专利名称：：一种核酸快速释放试剂和方法
技术领域：
：本发明涉及一种核酸快速释放试剂和方法。
背景技术：
：目前，核酸提取方法主要经历了三个发展阶段液体方法_离心柱方法_磁珠法。液体方法提取核酸，因其需要氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂而基本废弃；离心柱方法是目前使用最广泛的，相对于液体方法，提取步骤简单；磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，相对于离心柱方法，提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化，不过产使用的系列试剂产品基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。
发明内容本发明的目的在于提供一种使用安全，操作简便，制造成本较低的核酸释放试剂和方法本发明之核酸释放试剂由0.010.5mM/L(与KC1水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50200mM/L的KC1(氯化钾)水溶液，O.01%2%(与无菌水的质量体积比)的SDS(十二烷基磺酸钠)、LLS(Lithiumlaurylsulfate,十二烷基硫酸锂)、或Chelex-100(Chelex树脂)，以及0.05%1%(体积)的乙醇组成。配制方法以无菌水、KC1配制50200mM/L的KC1溶液，加入表面活性肽，使表面活性肽浓度达到0.010.5mM/L，加入0.01%2%(质量体积比)的SDS、LLS或Chelex-100，加入0.05X1%(体积比)的乙醇，混匀，即配成本发明之核酸释放试剂。所述百分比以无菌水体积为计算基准。本发明之核酸释放方法是取所述核酸释放试剂，根据不同的实验目的，用无菌水进行当量稀释，待平衡至室温后，混匀、分装至待测样品管，再加入待处理样本，待处理样本与核酸释放剂可以是任何比例，较优选的体积比为待处理样本核酸释放剂=1:l3;用移液器反复吸打5-10次，核酸即得到有效地释放。本发明之核酸释放剂同时能抑制Dnase和Rnase活性，且不对后续实验产生影响。所述核酸包括DNA和RNA。本发明之核酸释放试剂采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热，无需离心，只需一个移液器，即可完成DNA、RNA的释放和提取。本发明之核酸释放方法，可快速释放血清、血浆、尿液、棉拭子、细菌、真菌、组织、植物、口腔细胞、PCR反应产物、法医学样品及环境样品中的核酸，释放的核酸可用于检测、克隆、序列分析、PCR扩增、分子杂交和cDNA合成等下游实验。与目前已有的核酸提取方法相比较，本发明无需加热，无需离心，操作格外简便，接近自动化的操作保证了实验结果稳定，避免人工操作引起的差异及错误，可广泛应用于病原微生物的检测，法医学鉴定，组织和血液分型，基因突变的检测等领域。图1(a)为本发明核酸释放试剂及核酸释放方法用于检测HBVDNA标准品的荧光定量PCR扩增曲线；图1(b)为本发明核酸释放试剂及核酸释放方法用于检测HBVDNA标准品所作标准曲线；图2为本发明核酸释放试剂及核酸释放方法用于重复性检测HCVRNA阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；图3为本发明核酸释放试剂及核酸释放方法用于检测沙眼衣原体(CT)阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线。具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1用于HBVDNA的荧光定量PCR检测实施例核酸释放试剂配制0.ImM/L的表面活性肽溶于80mM/LKC1无菌水溶液，加入0.1%(质量体积比)SDS、0.5X(体积)乙醇。所述百分比以无菌水体积为计算基准(下同)。HBVDNA的荧光定量PCR检测用带滤芯吸嘴吸取5微升所述核酸释放试剂、5微升待测样本(标准品、阴性、阳性对照，未知浓度的HBVDNA阳性的血清或血浆)，加入PCR反应管中，移液枪头吸打5次，混匀，静置约5min后，用带滤芯吸嘴吸取40微升已配好的PCR反应液，于StratageneMx3000P或ABI7300/7500系列PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。PCR反应各成分浓度及比例如下<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>PCR反应程序为步<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>如附图1(a)、(b)中检测了HBVDNA标准品A、B、C、D，浓度分别为4X107IU/ml、4X106IU/ml、4X105IU/ml、4X104IU/ml，以此标准品浓度做标准曲线，分析斜率为_3.31，一致性系数为0.9995。实施例2用于HCVRNA的荧光定量PCR检测核酸释放试剂配制0.05mM/L的表面活性肽溶于100mM/LKC1无菌水溶液，加入0.01%(质量体积比)LLS、0.05X(体积)乙醇。用带滤芯吸嘴吸取5微升所述核酸释放试剂，5微升待测样本(标准品、阴阳性对照，已知HCVRNA阳性的血清或血浆)，加入PCR反应管中，移液枪头吸打8次，混匀，静置约5min后，用带滤芯吸嘴吸取40微升已配好的PCR反应液，于StratageneMx3000P或ABI7300/7500系列PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。HCVPCR反应液由引物、探针、dNTPs、5XPCRbuffer、灭菌纯化水、ROX溶液、酶等组成。每人份HCVPCR反应液40ii1，单人份用量配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>采用本发明核酸释放试剂及核酸释放方法6次重复性检测浓度为1X104IU/ml阳性样本，从扩增曲线看，基线平整，一直是水平线；指数区较明显，平台区汇于一起，同一个样本6次检测ct值的变异系数<2%，浓度值变异系数<50%(参见附图2)。实施例3用于性病系列病原体DNA的荧光定量PCR检测核酸释放试剂配制按实施例1比例配好核酸释放试剂，与水以2:3的比例将核酸释放试剂进行稀释后使用。性病系列病原体DNA的荧光定量PCR检测用棉试子擦净尿道口，再用另一棉试子插入尿道内轻轻转动后取出，将试子置含0.5ml生理盐水的EP管搅拌、挤干后，弃拭子，用带滤芯吸嘴吸取上述含分泌物的样本5iU，加入到所述核酸释放试剂中，用移液枪头吸打10次，混匀，静置约5min后，用带滤芯吸嘴吸取40y1已配好的PCR反应液，于StratageneMx3000P或ABI7300PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。针对沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、淋球菌(NGH)和单纯疱疹病毒2型(HSV2)设计相应的引物探针序列，PCR反应各成分浓度及比例如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>应用本发明核酸释放试剂及核酸释放方法对沙眼衣原体DNA进行检测，原液浓度为5X108IU/ml，以生理盐水10倍梯度稀释至5X103IU/ml，同时以生理盐水做阴性对照，从扩增的曲线上看，基线平整，阴性对照(NTC)无模板，不产生引物二聚体，一直是水平线；指数区较明显，斜率大且固定；平台区汇于一起，线性范围广(参见附图3)。权利要求一种核酸释放试剂，其特征在于，由0.01～0.5mM/L(与KCl无菌水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50～200mM/L的KCl无菌水溶液，0.01％～2％(与无菌水的质量体积比)的SDS、LLS或Chelex-100，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成；所述百分比以无菌水体积为计算基准。2.种核酸释放方法，其特征在于，取权利要求1所述核酸释放试剂，根据不同的实验目的，用无菌水进行当量稀释，待平衡至室温后，混匀、分装至待测样品管，再加入待处理样本，用移液器反复吸打5-10次。3.根据权利要求2所述的核酸释放方法，其特征在于，待处理样本与核酸释放试剂的体积比为待处理样本核酸释放试剂=1:13。全文摘要一种核酸释放试剂及方法，该核酸释放试剂由0.01～0.5mM/L(与KCl无菌水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50～200mM/L的KCl无菌水溶液，0.01％～2％(与无菌水的质量体积比)的SDS、LLS或Chelex-100，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成；所述百分比以无菌水体积为计算基准。该核酸释放方法是取所述核酸释放试剂，根据不同的实验目的，用无菌水进行当量稀释，待平衡至室温后，混匀、分装至待测样品管，再加入待处理样本，用移液器反复吸打5-10次。本发明核酸释放试剂使用安全，制造成本较低；核酸释放方法操作简便。文档编号C12N15/10GK101712954SQ20091030998公开日2010年5月26日申请日期2009年11月19日优先权日2009年11月19日发明者戴立忠申请人:戴立忠