胞外基质组合物的制作方法

专利名称：胞外基质组合物的制作方法
胞外基质组合物发明背景 发明领域本发明一般涉及胞外基质组合物的产生和应用，更具体涉及通过在低氧条件下于 合适的生长培养基中在表面上培养细胞得到的蛋白质。背景信息胞外基质(ECM)是围绕和支持细胞的复杂结构实体，其被体内发现于哺乳动物组 织中。ECM通常称作结缔组织。ECM主要由三种主要类型的生物分子组成，包括如胶原蛋 白和弹性蛋白的结构蛋白，如肌原纤蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白的特化蛋白质，和蛋白聚 糖。本领域已述及ECM组合物的体外生长及其在各种治疗和医学应用中的使用。此类 ECM组合物的一种治疗应用包括软组织和皮肤缺陷的治疗和修复，如皱纹和疤痕。由如痤疮、手术疤痕或衰老的缺陷引起的软组织缺陷的修复和加强已被证实非常 困难。许多材料已经用于校正软组织缺陷，取得了不同程度的成功，但是，没有材料完全安 全和有效。例如，硅引起各种生理和临床问题，包括长期副作用，如小结、复发性蜂窝组织炎 和皮肤溃疡。胶原蛋白组合物也已经用作软组织加强的可注射材料。胶原蛋白是结缔组织的主 要蛋白质和哺乳动物中最丰富的蛋白质，构成总蛋白质含量的约25%。文献中目前述及观 种胶原蛋白(详细的清单，参见，如以下表1和表2)。但是，体内超过90%的胶原蛋白是胶 原蛋白I、II、III和IV。不同的胶原蛋白材料已经用于软组织缺陷的治疗，如重构可注射牛胶原蛋白、交 联的胶原蛋白或其它异源胶原蛋白。但是，这些胶原蛋白存在几个问题。常见的问题包括为 去除潜在免疫原性物质以避免对象体内过敏反应制备植入材料的复杂性和高成本。此外， 利用这些胶原蛋白治疗的长期持久性还未被证实。也已述及其它可用于软组织修复或加强的材料，如，含水凝胶中的生物相容性陶 瓷颗粒(美国专利号5，204，382)、热塑性和/或热硬化性材料(美国专利号5，278，202)和 乳酸基共混聚合物(美国专利号4，235，312)。此外，也已述及天然分泌的ECM组合物(美 国专利号6，284, 284)。但是，这些材料经证实均有局限性。因此，需要新材料用于软组织修复和加强，克服前述材料的缺陷。这种需要在于提 供安全、可注射、长期持久性、可生物吸收的软组织修复和加强材料。体外培养的ECM组合物可另外用于治疗受损组织，如，受损心肌及相关组织。该组 合物可用作植入物或植入装置上的生物涂层，装置如支架；促进如心脏及相关组织的器官 内血管化的人造血管；和在疝气修复、盆底修复、创面修复和肩袖修复中有用的装置，如膜 片(或补片，patch)和类似物。冠心病(CHD)，也被称作冠心病(CAD)、缺血性心脏病和动脉粥样硬化心脏病，其 特点是供给血液和氧气到心脏的小血管窄化。冠心病通常由称作动脉硬化的病症引起，其发生于脂肪物质和斑块积聚在动脉壁上引起动脉窄化时。由于冠状动脉窄化，流向心脏的 血液可减慢或停滞，引起胸痛(稳定性心绞痛)、气短、心脏病发作及其它症状。在美国冠心病(CHD)是引起男性和女性死亡的主要原因。根据美国心脏协会 (American Heart Association)，1500万人以上有某些形式的该病症。尽管冠心病的症状 和体征在疾病晚期明显，大多数冠心病患者在心脏病突然发作之前数十年没有随疾病进展 而表现出疾病。该疾病是引起突然死亡最普遍的原因，也是年龄20岁以上男性和女性死亡 最普遍的原因。根据美国的目前趋势，一半健康的40岁男性会在将来患有CHD，三分之一健 康的40岁女性同样如此。在患病心脏或其它受损心脏中改善血流的当前方法包括创伤性外科手术技术， 如，冠状动脉旁路手术、血管成形术和动脉内膜切除术。这些方法自然在手术中和手术后具 有高度的固有风险，并且通常仅为心肌缺血提供临时治疗。因此，需要新的治疗选择以增加 当前可用技术治疗CHD和相关症状的成功。体外培养的ECM组合物可另外用于修复和/或再生受损细胞或组织，如软骨或骨 软骨细胞。骨软骨组织是有关或包含骨或软骨的任何组织。本发明所述的组合物对以下骨 软骨缺陷的治疗有用，如退化性结缔组织病，如类风湿和/或骨关节炎，及由于外伤具有软 骨缺陷的患者的缺陷。当前修复骨软骨损伤的尝试包括植入在生物相容和生物可降解水凝胶移植物中 的人软骨细胞，试图提高恢复关节软骨损伤的可能性。此外，已述及在藻酸盐珠子或包括聚 硫酸化藻酸盐的基质中的软骨细胞培养技术，生成透明型软骨组织。但是，通过人自体软骨 细胞的植入来修复关节软骨的软骨内损伤的尝试取得了有限的成功。因此，需要新的治疗 选择以增加当前可用技术治疗骨软骨缺陷的成功。体外培养的ECM组合物也在组织培养体系中有用，用于生成工程化组织植入物。 组织工程化领域包括利用细胞培养技术来生成新的生物组织或修复受损组织。在干细胞 革命的部分推动下，组织工程技术为损伤后组织再生和替换或退化性疾病的治疗提供了希 望。其也可用于美容过程领域中。组织工程技术利用各种细胞类型和培养技术可用于生成自体或异源组织或细胞。 在构建自体植入物中，可以获得供体组织并将其解离成单个细胞，随后附着于待植入在功 能组织期望位点的基底上并在其上培养。利用细胞培养技术，许多分离的细胞类型可在体 外扩增，但是依赖贴壁细胞需要特殊环境，通常包括三维支架的存在，其起生长模板的作用。当前组织工程技术一般提供人造植入物。成功的细胞移植疗法依赖于用于体内和 体外组织培养的合适的基底的发展。因此只包含天然材料并适于植入的ECM的发展会有更 多内源组织特性。因此，天然ECM材料的生成是组织工程领域中持续的挑战。发明_既述本发明部分基于如下基本发现，在刺激早期胚胎环境(如，低氧和减少的重力)的 条件下培养于表面(如，二维或三维表面)的细胞产生具有胎儿特性的ECM组合物。通过 在低氧条件下于包含一种或多种胚胎蛋白质的表面上培养细胞产生的ECM组合物具有多 种有益的应用。在一种实施方式中，本发明提供制备包含一种或多种胚胎蛋白质的ECM组合物的方法。该方法包括在低氧条件下于合适的生长培养基中在表面(如，二维或三维表面)上培 养细胞，产生可溶和不可溶的部分。在不同方面，该组合物单独包括可溶或不可溶的部分， 及可溶和不可溶部分的组合。在不同方面，产生的组合物包括层粘连蛋白、胶原蛋白和Wnt 因子的基因表达的增量调节和产生。在其它方面，产生的组合物包括层粘连蛋白、胶原蛋白 和Wnt因子的基因表达的减量调节。在其它方面，该组合物是物种特异性的并包括来自单 个动物物种的细胞和/或生物材料。尽管体外培养的ECM组合物在人类治疗中有用，该组 合物也可用于动物的其它物种。因此，该组合物非常适合兽医应用。在另一实施方式中，本发明提供产生Wnt蛋白质和血管内皮生长因子(VEGF)的方 法。该方法包括在低氧条件下于合适的生长培养基中在表面(如，二维或三维表面)上培 养细胞，从而产生Wnt蛋白质和VEGF。在不同方面，生长培养基无血清且低氧条件为1-5% 氧。在相关方面，与约15-20%氧的氧条件下产生的培养基相比，Wnt种类被增量调节。在 示例性方面，Wnt种类是wnt 7a和wnt 11。在另一实施方式中，本发明包括通过用本文所述的ECM组合物接触要被修复或再 生的细胞进行细胞修复和/或再生的方法。在一方面，该细胞是骨软骨细胞。因此，该方法 考虑骨软骨缺陷的修复。在另一实施方式中，ECM组合物可用作植入物或植入装置上的生物涂层。在不同 方面，本发明的组合物包括在植入物中或用作可植入装置——如支架和人造血管——上的 生物涂层，以促进如心脏及相关组织的器官内的血管化作用。在相关方面，该组合物包括在 组织再生膜片或植入物中，用于疝气修复、盆底修复、创伤修复、肩袖修复和类似修复。还有另一种实施方式中，本发明包括对象皮肤表面的改善方法，包括向对象皱纹 部位给予本文所述的ECM组合物。还有进一步实施方式中，本发明包括对象软组织修复或 加强的方法，包括向对象皱纹部位给予本文所述的ECM组合物。在另一实施方式中，本发明包括组织培养体系。在不同方面，培养体系由本文所述 的ECM组合物组成，如包含于二维或三维支持材料中。另一方面，本文所述的ECM组合物作 为不同类型细胞生长的支持物或二维或三维支持物。例如，该培养体系可用于支持干细胞 的生长。一方面，干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。在另一实施方式中，本发明的组合物可用于提供表面涂层，与装置在对象体内的 植入联合，用来促进内皮化和血管化作用。在另一实施方式中，本发明的组合物可用于提供治疗受损组织的方法。该方法包 括在受损组织的治疗允许的条件下用组合物接触受损组织，该组合物通过在低氧条件下于 包含一种或多种胚胎蛋白质的二维或三维表面上培养细胞而生成。在另一实施方式中，本发明包括用于细胞运送或在运送位点维持的包含本文所述 ECM组合物的生物载体。该载体可用于这样的应用中，如将细胞——诸如干细胞——注入受 损心肌，或用于腱和韧带的修复。在另一实施方式中，本发明提供刺激或促进毛发生长的方法。该方法包括用本文 所述的ECM组合物接触细胞。在一示例性方面，该细胞是毛囊细胞。在不同方面，可体内或 体外接触该细胞。附图简述

图1显示hECM包被的聚丙烯筛网植入2周后FBGC形成的图形表示。图IA显示未包被(第一柱)和hECM包被(第二柱)的纤维植入2周后每纤维FBGCs的数量。图IB 显示未包被(1-3柱)和hECM包被柱)的纤维植入2周后每纤维FBGCs的数量。*表 示 ρ < 0. 05。图2显示hECM包被的聚丙烯筛网植入2周后FBGC形成的图形表示。图2A显示 未包被(第一柱)和hECM包被(第二柱)的纤维植入5周后每纤维FBGCs的数量。图2B 显示未包被(1和3柱)和hECM包被(2和4柱)的纤维植入5周后每纤维FBGCs的数量。图3显示人毛囊细胞的图像表示。图3A是人毛囊细胞在hECM存在下细胞培养4 周后移植入小鼠并又生长4周后的图像，而图;3B是对照囊细胞(滤泡细胞)的图像。图4表示对胞外基质组合物(小鼠ECM和人ECM)的成纤维代谢反应的图形表示， 如MTT检测所示。图5是响应于人成纤维细胞暴露于hECM的细胞数量的图形表示，如Pico Green Assay所测。图6是对41个人类对象取激光治疗后3、7和14天的红斑评价的图形表示。于范 围0(无)到4(严重)评价红斑的严重性。4个数据集(0. IXhECM、IXhECM、10XhECM和 对照，从左到右)的各组表示第3天(左)、第7天(中)和第14天(右)的评价。图7是对41个人类对象取激光治疗后3、7和14天的水肿评价的图形表示。于范 围0(无)到2.5(严重)评价水肿的严重性。4个数据集(0. IXhECM、IXhECM、10XhECM 和对照，从左到右)的各组表示第3天(左)、第7天(中)和第14天(右)的评价。图8是对41个人类对象取激光治疗后3、7和14天的结痂评价的图形表示。于范 围0(无)到3.5(严重)评价红斑的严重性。4个数据集(0. IXhECM、IXhECM、10XhECM 和对照，从左到右)的各组表示第3天(左)、第7天(中)和第14天(右)的评价。图9是对41个人类对象取激光治疗后3、7和14天的经表皮失水(TWEL)值的图形 表示。于范围0(无)到4(严重)评价TWEL的严重性。4个数据集(0. IXhECM、IXhECM、 IOXhECM和对照，从左到右)的各组表示第3天(左)、第7天(中)和第14天(右)的 评价。图10是眼周区域硅复制品的三维轮廓图像分析的图形表示。对22个对象在激光 治疗前、治疗后4周和治疗后10周取数据点。数据集A表示hECM给药值；数据集B表示对 照。图11是激光手术后的矿脂使用分析的图形表示。图12是用在激光手术后0、3、5、7、10和14天取的数据点进行的皮肤红斑分析的 图形表示。图13是用在激光手术后0、3、5、7、10和14天取的数据点进行的mexameter分析 的图形表示。发明详述本发明涉及制备包括一种或多种胚胎蛋白质的ECM组合物的方法。特别地，该组 合物通过在低氧条件下于合适的生长培养基中在表面(如，二维或三维表面)上培养细胞 生成。该培养方法产生可溶和不可溶部分，其可分开或结合使用，得到生理上可接受的组合 物，具有各种应用。本发明的组合物具有各种应用，包括但不限于促进受损细胞或组织的修复和/或再生，用于膜片和植入物中以促进组织再生(如疝气修复、盆底修复、肩袖修复和创面修 复)，用于组织培养体系中以培养如干细胞的细胞，用于与植入装置(如，起搏器、支架、支 架移植物、人造血管、心脏瓣膜、支路、送药口或导管、疝气和盆底修复膜片)结合使用的表 面涂层，促进软组织修复、加强和/或诸如皱纹的皮肤表面的改善，用作生物防粘剂或用于 细胞运送或在运送位点维持的生物载体。本发明部分基于以下发现在血管发生前刺激早期胚胎环境(低氧和减少的重 力)条件下培养于二维或三维表面上的细胞产生具有胎儿特性的ECM组合物，包括胚胎蛋 白质的生成。细胞在低氧条件下的生长证明了具有胎儿特性和生长因子表达的独特的ECM。 不同于在常规培养条件下的ECM培养，超过5000个基因在低氧条件下培养的ECM中差异表 达。这造成了具有不同特性的培养的ECM和不同的生物组合物。例如，低氧条件下产生的 ECM类似于胎儿间充质组织，原因是胶原蛋白III、IV和V型和如纤连蛋白、SPARC、血小板 反应蛋白和透明质酸的糖蛋白相对丰富。低氧也加强调节伤口愈合和器官发生的因子的表达，如VEGF、FGF-7和TGF-β及 多种Wnt因子，该因子包括wnts 2b、4、7a、10a和11。培养的人胚胎ECM也体外刺激人成纤 维细胞中代谢活性的增加，如通过增加的酶活性所测定的。此外，响应于培养的胚胎ECM细 胞数量有所增加。在描述本发明的组合物和方法之前，要理解的是本发明不限于所述的特定组合 物、方法和实验条件，因为这些组合物、方法和条件可以变化。也要理解的是本文所用的术 语是仅以描述特定实施方式为目的，非意欲限制性的，而本发明的范围将仅由所附的权利 要求限定。如本说明书和所附的权利要求所用，除非上下文明确指出，否则单数形式的“a”、 “an”和“the”包括复数参考。因此，例如，参考“the method”包括一个或多个方法和/或 本文所述类型的步骤，其对于本领域技术人员在阅读本公开内容等的基础上将是显而易见 的。不同实施方式中，本发明涉及制备包含一种或多种胚胎蛋白质的ECM组合物的方 法及其应用。特别地，通过在低氧条件下于合适生长培养基中在二维或三维表面上培养细 胞而生成该组合物。通过在二维或三维构架上使细胞生长获得组合物，从而产生多层细胞 培养体系。根据本发明，生长于构架支持体的细胞在多层上生长，形成细胞基质。由于低氧 培养条件，培养的细胞在低氧条件下的生长相对于常规培养导致差异基因表达。ECM是蛋白质和生物聚合物的组合物，该生物聚合物实质上包括由细胞培养生成 的组织。基质细胞，如成纤维细胞，是依赖贴壁型细胞，当附于适于细胞培养的材料和表面 时要生长。由培养细胞产生的ECM材料沉积在三维结构中，为组织样结构的形成提供空间。提供三维结构的培养材料称为支架结构。ECM沉积的空间是例如编织筛网或由称 作微载体的球形珠紧密构型产生的间隙空间内的开口的形式。如本文所用，“胞外基质组合物”包括可溶和不可溶部分(fraction)或其任意部分 (portion)。不可溶部分包括那些沉积在支持物或支架上的分泌的ECM蛋白质和生物组分。 可溶部分包括涉及培养基，该培养基中已经培养细胞并且细胞已经分泌活性剂(多种)于 其中，并包括那些没有沉积在支架上的蛋白质和生物组分。两部分可收集并任选进一步处 理，单独使用或结合本文所述的各种应用使用。
用于培养基质细胞的支持体或支架可以是任何材料和/或形状，其(a)允许细胞 附着到其上(或可改性成允许细胞附着到其上)；和(b)允许细胞生长一层以上(即，形成 三维组织)。其它实施方式中，实质上二维的片或膜或珠可用于培养充分三维形式的细胞。一方面，生物相容材料形成结构或支架，其中该结构具有间隙空间，用于细胞附着 并生长称为三维组织。在一些实施方式中，构架的开口和/或间隙空间具有适当的尺寸，允 许细胞横跨该开口或空间。保持活跃生长细胞横跨构架看来促进了负责本文所述活性的生 长因子库(repertoire)的生成。如果开口太小，细胞可能迅速完成汇合，但是不能轻松脱 离筛网。这些被捕获的细胞可能呈现接触抑制和停止适当因子的产生，该因子对于支持增 殖和保持长期培养是必要的。如果开口太大，则细胞可能不能横跨开口，造成适当因子的基 质细胞产量减少，该因子对于支持增殖和保持长期培养是必要的。一般地，间隙空间至少约 lOOum、至少140um、至少约150um、至少约180um、至少约200um或至少约220um。当使用筛 网型基质，如本文示例，我们发现开口范围约100 μ m到约220 μ m会令人满意地地工作。但 是，取决于构架结构和复杂性，其它尺寸也允许。根据本文所述的方法，允许细胞横跨和继 续复制和长时期生长的任何形状或结构可发挥功能以精心产生细胞因子。在一些方面，构架由聚合物或线形成，该线经编织、机织、针织或其它方式编排形 成构架，如筛网或织物。该材料也可通过浇铸材料或构造成泡沫、基质或海绵状支架而形 成。在其它方面，构架是缠结纤维的形式，该纤维通过共同挤压聚合物或其它纤维，生成有 间隙空间的材料。在培养中，构架可以采用任何形式或几何学用于细胞生长。因此，其它形 式的构架，如下进一步说明，可满足产生适当条件培养基的需要。一些不同材料可用于构成支架或构架。这些材料包括非聚合和聚合材料。聚合 物，当使用时，可以是任何类型的聚合物，如同聚物、无规聚合物、共聚物、嵌段聚合物、共嵌 段聚合物(如，二嵌段聚合物、三嵌段聚合物等)、线性或分支聚合物和交联或非交联聚合 物。用作支架或构架的非限制性材料实例包括玻璃纤维、聚乙烯、聚酰胺(如，尼龙)、聚酯 (如，涤纶)、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯化合物(如，聚氯乙烯；PVC)、聚碳酸酯、聚四氟 乙烯(PTFE ；TEFLON) Uhermanox(TPX)、硝化纤维、多糖(如，纤维素、壳聚糖、琼脂糖)、多肽 (如，丝、凝胶、胶原蛋白)、聚乙二醇酸(PGA)和葡聚糖等。在一些方面，构架或珠子可由在使用条件下随时间降解的材料制成。生物降解也 指当体内或在体外条件下施用时化合物或组合物的吸收或降解。生物降解可通过生物试剂 的作用直接或间接发生。生物降解材料的非限制性实例包括聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、聚 (三亚甲基碳酸盐)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(即，PLGA)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、 聚己酸内酯、兽肠线缝合材料、胶原蛋白(如，马胶原蛋白泡沫)、聚乳酸或透明质酸等。例 如，这些材料可编织成三维构架，如胶原蛋白海绵或胶原蛋白凝胶。在其它方面，当长时期冷藏维持培养物和/或当需要额外的结构完整性，该构架 可由非生物降解材料组成。如本文所用，非降解材料指在培养基条件下不明显降解或分解 的材料。示例性非降解材料包括——作为非限制性实例——尼龙、涤纶、聚苯乙烯、聚丙烯 酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、膨胀型PTFE(ePTFE)和纤维素。示例性非降解构架包括 尼龙网——可以商品名Nitex 获得，具有平均孔径140 μ m和平均尼龙纤维直径90 μ m的尼 龙滤网(#3-210/36, Tetko, Inc.，N. Y.)。在其它方面，珠子、支架或构架是生物降解和非生物降解材料的结合物。非生物降
9解材料在培养期间为支架提供稳定性，而生物降解材料使足以生成细胞网络的间隙空间形 成，该细胞网络产生足以用于治疗应用的细胞因子。生物降解材料可包被于非生物降解材 料上或机织、编织或形成为筛网。可使用生物降解和非生物降解材料的各种结合物。示例性 结合物是用生物降解聚合物薄膜包被的聚(聚对苯二甲酸乙二酯)(PET)织物、聚(D-L-乳 酸-共-乙醇酸)，以获得极性结构。在不同方面，可以在接种细胞前预处理支架或构架材料，提高细胞的粘附力。例 如，在一些实施方式中，在接种细胞前，尼龙网用0. IM的乙酸处理，并温育于聚赖氨酸、胎 牛血清和/或胶原蛋白中，以包被该尼龙。也可同样用硫酸处理聚苯乙烯。其它实施方式 中，在支持构架存在下细胞生长可通过如下方法进一步加强于构架上添加或包被蛋白质 (如，胶原蛋白、弹性蛋白纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(如，硫酸乙酰肝素、4-硫酸软 骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等)、纤连蛋白和/或糖聚物(聚[N-对乙烯 苯甲基-D-乳酸酰胺]，PVLA)，以提高细胞的粘附力。当其材料是对细胞的粘附力差的基 底时，对支架或构架的处理有用。一方面，筛网用于ECM的产生。筛网是6种材料平纹形式的编织尼龙，具有约 100 μ m的孔和约125 μ m厚。在培养中，成纤维细胞通过带电蛋白质的相互作用附于尼龙并 生长于筛网空隙中而生成和沉积ECM蛋白质。过大或过小的筛网孔可能效率不高，但可与 没有实质上改变生成或沉积ECM的能力的以上那些区分开来。另一方面，其它编织材料用 于ECM制备，如聚烯烃材料，是编织构型为细胞生长和ECM沉积提供足够几何空间。例如，通过以下方法制备尼龙网用于本发明的任何步骤的培养切割成所需尺寸， 用0. 1-0. 5M乙酸洗涤，接着用高纯度水漂洗，然后蒸汽灭菌。为了用作ECM生成的三维支 架，筛网尺寸设为约IOcmX IOcm的正方形。但是，筛网可以是适于意欲应用的任何尺寸，并 可用于本发明的任何方法，包括接种、细胞生长和ECM生成的培养方法和最终形式的制备。在其它方面，用于产生培养组织的支架由微载体——其为珠子或颗粒——组成。 该珠子可以是微观的或宏观的及可进一步成形为需要的尺寸以允许向组织内渗透，或进一 步紧压形成特定的几何形状。一些组织渗透实施方式中，用于细胞培养的构架包括与细胞 结合形成三维组织的颗粒。细胞附于颗粒并彼此附着，形成三维组织。颗粒和细胞的复合 体大小足以进药入组织或器官，如通过注射或导管。一般考虑珠子或微载体为二维体系或 支架。如本文所用，“微载体”指具有纳米级到微米级尺寸的颗粒，其中该颗粒可以是任 何形状或几何形状，不规则形，非球形，球形或椭圆体形状。适于此目的的微载体的尺寸可以是适于特定应用的任何尺寸。一些实施方式中， 适于三维组织的微载体的尺寸可以是可通过注射进药的那些尺寸。一些实施方式中，微 载体具有至少约Ιμπκ至少约10 μ m、至少约25 μ m、至少约50 μ m、至少约100 μ m、至少约 200 μ m、至少约300 μ m，至少约400 μ m、至少约500 μ m、至少约600 μ m、至少约700 μ m、至少 约800 μ m、至少约900 μ m、至少约1000 μ m的颗粒尺寸范围。—些方面，其中微载体由生物降解材料制成。一些方面，可使用包括两层或多层不 同生物降解聚合物的微载体。一些实施方式中，至少外部第一层具有生物降解特性，以在培 养中形成三维组织，同时具有不同于第一层的特性的可生物降解的至少内部第二层被制成 当进药到组织或器官时腐蚀。
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一些方面，微载体是多孔微载体。多孔微载体指具有间隙的微载体，通过该间隙分 子从微粒中可扩散进来或出去。其它实施方式中，微载体是非多孔微载体。非多孔微粒指 这样的微粒其中选定尺寸的分子不在微粒中扩散进来或出去。用于组合物中的微载体是生物相容的，且对细胞低毒或无毒性。合适的微载体的 选择可取决于要治疗的组织、要治疗的受损类型、需要的治疗长度、细胞培养物的体内寿命 和形成三维组织所需的时间。微载体可包括各种聚合物，天然或合成的，带电(即，阴性或 阳性)或不带电的，生物降解或非生物降解的聚合物。聚合物可以是同聚物、无规共聚物、 嵌段共聚物、接枝共聚物和分支聚合物。—些方面，微载体包括非生物降解微载体。非生物降解微胶囊和微载体包括但不 限于由聚砜、聚(丙烯腈-共-氯乙烯)、乙烯乙酸乙烯酯、羟乙基甲基丙烯酸甲基丙烯酸 甲酯共聚物制成的那些。其可用于提供组织膨胀特性或用于微载体被机体去除的实施方式 中。一些方面，微载体包括可降解的支架。其包括从天然存在的聚合物制成的微载体， 其非限制性实例包括血纤蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、胶原蛋白、明胶、卵磷脂、壳聚糖、藻酸 盐或诸如聚赖氨酸的聚氨基酸等。在其它方面，可降解的微载体由合成聚合物制成，其非限 制性实例包括聚丙交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚 (己酸内酯)、聚二氧六环酮三亚甲基碳酸盐、聚羟基烷基酸酯(如，聚(羟基丁酸酯)、聚 (乙基谷氨酸)、聚(DTH亚氨基碳(双酚A亚氨基碳)、聚(邻酯)和聚氰基丙烯酸酯等。—些方面，微载体包括水凝胶，其一般为充水的亲水性聚合物网络。水凝胶具有选 择性触发聚合物溶胀的优势。取决于聚合物网络的组成，微粒的溶胀可以由各种刺激触发， 包括PH、离子强度、热、电、超声和酶活性。在水凝胶组合物中有用的聚合物的非限制性实例 包括由以下的聚合物形成的那些聚合物聚(丙交酯-共-乙交酯) ’聚(N-异丙基丙烯酰 胺)；聚(甲基丙烯酸接枝聚乙二醇)；聚丙烯酸和聚(氧丙烯-共-氧乙烯)乙二醇；和天 然化合物，如硫酸软骨素、壳聚糖、明胶、血纤蛋白原或合成聚合物和天然聚合物的混合物， 例如壳聚糖-聚(环氧乙烷)。聚合物可以可逆或不可逆地交联，形成适于形成三维组织的 凝胶。在示例性方面，用于本发明的微载体或珠子的全部或部分由葡聚糖组成。根据本发明，培养方法适用于不同类型的细胞的增殖，包括基质细胞，如成纤维细 胞，尤其原代人新生儿包皮成纤维细胞。在不同方面，接种于支架或构架上的细胞可以是基 质细胞，其包括成纤维细胞，有或无其它细胞，如以下进一步说明。一些实施方式中，细胞是 一般得自结缔组织的基质细胞，包括但不限于(1)骨；(2)松散的结缔组织，包括胶原蛋白 和弹性蛋白；(3)形成韧带和腱的纤维结缔组织，(4)软骨；(5)血液中的ECM ； (6)包括脂肪 细胞的脂肪组织；和(7)成纤维细胞。基质细胞可得自不同组织或器官，如皮肤、心脏、血管、骨髓、骨骼肌、肝脏、胰腺、 脑、包皮，其可通过活组织检查(如果合适)或尸体解剖获得。一方面，胎儿成纤维细胞可 从包皮大量获得，如新生儿包皮。—些方面，细胞包括成纤维细胞，，其可来自胎儿源、新生儿源、成人源或其组合。 一些方面，基质细胞包括胎儿成纤维细胞，其可支持各种不同的细胞和/或组织生长。如本 文所用，胎儿成纤维细胞指得自胎儿源的成纤维细胞。如本文所用，新生儿成纤维细胞指得
11自新生儿源的成纤维细胞。在适当的条件下，成纤维细胞可产生其它细胞，如骨细胞、脂肪 细胞和平滑肌细胞及中胚层起源的其它细胞。一些实施方式中，成纤维细胞包括皮肤成纤 维细胞，其是得自皮肤的成纤维细胞。普通的人皮肤成纤维细胞可以从新生儿包皮中分离。 这些细胞一般在原代培养结束时冻存。在其它方面，三维组织既可单独又可结合本文探讨的任何细胞类型用干细胞或祖 细胞制备。作为实例且非限制地，干细胞和祖细胞包括胚胎干细胞、造血干细胞、神经元干 细胞、表皮干细胞和间充质干细胞。一些实施方式中，“特定”三维组织可通过用细胞接种支架制备，该细胞得自特定 的器官，即，皮肤、心脏，和/或得自特定的个体，该个体随后将接受按照本文所述方法在培 养中生长的细胞和/或组织。对于某些体内应用，优选从患者本身的组织中获得基质细胞。基质支持构架存在 下细胞的生长可通过向构架添加或将构架支持体包被以如下物质而进一步促进蛋白质， 如，胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性纤维、网状纤维、糖蛋白；糖胺聚糖，如，硫酸肝素、4-硫酸 软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等；细胞基质，和/或其它材料。因此，由于本文所述的二维或三维培养体系适合不同细胞类型和组织的生长，并 取决于将要培养的组织和需要的胶原蛋白类型，可选择适当的基质细胞接种构架。尽管本发明的方法和应用适用于不同细胞类型，如组织特异性细胞或本文讨论的 不同类型的基质细胞，本发明所用细胞的来源(derivation)也可以是物种特异性的。因 此，可生成物种特异性的ECM组合物。例如，本发明所用的细胞可包括人细胞。例如，该细 胞可以是人成纤维细胞。同样，细胞来自另一物种的动物，如马(马)、犬科(狗)或猫科 (猫)细胞。此外，来自一个物种或物种一个品系的细胞可用于生成用于其它物种或相关品 系(如，异源、同源和异种品系)的ECM组合物。也可以理解的是得自不同物种的细胞可结 合生成多物种ECM组合物。因此，本发明的方法和组合物适合涉及非人类动物的应用。如本文所用，“兽医学” 指有关动物——尤其是家畜——的内科或外科治疗或与之有关联的医药科学。常见的兽医 动物可包括哺乳动物、两栖动物、鸟类、爬行动物和鱼类。例如，典型的哺乳动物可包括狗、 猫、马、兔、灵长类动物、啮齿类动物和农场动物，如牛、马、山羊、绵羊和猪。如上所述，培养中可能存在其它细胞与基质细胞在一起。这些其它的细胞可能具 有一些有益的效果，包括支持培养中的长期生长、增强生长因子的合成和促进细胞对支架 的粘附等。作为非限制性实例，其它细胞类型包括平滑肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、骨骼肌 细胞、内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、单核细胞和脂肪细胞。该细胞可随成纤维细胞一起接种 于构架上，或在一些方面，无成纤维细胞。这些基质细胞可得自合适的组织或器官，作为实 例而非限制，包括皮肤、心脏、血管、骨髓、骨骼肌、肝脏、胰腺和脑。在其它方面，除了成纤维 细胞，一种或多种其它细胞类型被接种于支架。在还有其它方面，支架仅接种成纤维细胞。通过分解合适的器官或组织可容易分离出成纤维细胞，该器官或组织将充当成纤 维细胞的来源。例如，组织或器官可经机械分解和/或用削弱相邻细胞间连接的消化酶和 /或螯合剂处理，使得能将组织分散成无明显细胞破损的单个细胞的悬浮液。酶的解离可 通过切碎组织并用任何一些单独或结合的消化酶处理组织糜完成。这些酶包括但不限于胰 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、DNA酶、链霉蛋白酶和/或分
12散酶等。机械破坏也可通过一些方法完成，该方法包括但不限于研磨器、搅拌器、滤网、均化 器、压力盒或声波仪(insonators)的利用，这仅仅例举一小部分。一方面，离体的包皮组织 用消化酶处理，一般用胶原蛋白酶和/或胰蛋白酶处理以将细胞从被包围结构解离出来。成纤维细胞的分离，例如，可按如下实现彻底洗涤新鲜的组织样品并在Hanks' 平衡盐溶液(HBSS)中切碎以去除血清。组织糜在新制备的诸如胰蛋白酶的解离酶溶液 中温育1-12小时。在该温育后，解离的细胞悬浮，通过离心沉淀，并在培养皿上涂平板。 所有的成纤维细胞会在其它细胞之前粘附，因此合适的基质细胞可以选择性分离并生 长。分离的成纤维细胞然后可生长至汇合，从汇合的培养物挑起并接种于三维构架上，参 见 Naughton et al.，1987，J. Med. 18 (3&4) :219_250。用高浓度基质细胞——如约 IO6 至 5 X IO7个细胞/ml-接种三维构架会导致三维基质支持体在较短时间内建立。一旦组织变成单个细胞的悬浮液，该悬浮液可分馏成亚群，从中可得到成纤维细 胞和/或其它基质细胞和/或成分。这也可利用细胞分离的标准技术完成，包括但不限于 特异性细胞类型的克隆和选择、不需要的细胞的选择性破坏(负选择)、基于混合种群中差 异细胞可凝集性的分离、冷冻-解冻过程、混合种群中细胞的差异粘附特性、过滤、常规和 区带离心、离心淘洗(逆流离心)、单位重力分离、逆流分配、电泳和荧光激活细胞分选。克 隆选择和细胞分离技术的综述，参见Freshney，Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed. , A. R. Liss, Inc. , New York，1987，Ch. 11 禾口 12，pp. 137—168。一方面，分离的成纤维细胞可生长产生细胞库。创建细胞库以允许起始不同数量 和时间安排的分批培养，并且允许对细胞污染物和特殊细胞特性进行事前测试。来自细胞 库的成纤维细胞随后生长，增加细胞数量到达对于接种支架合适的水平。涉及细胞环境暴 露和细胞接触材料的操作通过无菌实践进行，以减少外来材料或不需要的微生物污染的可 能性。本发明的另一方面，分离后细胞可通过几代生长达到适于建立主细胞库的数量。 然后可获得细胞库，填入适当的容器并保藏在低温条件中。来自主细胞库于冷冻瓶中的细 胞可解冻并通过额外几代(通常两代或多代)生长。然后该细胞可用于制备低温保藏的工 作细胞库。细胞扩大步骤利用在工作细胞库阶段的细胞小瓶，进一步增加细胞数量以接种支 架或支持体，如筛网(如，三维筛网)或微载体(如，珠子，二维的)。每一代是一系列传代 培养步骤，其包括接种细胞于生长表面、培育、饲养细胞和收获。细胞库和细胞扩大的培养可通过接种培养容器进行，如培养瓶、滚瓶或微载体。基 质细胞，如成纤维细胞，附于目的生长表面并在培养基存在下生长。培养容器，如培养瓶、滚 瓶和微载体，为细胞培养特别配置，且通常由各种胜任目的应用的塑料材料制成。微载体一 般是显微可见或肉眼可见的珠子，且一般由各种塑料材料制成。但是，其也可由其它材料制 成，如玻璃或固体/半固体生物基材料，如胶原蛋白或其它材料，如葡聚糖，如上所述的改 性糖化合物。培养中，消耗的培养基在细胞生长期间定期用新培养基取代，以保持营养物足以 可用和培养中抑制性产物的去除。培养瓶和滚瓶为细胞生长于其上提供表面，一般用于依 赖贴壁细胞的培养。一方面，温育在37°C加热下的室中进行。要求培养基和室环境相通的培养拓扑结
13构在室气体空间内使用空气和5% CO2 ν/ν以助于调节ρΗ。可选地，为保持培养温度和ρΗ 而装备的容器可用于细胞扩大或ECM生成操作。低于35°C或高于38°C的温度及低于3%或 高于12%的(X)2浓度可能不合适。从粘附表面收获细胞可通过生长培养基的去除和用缓冲盐溶液冲洗细胞进行，以 减少酶竞争性蛋白质、解离酶的应用以及然后在细胞分离后酶的中和。收集收获的细胞悬 浮液并通过离心分离收获液。可对来自传代培养收获的细胞悬浮液取样以评价回收细胞的 量和其它细胞属性，以及随后与新培养基组合并用作接种物。用于制备细胞库和支架接种 物的传代数量对于取得合意的ECM特性是至关重要的。制备适当的支架后，其通过播种制备的基质细胞接种。支架的接种可以多种方式 实施，如沉降。以与低氧生长筛网相同的方式制备为有氧条件下的ECM培养制备的筛网，除 了没有用厌氧室产生低氧条件。例如，对于为有氧和低氧条件下的ECM培养制备的两种筛网，将制备并灭菌的筛 网置于150mm直径X 15mm深的无菌培养皿中并垛叠约10层厚。然后通过沉降接种筛网垛 叠。将细胞加入新培养基得到对接种物合适的细胞浓度。将接种物加入筛网垛叠，其中细 胞沉积在尼龙纤维上并在温育条件下粘附。足够的时间后，从垛叠中无菌分离分别接种的 筛网片，并无菌地分别置于单独的150mmX15mm培养皿，该培养皿包含约50ml的生长培养 基。接种培养物的培育在低氧条件下进行，相比在正常培养条件下生成的ECM，发现其 生成了具有独特性质的ECM和周围培养基。如本文所用，低氧条件被表征为相比环境空气 的氧浓度(约15% -20%的氧)较低的氧浓度。一方面，低氧条件被表征为低于约10%的 氧浓度。一方面，低氧条件被表征为氧浓度约1 %到10 ^UW到9 ^UW到8 ^UW到7%、 1%到6%、1%到5%、1%到4%、1%到3%、或1%到2%。在某一方面，培养容器中体系保 持约1-3%的氧。可通过利用允许人控制环境气体浓度的培养装置产生和保持低氧条件，培 养装置例如，厌氧室。细胞培养物的培育一般在具有15-20%氧气和5% CO2的正常大气中进行以扩增 和接种，在这点上分流低氧培养物到充满95%氮气/5% CO2的密闭室中，从而在培养基中 创造了低氧环境。例如，带有为在低氧条件下产生ECM而培养的筛网的培养皿在37°C和95%空气 /5% CO2温育下开始生长2-3周。在接近大气的培养期后，将筛网培养皿在设计用于厌氧 培养的室中温育，该室用约95%氮气和5% CO2的气体混合物清洗。在培养期中，消耗的生 长培养基在大气氧水平下用新鲜培养基替换，并交换培养基后，将填满筛网的培养皿置于 厌氧室，该室用95%氮气/5% CO2清洗，然后在37°C温育。当其达到所需尺寸或包含所需 生物组分时，获得培养的筛网。在温育时期期间，基质细胞在开始生长到构架开口中之前，会沿直线生长并包围 三维构架。生长细胞产生大量生长因子、调节因子和蛋白质，其中一些分泌在周围培养基， 沉积在支持体上组成ECM的另外一些在下面更充分论述。生长和调节因子可添加到培养物 中，但非必需。基质细胞的培养产生不可溶和可溶部分。细胞生长到适当的程度，允许ECM 蛋白质的充分沉积。在三维组织培养期间，增殖细胞可从构架释放并粘在培养容器壁上，在那其可继
14续增殖并形成汇合单层。为了使这种可能影响细胞生长的事件最小化，可在加料期间或通 过将细胞培养物转移到新培养容器而去除释放的细胞。汇合单层的去除或培养组织向新容 器中的新培养基的转移保持或恢复培养物的增殖活性。一些方面，去除或转移可在培养容 器中进行，该培养容器含有超过25 %汇合的培养细胞的单层。可选地，在一些实施方式中培 养经搅拌以防止释放的细胞粘结；其它实施方式中，将新培养基连续输注穿过体系。一些方 面，可同时或第二个接着第一个一起培养两种或多种细胞类型(如，成纤维细胞和平滑肌 细胞或内皮细胞)。支架接种后，将细胞培养物在合适的营养培养基和温育条件——其支持细胞生 长为三维组织——下温育。很多商用培养基，如Dulbecco' s Modified Eagles Medium (DMEM)、RPMI 1640、Fisher' s、Iscove' s和McCoy' s，可适用于支持细胞培养物生长。 可用额外的盐、碳源、氨基酸、血清和血清组分、维生素、矿物质、还原剂、缓冲剂、脂质、核 苷、抗生素、粘附因子和生长因子补充培养基。技术人员可用的各种参考著作(如，Methods for Preparation of Media,Supplements and Substrates for Serum Free Animal Cell Cultures,Alan R. Liss,New York(1984) ；Tissue Culture-Laboratory Procedures,John Wiley & Sons,Chichester,England(1996) ；Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Techniques, 4th Ed. , Wiley-Liss (2000))中述及了不同类型培养基的配方。用于任何本发明培养步骤的生长培养基或培养基，无论在有氧或低氧条件下，可 包括血清或无血清。一方面，培养基是Dulbecco，s Modified Eagle Medium，其具有4. 5g/ L葡萄糖、丙氨酰-L-谷氨酰胺、Eq 2mM，并公称补充10%的胎牛血清。另一方面，培养基是 无血清培养基，是Dulbecco，s Modified Eagle Medium，其具有4. 5g/L葡萄糖基培养基和 Glutamax ，补充0. 5 %血清白蛋白、2 μ g/ml肝素、1 μ g/ml重组碱性FGF、1 μ g/ml大豆胰 蛋白酶抑制剂、IX ITS补充剂(胰岛素-运铁蛋白-硒，Sigma Cat. No. 13146)、1 1000 稀释脂肪酸补充剂(Sigma Cat. No. 7050)和1 1000稀释胆固醇。此外，同样的培养基可 用于低氧和有氧培养。一方面，接种并生长第一周后生长培养基从血清基培养基改变为无 血清培养基。温育条件将在适当的pH、温度和气体(如，02、CO2等)条件下以保持低氧生长条 件。一些实施方式中，温育期间细胞培养物可悬浮在培养基中以使增殖活性最大化并生成 促进各部分的期望生物活性的因子。此外，可周期性“加料”该培养物以去除消耗的培养基， 减少释放的细胞和添加新营养源。温育期间，培养的细胞在开始生长到支架开口中前沿直 线生长并包围三维支架丝。低氧条件下温育期间，相比起约15-20%正常大气氧浓度下的培育，数千基因被差 异表达。发现一些基因在这些组合物中被增量调节或减量调节，最显著的是某些层粘连蛋 白种类、胶原蛋白种类和Wnt因子。在不同方面，可通过与普通条件生长相比由低氧条件下 生长特有的酶解图谱(指纹图谱)或细胞产生的细胞产物组限定三维ECM。本文具体示例 的ECM组合物中，通过各种因子的表达和/或分泌表征三维组织及周围培养基。本文述及的三维组织和组合物含有存在于支架或构架上的ECM。一些方面，由于低 氧条件下的生长和生长在支持体上的细胞的选择，ECM包括各种层粘连蛋白和胶原蛋白类 型。可通过选择产生适当胶原蛋白类型的成纤维细胞和低氧条件下生长细胞来操纵或增加 沉积的ECM蛋白质的比例，在该低氧条件下特定层粘连蛋白和胶原蛋白种类的表达被增量调节或减量调节。在一些方面，利用限定特殊胶原蛋白类型的适当同种型或亚类的单克隆抗体实现 成纤维细胞的选择。在其它方面，固体基底，如磁性小珠，可用于选择或去除具有结合的抗 体的细胞。这些抗体的组合可用于选择(正选择或负选择)表达所需胶原蛋白类型的成纤 维细胞。可选地，用于接种构架的基质可以是合成所需胶原蛋白类型的细胞混合物。胶原 蛋白的示例性类型的分布和来源如表I所示。表1.各种类型胶原蛋白的分布和来源
权利要求
1.一种制备包含一种或多种胚胎蛋白质的组合物的方法，包括在低氧条件下于适当的生长培养基中在表面上培养细胞，从而生成包含一种或多种胚 胎蛋白质的可溶和不可溶组合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述生长培养基包括血清。
3.权利要求1所述的方法，其中所述生长培养基无血清。
4.权利要求1所述的方法，其中所述低氧氧条件是1-5%氧。
5.权利要求1所述的方法，其中与约15-20%氧的氧条件下生成的培养基相比胶原蛋 白种类被增量调节。
6.权利要求5所述的方法，其中所述胶原蛋白选自Va1 ;ΙΧα 1 ;IXa2 ;VIa2 ； VIII α 1 ；IVa 5 ；VII a 1 ；XVIII a 1 ；或 XII a 1 型。
7.权利要求1所述的方法，其中与约15-20%氧的氧条件下生成的培养基相比Wnt种类被增量调节。
8.权利要求7所述的方法，其中Wnt种类是wnt7a和wnt 11。
9.权利要求1所述的方法，其中与约15-20%氧的氧条件下生成的培养基相比层粘连 蛋白种类被增量调节。
10.权利要求9所述的方法，其中所述层粘连蛋白种类是层粘连蛋白8。
11.权利要求1所述的方法，其中透析、冻干并在缓冲剂中重构所述无细胞上清液。
12.权利要求1所述的方法，其中透析、干燥并在缓冲剂中重构所述无细胞上清液。
13.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。
14.权利要求13所述的方法，其中所述成纤维细胞是新生成纤维细胞。
15.权利要求1所述的方法，其中所述表面是三维的。
16.权利要求15所述的方法，其中所述表面包括筛网。
17.权利要求1所述的方法，其中所述表面是二维的。
18.权利要求17所述的方法，其中所述表面包括珠子。
19.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是种特异性的。
20.一种权利要求1所述方法制备的组合物，其中所述组合物是可溶部分。
21.一种权利要求1所述方法制备的组合物，其中所述组合物是不可溶部分。
22.—种权利要求1所述方法制备的组合物，其中所述组合物是可溶和不可溶部分的 组合。
23.一种细胞修复和/或再生的方法，包括用权利要求20、21或22中任一项所述的组 合物接触要修复或再生的细胞。
24.权利要求23所述的方法，其中所述细胞是骨软骨细胞。
25.—种组织再生膜片，包括权利要求20、21或22中任一项所述的组合物。
26.—种组织培养体系，包括权利要求20、21或22中任一项所述的组合物。
27.权利要求沈所述的组织培养体系，其中所述体系用于支持干细胞的生长。
28.权利要求27所述的组织培养体系，其中所述干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞 或神经元干细胞。
29.一种与装置在对象体内植入联合使用的表面涂层，所述表面涂层包括权利要求 20,21或22中任一项所述的组合物。
30.权利要求四所述的涂层，其中所述装置是起搏器、支架、支架移植物、人造血管、心 脏瓣膜、支路、送药口、导管或膜片。
31.权利要求四所述的涂层，其中所述涂层用于调节伤口愈合，调节炎症，调节纤维囊 形成，调节组织内生长或调节细胞内生长。
32.—种治疗受损组织的方法，包括在使所述受损组织得到治疗的条件下用权利要求 20,21或22中任一项所述的组合物接触所述受损组织。
33.权利要求32所述的方法，其中所述组织是心脏组织。
34.权利要求32所述的方法，其中所述组织是梗塞或缺血性组织。
35.权利要求32所述的方法，其中所述组织是肠组织。
36.一种改善对象皮肤表面的方法，包括将权利要求20、21或22中任一项所述的组合 物给药到对象的皱纹位置，从而提供改善的皮肤表面。
37.一种生物防粘剂，包括权利要求20、21或22中任一项所述的组合物。
38.一种用于细胞输送或在输送位点保持的生物载体，包括权利要求20、21或22中任 一项所述的组合物。
39.一种用于对象软组织修复或加强的方法，包括将权利要求20、21或22中任一项所 述的组合物给药到对象的皱纹位置，从而提供软组织修复或加强。
40.一种促进毛发生长的方法，包括用权利要求20、21或22中任一项所述的组合物接 触细胞，从而促进毛发生长。
41.权利要求40所述的方法，其中所述细胞是毛囊细胞。
42.权利要求40所述的方法，其中所述细胞被体内接触。
43.权利要求40所述的方法，其中所述细胞被离体接触。
44.权利要求43所述的方法，其中所述细胞被移植到对象中。
45.一种生成Wnt蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)的方法，包括在低氧条件下于适当的生长培养基中在表面上培养细胞，从而生成Wnt蛋白和VEGF。
46.权利要求45所述的方法，其中所述生长培养基无血清。
47.权利要求45所述的方法，其中所述低氧氧条件是1-5%氧。
48.权利要求47所述的方法，其中与约15-20%氧的氧条件下生成的培养基相比Wnt 种类被增量调节。
49.权利要求48所述的方法，其中所述Wnt种类是wnt7a和wnt 11。
50.权利要求45所述的方法，其中与约15-20%氧的氧条件下生成的培养基相比VEGF 种类被增量调节。
51.权利要求50所述的方法，其中所述VEGF种类是VEGF-A或其同种型。
52.权利要求45所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。
53.权利要求45所述的方法，其中所述表面是三维的。
54.权利要求53所述的方法，其中所述表面包括筛网。
55.权利要求45所述的方法，其中所述表面是二维的。
56.权利要求55所述的方法，其中所述表面包括珠子。
全文摘要
本发明涉及产生包括胚胎蛋白质的组合物的方法。该方法包括在低氧条件下在生物相容的二维或三维表面上体外培养细胞。该培养方法产生可溶部分和不可溶部分，它们可以分开使用或组合使用，以获得生理上可接受的用于各种医疗和治疗应用的组合物。
文档编号C12N5/071GK102066558SQ200980110464
公开日2011年5月18日 申请日期2009年1月30日 优先权日2008年1月30日
发明者F·捷格罗, G·K·诺尔顿, K·尼基, M·加特纳 申请人:希斯托金公司