专利名称：细胞培养方法及筛选方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养方法及筛选方法。
背景技术：
将从组织中分离的细胞用于试验、检查的技术是在生物技术相关领域不可或缺的 方法。广泛应用于疾病、病状的诊断，新药的开发及药效的判定，或是动物检查、植物检查、 环境污染物质的试验等。因此，生物技术区域中使用的细胞种类极其多样化。分离的细胞有直接以悬浮状态应用于试验的情况，但多数情况下，在使细胞附着 于培养皿的状态下进行培养而用于各种试验、检查中。细胞培养中使用的原代细胞、细胞 系，要求能够和在生物体内进行的试验即所谓的体内试验显示出相同的药物敏感性、毒性 反应等。即，在细胞培养容器上必须具有和在生物体内类似的细胞机能。此外，因为得到原 代细胞的分离操作繁杂，细胞培养试验中使用的细胞培养株价格昂贵，故期望用少数细胞 即可进行的试验方法。近年来，新药开发中出现了在临床试验阶段的开发中断的问题。这是因为药物代 谢试验阶段中动物种群差异的结果。到目前为止，临床前阶段中进行的药物代谢试验使用 大鼠、狗、猴等动物，来预测药物的体内代谢。但是，在对人进行的临床试验中，其预测在事 实上并不成立。因此，在进行对人的药物代谢等的预测上，使用人试验材料是最有效且简便 的方法，以其高效的医药品开发和安全的临床试验的实施而重要。考察药物在体内的代谢的药物代谢试验，主要在肝脏内进行吸收、代谢和排泄，使 用的人试验材料包括肝脏切片、肝细胞、肝微粒体等。其中肝脏切片获取困难，肝微粒体仅 能在限定了代谢酶的代谢试验中使用。因此，使用肝细胞是最有效的。在筛选中，使用的培养皿为树脂制皿和6孔、12孔、48孔、96孔的各种培养板。其 中，一般情况下，全部培养板的大小基本相同，孔数越多，1孔的大小就越小。此1孔相当于 1个培养皿。此外，因为最近有向微量化发展的趋势，故更小孔径的多个培养皿组成的384 孔培养板也开始使用，使用与作为目的的筛选方法相适应的培养板。这些培养皿的底部为 平坦的平板状，将此底面作为培养面来使用。但是，若在组织细胞的培养中使用现有的培养容器，会出现使其原来的机能消失 而去分化的情况、未分化细胞不分化的情况，产生不能发挥目的细胞的机能的问题。例如， 人新鲜肝细胞在通常的平板培养板上培养和分离时的代谢酶的机能在1日范围内会显著 下降，故向培养板上接种细胞后在4小时内应进行药物代谢试验。即，存在进行长时间的培 养时不能用于试验的问题，以及不能研究长时间的代谢稳定性的问题。为解决上述问题，进行了将人或动物来源的生物体物质(糖蛋白质、蛋白质等)对 培养容器表面进行包覆的尝试(参考专利文献1)、在高分子凝胶中培养的尝试(参考专利 文献2)和在微量容器中形成肝细胞块的尝试(参考专利文献3)。专利文献1 日本特开平第8-319317号公报专利文献2 日本特开平第8-308562号公报
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专利文献3 国际公开第2008/130025号
发明内容
发明所要解决的课题但是，在专利文献1公开的方法中，会出现因包覆的生物体物质特殊而导致的高 成本，培养容器内均一的细胞集合体的形成困难，不能长时间维持生物体内机能等的问题。 专利文献2公开的方法中，会出现不能控制细胞集合体的大小、难于进行显微镜观察、作为 筛选基板的操作性繁杂等问题。此外，上述的两种方法，均将市售的培养皿和培养板作为支 撑容器来使用，故难于在必要最小细胞数下进行有效的筛选。专利文献3公开的方法中，培 养初期的肝细胞代谢活性有升高的可能，但在2周以上难于维持代谢活性。本发明的目的在于提供可以长时间维持生物体内机能且可以以必要最小细胞数 来培养的细胞培养方法。解决课题的手段本发明的细胞培养方法，是通过在经分隔的微小空间内，以多层化的状态培养未 分化细胞，得到分化细胞的方法。其中，所谓多层化是指产生2层以上的细胞层积。在对医 药品进行筛选的情况下，优选向肝细胞、肠上皮细胞、神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞分 化的未分化细胞。尤其是在进行对人的药物代谢等预测的情况下，未分化细胞优选人细胞。 前述未分化细胞优选肝细胞、前体细胞等。此外，尤其优选前述经分隔的微小空间是表面具有多个微容器的细胞培养容器中 的该微容器。其中，优选前述微容器的底面积为为9X10_4mm2 9 X 10_2mm2，侧壁的高度为 15 y m 300 y m,侧壁的宽度为3 y m 15 y m。且为了易于进行显微镜观察，优选前述细胞 培养容器中形成有微容器的区域具有透明性。本发明的筛选方法是配置多个用上述培养方法培养的细胞从而筛选化合物的方 法。此外，为了以必要最小细胞数目培养，故前述细胞培养容器优选具有多个含有多个前述 微容器的经分隔化的部位的容器。发明效果依照本发明，可以提供可均一地长时间维持生物体内机能且可在必要最小细胞数 下培养的细胞培养方法。附图简述[
图1]显示用实施例1的细胞培养方法的细胞培养容器的构成的平面图。[图2]显示用实施例1的细胞培养方法的细胞培养容器的构成的截面图。[图3]显示用实施方式的筛选方法的细胞培养容器的构成的平面图。[图4]显示用实施方式的筛选方法的细胞培养容器的构成的截面图。符号说明10细胞培养部11微容器12微容器的侧壁13 部位14部位的侧壁
发明的最佳实施方式在本发明中，将肝干细胞等未分化的细胞在作为经分隔的微小空间的微容器内， 以多层化状态培养成均一的大小。本发明中尤其重要之处为使用具有增殖能力的未分化细 胞、在经分隔的微小空间内进行培养以及多层化培养。由此，例如可以形成含有分化的肝实 质细胞的细胞块而谋求机能的提高。此外，因为肝干细胞为未分化增殖，故可以维持细胞机 能。本发明为这样的培养方法以及使用了此方法的筛选方法。在本发明的培养方法及筛选方法中使用的培养容器的表面，形成了凹凸板型 (pattern 〃夕一 > )，即多个微容器，即培养空间。通过使分隔此微容器的侧壁(凸部)的 宽度及高度最适合化，可以仅在微容器内培养细胞，维持均一的分化状态。需要说明的是， 也可考虑形成由凝胶构成的经分隔的培养空间以代替微容器。由侧壁围绕成的微容器的尺度必须为用于细胞培养的最适范围。如微容器的底面 面积过大，则和在平板上培养一样，部分的细胞薄薄地延伸，并不形成均一的多层化状态。 另一方面，如微容器的底面面积过小，则不能容纳细胞。故，根据培养细胞的种类不同，空间 的尺度优选可容纳多个 数十个的范围。此外，微容器的侧壁也必须选择为用于细胞培养的最适范围。如侧壁的宽度太宽， 在侧壁上面的细胞相连接，不适于培养。如侧壁的宽度太窄，则制备变困难。如侧壁的高度 太低，细胞会越过侧壁，不适于培养。如侧壁的高度太高，则不仅制备困难，且物质难于扩 散，培养环境恶化。以下对本发明的实施方式进行说明。但本发明并不仅限于以下的实施方式。此外， 为了明确说明，对以下的记载和图进行了适当的简化。实施方式使用图1、2对实施方式中用于细胞培养的细胞培养部的微容器的构成进行说明。 图1是显示本实施方式的微容器的构成的平面图，图2是图1的II-II截面图。如图1所 示，细胞培养部10包括微容器11、侧壁12。细胞培养部10的培养面中，网目状地形成多个 侧壁12，由侧壁12包围住四面的空间为微容器11。图1中，微容器11的底面的宽度用a表示，用于分隔微容器11的侧壁12的宽度 用b表示，高度用c表示。其中，必须使3iim彡b彡15iim，且c/b彡2。如侧壁12的宽度 b超过15 y m,则在侧壁上面的细胞相连接，不适于培养。另一方面，如侧壁12的宽度不足 3ym，则制备困难。如侧壁的高度过低，则细胞越过侧壁，不适于培养。如侧壁12的高度c 不足侧壁12的宽度b的2倍，则微容器11中培养的细胞会溢出而移动到邻接的微容器11 中。此外，具体而言，在1边为100 ym的四边形的微容器内要使人胚肝细胞多层化时，优选 侧壁12的高度c为1511111 30011111，更优选5011111 15011111。其中，如侧壁的高度c过高， 则不仅制备困难，且物质难于扩散，培养环境恶化。侧壁12可以为多阶梯形状。对于微容器11的底面形状并无特别的限制，除了正方形、圆形、多边形以外，还可 以采用各种形状。此底面面积优选9X10_4mm2 9X10_2mm2。此外，优选各向同性的形状， 在底面为矩形的情况下，优选长边为短边的1 1. 5倍。为了使必要的细胞数最小，如图3及4所示，本发明中使用的细胞培养部具有仅包 含1次筛选中必要的多个微容器的分隔部位即可。例如，在使用分化效率高的1边200i!m 的正方形且高度50 y m的微容器而筛选中必要的最小细胞数目为约1000个的情况下，需要9个微容器，因此设置分隔化有9个微容器的部位，此外，通过设置多个部位以使得可同时 检测多个样品和医药品的高通量筛选成为可能。其中，图3是显示本实施方式的其它的细胞培养部的构成的平面图，图4是图3的 IV-IV截面图。图3中，显示将多个微容器分隔化的侧壁14及经分隔化的部位13。侧壁14 的高度d只要能保持培养液和反应液等上清液不干燥的容量即可，适当地设定即可。作为本发明的细胞培养部的凹凸板型的生产方法，并无特殊限定，可列举例如使 用模具的转印成型，3维光成型，精密机械切削、湿法刻蚀、干法刻蚀、激光加工、放电加工等 方法。考虑到细胞培养容器的用途、所要求的加工精度、成本等，优选从这些生产方法中适 当地选择。作为使用模具的转印成型方法的具体实例，可列举以金属构造体为模型的树脂成 型来形成凹凸板型的方法。此方法可以高转印率地用金属构造体的形状在树脂上再现凹凸 板型，此外由于通过使用通用的树脂材料可以降低材料成本，因而优选。这样的使用金属构 造体的模型的方法，具有成本低，能满足高尺度精度的优点。作为上述金属构造体的生产方法，可列举例如对使用光刻制备的抗蚀板型或使用 3维光成型制备的树脂板型的电镀处理、精密机械切削、湿法刻蚀、干法刻蚀、激光加工、放 电加工等。考虑用途、要求的加工精度、成本等而进行适当选择。作为将上述得到的金属构造体作为模型使用而使树脂成形为凹凸板型的方法，可 列举例如通过注射成型、冲压成型、单体浇铸成型、溶剂浇铸成型、热压印成型、挤出成型来 轧制转印等的方法。从生产性及模型转印性的观点来看，优选采用注射成型。作为构成本发明的筛选芯片的材料，只要具有自支撑性即可，并无特殊规定。可列 举例如合成树脂、硅、玻璃等。从成本方面和显微镜观察的细胞辨识性的观点来看，优选透 明的合成树脂作为材料。作为透明的合成树脂，可列举例如聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯 共聚物等丙烯酸类树脂，聚苯乙烯等苯乙烯类树脂，环烯烃等烯烃类树脂，聚对苯二甲酸乙 二酯、聚乳酸等酯类树脂，聚二甲基硅氧烷等硅类树脂，聚碳酸酯等。这样的树脂中，可以在 不损害透明性的范围内含有着色剂、扩散剂、增稠剂等各种添加剂。本发明的筛选芯片以提高表面的亲水性、生物体适应性、细胞亲和性等为目的，也 可对凹凸板型的表面一侧进行表面处理，配置成改性层及/或包覆层。作为设置上述改性层的方法，只要不是失去自支撑性的方法和引起lOOym以上 的极端表面粗糙的方法即可，并无特殊规定。可列举例如药品处理、溶剂处理、通过表面接 枝聚合的接枝聚合物的引入等化学处理，电晕放电、臭氧处理、等离子体处理等物理处理方 法。此外，作为设置包覆层的方法，并无特别规定，可列举例如溅射、蒸镀等干法包覆 法，无机材料包覆、聚合物包覆等湿法包覆法等方法。为了不混入气泡地注入培养液而希望在凹凸板型上赋予亲水性，作为形成均一的 亲水性膜的方法，优选无机蒸镀法。此外，考虑细胞亲和性的情况下，更优选包覆例如胶原、纤维连接蛋白等细胞亲和 性蛋白质。为了均一地包覆胶原水溶液等，优选在形成上述的亲水性膜后包覆。通常情况 下，在细胞培养中，由于优选模仿生物体内环境在细胞外基质表面的培养，尤其优选在配置
6上述那样的均一的亲水性无机膜后，配置含有适合培养细胞的细胞外基质的有机膜。用本发明的培养方法及筛选方法培养的细胞优选未分化细胞，可列举肝干细胞、 肝前体细胞、肠干细胞、肠上皮前体细胞、间质系干细胞、心肌前体细胞、胚胎干细胞等，依 照筛选目的，适宜地选择细胞种类即可。例如，以假想医药品在肝脏中的代谢反应的筛选为 目的的情况下，使用向肝细胞分化的肝干细胞等。尤其是在以人体内的医药品的代谢反应 为目的的情况下使用人肝干细胞。本发明的筛选方法，仅在培养细胞的微容器内配置细胞，为使细胞在此空间内 发挥类似于在生物体内的机能，必须接种适当的细胞数。细胞接种密度优选1.0X104 5.0X106细胞/cm2。例如在微容器为正方形，1边为100 iim的情况下，优选1X104 1.0X105 细胞/cm2。在多层化的细胞为肝细胞或肠上皮细胞的情况下，优选测定基因表达量、代谢酶 活性、转运体活性等来进行筛选。此外，在多层化的细胞为神经细胞或心肌细胞的情况下，优选测定基因表达量、酶 活性活动电位等来进行筛选。在多层化的细胞为血管内皮细胞的情况下，优选目视观察血管新生的筛选方法。 实施例下面使用实施例对本发明的细胞培养方法进行说明，但是本发明并不限于这些实 施例。〈胚肝细胞的培养方法〉将人胚肝细胞的冷冻原液接种于IV型胶原包覆培养皿(BD生产)上，培养约10日 后，使其增殖。随后，在0.03% IV型胶原(新田7千 > 生产)包覆的凹凸板型基材上，以 1个微容器中加入5个细胞的比例(3.8X104细胞/cm2)接种肝细胞，于5% C02、37°C下培 养3周。使用的培养液的组成为加入了 10%胎牛血清、lyg/ml胰岛素、1X10_7M地塞米松、 10mM烟酰胺、2mM L-谷氨酰胺、50 y M 0 -巯基乙醇、5mM HEPES、59 y g/ml青霉素、100 y g/ ml链霉素的DMEM/F12培养基，从接种后第1日开始，在上述培养液中再加入25ng/ml HGF、 20ng/ml EGF、10ng/ml制瘤素M来使用。使用同样组成的新鲜培养基0. 5mL，每数日更换培 养基。<基因表达解析>作为肝脏代表的药物代谢酶的细胞色素P450 (CYP)的基因表达，通过从培养规定 日数后的细胞中回收RNA，cDNA合成后进行实时PCR来进行评价。实施例1作为图1所示的凹凸板型形状，通过光刻制备a = lOOum.b = lOum.c = 50um 的板型，进行Ni电解电镀，得到具有对应凹凸形状的金属模具。使用此金属模具，通过热压 印成型法在聚苯乙烯上进行板型转印，生产出前述尺度的树脂基材。通过在此树脂基材表 面进行真空蒸镀，形成lOOnm的二氧化硅膜，进行Y射线灭菌，得到凹凸板型基材。在此凹 凸基材上包覆IV型胶原后，培养人胚肝细胞。比较例1使用市售(Becton Dickinson生产、Falcon(注册商标))的经Y射线灭菌的平板状24孔培养板，用IV型胶原包覆后，培养人胚肝细胞。表1显示了实施例1及比较例1中培养3周后的CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9的基因 表达量。表中，比较例1的3周后的各CYP表达量以1来表示。在实施例1中，和比较例相 比，任一种CYP的表达量均升高，在3周的培养中也维持其机能。[表 1]
权利要求
细胞培养方法，其中，在经分隔的微小空间内，以多层化的状态培养未分化细胞，得到分化细胞。
2.权利要求1的细胞培养方法，其特征在于，前述未分化细胞为向肝实质细胞、肠上皮 细胞、神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞分化的未分化细胞的任一种。
3.权利要求1或2的细胞培养方法，其特征在于，前述未分化细胞为人细胞。
4.权利要求1 3中任一项的细胞培养方法，其特征在于，前述经分隔的微小空间是表 面具有多个微容器的细胞培养容器中的该微容器。
5.权利要求4的细胞培养方法，其特征在于，前述微容器的底面积为9X10_4mm2 9Xl(T2mm2，侧壁的高度为15 μ m 300 μ m，侧壁的宽度为3 μ m 15 μ m。
6.权利要求4或5的细胞培养方法，其特征在于，前述细胞培养容器中形成有微容器的 区域具有透明性。
7.筛选方法，其中，配置多个使用权利要求1 6中任一项的培养方法培养的细胞，对 化合物进行筛选。
8.筛选方法，其中，配置多个使用权利要求4 6中任一项的培养方法培养的细胞，对 化合物进行筛选，其特征在于，前述细胞培养容器具有多个含有多个前述微容器的经分隔 化的部位。
全文摘要
本发明的目的在于提供可以长时间维持生物体内机能且可以以必要最小细胞数来培养的细胞培养方法。本发明的细胞培养方法为通过在经分隔的微小空间内，以多层化的状态培养未分化细胞，而得到分化细胞的方法。在对医药品进行筛选的情况下，优选分化为肝细胞、肠上皮细胞、神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞的未分化细胞。尤其是在进行对人的药物代谢等预测的情况下，优选人细胞。
文档编号C12Q1/02GK101939416SQ20098010501
公开日2011年1月5日 申请日期2009年2月5日 优先权日2008年2月6日
发明者小坂知子, 田崎刚, 福田始弘, 谷口英树, 郑允文, 鹤田仁志 申请人:公立大学法人横浜市立大学;可乐丽股份有限公司