专利名称：生产生物活性hiv-1 tat蛋白的方法
生产生物活性HIV-1TAT蛋白的方法本发明涉用于疫苗的生物活性HIV-lTat、其衍生物和其前体，包括所有HIV-I分 化体-特异性形式的生产。人免疫缺陷病毒(HIV)，S卩，AIDS的病原体，持续在世界范围内快速传播。WHO和 UNAIDS估计自开始流行以来，已有超过六千万人感染了该病毒。在2004年年末，有超过 四千万人，大部分生活在发展中国家，感染了 HIV。发展中国家中HIV流行病的无情传播和 由AIDS导致的发病率和死亡率加强对针对AIDS的有效、安全且廉价的疫苗的急需性。在过去的15-20年中，HIV疫苗开发中的大部分努力集中在通过利用产生能够防 止感染的中和抗体(NA)的基本原理，靶向负责病毒结合和进入的HIV包膜蛋白(Env)而获 得消除性免疫(Wahren，2002)。然而，来自临床前和临床试验的结果，包括最初的III期试 验(VaxGen的AIDSVAX)，其中在白种人中没有观察到对原发性感染的保护作用，这些结果 是非常令人失望的。这可以通过所述疫苗不能激发保护性NA来解释，其归因于Env的高可 变性(Myers，1995)，并且阻止NA对相关的、主要是构象表位的识别；且还可以通过gpl20 的严重糖基化来解释，其有助于隐藏关键的(中和)erw-表位(在Burton 1997中综述)。最近以来，已经开发了其它方法，其目的是诱导针对其它HIV抗原的T细胞介导的 反应。这些方法目的在于控制病毒复制，其在不存在消除性免疫的条件下实现，提供保护以 避免疾病进展，并因此减少病毒传播至健康个体。然而，这些方法也都失败了。其中的一个 实例是Merck最近基于三种HIV基因进行的试验。这种疫苗使用三种成分的混合物产生， 每种成分用一种常见的感冒病毒，即5型腺病毒(Ad5)的复制缺陷型版本制成，所述5型腺 病毒(Ad5)作用为HIV gag、pol和nef基因的载体或递送载体。该疫苗不能预防感染在 接受三剂量疫苗系列中的至少一剂量的志愿者中，在接受疫苗的741名志愿者中观察到24 例HIV感染，在安慰剂组的762名参与者中观察到21例HIV感染。另外，该疫苗不减少被 感染的那些人血流中的病毒的量；诊断感染后约8-12周的HIV RNA水平在疫苗和安慰剂组 中相似。一种根本不同的方法是基于关键的HIV调控基因tat以及其蛋白产物tat作为 疫苗候选物。作为非常早期的调控蛋白并且在HIV-I复制和发病机理中起着主要作用， Tat代表疫苗开发的最佳候选物(Ensoli, 1990，1993和1994 ；Chang, 1997)。Tat是一种 在感染后非常早，甚至在HIV整合之前产生的重要的病毒调控蛋白，并且是病毒基因表达 (Arya, 1985 ；Fisher, 1986 ；Ensoli, 1993 ；Wu, 2001)、以及细胞-到-细胞病毒传播和疾病 进展所必需的。事实上，在不存在Tat时，没有或可以忽略量的结构蛋白得到表达，并且因 此，不形成传染性病毒。此外，Tat由被感染的T淋巴细胞释放在细胞外环境中(Ensoli， 1990和1993 ；Chang，1997)，并且进入感染的细胞和未感染的细胞，在感染的细胞中，其促 进HIV-I复制，在未感染的细胞中，其引起控制细胞周期的细胞因子和细胞基因的激活或 抑制(Frankel和Pabo, 1988 ；Ensoli, 1993 ；Chang, 1995)。这一方法的目的在于诱导中和 细胞外Tat的抗体和针对病毒感染的细胞的T细胞反应。一些研究表明针对Tat的免疫反应具有保护作用，并且可以在体内控制疾病的进 展(Reiss, 1990 ；Rodman, 1993 ；Re, 1995 ；Zagury, 1998 ；Re, 2001)。特别地，与疾病晚期阶段的患者相比较，在无症状HIV-感染个体中(Krone 1988，Demirhan 2000，Re 2001)和与 快速进展者相比较，在非进展者中(Zagury 1998)，已经显示了更高的抗-Tat抗体流行性。 我们最近在一组252名个体中进行了横向和纵向的研究，该组个体具有准确估测的血清转 化日期和平均7.2年的随访(Rezza，待出版)。这一研究的结果揭示在抗-Tat抗体的存在 和疾病的较缓慢进展之间的强相关性。事实上，对于抗-Tat阳性个体，发展AIDS或严重免 疫缺陷的危险比抗-Tat阴性个体低60%。纵向分析还表明持久为抗-Tat阳性的个体具有 最低的疾病进展危险，而持久为抗-Tat阴性的那些个体具有最高的发展严重免疫缺陷的 危险。特别地，暂时为抗-Tat阳性/阴性的个体与持久为阴性的个体相比具有几乎70%更 低的危险，这提供了抗-Tat抗体的存在预示较缓慢的疾病进展的证据(Rezza，待出版)。Tat的免疫原区在所有的表位M亚型中是保守的(B和T细胞)(Myers，1995)。实际 上，我们最近的数据表明来自HTLVIIIB实验室-适应病毒株的分化体B毒株-来源(BH-10) Tat蛋白的有效交叉识别(Butt0，2003)，所述HTLVIIIB实验室-适应病毒株在约20年前 (Ratner, 1985)由在非洲传播并属于不同的HIV-I分化体的病毒感染的个体分离，由此反 映出相对应的Tat区的高保守程度。具体地，来自主要感染了 A，B，C和D以及较轻程度的 F和G HIV-I亚型的意大利、乌干达和南非患者的血清以相似的水平(S卩，抗-Tat抗体的流 行性和滴度)识别BH-IOTat蛋白。这一观察得到序列保守分析结果的进一步证实，这表明 预测的Tat氨基酸序列在属于不同HIV-I分化体的不同传播病毒中是充分保守的，并且表 现出与BH-IOTat序列相对较高程度的同源性(Butt0，2003)。在Tat的第一外显子编码的部分，并且特别是在1-58区，同源性特别高，在1_58 区中包含Tat的功能结构域和大部分目前鉴定的B、T-辅助和CTL表位(Butt0，2003)。此 外，使用来自相同BH-IOTat序列的线性肽对来自意大利、乌干达和南非患者的Tat-阳性血 清的表位作图研究表明相同的识别模式，并且证实氨基末端区包含Tat的主要B细胞表位， 尽管大部分抗-Tat抗体表现为构象抗体，其不取决于感染的病毒毒株(Butt6，2003)。这 些发现表明Tat的总体性质在构象水平上也是保守的，并且提供有力的正式证据表明基于 Tat的疫苗确实可以表现为针对HIV的“通用”工具，原因在于其能够诱导有效针对不同病 毒分化体的广谱的免疫反应。我们已经通过在不同动物模型中进行的临床前研究证实了这一假说，所述不同的 动物模型包括小鼠和食蟹猴，证明用生物活性Tat蛋白或tatDNA接种是安全的，引发广谱 且特异性的免疫反应，并且最重要的是，在接种的猴子中诱导针对高度致病性病毒(SHIV 89. 6P)感染的长期保护，所述高度致病性病毒在这些猴子中引起AIDS和死亡(Cafaro， 1999,2000 和 2001)。特别地，天然Tat蛋白诱导Th-I和⑶8+CTLs细胞免疫反应和高滴度的抗-Tat 抗体，并且阻断猿/人免疫缺陷病毒(SHTV) 89. 6P的原发性感染，这如由在食蟹猴中CD4+T 细胞计数的维持和疾病发作的缺乏所示(Cafaro，1999，2000和2001)。当然，保护是长期 的，因为在两年的随访过程中，在被保护动物的外周血单核细胞或在淋巴结中均没有发现 病毒复制的迹象。此外，当用破伤风类毒素两次加强时，在任何被保护的猕猴中，无论是在 血浆中还是在淋巴结中，均没有检测到静息细胞中隐藏的残留病毒，破伤风类毒素为已知 的激活病毒复制的刺激物。长期的保护作用与针对Tat的高且稳定的体液和细胞(CD4和 CD8T-细胞反应)的存在相关。最后，在SHIV感染的猕猴中进行的试验性研究表明用TatDNA或蛋白接种在患有AIDS的猴子中也是安全的。除了表现为关于HIV/AIDS疫苗的有价值的抗原之外，生物活性Tat还表现出免疫 调节性特征，使其成为用于其它抗原的有吸引力的佐剂。事实上，我们最近已经表明，单核 细胞来源的树突细胞(MDDC)，和更小程度上巨噬细胞，而非B类淋巴母细胞细胞系或T细胞 胚细胞，有效且快速地摄取天然的而不是氧化-失活的Tat (Fanales-Belasio，2002)。当摄 取时，天然Tat促进MDDC成熟和活化(增加MHC抗原和共刺激分子的表达、生成Th-I细胞 因子和趋化因子)，导致异源和外源可溶抗原更有效的呈递(Fanales-Belasio，2002)。更 近的数据表明这些作用均由天然Tat对TNFci表达的诱导所介导(Fanales-Belasio，已投 稿)。此外，我们已经表明，在表达Tat或用外源生物活性Tat蛋白处理的B和T细胞中， Tat修饰免疫蛋白酶体的催化亚基组成。特别地，Tat上调潜伏膜蛋白7和多催化性内肽酶 复合物样1亚基，并且下调潜伏膜蛋白2亚基。这些改变与蛋白酶体的所有三种主要的蛋 白水解活性的增加相关，并且导致异源抗原亚结构域MHC-I-结合CTL表位更有效的产生和 呈递(Gavioli，2004)。因此，Tat对抗原加工和CTL表位产生的修饰可能在HIV-I感染过 程中的病毒感染的细胞的控制和Tat用于接种策略的应用具有影响。综上所述，存在日益增长的表明生物活性Tat作用为抗原和有效的佐剂的证据实 体，原因在于i)其诱导向Thl诱导的表型的MDDCs成熟和活化，ii)其得到主要组织相容 性复合物(MHC)种类I呈递途径的通路(Moy等，Mol Biotechnol (分子生物技术)，1996 ； Kim等，J Immunol (免疫学杂志)1997)，和iii)其调节蛋白酶体催化亚基组成，所述蛋白 酶体催化亚基组成修饰有利于亚结构域和隐藏表位呈递的CTL表位的序位。综合看来，这 些特征使得单独的Tat或与其它抗原结合的Tat成为HIV疫苗的最佳候选者。在血清阳性患者中，这应该有助于减少HIV-I复制和疾病进展。在接种后暴露 于病毒的个体中，疫苗可以在感染的一开始时改变病毒-宿主的动力学，并且这将影响重 要的免疫细胞的消耗和感染的进展，原因在于累积的证据表明在感染开始时病毒负荷的水 平是向疾病进展的强指示(Mellors，1996 ；Watson, 1997 ；Lifson, 1997 ；Ten Haaft, 1998 ； Staprans,1999)。这一途径还具有这样的优点不使用在目前的HIV检测中出现的HIV成分，并且患 者检测为HIV-阴性。重要的是使用Tat的生物活性形式，原因在于天然构象的保持允许诱导有效的 Thl细胞免疫反应；诱导针对构象表位的抗体；并且对于保留Tat的佐剂性质是重要的。HIV-1(HTLV-IIIB毒株，克隆BH-10)的Tat蛋白是由两个外显子编码的86个氨基 酸的分子。第一外显子的产物对于HIV-I启动子的反式激活是充分的。该区域包含4个结 构域，包括氨基端结构域(aa 1-21)，富含半胱氨酸(cystein)的结构域(aa 22_37)，核心 (aa 38-48)和碱性结构域(49_57)。富含半胱氨酸的区域是锌离子介导的二聚体形成所必 需的，并且代表反式激活结构域。碱性区域，富含赖氨酸和精氨酸残基，是核定位必需的，并 且可以特异性结合其RNA靶标，所述RNA靶标为LTR中的反式激活反应元件(TAR) (Hauber, 1989 ；Ruben, 1989 ；Roy, 1990 ；Chang, 1995)。由外显子 2 编码的 Tat C 端 14 个氨基酸不是 HIV-ILTR反式激活所必需的，但是包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，这是在胞外 基质蛋白中存在的基序(Bari 1 Iari，1993 ；Brake，1990)。这一区域和碱性结构域分别是胞外Tat与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用和胞外Tat与整联蛋白家族的细胞表面分子的 相互作用所必需的，并且介导树突细胞(DC)对Tat的摄入(Fanales-BelasiO，2002)。事实上，生物活性Tat被单核细胞来源的DC选择性且有效地摄入和加工，从而诱 导其成熟，并且促进其呈递抗原的能力，激发针对Thl模式的免疫反应，并且增加针对其它 抗原的τ细胞反应。这些功能仅由生物活性的Tat蛋白实施，并且在该蛋白氧化/失活后 消失或被极大地阻碍(Fanales-Belasio，2002)。已经发现所尝试的通过重组宿主的常规培养生产Tat仅产生物失活的Tat，并且 因此对于以商业规模生产Tat是无用的，因为生物特性的恢复可能是仅在产物的完全变性 和正确重折叠之后获得。变性和重折叠方法需要使用在对于人类应用的目的生物制剂所不 允许的溶剂，以致这些方法是无用的，且它们也不能作用为生产生物活性Tat的指导。令人吃惊地，现在已经发现通过在重组子即生产Tat的培养物的对数生长期过程 中诱导Tat生产而生产生物活性的Tat是可能的。因此，在第一方面中，本发明提供用于制备生物活性Tat的方法，所述方法包括培 养在诱导时能够表达Tat的宿主生物体，并且其中Tat的表达是在宿主生物体的对数生长 期过程中诱导的。适当的宿主生物体优选是容易允许在商业条件下大体积培养的那些。因此，优选 地尽可能地避免复杂的方法步骤。优选的生物体通常是真核生物体，包括细菌和酵母。可以使用任何能够被转化从 而表达Tat的生物体。实例包括酿酒酵母(S. cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、 和大肠杆菌(E. coli)。特别优选的是大肠杆菌。优选大肠杆菌BL21菌株，其已经专门开发 用于大体积生产。生物活性Tat —般是单体的(monomeric)，并且不被氧化，即，其以其还原形式存 在。对于细胞培养的目的，氧化是不可能的，并且在晚期生长期过程中的诱导导致产生二聚 体的、四聚体的、和/或多聚体的Tat。在不进行处理的条件下，不可能由所述分子得到生物 活性的、单体形式的Tat，所述处理使得所得到的Tat不能用于治疗制剂中。因此，在备选的方面中，本发明提供用于生产单体Tat的方法，所述方法包括培养 在诱导时能够表达Tat的宿主生物体，并且其中Tat的表达是在所述宿主生物体对数生长 期过程中诱导的。重组Tat蛋白的生物活性可以使用数种检测评估，诸如通过单核细胞来源的树突 细胞(MDDC)的摄取，Tat-缺陷型原病毒的拯救，HIV-ILTR的反式激活，卡波西肉瘤细胞和 细胞因子-激活的内皮细胞的增殖、迁移和侵入(Ensoli，1992和1993 ；Barillari 1993和 1999 ；Fiorelli, 1995 ；Fanales-Belasio, 2002) 然而，由于极好的重现性和灵敏性，以及 其对于疫苗功效的重要作用，由MDDC摄取是关于重组Tat蛋白的优选潜力检测。胞外Tat 被细胞摄取(Frankel 和 Pabo，1988 ；Ensoli 1993 ；Chang 1997 ；Tyagi 2001)，并且，与大 多数可溶蛋白不同，进入I类MHC呈递途径，并且激发CTL活性(Moy 1996 ；Kim 1997)。已 经表明，在大部分有效的APCs中，MDDCs比其它细胞类型如T细胞胚细胞和B类淋巴母细胞 细胞系更有效地摄取Tat，且以时间_、剂量-和成熟-依赖性方式摄取(Fanales-Belasio 2002)。Tat被MDDCs以低至O.Olng/ml的剂量摄取，且摄取在5-10分钟后最大。这种方法 显著地被蛋白的氧化/失活和被低温(Fanales-Belasio 2002)所妨碍，并且在本文用于表征具体的Tat样品是否是生物活性的。生物活性Tat通常能够在非免疫妥协的患者中诱导免疫学反应，并且将具有上文 关于生物活性Tat所述的其它特征。对于生物活性Tat特别优选的标记是其被单核细胞来 源的树突细胞摄取的能力。关于MDDC的Tat摄取的适当的检测记述在Fanales-Belasio Ε, Moretti S, Nappi F, Barillari G, Micheletti F, Cafaro Α,禾口 Ensoli B. “ Native HIV-ITat Protein Targets Monocyte-Derived Dendritic Cells And Enhances Their Maturation, Function And Antigen-Specific T Cell Responses (天然 HIV-lTat 蛋白 靶向单核细胞来源的树突细胞，并且提高其成熟、功能和抗原特异性T细胞反应)"J. Immunol.(免疫学杂志)2002，168 191-206 中。因此，在一方面中，本发明提供用于制备生物活性的Tat的方法，所述方法包括培 养在诱导时能够表达Tat的宿主生物体，并且其中Tat的表达是在宿主生物体的对数生长 期过程中诱导的，其中生物活性的量度是Tat被单核细胞来源的树突细胞摄取的能力。实际上，在本发明的所有方面中，生物活性的量度可以是Tat被单核细胞来源的 树突细胞摄取的能力。可以按照本发明生产表现出Tat的理想特性，特别是被MDDC摄取的能力的任何 Tat变体或突变体，并且其可以包括在"生物活性Tat"的定义中。所述变体和突变体可 以天然获得，诸如由任何HIV毒株、或分化体获得，或可以通过遗传操作编码Tat的核酸获 得。所述操作可以是通过删除、插入或倒置进行，包括通过其组合进行，条件是保留生物活 性Tat的特性。特别地，优选保留在上文中鉴定为在分化体之间是保守的那些区域。例如， 可以结合前导序列和/或尾序列，例如，以辅助分泌和/或提供抗消化的保护水平。Tat编 码序列可以包括两个天然存在的外显子，有或无间插内含子，并且仅需要包含用于保留生 物活性的足够序列信息。然而，通常优选地使用尽可能多的天然存在的序列。Tat是本领域中公知的。然而，优选的，tat蛋白是SEQ ID NOs. 2或3所示的那 些，尤其是在任何翻译后修饰之后(诸如分裂掉N'端Met)。对于SEQ ID NO. s 5和6所 示的Tat遵循相同的内容。在需要突变体或变体是tat的情形中，如优选地，这些将具有生 物活性，并且优选地其至少与"生物活性tat"相当。适当地，所述突变体或变体优选地与 所述SEQ ID Nos所示的氨基酸序列、至少其中所示的编码tat氨基酸序列的核苷酸序列、 或其中所示的全长核苷酸序列有至少70%，更优选地至少75%，更优选地至少80%，更优 选地至少85 %，更优选地至少90 %，更优选地至少95 %，更优选地至少99 %，更优选地至少 99. 5%，且最优选地99. 9%的序列同源性。因此，特别优选地是Tat是SEQ ID NOs. 2，35或 6所示的那些，或其具有生物活性且与所述序列具有至少70%的序列同源性的突变体或变 体。在这种情形中，上文提及的更高水平的序列同源性也是优选的。任何核酸序列，诸如上文所述，可以用来编码Tat，但是优选的是，从培养的宿主获 得的表达产物与本领域已经证明是生物活性的且具有需要的特性的Tat是相同的、或基本 上相同的。宿主生物体可以被基因组转化，或通过结合适当的表达质粒来转化。为了成为可 诱导的，优选地，Tat编码序列应该处于可诱导启动子的控制之下。“可诱导启动子”意指不 是组成型的且仅在所选的环境下在其控制之下引起编码序列表达的启动子。可诱导启动子通常分成两类，第一类是其中通常组成型地存在聚合酶，但在不存在易化配体的条件下，将不识别该启动子，或仅以有限程度识别其。第二类是其中启动子仅 被特异性聚合酶识别，所述特异性聚合酶本身不是组成型表达的，并且可以是处在可诱导 启动子的控制之下。在大肠杆菌BL21菌株中，T7RNA聚合酶处在lac(IPTG可诱导的)启动子控制下， 以便这种聚合酶的产生可以容易地通过添加IPTG进行诱导。那么，对于控制外源序列所必 需的所有问题是关于所述序列与T7启动子缔合。向BL21大肠杆菌培养物中加入IPTG将 刺激T7RNA聚合酶生产，然后其可以在T7启动子的控制下转录该序列。在本发明中，在该 实例中，Tat编码序列处在T7启动子的控制下。宿主生物体可以在任何适当的条件下培养，所述条件允许以本领域对于表达外 源蛋白公知的方式进行表达。对本领域公知技术的唯一显著的背离是外源蛋白Tat的诱 导在对数期开始至平台期之前实施和终止。在常规蛋白生产培养物中，诱导之前，通常允 许OD达到1. 2或更高。尽管在该水平诱导产生与按照本发明获得的相似量的Tat，但是该 Tat不是生物活性的。通过在对数期过程中而不是在对数期开始显著到达平台期时进行诱 导，可能获得与在OD 1.2获得相似的产率，但是其中Tat是生物活性的。优选的OD' s在 0. 4-0. 9范围内，更优选地在0. 45-0. 8范围内，包括端点值。特别优选地是用于诱导的OD 是0. 5-0. 7，包括端点值，并且发现OD约为6提供极好的生物活性Tat产率。通过本发明的方法生产的Tat是特别有利的，因为其可以在发酵步骤中不被动物 来源的蛋白污染而获得。其还具有这样的优点，即，由于溶剂不允许在用于人类的生物制剂 中使用，于是避免了溶剂的使用。另一个优点是按照本发明生产的Tat能够进行配制，从而 经受住在低至-80°C或者低于-80°C的温度下的保存。按照本发明获得的Tat可以按需要使用。特别优选的是将这种Tat用在疫苗制剂 中，如本领域所述，但是考虑了关于这样生产的Tat的其它应用，并且同等地在本领域技术 人员的能力范围内。在另一方面中，提供了按照本发明的方法生产的生物活性Tat。现在，将通过下述非限制性实施例进一步描述本发明。本文引用的任何参考文献 按其不与本发明冲突的程度结合于此作为参考。
实施例HIV-ITAT 基因tat基因的结构已经通过反式激活感受态cDNA，即pCV-Tat的分子克隆和核苷酸 测序鉴定(Ensoli，1993)。已经显示Tat蛋白由包含两个编码外显子的双剪切的RNA翻译 (Aldovini，1986)。第一编码外显子(核苷酸5411-5625) (Ratner，1985)，其紧接着位于env 基因前并且限定72个氨基酸，已经证明其是反式激活所必需的和充分的(Sodroski，1985 ； Seigel, 1986)。第二编码外显子编码另外14个氨基酸，并且位于核苷酸7956和核苷酸8001 之间，使得Tat蛋白的总大小为86个氨基酸。在该方法中所用的tat基因来源于pCV-Tat质粒(Ensoli，1993)。为了产生tat 表达质粒pCV-Tat (全长tat cDNA)，使用tat cDNA的-61至-41和+270至+289的引物通 过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。引物在5'末端设计有Pstl位点作为连接体。然后， 将PCR扩增的片段用Pstl消化，并且克隆到pCVO的Pstl位点。通过核苷酸序列分析验证构建体的序列和方向。tat基因，原始来源于HTLV-III-感染的细胞系，后来鉴定为来源于 HTLV-IIIB分离体BH-10克隆(分化体B)。表达系统pET系统是用于在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的有力系统。基于最初由 Studier及同事(Studier，1986和1990 ；Rosenberg, 1987)开发的T7启动子驱动的系统， Novagen的pET系统已经用于表达数以千计的不同蛋白。pET系统提供能够调整基础表达 水平以最优化靶基因表达的载体-宿主组合(Rosenberg，1987)。在非表达宿主中建立质 粒后，通常将其转化到携带T7RNA聚合酶基因的宿主(XDE3溶原体)中，用于表达靶蛋白。 在λ DE3溶原体中，T7RNA聚合酶基因处于lacUV5启动子控制下。这允许在非诱导状态的 某种程度的转录。对于更严格的控制，可以使用携带PLysS的宿主。pLys质粒编码T7溶菌 酶，其是T7RNA聚合酶的天然抑制剂，并且因此减少T7RNA聚合酶在非诱导的细胞中转录靶 基因的能力。对于重组Tat的表达，细菌菌株BL21(DE3)用pET-TAT和pLysS质粒来转化。BL21 细胞是最广泛使用的宿主。这些细胞缺少Ion蛋白酶，并且缺乏ompT外膜蛋白酶(表1)。 BL21细胞对利福平敏感，pLyS表达T7溶菌酶，其抑制基础T7RNA聚合酶。
细菌菌株 BL21(DE3)pLysS菌株基因型F一 ompThsdS^ (r_ m_ ) gal dcm (DE3) pLysS (CmR)细菌菌株遗传标记F"=不包含F附件体 ompT 二缺乏外膜蛋白酶 hsdS =在特定位点(r_ m")消除DNA限制性和甲 基化 gal=不能利用半乳糖 dcm =在序列CCWGG中没有胞嘧啶的甲基化 CmR=氯霉素抗性表1.用于表达Tat蛋白的细菌菌株的特征pET载体来源于pBR322，并且是许多pET家族载体的前体。pET-3a-d载体携带N 端T7 Tag序列和BamHI克隆位点。在本研究中使用pET_3c载体(
图1)。pET_3c载体的 序列在序列表中以SEQ ID NO. 7提供。pET-3c的图谱与pET_3a (显示的)的图谱除下述例外之外相同pET_3c是4638bp 的质粒，在510处BamHI外每个位点减去2bp ；Nco位点替换Nde I位点，在pET_3c的位置 550处具有净bp缺失。质粒pLysS是4886bp质粒，其通过在pACYC184的BamHI位点插入T7溶菌酶基因 而构建(Studier，1986和1990)。这种质粒不是克隆质粒，并且用在ADE3溶原性宿主中， 以通过产生T7溶菌酶来抑制来自T7启动子的基础表达，T7溶菌酶为T7RNA聚合酶的天然 抑制剂(图2)。pLyS载体的序列提供在SEQ ED NO. 8中。
构建表达载体并制备产物细胞系pET-TAT通过将来自pCV-Tat表达质粒的261bp Tat克隆到pET_3c的5 ‘ NdeI 和3' BamHl位点而构建(图3和SEQ ID NO. 1，其显示pET_3c克隆表达区)。利用包含NdeI分裂位点的5 ‘引物和包含BamHl分裂位点的3 ‘引物从pCV_TAT 质粒扩增tat基因的261bp片段(图4，其显示克隆在pET-3C中用Eco RI切下的pCV_Tat 载体所包含的原始序列；还显示在SEQ ID N0S. 2和3中)。将扩增的tat产物和pET_3c载体用NdeI和BamHl消化。然后，消化之后进行连 接酶反应，转化到NovaBlue细菌菌株中，并且通过PCR筛选选择tat阳性克隆(图5，其显 示261 bp Tat基因的克隆，还如在SEQ ID NO. 4中所示)。使用ABI PRISM BigDye终止子循环测序试剂盒(应用生物系统(Applied Biosystems))，使用T7启动子和T7终止子作为测序引物，通过Sanger法测序tat cDNA在 pET-3c载体中的正确插入(图6，其显示tat在pET-3c载体中的插入，突出显示ntd位置 22-282 的 CDS,其还如 SEQ ID N0S. 5 和 6 所示)。将得到的重组质粒(pET-3c/Tat)用于转化多个大肠杆菌菌株，所述大肠杆菌菌 株包含在IPTG (异丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(thiogalactopyranoside))-可诱导 的lacUV5启动子控制下编码的T7RNA聚合酶的基因。通过SDS-PAGE评估在诱导细菌培 养物后的重组Tat蛋白的生产，得到质粒构建体的功效和最佳细菌菌株的选择。为了在 BL21(DE3)pLysS中的表达pET-3C/Tat，将过夜细胞培养物以1 10稀释在合成培养基(pH 7. 5)中，所述合成培养基包含氨苄青霉素lml/L (储液为25mg/mL)，氯霉素lml/L (储液为 34mg/mL)，硫胺(thiamin) 0. 5ml/L(储液为 4. 5mg/mL)，Mg 溶液 1. 25ml/L(储液为 240mg/ mL)，和葡萄糖12ml/L(储液为630mg/mL)。然后，将稀释的细菌在37°C培养，直至600nm的光学密度为0.6-0. 7。为了最优化 重组蛋白的表达条件，进行数个诱导实验。通过向在37°C培养物中加入ImM IPTG 4小时 而获得最有效的Tat生产。结束时，离心细菌，并且将沉淀物重悬在裂解缓冲液中。超声处 理包含Tat蛋白的细菌裂解物，并且离心，以增溶该蛋白。然后，将沉淀物重悬在包含甘露 糖、甘油、磷酸盐缓冲液、DTT和NaCl的缓冲液中。将样品再次超声处理，并且以10，500xg 离心 30 分钟，过滤上清，并且上样到 DEAE SEPHAROSEFAST FLOW(Amersham Pharmacia Biotech(安玛西亚法玛西亚生物技术)，Uppsala，瑞典)柱。然后，该蛋白用IM NaCl洗 脱。收集包含Tat的级分，并且以1 1体积比稀释，并上样到肝素琼脂糖CL-6B(Amersham Pharmacia Biotech (安玛西亚法玛西亚生物技术)，Uppsala，瑞典)柱。然后，该蛋白用2M NaCl洗脱。收集包含Tat的级分，并透析以去除NaCl。通过SDS-PAGE验证通过上述步骤 得到的蛋白的纯度等级。回收的蛋白的产率显示在表2中。表2.纯化在大肠杆菌中表达的Tat蛋白
权利要求
1.用于制备生物活性Tat的方法，所述方法包括培养在诱导时能够表达Tat的宿主生 物体，并且其中Tat的表达是在所述宿主生物体的对数生长期过程中诱导的。
2.按照权利要求1的方法，其中生物活性的量度是Tat被单核细胞来源的树突细胞摄 取的能力。
3.按照前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主生物体容易允许大体积培养。
4.按照前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主生物体是真核细胞。
5.按照权利要求4的方法，其中所述宿主生物体是细菌或酵母。
6.按照权利要求5的方法，其中所述宿主生物体是酿酒酵母(S.cerevisiae)、枯草芽 ？包杆菌(B. subtilis)、或大肠杆菌(E. coli)。
7.按照权利要求6的方法，其中所述宿主生物体是大肠杆菌BL21菌株。
8.按照前述权利要求中任一项的方法，其中由培养的宿主获得的表达产物与本领域中 已证明是生物活性的Tat相同，或基本上相同。
9.按照前述权利要求中任一项的方法，其中Tat为SEQID NOs. 2或3所示，或为其具 有生物活性且与所述序列具有至少70%序列同源性的突变体或变体。
10.按照前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主生物体已经使用适当的表达质 粒转化。
11.按照前述权利要求中任一项的方法，其中编码Tat的序列处于可诱导启动子的控 制下。
12.按照前述权利要求中任一项的方法，其中所述启动子仅被特异性聚合酶识别，所述 特异性聚合酶受到可诱导启动子的控制。
13.按照权利要求11或12的方法，其中所述启动子是Iac启动子。
14.按照权利要求11-13中任一项的方法，其中所述编码Tat的序列处于T7启动子的 控制下。
15.按照权利要求14的方法，其中所述宿主生物体能够表达T7RNA聚合酶，并且其处 于Iac启动子的控制下。
16.按照前述权利要求中任一项的方法，其中Tat的表达在0.4-0. 9范围内、包括端点 值的OD处诱导。
17.按照前述权利要求中任一项的方法，其中Tat的表达在0.45-0. 8范围内、包括端点 值的OD处诱导。
18.按照前述权利要求中任一项的方法，其中Tat的表达在0.5-0. 7范围内、包括端点 值的OD处诱导。
19.按照前述权利要求中任一项的方法，其中Tat的表达在约为0.6的OD处诱导。
20.按照前述权利要求任一项获得的Tat。
21.用于生产单体Tat的方法，所述方法包括培养在诱导时能够表达Tat的宿主生物 体，并且其中Tat的表达是在所述宿主生物体的对数生长期过程中诱导的。
全文摘要
在大体积培养物中产生的Tat蛋白在常规光学密度下诱导时是没有活性的，但是在对数生长期过程中诱导时可以以生物活性形式获得。
文档编号C12N15/70GK102007141SQ200980111208
公开日2011年4月6日 申请日期2009年2月6日 优先权日2008年2月6日
发明者毛罗·马格纳尼, 芭芭拉·恩索利 申请人:乌尔比诺大学, 国家高等卫生院