专利名称：用于植物害虫控制的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于植物中害虫或病原体控制的方法和组合物。更具体地，公开了包 含重组DNA的转基因植物细胞、植物和种子，以及制备和使用这些与害虫抗性有关的植物 细胞、植物和种子的方法。2.相关技术说明植物和动物是许多线虫害虫的感染目标。因此，希望有保护植物免遭线虫感染的 改良方法，因为这样的方法将提高食品生产的产量和稳定性。存在大量的植物寄生线虫种，包括各种胞囊线虫(例如异皮线虫属(Heterodera) 的种)、根结线虫(例如根结线虫属(Meloidogyne)的种)、根腐线虫(例如短体线虫属 (Pratylenchus)的种)、剑线虫(例如剑线虫属(Xiphinema)的种)以及茎和鳞茎线虫(例 如茎线虫属(Ditylenchus)的种)等。垫刃线虫(垫刃目(Tylenchida)的成员)，包括异皮 科(Heteroderidae)、根结科(Meloidogynidae)和短体科(Pratylenchidae)，是最大的和 在经济上最重要的植物寄生线虫类别。其它重要的植物寄生线虫包括矛线目(Dorylaimid) 线虫(例如剑线虫属(Xiphinema)的种)等。线虫种通过一系列的生命周期阶段和蜕皮 生长。一般而言，有5个阶段和4次蜕皮卵阶段；Jl (即，第一幼虫阶段)；Ml (即，第一蜕 皮)；J2(第二幼虫阶段；有时从卵孵化)"2;3;10;抖;114乂(成年)。幼年(“J”)阶 段有时也被称为幼虫(“L”)阶段。基因表达可能对于一个或多个生命周期阶段是特异性 的。线虫已经进化成为非常成功的植物和动物的寄生虫，并且导致农业和家畜的显著的经 济损失，以及人类的发病率和死亡率。植物的线虫寄生虫可以寄居于植物的所有部分，包 括根、开放的花蕾、叶和茎。植物寄生虫根据食性被大体分类为迁移外寄生物(migratory ectoparasites)、迁移内寄生物(migratory endoparasites)禾口栖息内寄生物(sedentary endoparasites)。栖息内寄生物，包括根结线虫(根结线虫属(Meloidogyne)的种，RKN)、 胞囊线虫(球胞囊线虫属(Globodera)和异皮线虫属(Heterodera)的种)和肾形线虫属 (Rotylenchulus)的种)，诱导取食部位，并且在根内建立长期感染，这对作物通常具有非 常大的损伤。线虫感染是农业上重要的许多作物耕种中的一个重要问题。例如，大豆胞囊 线虫(Heterodera glycines, SCN)被认为引起大豆产量损失，据估计北美每年损失超过10 亿美元。这种损伤是胞囊线虫引起的大豆植物矮缩的结果。矮缩植物具有较小的根系，在其叶中显示矿物质缺乏的症状，并且容易枯萎。据估计寄生线虫在全世界每年导致园艺和 农业损失超过780亿美元，基于估计的全部主要作物的平均12%的年损失。控制植物病害的传统方法是采用化学处理和构建抗性作物与其野生型亲属之间 的种间杂种作为抗性种质的来源。化学线虫控制剂在消灭线虫侵扰方面无效。由于缺乏选 择性，化学线虫控制剂也对非目标动物群发挥作用，通常在应用线虫控制剂后的一段时间 里有效地使田地贫瘠化。已知杀线虫剂如涕灭威及其环境分解产物对哺乳动物有很高的毒 性。因此，政府对这些化学品的使用进行限制。最广泛使用的杀线虫剂，甲基溴，按计划将 很快退出使用，目前，还没有有前途的候选物来代替这种处理。利用植物生物技术的方法已经提供了有效的控制昆虫侵扰的手段，例如，通过昆 虫控制剂的植物表达。据报道生物技术相关的线虫控制剂通常是植物表达的核苷酸，当被 线虫摄入时对目标线虫选择性地具有毒性。但是，几乎没有利用生物技术方法有效控制线 虫感染的例子。
发明内容
一方面，本发明提供作为植物线虫控制剂有效的试剂。在一个实施方案中，有效的 化合物是以前不知其对植物寄生线虫有毒的甲基酮类(methylketones)。另外，本发明人发 展了在线虫感染的植物根部表达甲基酮类如2-十一烷酮、2-十三烷酮和2-十五烷酮以降 低或抑制线虫生长、发育或线虫感染引起的植物病害的组合物和方法。在具体的实施方案 中，该方法包括产生含有一个或多个转基因的转基因植物，所述转基因允许在对线虫感染 敏感的植物组织中产生2-十一烷酮、2-十三烷酮和/或2-十五烷酮。另一方面，本发明提供构建和使用包含甲基酮合酶编码区的转基因表达盒以及在 植物细胞中，特别是在植物的根细胞中表达该合酶的方法。本发明提供包含转基因的转基 因植物，其中转基因植物的根产生甲基酮。在特定实施方案中，甲基酮合酶转基因还包含序 列区，该序列区包含与甲基酮合酶编码区可操作连接的异源质体转运肽分子。“异源”是指 给定序列相对于任何其它参考序列不在其天然环境中。因此，当两个序列可以从同一物种 中分离时，一个序列相对于第二个可操作连接的序列可能是异源的，将不是它们的天然方 向。因此，与给定甲基酮合酶编码区可操作连接的异源转运肽不是在自然界中通常以与甲 基酮合酶编码区可操作连接的未修饰状态发现的转运肽。在本发明的另一方面，提供了包含SEQ ID NO :1或2的修饰的DNA编码序列，其编 码SEQ ID NO :3的甲基酮合酶；提供了编码SEQ ID NO :5的甲基酮合酶的SEQ ID NO 4 ； 并且提供了编码SEQID NO :7的甲基酮合酶的SEQ ID NO :6。在某些实施方案中，编码具有 甲基酮合酶活性的多肽的DNA编码序列与所述SEQ ID NO中的任一个或多个具有至少大约 80%、85%、90%、95%、98%或99%的百分序列同一性。在本发明的再另一方面，提供了一种异源融合蛋白，该异源融合蛋白包含质体转 运肽分子(如SEQ ID NO :9或11)和具有甲基酮合酶活性的甲基酮合酶分子(如SEQ ID NO :13、15、17、19、21、23、25 或 27)或甲基酮合酶分子变体(如 SEQ ID NO :29、31、33、35、37 或39)，或与所述SEQ ID NO中的任一个或多个具有至少大约80%、85%、90%、95%、98% 或99%的百分序列同一性的甲基酮合酶分子。在本发明的再另一方面，提供了包含异源酰基载体蛋白编码区的转基因表达盒，该酰基载体蛋白编码区编码酰基载体蛋白(如SEQ IDN0:41、43、45、47、49、51、53、55或 57)，在植物组织中与包含甲基酮合酶编码区的转基因一起表达。在本发明的再另一方面，提供了包含与甲基酮合酶编码区可操作连接的异源质体 转运肽分子的转基因种子。该转基因种子还可以包含转基因表达盒，该转基因表达盒包含 异源酰基载体蛋白编码区。本发明的其它方面特别涉及转基因植物细胞，包含多种植物细胞、核和细胞器的 转基因植物，和来自这些植物的后代转基因种子、胚、胚珠和转基因花粉。植物细胞及其部 分选自用异源甲基酮合酶编码区转化的转基因植物细胞群体，并且还可包含异源酰基载体 蛋白编码区，与不含异源编码区的细胞相比，是通过从包含异源编码区的任何群体中选择 转基因植物细胞。本发明也提供了生产非天然转基因种子的方法，该转基因种子可以用来生产具有 害虫抗性的转基因植物作物，该害虫抗性是由于异源甲基酮合酶编码区的表达，在某些实 施方案中，是由于异源酰基载体蛋白编码区在构成转基因植物的植物细胞的核或细胞器或 细胞质中的共表达。本发明的各个方面特别可用于具有线虫抗性活性的转基因植物，包括 但不限于谷类，包括玉米、小麦、大麦、黑麦和水稻；蔬菜；番茄；马铃薯；苜蓿；豆类，包括 菜豆、大豆、豌豆和紫花苜蓿；甘蔗；甜菜；烟草；棉花；油菜籽(油菜(canola))；向日葵； 红花；和高粱。本发明提供在其基因组内包含异源甲基酮合酶编码区并且还可包含异源酰基载 体蛋白编码区的转基因大豆植物，其中所述植物对线虫感染具有抗性，或者显示减轻的由 线虫感染引起的病害症状。本发明进一步提供提高线虫耐受作物的产量的方法。该方法包括在线虫的存在下 培育包含异源甲基酮合酶编码区的作物，该作物还可包含异源酰基载体蛋白编码区。本发明的另一方面提供一种生产杂种种子的方法，包括从线虫耐受植物获得杂种 种子，该植物也具有稳定整合的编码甲基酮合酶的异源核苷酸序列，并且还可整合有编码 酰基载体蛋白的异源核苷酸序列。该方法进一步包括从由杂种种子长成的植物产生作物， 其中由所述杂种种子产生的植物的一部分对于异源甲基酮合酶编码序列和(如果存在的 话)异源酰基载体蛋白编码序列而言是纯合的，由所述杂种种子产生的植物的一部分对于 异源甲基酮合酶编码序列和(如果存在的话)异源酰基载体蛋白编码序列而言是半合子， 由所述杂种产生的植物的一部分没有异源甲基酮合酶编码序列或异源酰基载体蛋白编码 序列；选择纯合的和半合子的植物；从选择的植物收集种子，并种植所述种子，以产生进一 步的后代植物；从这些后代植物开始重复选择和收集步骤至少一次，以产生近交系；并且 使该近交系与第二株系杂交，以产生杂种种子。本发明的植物选自但不限于玉米、大豆、棉 花、油菜(芸苔)、小麦、向日葵、高粱、苜蓿、大麦、粟、水稻、烟草、番茄、马铃薯、水果和蔬菜 作物、草皮草、甘蔗、甜菜和红花。在本发明的另一方面，涉及对农业上重要的寄居于土壤的昆虫的控制，所述昆虫 包括但不限于玉米根虫属(Diabrotica)、非耳象属(Diapr印es)、桔根象属(Pachnaeus)、 短喙象属(Asynonychus)、厉眼蕈蚊属(Lycoriella)、蕈蚊属(Sciara)、Stenophlus 和迟眼 蕈蚊属(Bradysia)等。也涉及更广泛的杀螨、杀虫和驱虫性质。发明详述
本发明涉及用于植物的害虫控制，特别是线虫控制的方法和组合物。一方面，本 发明涉及控制、预防或处理转基因植物中的线虫感染。在一个实施方案中，该方法包括产 生含有重组构建体的转基因植物，和表达这种构建体以使植物具有线虫抗性。重组构建体 可包含编码一种或多种蛋白质的核苷酸序列，其中该序列与在植物细胞中具有功能性的异 源启动子可操作地连接，以及用该重组构建体转化的细胞。包含(意思是包括但不限于) 重组构建体的细胞可以是原核或真核细胞。特别是，它们可以是植物细胞。也涉及来源于 这些转化的植物细胞的植物和种子。在一个实施方案中，本发明的转基因植物或其部分 产生一种或多种脂肪酸化合物，其中至少一种是2-十三烷酮。2-十三烷酮是野生多毛番 茄(Lycopersicon hirsutum) (Solanum habrochaites)中产生的主要的甲基酮(占总挥 发物含量的76% )(相比21%的2-i烷酮和3%的2-十五烷酮；Fridman等人，Plant Celll7 :1252-67, 200 。高等植物通过涉及酰基载体蛋白辅助因子(ACP)和脂肪酸合酶 (FAS)酶复合物的代谢途径合成脂肪酸。FAS复合物由大约8个单独的酶组成，这些酶催化 30个或更多的反应步骤，它们在植物中全都位于质体中。本发明提供异源分子，该异源分子被导至植物的质体中，以由FAS复合物产生甲 基酮，特别是2-十三烷酮，包括但不限于编码具有甲基酮合酶活性的多肽如SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7的核苷酸，或GenBank登录号AY701574中给出的氨基酸序列。 在某些实施方案中，具有甲基酮合酶活性的多肽(例如，允许产生甲基酮类，如2-十一烷 酮、2-十三烷酮和2-十五烷酮)可与以下所示的任一种或多种氨基酸序列具有至少80%、 至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性SEQ ID NO: 3,SEQ IDNO :5,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :13,SEQ ID NO :15,SEQ IDNO :17,SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ IDNO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 31、SEQ IDNO :33,SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37 或 SEQ ID NO :39。编码的多肽的功能也可 以通过测定编码它的转基因的存在在减少线虫感染、生长、繁殖或症状方面的效能来确定。 例如，在类似条件下，在包含编码甲基酮合酶活性的异源核苷酸构建体的转基因植物中，相 对于对照植物，例如不包含该异源分子的其它等基因植物，虫瘿、胞囊或蠕虫数目减少20% 或更多、25%或更多、50%或更多、80%或更多或95%或更多，表明存在功能性分子。在某些实施方案中，被引导至植物质体中以产生甲基酮的本发明提供的异源分子 在核苷酸水平上与如下所示的一种或多种序列可具有至少80%、至少85%、至少90%、至 少 95%、至少 98%、至少 99%或 100%的序列同一性SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32,SEQ ID NO :34,SEQ ID NO :34,SEQ ID NO :36 或 SEQ ID NO :38 ；或 SEQ ID NOs 58-61中的任一个。因此，在具体实施方案中，异源分子可包含编码异源叶绿体转运肽的序 列，例如，但不限于，如SEQ IDNO :9或SEQ ID N0:11所示。同样，在某些实施方案中，本发明的核苷酸还可包含编码如SEQID NO :41、SEQ ID NO 43,SEQ ID NO 45、SEQ ID NO 47、SEQ IDNO 49、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :55或SEQ IDNO :57中的任一个所示的酰基载体蛋白(例如ACP 1)的序列，或者可以包 含编码与这些序列中任一个具有至少大约85%、90%、95%、98%或99%序列相似性的酰 基载体蛋白的序列。
本发明的另一方面提供生产和使用一种或多种甲基酮类如2-十三烷酮来控制线 虫侵扰的方法。因此，提供了例如在植物细胞中产生甲基酮的方法。甲基酮然后可以在种 植作物之前、期间或之后施加到土壤中，以控制或减少在土壤中生长的作物的线虫侵扰或症状。除非另外指出，术语将根据相关领域普通技术人员的常规用法来理解。分子生 物学常用术语的定义也可以在以下文献中找到Rieger等人，Glossary of Genetics Classical and Molecular,5th edition, Springer-Verlag :New York,1991 ；and Lewin, Genes V, OxfordUniversity Press :New York，1994。 DNA 喊基的命名如 United States Code of Federal Regulations，第 1 部分，1. 822 节的标题 37 所示。本文使用的“转基因植物”是其中植物的一个或多个或全部细胞包含转基因的任 何植物。转基因可以整合到核基因组或细胞器基因组内，或者可以是染色体外复制的DNA。 术语“转基因”是指相对于它所引入的转基因微生物、植物、动物或细胞部分或完全为异源 的、外源的核酸。构成植物的各种细胞和组织类型的细胞包括但不限于种子、根、叶、芽、花、 花粉和胚珠。“重组DNA”是具有通过内源和/或外源分子在转录单元中的组合、通过诱变、限 制酶等的操作，或者仅仅通过插入多拷贝的天然转录单元而引入的遗传工程修饰的多核苷 酸。重组DNA可包含从不同来源获得的DNA区段，或从相同来源获得的DNA区段，但是该 DNA区段经过操作连接在自然中不以连接形式存在的DNA区段。分离的重组多核苷酸例如 可以作为纯化的分子存在，或者整合到基因组内，如植物细胞或细胞器基因组或微生物质 粒或基因组内。多核苷酸包含引起RNA在植物细胞中转录的连接的调节分子。本文使用的“百分同一性”是指两个最佳比对的DNA或蛋白质区段在组分(例如 核苷酸序列或氨基酸序列)的整个比对窗口上保持不变的程度。测试序列与参考序列的比 对区段的“同一性分数”是两个比对的区段的序列共有的相同组分数除以比对窗口上参考 区段中序列组分的总数，该窗口是完整测试序列或完整参考序列中较小的那一个。“百分同 一性” (“％同一性”)是同一性分数乘以100。“表达”的意思是DNA转录产生RNA。得到的RNA可以是但不限于编码蛋白质的 mRNA、反义RNA或用于RNAi技术的双链RNA。表达也可以指RNA的翻译，S卩，由mRNA产生编 码的蛋白质。本文使用的“启动子”是指用于初始化转录的调节DNA分子。“植物启动子”是能 够启动在植物细胞中转录的启动子，无论其来源是否是植物细胞。例如，众所周知，某些土 壤杆菌启动子在植物细胞中具有功能。因此，植物启动子包括从植物、植物病毒(特别是双 链DNA病毒)和细菌如土壤杆菌属和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)细菌获得的启动子 DNA。组成型启动子通常导致在植物的大多数或所有细胞中转录。特别是，如FMV启动子 (FMV，美国专利6，051，753)、增强的35S启动子(E35S，美国专利5，359，142)、水稻肌动蛋白 启动子(美国专利5，641，876)和各种嵌合启动子(美国专利6，660，911)等启动子在本发 明中是有用的。在发育控制下的启动子的例子包括偏好在某些组织如叶、根或种子中启动 转录的启动子。这些启动子被称为“组织偏好的”。只在特定组织中启动转录的启动子被称 为“组织特异性的”。相对于其它植物组织提供在根组织中增强表达的许多根特异性或根增强启动子或片段是本领域已知的(例如美国专利5，110, 732,5,837,848 ；5, 837, 876 ；5，633，363 ； 5，459，252 ；5，401，836 ；7，196，247 ；7，232，940 ；7，119，254 ；和 7，078，589)。实例包括根 增强的或根特异性的启动子，如CaMV-来源的as-Ι启动子或小麦POXl启动子(美国专利 5，023，179)、酸几丁质酶基因启动子(Samac 等人，Plant Mol. Biol. 25 :587-596 (1994)； CaMV35S启动子的根特异性亚结构域(Lam等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. )86 7890-7894(1989))；来自毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的根增强 0RF13 启 动子(Hansen等人，Mol. Gen. Genet. 254 :337-343(1997)；用于烟草根特异性基因RB7的 启动子(美国专利 5，750，386)；禾口 Conkling 等人(Plant Physiol. 93 :1203-1211 (1990) 报道的根细胞特异性启动子。其它实例包括引导根特异性基因在水稻中转录的RCc2和 RCc3启动子(Xu等人，Plant Mol. Biol. 27 :237,1995)；大豆根特异性谷氨酰胺合成酶启 动子(Hire 等人，Plant Mol. Biol. 20 :207-218,1992)；四季豆 GRP 1.8 基因的根特异性 控制元件(Keller 和 Baumgartner，Plant Cell 3 :1051-1061,1991.)；毛根土壤杆菌甘 露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子(Sanger等人，Plant Mol. Biol. 14 :433-443, 1990)；和编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，它在大豆的根和根瘤中表达 (Miao 等人，Plant Cell 3 :11-22,1991) 也参见 Bogusz 等人，Plant Cell 2:633-641， 1990，其中描述了两种从来自固氮非豆类糙叶山黄麻(Parasponia andersonii)和相关非 固氮非豆类山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的根特异性启动子。Leach和 Aoyagi (1991)描述了对毛根土壤杆菌的高表达rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析 (参见Plant Science (Limerick) 79 :69-76)。其它根偏好的启动子包括VfEN0D_GRP3基因 启动子(Kuster 等人，Plant Mol. Biol. 29(4) :759-772,1995)；和 rolB 启动子(Capana 等 人，Plant Mol. Biol. 25 =681-691,1994)。线虫诱导的启动子的例子包括，例如，TobRB7启 动子(Opperman 等人，Science 263 :221-223,1994)和美国专利 6，262，344 和 7，193，136 所述的启动子。术语“抗性”或“耐受性”当用于比较转基因在转基因植物中的有效性时，是指转 基因植物当暴露于线虫侵扰压力时，相对于类似条件下线虫敏感性非转基因植物呈现的表 型，保持希望的表型的能力。抗性水平可以通过比较暴露或未暴露于线虫感染的转基因植 物与非转基因植物的物理特性来确定。所观察的示例性的物理特性包括植物高度、能够在 线虫攻击下存活的植物群体的增长(即，与寄生线虫接触的植物可以具有增强的根生长、 增加的果实或谷粒产量，和繁殖线虫感染或群体增长率)。重组DNA的表达产物可能对线虫 直接有毒(杀线虫)，或者可能影响迁移性、宿主发现、取食部位建立、繁殖力或具有其它线 虫抑制效果。“转化的种子”是由转化的植物产生的种子。转化的植物含有转化的细胞。转化的 细胞是已经通过引入外源DNA分子而改变的细胞，或者在本发明中，包含异源甲基酮合酶 或异源酰基载体蛋白或这两者的组合。线虫包括但不限于植物寄生物种，例如，异皮线虫属(Heterodera)的种、球胞囊 线虫属(Globodera)的种、根结线虫属(Meloidogyne)的种、肾形线虫属(Rotylenchulus) 的种、纽带线虫属(Hoplolaimus)的种、刺线虫属(Belonolaimus)的种、短体线虫属 (Pratylenchus)的种、长针线虫属(Longidorus)的种、拟毛刺线虫属(Paratrichodorus) 的种、茎线虫属(Ditylenchus)的种、剑线虫属(Xiphinema)的种、锥线虫属(Dolichodorus)的种、螺旋线虫属(Helicotylenchus)的种、穿孔线虫属(Radopholus)的 种、潜根线虫属(Hirschmanniella)的种、矮化线虫属(Tylenchorhynchus的种和毛刺线虫 属(Trichodorus)的种，等等。本发明提供重组DNA构建体，其包含当引入植物细胞中时赋予植物对线虫感染或 线虫感染引起的植物病害的抗性的多核苷酸。这样的构建体一般也包含与所述多核苷酸可 操作连接的启动子，以提供在植物细胞中的表达。其它构建体成分可以包括额外的调节分 子，如5’前导区或3’非翻译区(如聚腺苷酸化位点)、内含子区和转运肽或信号肽。这样 的重组DNA构建体可以采用本领域普通技术人员已知的方法装配。根据本发明制备的重组构建体通常也包括3'非翻译DNA区(UTR)，该UTR—般在 多核苷酸编码区后含有聚腺苷酸化序列。有用的3’ UTR的例子包括但不限于来源于根癌 土壤杆菌的胭脂氨酸合酶基因(nos)的3’ UTR，编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶-加氧酶 (rbcS)小亚基的基因，和根癌土壤杆菌的T7转录物。构建体和载体也可包括用于靶向蛋白质产物的转运肽，特别是靶向至叶绿体、白 色体或其它质体细胞器、线粒体、过氧化物酶体或液泡或胞外位置。关于叶绿体转运肽的应 用的说明，参见美国专利5，188，642和美国专利5，728，925。许多叶绿体定位的蛋白质从核 基因表达为前体，并且被叶绿体转运肽(CTP)靶向至叶绿体。其它这样的分离的叶绿体蛋 白质的例子包括但不限于如美国专利7，193，133所述的与核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶小 亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、 烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(EPSPQ和转运肽有关的蛋白质。已经在体内和体外证明， 可以利用与异源CTP的蛋白质融合将非叶绿体蛋白质靶向至叶绿体，并且CTP足以将蛋白 质靶向至叶绿体。已经证明，合适的叶绿体转运肽如拟南芥(Arabidopsis thaiiana)EPSPS CTP (CTP2, Klee 等人，Mol. Gen. Genet. 210 :437-442,1987)和矮牵牛(Petunia hybrida) EPSPS CTP (CTP4，delIa-Cioppa 等人，Proc. Natl. Acad. ki.USA83 :6873-6877,1986)的引 入可将异源EPSPS蛋白序列靶向至转基因植物中的叶绿体。通过表达包含氨基末端CTP与 草甘膦抗性EPSPS酶的融合蛋白产生草甘膦抗性植物是本领域技术人员公知的(美国专利 5，627，061，美国专利 5，633，435，美国专利 5，312，910，EP 0218571，EP189707, EP 508909 和EP 924299)。本领域技术人员应当认识到，可以制备各种嵌合构建体，该构建体利用CTP 的功能性将各种甲基酮合酶或酰基载体蛋白输入到植物细胞质体中。合适的植物转化方法实际上包括可以将DNA引入细胞中的任何方法，如直接输 送DNA(例如，通过PEG介导的原生质体转化，通过电穿孔，通过用碳化硅纤维搅动，以 及通过加速DNA包被的颗粒)，通过土壤杆菌介导的转化，通过病毒或其它载体。一种 优选的植物转化方法是微粒轰击，例如，如美国专利5，015，580(大豆)、5，550，318(玉 米)、5，538，880 (玉米)、6，153，812 (小麦)、6，160，208 (玉米)、6，288，312 (水稻)和 6，399，861 (玉米)和 6，403，865 (玉米)所述。土壤杆菌介导的植物(特别是作物)转化的详细步骤包括，例如，美国专 利 5，004，863、5，159，135、5，518，908、5，846，797 和 6, 624, 344(棉花)；5，416，011、 5，569，834,5, 824，877,5, 914，4516，384，301 和 7，002，058 (大豆)；5，591，6165，981，840 和7，060, 876 (玉米)；5, 463，174和5，750，871 (芸苔属的种，包括油菜籽和油菜)，和美国 专利申请公开2004/0244075 (玉米)、2004/0087030 (棉花)和2005/0005321 (大豆)所公开的步骤。土壤杆菌介导的转化的其它步骤在W09506722(玉米)中公开。对于许多植物 种，包括双子叶植物和单子叶植物，尤其包括花生(Cheng等人，Plant Cell Rep. ,15 :653, 1996)；芦笋(Bytebier 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 84 :5345,1987)；大麦(Wan 和 Lemaux, Plant Physiol.，104 :37,1994)；水稻(Toriyama 等人，Bio/Technology,6 :10， 1988 ；Zhang 等人，Plant Cell Rep.，7 :379,1988 ；小麦(Vasil 等人，Bio/technology，10 667，1992 ；Becker 等人，Plant J.，5 -.299,1994)；紫花苜蓿(Masoud 等人，Transgen. Res.， 5:313，1996)；芸苔属的种(Radke等人，Plant Cell Rep. , 11 :499-505,1992)；和番茄(Sun 等人，Plant Cell Physiol. ,47 :426_431，2006)，已经报道了类似的方法。转基因植物细胞 和转基因植物也可以通过用其它载体转化获得，例如但不限于使用病毒载体(例如，烟草 蚀纹病毒(TEV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)以及Edwardson和Christie，“The Potyvirus Group =Monograph No. 16", 1991,Agric. Exp. Station,Univ. of Florida提到的病毒、质粒、 粘粒、YAC (酵母人工染色体)、BAC (细菌人工染色体)或任何其它合适的克隆载体，使用合 适的转化方案时，例如但不限于细菌感染(例如，如上所述使用土壤杆菌)、二元细菌人工 染色体构建体，直接输送DNA (例如，通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄取、电 穿孔、使用碳化硅纤维搅动，以及微粒轰击)。本领域普通技术人员应当清楚，可以使用各 种转化方法，并且可以为了从任何数目的感兴趣的植物种产生稳定的转基因植物而进行改 变。例如，稳定遗传的重组DNA构建体和小染色体的构建可以用作构建转基因植物的载体 (美国专利7，235,716)。本发明的植物包括但不限于金合欢、紫花苜蓿、莳萝、苹果、杏、朝鲜蓟、芝麻菜、芦 笋、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、黑莓、蓝莓、花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、油菜、哈密瓜、胡萝卜、木薯、菜花、芹菜、樱桃、香菜、柑橘、克莱门小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄 子、苦苣、宽叶莴苣(escarole)、桉树、茴香、无花果、林木、葫芦、葡萄、柚子、蜜露、豆薯、猕 猴桃、莴苣、韭菜、柠檬、莱檬、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、燕麦、秋葵、洋葱、橙子、观赏 植物、木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松树、菠萝、大蕉、李子、石榴、杨树、马铃 薯、南瓜、温柏、辐射松、菊苣、萝卜、油菜籽、木莓、水稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭 瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香、橘子、茶、烟草、番茄、草皮草、葡萄藤、西瓜、小麦、 山药、和西葫芦。作物被定义为为了产生一种或多种商业产品而栽培的植物。这样的作物 或作物植物的例子包括但不限于大豆、油菜、芸苔、棉花(棉籽)、花生、向日葵、木豆、鹰嘴 豆、等等，和谷物，如玉米、小麦、水稻、燕麦、小米、黑麦、等等。芸苔、油菜籽和菜籽油在本申 请公开内容中作为同义词使用。产生含有稳定整合的重组DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法优选 地在组织培养基中并且在受控制的环境中实施。受体细胞目标包括但不限于分生组织细 胞、愈伤组织、未成熟的胚或胚的部分、配子细胞如小孢子，花粉，精子和卵细胞。涉及可以 再生能育植物的任何细胞，作为用于实施本发明的有用的受体细胞。愈伤组织可以从各种 组织来源开始，包括但不限于未成熟的胚或胚的部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够 增殖为愈伤组织的细胞可以作为用于遗传转化的受体细胞。用于制备本发明的转基因植 物的实用的转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚的转化，和随后能 育转基因植物的再生)，例如，在美国专利6，194，636和6，232，526和美国专利申请公开 2004/0216189 中公开。
在普通的转化实践中，在任何一个转化实验中只将DNA导入一小部分目标细胞 中。标记基因通常用来提供鉴别那些被转基因DNA构建体转化的细胞的有效系统。优选 的标记基因提供选择性标记，该选择性标记提供对选择剂如抗生素或除草剂的抗性。植物 细胞可能耐受的任何抗生素或除草剂都可能是有用的选择剂。使可能被转化的细胞暴露 于选择剂。存活细胞群体中将是那些通常以足以使细胞在选择剂的存在下存活的水平表达 抗性基因的细胞。也可以进一步测试细胞，以证实重组DNA的整合。常用的选择性标记基 因包括提供抗生素抗性的基因，所述抗生素如卡那霉素或巴龙霉素(nptll)、潮霉素B(aph IV)、庆大霉素(aac3和aacC4)和草丁膦(bar或pat)、草甘膦(EPSPQ和麦草畏(麦草畏 单加氧酶)。有用的选择性标记基因和选择剂的例子在美国专利5，550，318,5, 633，435、 5，780，708和6，118，047中说明。也可以使用可筛选的标记或报道基因，如提供目视鉴别转 化体的标记。有用的可筛选的标记的非限制性实例包括，例如，表达通过作用于产色底物产 生可检测颜色的蛋白质的基因(例如，β-葡糖醛酸酶，GUS，uidA，或萤光素酶Iuc)或其本 身可以被检测，如绿色荧光蛋白(GFP，gfp)或免疫原性分子。本领域技术人员将认识到可 以使用许多其它有用的标记或报道基因。性状堆积和育种例如，通过表达其它转基因，本发明的重组DNA构建体可以与其它提供额外的农 学性状的重组DNA堆积(例如在被转化植物的情况下，性状包括但不限于除草剂抗性、昆 虫抗性、冷发芽耐受性、缺水耐受性、产量提高、质量提高、真菌、病毒和细菌病抗性)。本 发明的重组DNA构建体也可以转化到携带天然害虫或病原体抗性基因的植物品种中，以 提高抗性表型的效力。用于基因表达协调降低和/或提高的构建体在美国专利申请公开 2004/0126845A1中公开。可以收获转基因能育植物的种子并用来长成在基因组中包含重 组DNA构建体的本发明转基因植物的后代，包括杂种代。因此，除了用本发明的重组DNA构 建体直接转化植物以外，也可以通过使具有重组DNA的第一植物与缺乏该构建体的第二植 物杂交制备本发明的转基因植物。例如，重组DNA可以导入适合转化的植物系中，以产生转 基因植物，该转基因植物可以与第二植物系杂交，以将重组DNA渗入得到的后代中。本发明 的转基因植物可以与具有其它重组DNA或天然存在的提供一种或多种额外性状(例如但不 限于除草剂抗性、害虫或病害抗性、环境应激抗性、养分含量改变、和产量提高)的遗传区 的植物系杂交，以产生具有提供希望的靶序列表达行为和额外的性状的重组DNA的后代植 物。一般来说，在这种用于组合性状的育种中，提供额外性状的转基因植物是雄性株系，而 携带基本性状的转基因植物是雌性株系。这一杂交的后代分离，使得一些植物将携带两个 亲本性状的DNA，而一些植物携带一个亲本性状的DNA ；这些植物可以根据与亲本重组DNA 相关的标记进行鉴定。携带两个亲本性状的DNA的后代植物可以与雌性亲本系回交多次， 例如，通常6-8代，以产生与一个原转基因亲本系具有基本相同的表型但是具有另一转基 因亲本系的重组DNA的后代植物。本发明的转基因植物、植物部分、种子或后代植物可以加工为在商业上有用的产 品。这些产品包括但不限于粗粉、面粉、油、干草、淀粉、汁液、蛋白质提取物和纤维。实施例以下实施例用来说明本发明的实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现在实施本发明中工作良好的技术。但是，本领域技术人员根 据本公开内容应当理解，可以对公开的具体实施方案进行许多变化，而仍然获得相同的或 相似的结果，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，应当明白，化学和生理相关的 某些试剂可以替代此处公开的试剂，而将获得相同的或相似的结果。本领域技术人员明白 的所有这些相似的替代和改变被认为包括在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概 念内。实施例1本实施例说明各种甲基酮的惊人的杀线虫效果。在体外针对秀丽隐杆线虫 (C. elegans)Ll和L4幼虫和南方根结线虫(M. incognita)寄生前J2幼虫(在土壤中发现的 散布幼虫阶段)测试了各种链长的甲基酮。如表1所示，对于中等长度的甲基酮类(10-14 碳链长度)观察到杀线虫活性。该表显示对秀丽隐杆线虫Ll和L4幼虫和南方根结线虫J2 幼虫有效的各种甲基酮的体外IC30值(单位为百万分之一)。IC30被定义为秀丽隐杆线 虫暴露4小时及南方根结线虫暴露M小时后30%的线虫被杀死时的甲基酮的浓度。表1.各种甲基酮对线虫的体外效果
权利要求
1.包含编码与异源转运肽可操作连接的植物甲基酮合酶的序列的多核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述植物甲基酮合酶包含与选自SEQID NO :13,15, 17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39的多肽有至少大约85%同一性的氨基酸序列， 其中所述多肽具有甲基酮合酶活性。
3.权利要求1的多核苷酸，其中所述转运肽是叶绿体转运肽。
4.权利要求3的多核苷酸，其中所述叶绿体转运肽选自EPSPS叶绿体转运肽、小亚基核 酮糖-1，5-二磷酸羧化酶叶绿体转运肽、铁氧还蛋白叶绿体转运肽、铁氧还蛋白氧化还原 酶叶绿体转运肽、集光复合蛋白I和蛋白II叶绿体转运肽和硫氧还蛋白F叶绿体转运肽。
5.权利要求1的多核苷酸，其中所述编码植物甲基酮合酶的序列显示与选自SEQID NO :12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 和 38 的多核苷酸序列有至少大约 80%的 百分序列同一性。
6.一种构建体，其包含与在植物中具有功能性的启动子可操作连接的权利要求1的多 核苷酸。
7.包含权利要求1的多核苷酸的植物细胞。
8.权利要求7的植物细胞，其中所述转运肽是叶绿体转运肽。
9.权利要求7的植物细胞，其中所述植物细胞来自种子、根、叶、芽、花、花粉或胚珠。
10.权利要求7的植物细胞，其中所述细胞产生甲基酮。
11.权利要求10的植物细胞，其中所述甲基酮是2-十一烷酮或2-十三烷酮或2-十五烷酮。
12.权利要求7的植物细胞，其中所述细胞是作物细胞。
13.权利要求7的植物细胞，其中所述细胞来自选自棉花、大豆、油菜、玉米、小麦、水 稻、向日葵、高粱、甘蔗、马铃薯、番茄和树的植物。
14.包含权利要求1的多核苷酸的植物或其部分。
15.权利要求14的植物或其部分，其中其部分选自种子、花粉、根、叶、芽、花和胚珠。
16.包含含有权利要求1的多核苷酸的植物组织的加工产品。
17.权利要求16的加工产品，其选自粗粉、面粉、油、干草、淀粉、汁液、蛋白质提取物和 纤维。
18.控制植物中的病原体或害虫的方法，包括在植物中表达权利要求6的构建体。
19.权利要求18的控制植物中的病原体或害虫的方法，其中多核苷酸序列包含与编码 酰基载体蛋白的序列可操作连接的编码第二异源转运肽的序列。
20.权利要求19的方法，其中所述病原体或害虫是线虫。
21.权利要求20的方法，其中所述线虫选自异皮线虫属的种、球胞囊线虫属的种、根 结线虫属的种、肾形线虫属的种、纽带线虫属的种、刺线虫属的种、短体线虫属的种、长针线 虫属的种、拟毛刺线虫属的种、茎线虫属的种、剑线虫属的种、锥线虫属的种、螺旋线虫属的 种、穿孔线虫属的种、潜根线虫属的种、矮化线虫属的种和毛刺线虫属的种。
22.权利要求19的方法，其中所述病原体或害虫是昆虫害虫。
23.权利要求22的方法，其中所述昆虫害虫选自玉米根虫属(Diabrotica)、非 耳象属(Diaprepes)、結牛艮象属(Pachnaeus)、短像象属(Asynonychus)、厉目艮章岐属 (Lycoriella)、蕈岐属(Sciara)、Menophlus 和迟眼蕈岐属(Bradysia)。
24.生产种子的方法，包括将权利要求14的植物与其自身或第二植物杂交。
25.权利要求M的生产种子的方法，其中多核苷酸序列包含与编码酰基载体蛋白的序 列可操作连接的编码第二异源转运肽的序列。
26.权利要求1的多核苷酸，进一步包含与编码酰基载体蛋白的序列可操作连接的编 码第二异源转运肽的序列。
27.权利要求沈的多核苷酸，其中所述酰基载体蛋白包含显示与选自SEQID NO 41, 43、45、47、49、51、53、55和57的多肽有至少大约85%同一性的氨基酸序列。
28.权利要求沈的多核苷酸，其中所述第二转运肽是叶绿体转运肽。
29.权利要求沈的多核苷酸，其中所述第二转运肽选自EPSPS叶绿体转运肽、小亚基核 酮糖-1，5-二磷酸羧化酶叶绿体转运肽、铁氧还蛋白叶绿体转运肽、铁氧还蛋白氧化还原 酶叶绿体转运肽、集光复合蛋白I和蛋白II叶绿体转运肽和硫氧还蛋白F叶绿体转运肽。
30.权利要求沈的多核苷酸，其中所述编码酰基载体蛋白的序列显示与选自SEQID NO :40、42、44、46、48、50、52、M和56的多核苷酸序列有至少大约80%的序列同一性。
31.权利要求7的植物细胞，其中所述多核苷酸序列包含与编码酰基载体蛋白的序列 可操作连接的编码第二异源转运肽的序列。
32.权利要求14的植物或其部分，其中所述多核苷酸序列包含与编码酰基载体蛋白的 序列可操作连接的编码第二异源转运肽的序列。
33.植物、植物部分、种子或后代的加工产品，其中所述产品包含权利要求7的植物细胞。
34.权利要求33的加工产品，其中该加工产品选自粗粉、面粉、油、干草、淀粉、汁液、蛋 白质提取物和纤维。
全文摘要
本发明涉及控制线虫侵扰。本发明公开了为了达到线虫侵扰减少通过给植物细胞提供重组DNA分子用于控制线虫侵扰的方法和组合物。本发明也涉及产生表达用于保护植物免遭线虫侵扰的重组DNA分子的转基因植物的方法。
文档编号C12N15/82GK102046796SQ200980107449
公开日2011年5月4日 申请日期2009年2月9日 优先权日2008年2月10日
发明者C·C·鲍布利特, D·J·威廉姆斯, J·D·布拉德雷, M·J·卡劳弗德, S·弗拉辛斯基 申请人:孟山都技术公司