专利名称:骨髓毒性预测的制作方法
骨髓毒性预测本发明一般而言涉及毒理学领域。更具体地,本发明涉及预测骨髓毒性的方法以 及针对潜在骨髓毒性对化合物加以筛选的方法。在针对有效细胞毒性药物化合物的体内毒性研究期间,经常观察到骨髓消融,因 为骨髓祖细胞是高度增殖性的,并且对细胞周期阻滞、DNA损伤和凋亡敏感。骨髓毒性是主 要的关注点,特别是对于为非肿瘤学的适应症开发的药物而言,因为其可能导致中性白细 胞减少症、贫血和全身性免疫抑制。因此,在体内毒性研究期间消融骨髓的化合物通常不被 用于进一步开发,导致项目延迟以及相当大的经济支出。进行体内毒理学研究来测定骨髓消融是麻烦、费时、昂贵的,并且典型地,需要大 量化合物。测量特定祖干细胞群体的毒性和/或集落形成的体外测定法可用作体内毒性研 究的代替,但是这些方法需要进一步确认其是否能够概括体内研究观察到的复杂性和细微 差别。激酶是负责磷酸化底物以及传递细胞间和细胞内信号的酶。它们完成祖干细胞分 化中的整合作用以及造血祖干细胞中有丝分裂的启动、增殖和终止。激酶通常是药物研究 的靶标,因为很多信号级联过程在多种疾病中具有已知作用。小分子激酶抑制剂(SMKIs) 通常与激酶ATP结合口袋竞争性结合,阻断酶磷酸化底物的能力。由于激酶组(kinome)中 的ATP结合口袋的高度保守性,SMKIs除了对想要的靶标之外还经常抑制很多激酶,由此对 于这类化合物来说,脱靶激酶抑制相关的毒性为人关注。特别地,在临床或体内毒性研究中 观察到的骨髓毒性或消融是SMKIs的常见毒理倾向,因为负责细胞分化或增殖的激酶可被 抑制。我们现在发明了一种体外方法,用于预测哪些化合物将在体内骨髓毒性研究中显 示阳性(即,骨髓毒性)结果,其中使用的方法更迅速、使用更少量的试剂、更易于自动化并 且更廉价。本文公开内容中提到的所有出版物都通过引用整体并入本文。本发明提供了在体外毒性测定中快速测定骨髓毒性的方法,这通过检测化合物和 多种激酶之间的相互作用(激酶结合和/或抑制)来完成。因为激酶抑制和/或结合可快 速地使用自动化方法来测定,因此本发明的方法可以针对骨髓毒性(或缺乏骨髓毒性)高 通量筛选化合物。在一种优选的实施方案中,对激酶活性的抑制是通过测定所述化合物对所述激酶 的亲和性来测量的。实践中,可使用本领域已知的方法来测定结合和抑制。见,例如,通过 引用完全并入本文的 M. A.Fabian et al.,NatureBiotechnol (2005) 23 :329_36。通常,化 合物对给定激酶的结合亲和性与化合物抑制该激酶的活性的能力非常相关,因此结合亲和 性是抑制性活性的可靠替代。可通过本领域已知的多种方法来测定结合亲和性;例如通过 使用固定化的激酶(或者固定化的测试化合物,或固定化的竞争性配体,它们中任一种可 被标记)进行竞争性测定法。可通过标准方法固定化合物和激酶,例如通过生物素化以及 在包被链霉抗生物素蛋白的底物上捕获。因此,可制备具有例如多种固定化激酶的测试底物,优选地,包含本文鉴定的十九 种ANKKl (Seq Id. No. 1) ,AURKC (Seq Id. No. 2)、CLK4 (Seqld. No. 3)、IRAK3 (Seq Id. No. 4),JAKl (Seq Id. No. 5)、MARK2 (Seq Id. No. 6)、MUSK (Seq Id. No. 7)、MYLK2 (Seq Id. No. 8)、 RIPKl (Seq Id. No. 9)、STK17A (Seq Id. No. 10)、STK17B (Seq Id. No. 11)、SGKl 10 (Seq Id. No. 12)、TRKA (Seq Id. No. 13)、TRKC (Seq Id. No. 14)、ULKl (Seq Id. No. 15)、ULK2 (Seq Id. No. 16)、ZAP70 (Seq Id. No. 17)、TYK2 (Seq Id. No. 18)、R0CK2 (Seq Id. No. 19)。还可测试下述其它激酶化合物对这些其它激酶中的一种或多种的高亲和性 (除了对十九种鉴定的激酶中的大多数之外)与较高的骨髓毒性相关。所述其它激酶是: AMPKAl (Seq Id. No. 20)、CDK7 (Seq Id. No. 21)、IKKE (Seq Id. No. 22)、MLK2 (Seq Id. No. 23)、 MLK3 (Seq Id. No. 24)、MERTK (Seq Id. No. 25)、MLCK (Seq Id. No. 26)、PAK4 (Seq Id. No. 27)、 SLK (Seq Id. No. 28)、MST3 (Seq Id. No. 29)、STK33 (Seq Id. No. 30)、SYK (Seq Id. No. 31)、 TRKB (Seq Id. No. 32)、TSSKl (Seq Id. No. 33)、JAK2 (Seq Id. No. 34)。优选的激酶是序列表中给出的人激酶。但是,本方法中也可使用来自任何其它来 源的激酶。本发明的一种优选的实施方案包含用于预测化合物的体内骨髓毒性的方法,所 述方法包括提供测试化合物;以及测定所述化合物抑制一组预测性激酶的激酶活性的能 力,其中每种预测性激酶选自 ANKKl、AURKC、CLK4、IRAK3、JAKl、MARK2、MUSK、MYLK2、RIPK1、 R0CK2、STKl7A、STKl7B、SGKl 10、TRKA、TRKC、ULKl、ULK2、ZAP70 和 TYK2 构成的组;其中,将 至少八种预测性激酶的激酶活性抑制85%或更多表示所述化合物将展示出体内骨髓毒性。在另一优选的实施方案中,该组预测性激酶还包含AMPKA1、⑶K7、IKKE, MLK2、 MLK3、MERTK、MLCK, PAK4、SLK、MST3、STK33、SYK、TRKB, TSSKl 禾口 JAK2。在一种优选的实施方案中,所述方法的所述预测性激酶组包含MUSK。在另一优选 实施方案中,所述方法的所述预测性激酶组还包含TYK2和IRAK3。在另一优选的实施方案 中,所述方法的所述预测性激酶组还包含SgKllO和TRKC。在另一优选的实施方案中,所述 方法的所述预测性激酶组还包含ZAP70和R0CK2。在另一优选的实施方案中,所述方法的所 述预测性激酶组还包含MYLK2、TRKA、ULK1和CLK4。在另一优选的实施方案中,所述方法的 所述预测性激酶组还包含ANKK1。在另一优选的实施方案中,所述方法的所述预测性激酶组 还包含JAKl。激酶可被直接(即,通过吸附、共价键或生物素-抗生物素蛋白结合等),或者间 接(例如通过结合到配体上,该配体通过吸附、共价键、生物素-抗生物素蛋白或其它连接 与表面相连)固定到表面。然后可将激酶与测试化合物接触,测定亲和性(或酶抑制),例 如通过测量经标记化合物的结合或者经标记竞争物的失去来进行。针对包含该模型的激酶测量每种化合物的激酶亲和性。具有高的总活性(例如, 展示出对十九种激酶中的八种或更多种的高亲和性)的化合物具有高的骨髓毒性可能性 预测在体内测试系统中该化合物的骨髓毒性测试为阳性。具有针对鉴定的激酶中十六种或 更多种有高活性的化合物非常可能展示出骨髓毒性。具有低的总活性(例如,显示出对鉴 定的激酶的低亲和性,或者显示出仅对1-4种鉴定的激酶的高亲和性)被预测在毒性检验 中呈测试阳性。“高亲和性”在本文中使用时指在大约10 μ M时对激酶活性抑制至少大约 85%。在一种优选的实施方案中,以大约10 μ M的浓度对测试化合物加以测试。在本发明的一种优选的实施方案中,对至少十种预测性激酶抑制85%表明所述测 试化合物将展示出体内骨髓毒性。
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在本发明的一种优选的实施方案中,对至少十五种预测性激酶抑制85%表明所述 测试化合物将展示出体内骨髓毒性。在本发明的一种优选的实施方案中,对至少十八种预测性激酶抑制85%表明所述 测试化合物将展示出体内骨髓毒性。在本发明的一种优选的实施方案中,对至少十九种预测性激酶抑制85%表明所述 测试化合物将展示出体内骨髓毒性。本发明的另一方面是开发药物的方法,所述方法包括提供多种化合物;测定每 种化合物抑制一组预测性激酶的激酶活性的能力,其中每种预测性激酶选自ANKK1、AURKC、 CLK4、IRAK3、JAK1、MARK2、MUSK、MYLK2、RIPK1、R0CK2、STK17A、STK17B、SGK110、TRKA、TRKC、 ULKU ULK2、ZAP70和TYK2构成的组;排除掉展示出对阈值数量的预测性激酶的激酶活性 抑制大约85%或更高的每种化合物。在一种优选的实施方案中,用于开发药物的方法的预 测性激酶组还包含 AMPKAl、CDK7、IKKE, MLK2、MLK3、MERTK, MLCK, PAK4、SLK、MST3、STK33、 SYK、TRKB、TSSK1和JAK2。在一种优选的实施方案中,所述方法的预测性激酶的阈值数量为 十四。在另一优选的实施方案中,所述方法的预测性激酶的阈值数量为十六。在另一优选 的实施方案中,所述方法的预测性激酶的阈值数量为十八。在另一优选的实施方案中,所述 方法的预测性激酶的阈值数量为十九。在用于开发药物的方法的一种优选的实施方案中,对激酶活性的抑制是通过测 定所述化合物对所述预测性激酶的亲和性来测量的。本发明的另一方面是用于针对潜在 骨髓毒性对化合物加以测定的基底,其包含结合有一组预测性激酶的表面,所述激酶选 自 ANKKU AURKC, CLK4、IRAK3、JAK1、MARK2、MUSK、MYLK2、RIPKl、R0CK2、STK17A、STK17B、 SGKl 10、TRKA, TRKC, ULK1、ULK2、ZAP70 和 TYK2 构成的组。在另一实施方案中,用于对化合物加以测试的基底还包含固定到所述固相支持 体上的至少一种选自 AMPKA1、CDK7、IKKE、MLK2、MLK3、MERTK、MLCK、PAK4、SLK、MST3、STK33、 SYK、TRKB, TSSKl和JAK2构成的组的激酶。在本发明的测定中测试阳性的候选药物(即,被预测为在体内测定中展示骨髓毒 性的候选药物)通常被鉴定为“骨髓消融性”或“潜在骨髓消融性”,将从进一步开发中被排 除或去掉。在高通量筛选应用的情况下,此类化合物被标记为潜在骨髓消融性(例如在自 动化高通量系统的情况下,通过软件来管理系统),由此可以做出早期决定。因此,人们可使用本发明的方法,部分基于化合物骨髓毒性的可能性,来对用于药 物开发的候选化合物进行优先级排序和选择。例如,如果制备了对选择的靶标具有相似活 性的多种化合物(例如50种或更多),并且想要优先排序出或选择出所述化合物的子集用 于进一步开发的话,可以在本发明的方法中对整个化合物组加以测试,弃去或排除展示出 骨髓毒性阳性迹象的所有那些化合物。这通过早期鉴定重要的毒性来源,降低了药物开发 的成本以及为开发所选任何化合物的投资额。因为本发明的方法迅速并且易于自动化,可 对化合物进行大规模筛选,这原本是不可能或者不现实的。还可使用本发明的方法来鉴定环境污染物等,在这种情况下,典型地,鉴定此类化 合物用于对其毒性性质的进一步研究。在本发明的方法的这种应用中,可通过已知方法对 环境样品(例如怀疑被污染的土壤、水或空气)进行分级分离,并对所述级分应用本发明的 方法。然后可对展示出骨髓毒性迹象的级分进行进一步的分级分离,并且(使用本发明的方法),鉴定出起作用的毒性试剂。或者,可使用怀疑是环境污染物的纯的或经纯化的化合 物进行本发明的方法,以测定它们骨髓毒性的潜力。因为本发明的方法迅速并且易于自动 化,可对样品进行大规模筛选,这原本是不可能或者不现实的。定义除非另有指明,用于本申请(包括说明书和权利要求书)中的下述术语具有下文 给出的定义。除非上下文有明确指示,单数形式“一个/种”和“这个/种”(“a”、“an”和 “the”)也包括复数指代。术语“骨髓毒性”在本文中使用时指通过施用化学或生物试剂或与化学或生物试 剂接触导致的鸟或哺乳动物中的造血细胞系统的细胞过少,所述细胞包括B细胞、T细胞、 NK细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、巨核细胞、血小 板、红细胞或者任何其祖细胞。在大多数情况下,鸟或哺乳动物是小鼠、大鼠、小猎犬或用 于临床前安全性研究的非人灵长动物,但是也可以是人。“骨髓毒性的可能性”具体表示 以75%的置信度,将待测化合物预测为在体内骨髓测试中展示出骨髓毒性或者缺乏骨髓毒 性。术语“测试化合物”指将用来测试骨髓毒性的物质。测试化合物可以是候选药物 或先导化合物、化学中间产物、环境污染物、化合物的混合物等。术语“激酶”指能将磷酸基团连到蛋白或分子上和/或从蛋白或分子上去除磷酸 基团的酶。“抑制激酶活性”指化合物降低或干扰此类磷酸酶活性的能力。鉴于小分子针对 给定激酶的结合亲和性与所述分子抑制激酶活性的能力良好相关,因此本文中将结合亲和 性认为与激酶活性同义,高结合亲和性被认为与高激酶抑制性活性等同。
实施例为鉴定出指示测试化合物将展示骨髓毒性的激酶组,进行下述分析。首先,选择65 种合适的小分子激酶抑制剂(“SMKIs”)以形成训练组。接着,针对训练组中的每种化合 物,获得体内测试结果和针对322种激酶的单点抑制谱。然后进行统计学分析,以(1)使用 所述单点激酶抑制谱建立模型,以预测所述骨髓毒性结果,以及(2)鉴定与骨髓毒性结果 相关的激酶。针对训练组(N = 65)中的每种化合物,获得针对322种激酶的抑制谱和体内测定 结果。为测定结果获得两种不同的读数阴性(N = 40)和阳性(N = 25)。先在所有抑制 谱的组中进行预处理,除去无信息的或有偏倚的激酶。在65种化合物的组中不具有差异的 激酶被除去,因为它们不提供信息。进行特征选择(FS)和模式识别(PR),以建立模型。对于所有分析,使用交叉验证 来评估多种试验中的模型性能。每种试验随机将初始数据分入训练组和测试组;训练组被 用于建立临时模型,测试组被用于预测结果,然后对性能加以验证。使用特征选择方法来测 定哪些激酶或“特征”可能与骨髓毒性结果最相关。在每种试验中,针对所选的特征的抑制 值被用作为模式的输入。使用针对FSl的Q-值/Wilcox T-检验杂交算法(Storey JD.,“A directapproach to false discovery rates" (2002, J. Royal Stat. Soc. B,64 479-498) ;Storey JD et al. ,"Statistical significance for genome—wideexperiments,,(2003,Proc Natl AcadSci USA,100 :9440_45) ;Storey JD. ,“The positive false discovery rate :A Bayesian interpretation and theq-value,,(2003, Ann. Stat,31 :2013_35) ;Storey JD et al., "Strong control, conservative point estimation, and simultaneous conservative consistencyof false discovery rates :A unified approach,, (2004, J.Royal Stat. Soc. B, 66 187-205))和针对 PR 的支持向量机(Support Vector Machines) (T. Hastie et al. , "The Elements of Statistical Learning,,(2001, Springer-Verlag) ;R. 0. Duda et al. , "Pattern Classification,2nd Ed. " (2000, ffiley-Interscience)禾口 "Feature Extraction-Foundations andApplications,, (2006, Springer-Verlag, I.Guyon et al.Eds.))的组合。使用选择的方法组合,通过改变用作为ra输入的激酶的数目,来优化模型的性 能。当选择十九种激酶时,平均错误率最低。然后通过进行10个5倍交叉验证,对使用特征选择和模式识别方法的这种组合、 特征数量以及优化细调参数的模型的精确性加以评估。重要的是,在每个交叉验证倍数中, 进行特征选择和模式识别。得到的模型具有85% 士5%的精确度S卩,该模型平均来说,对 骨髓毒性结果进行正确预测的时间占85%。10个5倍交叉验证还被用于确定与骨髓毒性结果相关的激酶。激酶的选择基于 激酶在50种试验(10个5倍交叉验证)中被选择为显著的次数以及在15-25种特征间获 得合理错误率这一事实。前十九种经常被选择的激酶被选择以包括在最后的模型中。进行 若干轮测试后,发现针对这十九种激酶的激酶抑制谱在预测实际的骨髓毒性中是重要的。对于每种SMKI,模型由针对下述十九种激酶的单点激酶抑制谱构成ANKK1、 AURKC、CLK4、IRAK3、JAK1、MARK2、MUSK、MYLK2、RIPK1、R0CK2、STK17A、STK17B、SGK110、TRKA、 TRKC、ULKU ULK2、ZAP70、TYK2。此外,包括进在进行激酶筛选的浓度下获得的体内骨髓毒 性测定结果。虽然参照具体实施方案对本发明进行了描述,但是本领域技术人员应当理解,可 进行多种改变,代替多种等同方案,而不偏离本发明的真实精神和范围。此外,可进行很多 种修改以使得特定的情况、材料、物质组成、方法、方法步骤适应于本发明的客观精神和范 围。所有此类修改都意欲落入本文所附的权利要求的范围。本文中给出的所有专利和出版物都通过引用整体并入本文。
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权利要求
预测化合物的体内骨髓毒性的方法,所述方法包括a)提供测试化合物;b)测定所述化合物抑制一组预测性激酶的激酶活性的能力,其中每种预测性激酶选自ANKK1、AURKC、CLK4、IRAK3、JAK1、MARK2、MUSK、MYLK2、RIPK1、ROCK2、STK17A、STK17B、SGK110、TRKA、TRKC、ULK1、ULK2、ZAP70和TYK2构成的组;其中至少八种预测性激酶的激酶活性被抑制85%或以上表明所述化合物将展示出体内骨髓毒性。
2.权利要求1的方法,其中所述预测性激酶组还包含41^以1、^1(7、11(1^、1^1(2、1^1(3、 MERTK, MLCK, PAK4、SLK、MST3、STK33、SYK、TRKB, TSSKl 和 JAK2。
3.权利要求1-2中任意一项所述的方法,其中所述预测性激酶组包含MUSK。
4.权利要求1-3中任意一项所述的方法,其中所述预测性激酶组还包含TYK2和 IRAK3。
5.权利要求1-4中任意一项所述的方法,其中所述预测性激酶组还包含SgKllO和 TRKC0
6.权利要求1-5中任意一项所述的方法,其中所述预测性激酶组还包含ZAP70和 R0CK2。
7.权利要求1-6中任意一项所述的方法,其中所述预测性激酶组还包含MYLK2、TRKA、 ULKl 禾口 CLK4。
8.权利要求1-7中任意一项所述的方法,其中所述预测性激酶组还包含ANKKl。
9.权利要求1-8中任意一项所述的方法,其中所述预测性激酶组还包含JAKl。
10.权利要求1-9中任意一项所述的方法,其中在大约10μ M的浓度测试所述测试化合物。
11.权利要求1-10中任意一项所述的方法,其中至少十种预测性激酶的激酶活性被抑 制85%或以上表明所述化合物将展示出体内骨髓毒性。
12.权利要求1-11中任意一项所述的方法,其中至少十五种预测性激酶的激酶活性被 抑制85 %或以上表明所述化合物将展示出体内骨髓毒性。
13.权利要求1-12中任意一项所述的方法,其中至少十八种预测性激酶的激酶活性被 抑制85 %或以上表明所述化合物将展示出体内骨髓毒性。
14.权利要求1-13中任意一项所述的方法,其中十九种预测性激酶的激酶活性被抑制 85 %或以上表明所述化合物将展示出体内骨髓毒性。
15.权利要求1-14中任意一项所述的方法,其中激酶活性的抑制是通过测定所述化合 物对所述预测性激酶的亲和性来测量的。
16.开发药物的方法,所述方法包括a)提供多种化合物;b)测定每种化合物抑制一组预测性激酶的激酶活性的能力,其中每种预测性激酶选 自 ANKKU AURKC, CLK4、IRAK3、JAK1、MARK2、MUSK、MYLK2、RIPKl、R0CK2、STK17A、STK17B、 SGKl 10、TRKA、TRKC, ULK1、ULK2、ZAP70 和 TYK2 构成的组;禾口c)排除展示出对阈值数量的预测性激酶的激酶活性抑制大约85%或以上的每种化合物。
17.权利要求16的方法,其中所述预测性激酶组还包含AMPKA1、⑶K7、IKKE,MLK2、 MLK3、MERTK、MLCK, PAK4、SLK、MST3、STK33、SYK、TRKB, TSSKl 禾口 JAK2。
18.权利要求16-17中任意一项的方法,其中预测性激酶的所述阈值数量是十四。
19.权利要求16-18中任意一项的方法,其中预测性激酶的所述阈值数量是十六。
20.权利要求16-19中任意一项的方法,其中预测性激酶的所述阈值数量是十八。
21.权利要求16-20中任意一项的方法,其中预测性激酶的所述阈值数量是十九。
22.权利要求16-21中任意一项的方法,其中激酶活性的抑制是通过测定所述化合物 对所述预测性激酶的亲和性来测量的。
23.测试基底,其包含固相支持体;以及固定在所述固相支持体上的选自ANKK1、AURKC、CLK4、IRAK3、JAKU MARK2、MUSK、MYLK2、RIPKl、R0CK2、STK17A、STK17B、SGKl 10、TRKA、TRKC、ULK1、ULK2、ZAP70 和TYK2构成的组的至少一种激酶。
24.权利要求23的测试基底,其还包含固定到所述固相支持体上的选自AMPKA1、⑶K7、 IKKE、MLK2、MLK3、MERTK、MLCK、PAK4、SLK、MST3、STK33、SYK、TRKB、TSSKl 和 JAK2 构成的组 的至少一种激酶。
25.基本如前文所述,尤其是参照前述实施例的方法和测试基底。
全文摘要
通过化合物抑制来自选定组的至少八种激酶的能力,来预测化合物将在体内测定中展示出骨髓毒性的可能性。
文档编号C12Q1/48GK101952458SQ200980104763
公开日2011年1月19日 申请日期2009年2月6日 优先权日2008年2月14日
发明者A·J·奥拉哈斯基, D·M·戈尔茨坦, H·M·L·比特, H·乌帕尔, H·林, K·L·科拉雅 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司