专利名称：胰岛细胞的制备和移植的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及胰岛移植领域，更具体地，涉及用于改进胰岛细胞的分离、存活 能力及移植的新组合物及方法。
背景技术：
其背景与胰岛细胞移植相关地描述，而不限制本发明的范围。胰岛细胞移植可以用于恢复胰岛素产生及对I型(青少年)糖尿病的血糖控制。 当前的结果及毒性不能证明广泛应用的合理性，然而在这两者中的改进能够使此项技术可 用于临床(非试验的)应用，并能够使此成为优选及领先的I型糖尿病疗法。在授权给Habener等人的美国专利No. 6，923，959中有一个这种方法，即在器官 移植之前，预先诱导免疫耐受性状态的方法。简单地说，描述了新鉴定的干细胞用于I型 胰岛素依赖型糖尿病及其他症状的治疗的组合物及方法，所述干细胞能够分化成为多种胰 岛细胞，包括产生胰岛素的beta细胞以及肝细胞。巢蛋白已经被确认为胰岛干细胞的分 子标记物，而细胞角蛋白-19充当明显不同种类的胰岛导管细胞的标记物。描述了这样的 方法，其中巢蛋白阳性的干细胞可以从胰岛中分离，并被培养以获得进一步的干细胞或类 胰岛样结构(pseudo-islet like structures)。公开了胰腺干细胞的体外分化方法。描 述了方法，借助该方法可以分离、扩增胰腺干细胞并将其以异种(allogeneically)、同源 (isogeneically)或异基因(xenogenically)地移植到需要的患者中，以替代损失或损伤 的胰岛素分泌细胞或其他细胞。另一种用于提高移植的组织存活能力的方法示于授权给Cochrum等人的美国专 利No. 5，578，314中，其公开了用于移植的生物组织的多层藻酸盐覆盖物。简单地说，示教 了用于移植的生物组织及细胞的多层覆盖物的方法，在该方法中所述细胞或组织移植物使 用纯化的藻酸盐多重覆盖物包被。该方法包括施加与二价阳离子形成凝胶的藻酸钠第一包 被，随后可选地使用锶、钡或其他二价阳离子处理，使藻酸钠中单层覆盖的液滴再悬浮，并 在第一覆盖物周围通过二价阳离子从单层的覆盖物到周围可溶的藻酸盐的交换或扩散而 形成卤素层，除去多余的覆盖物及使得剩余的可溶藻酸盐与二价阳离子形成凝胶。包覆的 移植物具有不同的结构，其生物组织或细胞核心被第一藻酸盐包覆所覆盖，所述包覆被中 间的卤素层包围，该卤素层被外侧覆盖物所覆盖。Goto等人递交的美国专利申请No. 20080009061涉及保存胰岛的方法，保存胰岛 的容器以及用于移植胰岛的试剂盒。简单地说，所述用于保存胰岛的方法包括用于保存胰 岛的容器及用于移植胰岛的试剂盒，以有效地保存胰岛。Brand等人递交的美国专利申请No. 20060189520涉及糖尿病使用组合物的疗法， 并提供了胰岛再生疗法的方法，所述疗法包括一组因子的成员，该因子补充胃泌素/CCK受 体配体，使用制剂、设备及方法以持久释放递送，并局部递送到靶器官。发明概述本发明用于改善胰岛异种移植的效果，具体地通过(a)通过给予阿那白滞素 (Anakinra)(重组的人白细胞介素_1受体拮抗剂，例如，Kinert )阻断白细胞介素_1在
4移植物移入期的激活，保护接收者免受炎症导致的胰岛损坏，(b)通过ET-Kyoto溶液的导 管注射，增加从供体胰腺得到的胰岛的收率，和/或(c)在胰腺消化期间，通过使用胰蛋白 酶抑制剂进行胰蛋白酶抑制作用，来增加从供体胰腺得到的胰岛的收率。更具体地，本发明包括制备可移植的胰岛制备物(pr印aration)的组合物和方 法，所述方法包括，获得供体胰腺；向胰腺导管注射ET-Kyoto溶液或其等价物；分离胰腺 β-胰岛细胞；并使用人类白细胞介素-1拮抗剂在胰岛移植时处理患者。在一个实施方案 中，其中所述胰腺β-胰岛细胞使用合适的胶原蛋白酶处理，例如，人类胶原蛋白酶。在一 个具体的实施例中，胰岛在其从胰腺中提取之后，在ET-Kyoto溶液中处理。在一个方面，人 类白细胞介素-1拮抗剂选自白细胞介素-lbetadL-Ιβ)基因转录的一种或多种改性剂； IL-I β基因翻译的一种或多种改性剂；靶向IL-I β表达的一种或多种siRNA ；—种或多种 IL-I β受体阻断剂；一种或多种白细胞介素-1受体拮抗剂蛋白质；一种或多种白细胞介 素-1受体拮抗剂肽；改变IL-I β的释放的一种或多种活性剂；中和IL-I β的一种或多种 抗体；阻断IL-I β受体的一种或多种抗体；一种或多种重组的、天然产生的IL-I β受体拮 抗剂；一种或多种阴离子运输抑制剂、脂氧素及α “生育酚，其抑制IL-I β的释放；一种或 多种鸦片样物质，其抑制蛋白水解酶，所述蛋白水解酶将无活性的IL-I β前体转化为其成 熟的、有活性的形式；中和IL-I β的生物功能的一种或多种抗体，及其混合物和组合物。在 一个具体的实施例中，所述IL-I β拮抗剂为阿那白滞素。该方法可以进一步包括同时向患 者提供肿瘤坏死因子拮抗剂，所述拮抗剂选自基因转录的抑制剂、灭活的肿瘤坏死因子、肿 瘤坏死因子受体阻断剂及可溶的肿瘤坏死因子受体。本发明的另一个方面为制备可移植的胰岛制备物的方法，所述方法包括步骤获 得供体胰腺；向胰腺导管注射ET-Kyoto溶液或其等价物；在胰蛋白酶抑制剂存在下从获 得的胰腺中分离胰腺β “胰岛细胞；并使用人类白细胞介素-ι拮抗剂在胰岛移植时处理 患者。胰蛋白酶抑制剂的实例包括血清α-1抗胰蛋白酶、利马豆胰蛋白酶抑制剂、库尼兹 (Kunitz)抑制剂、卵类粘蛋白抑制剂或大豆抑制剂。本发明的另一个实施方案为制备可移植的胰岛制备物的方法，通过获得供体胰 腺；在胰蛋白酶抑制剂存在下从获得的胰腺中分离胰腺β-胰岛细胞分离胰腺β-胰岛细 胞；并使用人类白细胞介素-1拮抗剂及肿瘤坏死因子拮抗剂在胰岛移植时处理患者。附图简要说明为了更完全地理解本发明的特征和优点，参考本发明的详细描述以及附图进行说 明，其中
图1显示导管注射组(DI)及标准组(标准)中纯化前后的胰岛收率。DI组在胰 岛纯化前后的胰岛收率均显著地更高。图2显示DI组中三个患者在胰岛移植前后的空腹血糖值。所有患者在胰岛移植 后改善了血糖控制。图3显示了 DI组中三个患者在胰岛移植前后的日常胰岛素剂量。所有三个患者 变得不依赖胰岛素。发明详述虽然在下文详述了本发明的不同实施例的制备和使用，应该意识到本发明提供多 种可行的发明构思，该构思可以在多种具体环境下具体化。此处讨论的具体的实施例仅仅为了说明制造并使用本发明的具体方法，而非限制本发明的范围。
为了减轻本发明理解上的困难，多个术语定义于下文。此处定义的术语具有本发 明相关领域普通技术人员所熟知的含义。术语如“一个(a) ”，“一个(an) ”，“该(the)，，不 期待仅指单数的个体，而包括具体实例可能用作说明的一般的类别。该术语在此用于描述 本发明的具体实施例，但其使用并不限制本发明，除非在权利要求中指出。
缩写列表
佳
2-D ABO
AE
AIDS ALT ANC AST BCC BUMC BUN CBC CFR CMP CRF DL DM DRI
EBV 爱泼斯坦-巴尔病毒 EU 内毒素单位 FDA 食品与药物管理局 Fr 法国的 G 厚度 g 克
GFR 肾小球滤过率 Glofil 碘酞GFR评价 Hb血红蛋白
HbAlc 血红蛋白 HBsAg B型肝炎表面抗体 HBV B型肝炎病毒 HCV C型肝炎病毒 Hg萊
HIV 人类免疫缺陷病毒 HLA 人类白细胞抗体
血型系统(A，B, AB及0) 不良事件
获得性免疫缺陷综合征 丙氨酸转氨酶 嗜中性细胞绝对计数 天冬氨酸转氨酶 基底细胞瘤 贝勒大学医学中心 血液尿素氮 全血球计数 联邦管理法规 完全代谢检查 病历报告表 分升 糖尿病
糖尿病研究所[迈阿密]
Mg
镁
mL毫升mm毫米mm3立方毫米MMF麦考酚酸酯(CellCept)Na钠NCI国立癌症研究所ng纳克OGTT口服葡萄糖耐量试验PA前后方向的PAK肾脏移植后的胰腺PCP间质性浆细胞肺炎PO经口服PPD纯化的蛋白衍生物PRA群体反应性抗体PSA前列腺特异性抗原PT凝血酶原时间PTA仅胰腺移植PTT部分凝血活酶时间PV门静脉RBC红细胞SAE严重不良事件SCC鳞状细胞癌SIR西罗莫司SPK同时的胰腺-肾脏移植AlcTAC他克莫司(Prograf)TB肺结核TC总胆固醇TGC甘油三酸酯UNOS器官统一网络Uff威斯康星大学WBC白细胞
6
HTLV-I 人类T淋巴细胞病毒
HTN高血压
ICT胰岛细胞移植
ICU加护病房
IE胰岛等价物
IgG免疫球蛋白G
IgM免疫球蛋白M
IND研究用新药
INH异烟胼盐酸盐
IRB机构审查委员会
IU国际单位
IV经静脉的
IVGTT静脉葡萄糖耐量试验
K钾
kg千克
LDL低密度脂蛋白
LFT肝脏功能试验
MAGE平均血糖漂移幅度
I型糖尿病(DM)是具有显著的 :
为19岁或以下个人约120，000,以及在全年龄300，000到500，000人，以及全世界1. 5亿
人。在美国每年有30，000新诊断的病例。DM在美国是最常发的儿童慢性疾病之一、在 美国该疾病的治疗及并发症的花费为每年900亿美元。本发明的新特征包括(a)在胰岛细胞移植物接受者中使用白细胞介素-1阻碍物， (b)在器官采集时，使用保存液ET-Kyoto进行供体胰腺的导管保存，和/或(c)在供体胰腺 消化中采用胰蛋白酶抑制。ET-Kyoto溶液，及其变体，包括作为非还原二糖的海藻糖，其使 细胞膜在不同压力条件下稳定。ET-Kyoto溶液的两种变体具有不同的电解质组成，例如， Na 1 OOmmol/L, K44mmol/L (所谓“细胞外”溶液)以及“细胞内型” IT-Kyoto溶液，例如Na 20mmol/L, K 130mmol/L,以及35gr/l海藻糖。完整的溶液归纳于表1。
权利要求
制备可移植的胰岛制备物的方法，所述方法包括步骤获得供体胰腺；向胰腺导管注射ET Kyoto溶液或其等价物；分离胰腺β 胰岛细胞；以及使用人类白细胞介素 1拮抗剂在胰岛移植时处理患者。
2.权利要求1所述的方法，其中所述分离胰腺β-胰岛细胞的步骤使用胶原蛋白酶进行。
3.权利要求2所述的方法，其中所述胶原蛋白酶包括人类胶原蛋白酶。
4.权利要求1所述的方法，其中所述胰岛在其从胰腺中提取之后，在ET-Kyoto溶液中处理。
5.权利要求1所述的方法，其中所述分离胰腺β-胰岛细胞的步骤在胰蛋白酶抑制剂 的存在下进行。
6.权利要求1所述的方法，其中所述人类白细胞介素-1拮抗剂选自白细胞介 素-lbeta(IL-l β)基因转录的一种或多种改性剂；IL-I β基因翻译的一种或多种改性剂； 靶向IL-I β表达的一种或多种siRNA ；—种或多种IL-I β受体阻断剂；一种或多种白细胞 介素-1受体拮抗剂蛋白质；一种或多种白细胞介素-1受体拮抗剂肽；改变IL-I β的释放 的一种或多种活性剂；中和IL-I β的一种或多种抗体；阻断IL-I β受体的一种或多种抗 体；一种或多种重组的、天然产生的IL-I受体拮抗剂；一种或多种阴离子运输抑制剂、脂氧 素及α-生育酚，其抑制IL-I β的释放；一种或多种鸦片样物质，其抑制蛋白水解酶，所述 蛋白水解酶将无活性的IL-I β前体转化为其成熟的、有活性的形式；中和IL-I β的生物功 能的一种或多种抗体，及其混合物和组合。
7.权利要求1所述的方法，进一步包括向患者提供肿瘤坏死因子拮抗剂，所述拮抗剂 选自基因转录的抑制剂，灭活的肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子受体阻断剂及可溶的肿瘤坏 死因子受体。
8.制备可移植的胰岛制备物的方法，所述方法包括步骤 获得供体胰腺；向胰腺导管注射ET-Kyoto溶液或其等价物；从割取的胰腺中在胰蛋白酶抑制剂的存在下分离胰腺β-胰岛细胞；以及 使用人类白细胞介素-ι拮抗剂在胰岛移植时处理患者。
9.权利要求8所述的方法，其中所述胰蛋白酶抑制剂选自血清α-l抗胰蛋白酶，利马 豆胰蛋白酶抑制剂，库尼兹抑制剂，卵类粘蛋白抑制剂或大豆抑制剂。
10.权利要求8所述的方法，其中所述胰腺胰岛在其从胰腺中提取之后，在ET-Kyoto溶 液中处理。
11.权利要求8所述的方法，其中所述胰腺胰岛使用胶原蛋白酶处理。
12.权利要求11所述的方法，其中所述胶原蛋白酶包括人类胶原蛋白酶。
13.权利要求8所述的方法，其中所述人类白细胞介素-1拮抗剂选自白细胞介 素-lbeta(IL-l β)基因转录的一种或多种改性剂；IL-I β基因翻译的一种或多种改性剂； 靶向IL-I β表达的一种或多种siRNA ；—种或多种IL-I β受体阻断剂；一种或多种白细胞 介素-1受体拮抗剂蛋白质；一种或多种白细胞介素-1受体拮抗剂肽；改变IL-I β的释放的一种或多种活性剂；中和IL-I β的一种或多种抗体；阻断IL-I β受体的一种或多种抗 体；一种或多种重组的、天然产生的IL-I受体拮抗剂；一种或多种阴离子运输抑制剂、脂氧 素及α-生育酚，其抑制IL-I β的释放；一种或多种鸦片样物质，其抑制蛋白水解酶，所述 蛋白水解酶将无活性的IL-I β前体转化为其成熟的、有活性的形式；中和IL-I β的生物功 能的一种或多种抗体，及其混合物和组合。
14.权利要求8所述的方法，进一步包括向患者提供肿瘤坏死因子拮抗剂，所述拮抗剂 选自基因转录的抑制剂，灭活的肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子受体阻断剂及可溶的肿瘤坏 死因子受体。
15.制备可移植的胰岛制备物的方法，所述方法包括步骤获得供体胰腺；从割取的胰腺中在胰蛋白酶抑制剂的存在下分离胰腺β-胰岛细胞分离胰腺β-胰岛 细胞；以及使用人类白细胞介素-1拮抗剂及肿瘤坏死因子拮抗剂在胰岛移植时处理患者。
16.权利要求15所述的方法，其中所述提取使用ET-Kyoto溶液中的合适的胶原蛋白酶 进行。
17.权利要求15所述的方法，其中所述胰岛在其从胰腺中提取之后，在ET-Kyoto溶液 中处理。
18.权利要求15所述的方法，其中所述胰蛋白酶抑制剂选自血清α-1抗胰蛋白酶，利 马豆胰蛋白酶抑制剂，库尼兹抑制剂，卵类粘蛋白抑制剂或大豆抑制剂。
19.权利要求15所述的方法，其中所述胶原蛋白酶包括人类胶原蛋白酶。
20.权利要求15所述的方法，进一步包括向患者提供肿瘤坏死因子拮抗剂，所述拮抗 剂选自基因转录的抑制剂，灭活的肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子受体阻断剂及可溶的肿瘤 坏死因子受体。
全文摘要
本发明包括制备用于移植的胰岛细胞的组合物和方法。
文档编号C12N5/071GK101981180SQ200980110879
公开日2011年2月23日 申请日期2009年1月21日 优先权日2008年1月22日
发明者松本慎一 申请人:贝勒研究院