2 mg/L发酵 液。
灵芝发酵的培养基组成为玉米粉8g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨3g/L、豆饼粉3g/L、 KH2P04 1.5 g/L、 MgS04 0. 75 g/L。
实施例4:
中药蜣螂乙醚提取物的制备取蜣螂虫的腹部部分，粉碎制成60目粉，用50倍体积的乙 醚-乙酸乙酯(体积比为85:15)混合溶液于25。C提取2. 5h，过滤，滤液减压挥去溶剂后获得 蜣螂乙醚提取物。
然后采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ganoderma lucidum)，保 藏号CCGMC 5.616。将其接种于装有300mL培养基的lL摇瓶中，在温度为30。C、转速为 170r/min条件下回转式发酵56h;补加蜣螂乙醚提取物185 mg/L后，在温度为27。C、转速为 140r/min条件下回转式发酵132h结束。发酵液离心后浓縮至原体积的3/5，加入4倍体积的工 业酒精除去多糖和蛋白质，取上清液旋转蒸发去水后，用40倍体积的正丁醇回流提取2小时 ，提取物挥去正丁醇后，再用氯仿于5(TC下振摇提取2小时，提取物挥去氯仿后，获得三萜 样品。三萜样品用甲醇溶解，先用大孔树脂柱(①2.5cmX50cm)吸附，采用3. 6倍柱体积的 甲醇洗脱，流速0.8 mL/min。再用硅胶柱(①1. 6cmX 50cm)进行分离，采用紫外检测器于255nm处检测，2. 6倍柱体积的甲醇洗脱，流速O. 8mL/min。然后用碳18柱(①1. 6cmX 50cm) ，采用3倍柱体积的50%、 70%和90%的甲醇溶液进行梯度洗脱，流速0.8mL/min。收集50%甲 醇溶液的洗脱组份；再换用碳18柱(①1.6cmX60cm)，用2. 5倍柱体积的30%、 40%和50%的 甲醇溶液洗脱，流速0.8mL/min。收集50%甲醇溶液的洗脱组份，挥去溶剂后，用氯仿溶解 ，过滤去渣，滤液挥去氯仿后，得白色赤芝酮C产品，纯度为95. 11%，得率为1.8mg/L发酵 液。
灵芝发酵的培养基组成为玉米粉8g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨3g/L、豆饼粉3g/L、 KH2P04 1.5 g/L、 MgS04 0. 75 g/L。
实施例5:
中药蜣螂乙醚提取物的制备取蜣螂虫的腹部部分，粉碎制成40目粉，用50倍体积的乙 醚-乙酸乙酯(体积比为65: 35)混合溶液于25。C提取1.8h，过滤，滤液减压挥去溶剂后获 得蜣螂乙醚提取物。
然后采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ganoderma lucidum)，保 藏号CCGMC 5.616。将其接种于装有300mL培养基的lL摇瓶中，在温度为29。C、转速为 160r/min条件下回转式发酵30h;补加蜣螂乙醚提取物215 mg/L后，在温度为28。C、转速为 140r/min条件下回转式发酵138h结束。发酵液离心后浓縮至原体积的3/5，加入4倍体积的工 业酒精除去多糖和蛋白质，取上清液旋转蒸发去水后，用40倍体积的正丁醇回流提取2小时 ，提取物挥去正丁醇后，再用氯仿于5(TC下振摇提取2小时，提取物挥去氯仿后，获得三萜 样品。三萜样品用甲醇溶解，先用大孔树脂柱(①2.5cmX50cm)吸附，采用3. 5倍柱体积的 甲醇洗脱，流速l.O mL/min。再用硅胶柱(①1. 6cmX 50cm)进行分离(采用紫外检测器， 255nm检测)，260%柱体积的甲醇洗脱，流速O. 8mL/min。然后用碳18柱(①1. 6cmX 50cm) ，采用3倍柱体积的50%、 70%和90%的甲醇溶液进行梯度洗脱，流速O. 7mL/min。收集50%甲 醇溶液的洗脱组份；再换用碳18柱(①1.6cmX60cm)，用2. 8倍柱体积的30%、 40%和50%的 甲醇溶液洗脱，流速0.8mL/min。收集50%甲醇溶液的洗脱组份，挥去溶剂后，用氯仿溶解 ，过滤去渣，滤液挥去氯仿后，得白色赤芝酮C产品，纯度为93. 19%，得率为2.6 mg/L发酵 液。
灵芝发酵的培养基组成为玉米粉8g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨3g/L、豆饼粉3g/L、 KH2P04 1.5 g/L、 MgS04 0. 75 g/L。
权利要求
1.一种从灵芝发酵液中制备三萜类物质赤芝酮C的方法，其特征在于，包括以下步骤1)蜣螂乙醚提取物的制备取蜣螂的腹部部分烘干、粉碎，用乙醚-乙酸乙酯混合溶液提取，滤液经旋转蒸发后获得蜣螂乙醚提取物；2)灵芝液体培养采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种，保藏号为CCGMC 5.616，将灵芝菌种接种于培养瓶中，在温度为26-30℃、转速为130-180r/min条件下回转式发酵25-80h；补加蜣螂乙醚提取物150-400mg/L后，在温度为25-30℃、转速为100-180r/min条件下回转式发酵72-144h结束；3)赤芝酮C的提取将发酵液离心后浓缩，加入工业酒精除去多糖和蛋白质，取上清液旋转蒸去水后，用正丁醇回流提取，挥去正丁醇后再用氯仿提取，挥去氯仿后获得赤芝酮C的粗提物；4)赤芝酮C的分离和纯化粗提物用甲醇溶解，先用大孔树脂柱分离，然后用硅胶柱分离，先后两次用碳18柱梯度洗脱，收集50％甲醇溶液的洗脱组份，挥去溶剂后用氯仿溶解，过滤去渣，滤液挥去氯仿后得白色赤芝酮C产品。
2.根据权利要求l所述的一种从灵芝发酵液中制备三萜类物质赤芝酮 C的方法，其特征在于，1)步骤中提取条件为将蜣螂粉碎成40-60目粉，用50倍体积的乙 醚-乙酸乙酯混合溶液于25。C提取l-3h。
3.根据权利要求l所述的一种从灵芝发酵液中制备三萜类物质赤芝酮C的方法，其特征在于，1)步骤中乙醚-乙酸乙酯混合溶液的乙醚与乙酸乙酯体积比为3:7-9:1。
4.根据权利要求l所述的一种从灵芝发酵液中制备三萜类物质赤芝酮 C的方法，其特征在于，2)步骤中液体培养基组成为玉米粉8g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨 3g/L、豆饼粉3g/L、 KH2P041. 5g/L、 MgS04 0. 75g/L。
5.根据权利要求l所述的一种从灵芝发酵液中制备三萜类物质赤芝酮 C的方法，其特征在于，3)步骤提取条件为将发酵液离心后浓縮至原体积的3/5，加入4倍 体积的工业酒精除去多糖和蛋白质，取上清液旋转蒸去水后，用40倍体积的正丁醇回流提取 2小时，挥去正丁醇后，再用氯仿于5(TC下振摇提取2小时，挥去氯仿后。
6.根据权利要求l所述的一种从灵芝发酵液中制备三萜类物质赤芝酮 C的方法，其特征在于，4)步骤中大孔树脂柱分离时采用3-4倍柱体积的甲醇洗脱，流速 0.6-1.0 mL/min;硅胶柱分离时采用2-3倍柱体积的甲醇洗脱，流速0.6-1.0 mL/min;第一 次采用碳18柱梯度洗脱时，用2-3倍柱体积的50%、 70%和90%的甲醇溶液，流速0.5-1.0 mL/min;第二次采用碳18柱梯度洗脱时，用2-3倍柱体积的30%、 40%和50%的甲醇溶液，流速 0.5-0.8 mL/min。
7.根据权利要求l所述的一种从灵芝发酵液中制备三萜类物质赤芝酮 C的方法，其特征在于，4)步骤中使用的大孔树脂柱规格为①2.5cmX50cm，硅胶柱规格为 ①1.6cmX50cm，第一次碳18柱规格为①1. 6 cmX50cm，第二次碳18柱规格为①1. 6 X 60cm。
全文摘要
本发明公开了一种从灵芝发酵液中制备三萜类物质赤芝酮C的方法，通过在灵芝发酵液中补加蜣螂的乙醚提取物150-400mg/L来促进赤芝酮C的形成，并进一步探索出灵芝发酵液中赤芝酮C的提取、分离和纯化技术，形成了一种能在灵芝发酵液中制备单一化合物赤芝酮C的简单、低成本的方法。本发明的发酵工艺简单、发酵时间较短，且原料来源不受时间、季节等限制，可实现规模化生产。
文档编号C12P33/00GK101613736SQ20091030517
公开日2009年12月30日 申请日期2009年8月4日 优先权日2009年8月4日
发明者刘高强, 王晓玲, 韩文军 申请人:中南林业科技大学