重复产生重组蛋白的高产细胞系的方法和物质的制作方法

专利名称：重复产生重组蛋白的高产细胞系的方法和物质的制作方法
重复产生重组蛋白的高产细胞系的方法和物质
1.发明领域本发明属于在真核细胞中制备重组基因产物的领域。具体地，本发明涉及快速、可 重复地生成适于大规模生产重组基因产物的高产真核生产细胞系的方法和物质。本发明包 括特异性载体系统，特征性的(characterized)、经遗传改造的宿主细胞和使用方法。2.
背景技术：
CHO细胞系是最广泛使用的制备生物药的宿主细胞。传统上，所述宿主细胞用表达 载体转染，所述载体含有编码重组基因产物(例如蛋白)的目标基因(GOI)和选择标记，所 述选择标记诸如抗生素例如新霉素或氨甲喋呤的抗性基因。在一小部分宿主细胞中，所述 表达构建体经非同源重组而随机引入基因组。这些稳定转染的细胞在抗生素化合物的选择 压力下被选出。为了获得调节顺应性单细胞衍生细胞系，随后通过有限稀释进行进一步的 克隆步骤。虽然分析了数百个单细胞衍生克隆，但表达水平常常仍然很低，其需要优化转染 过程或扩增表达构建体的初始整合拷贝，例如通过增加氨甲喋呤浓度或另一种扩增系统来 实现。全部过程需要至少6个月，有时多达一年。该方法的主要问题是整合事件的随机特性。周围的基因组DNA对所整合的表达构 建体的转录活性有主要的影响(“位置效应")。由于这种非同源整合过程的stochastic 特性，无法针对具有高转录活性的基因座(转录热点)进行整合。由于大部分哺乳动物DNA 并非编码序列，甚至编码部分也只有小部分具有转录活性，因此，绝大多数整合事件导致转 基因的低水平表达。总之，表达构建体的随机整合将导致转基因的表达水平的宽范围差异， 仅有一部分细胞显示高水平表达。为避免所需的繁重筛选过程和减少产生高水平生产者细胞系所需的时间，最好是 有将任意GOI定向插入宿主细胞基因组的表达热点的系统。为了重复地将GOI引入此位点，所找的位点可以补加允许通过序列特异性重组酶 如Cre或FLP来进行插入的序列。用FIp进行的这种修饰参见W092/15694，在无标记的反 复DNA表达盒交换方面的改动见US2001/0032341。用Cre在植物细胞基因组中进行的修饰 见 WO 91/09957，进一步的改动见 US2006/0014264A1。这两种重组酶都依赖特异性识别位点，需先将这些位点引入基因组中的合适位 置。在转基因动物的情况中，这通过同源重组实现。为了使用这些特异性重组酶生成生产细胞系，主要的问题是鉴定适于经同源重组 插入识别位点的基因。该基因需被高水平转录，但同时应不是该细胞所必需的。黑素瘤细 胞或杂交瘤细胞中的免疫球蛋白基因座是所述合适位置的例子。用Cre通过同源重组和序 列特异性重组的组合进行的抗体生成见WO 96/30498。一种类似的方法在EP11405908A1中 被描述为高产通用表达系统。虽然可以应用，但这些方法限用于相应宿主细胞中已知的、非必需的、高水平表达 的细胞性基因(cellular gene)。自发同源重组除了很少见以外，其效力也有赖于相应的位 点。要想效率高，就得使用大的同源序列，此时等基因(isogenic)序列是最有效的。因此， 在序列信息知之有限的宿主(象仓鼠)中使用这种方法时，其应用性会受到限制。
为了鉴定允许高表达水平的随机基因组座位，有人建议在靶位点引入含有报告基 因以及所用重组酶的识别位点的载体(wo 2004/029284A3)。一方面报告基因允许鉴定随机 标记的整合位点的表达能力，另一方面这些识别位点也允许该报告基因与GOI进行交换。Puttini et al. (J. Biotechnol. 116 (2005)，145-151)披露了在细胞系进行定向、 双链断裂介导的转基因的方法。据此获得了表达靶基因的宿主细胞。该靶向载体含有兆碱 基核酸酶(meganuclease)的单个识别位点。报道的靶向效率很低，为2. 5X 10_6(10个克隆 /2X IO7细胞，转染效率为20%)。故，该文献并未提供可信赖的获得高产宿主细胞的方法。WO 2004/029284描述了用FLP重组酶催化位点特异性重组来产生生产者 (producer)宿主细胞的方法。所得表达细胞系仍包含FLP重组酶识别位点，在有些情况下， 在引入目标基因后，处在编码序列内。这导致生产者细胞系的稳定性下降。该文献还建议 将组II内含子作为备选的识别位点，但未披露相关实验证据。兆碱基核酸酶识别位点组I 内含子编码的归巢内切核酸酶未被披露。Sorrel & KoIb (Biotech. ADV 23 (2005)，431-469)描述了 用具有兆碱基核酸酶 I-Sce-I的单个识别位点的靶向载体经同源重组对哺乳动物基因组进行位点特异性修饰。 靶/替换载体的整合经由定向同源重组而发生，但不经由随机整合而发生。Belfort & Roberts (Nucleic Acids Res. 25 (1997)，3379-3388)描述了归巢内切 核酸酶，包括组I和组II内含子编码的分子。所有这些方法中，交换反应的效率取决于所用的重组酶的效力。此外，随机选出的 基因座可能有较好的转录活性，但它有可能不支持所用重组酶的有效重组。为了找出合适 的整合位置，该方法需要额外进行筛选。使用所述重组酶的另一个潜在障碍是，所需宿主细 胞中存在假识别位点。这些假识别位点可以引起不良重组事件。这将导致该系统的效率降 低，并有可能产生具有不良表型的遗传修饰细胞。同样，进行了鉴定最适细胞的筛选。虽然 该方法看似有用，其产生高产生产细胞的效力和通用性较低。总之，仍需要快速、有效的通 用系统来产生高产真核生产细胞系，其具有经证实的大规模生产重组蛋白的能力。本发明披露了满足这一需求的方法和物质。3.发明概述本发明描述了涉及wildcard-策略的方法和物质，所述策略用于产生高产真核细 胞系以制备生物药，其涉及将含有GOI的表达盒定点引入事先已形成、且已鉴定清楚的宿 主细胞系(wildcard细胞)。wildcard细胞在动态培养系统中选择大规模生产所需的特 性。其通过将靶报告盒随机引入起始细胞系的基因组、并通过鉴定整合位点的表达能力来 产生。通过将报告基因与目标基因(GOI)交换，获得了能有效表达所需基因产物的生产者 细胞系。用交换载体(exchange vector)来提供GOI，该载体不允许GOI自身强表达，优选 对经转染的细胞不赋予可选择的特性。与文献记载的系统不同，wildcard策略不使用重组酶来介导表达盒的交换。第一 报告基因与选择标记的交换通过双链断裂(DSB)诱导的同源重组来介导。为了在所需基因 组位置诱导DSB，靶基因组合有少见的DSB介导酶例如少见的切割兆碱基核酸酶或归巢内 切核酸酶(HE)如I-SceI的一或两个识别位点作为特异性标签。HE被带入细胞，在指定位 置赋予对识别位点的限制。DSB断裂的修复通过该细胞的内源修复机制以高频进行。平行的经转染的交换载体由于与交换盒(exchanged cassette)的侧翼区有序列同源性而用作 修复基质(repair matrix)。这种新的宿主细胞有利于在短时间内将GOI克隆到预定的基因组表达热点，以获 得重组基因产物(尤其重组蛋白)的可重复的高效生产细胞系。所述方法包括以下步骤-对含有选择标记的靶载体、可定量的报告基因、以及介导DSB诱导型同源重组的 识别位点进行随机整合。-选出通用宿主细胞系(“wildcard”细胞)，其在转录活性基因座优先带有单个 整合拷贝，对此通过报告基因来进行判定。-将报告基因和第一选择标记与目标基因(GOI)交换，同时通过DSB诱导的同源重 组生成至少一个额外的选择标记，所述重组以具有所需元件的交换载体作为修复基质。通用的wildcard宿主细胞中的交换过程可对另一 GOI进行，每次都产生生产细 胞，其具有可预测的高表达水平，高质量的产物(即糖基化)，以及允许大规模生产基因产 物(例如蛋白)的生长特性。所述方法优先允许生成任何重组蛋白。所得蛋白可以是酶，尤其蛋白酶，蛋白酶抑 制剂，激素，细胞因子，有或无跨膜域或胞内域的报告蛋白(即膜结合型或可溶型)，全长抗 体或抗体功能域。具体地，所得蛋白可以象所述蛋白的融合蛋白组合成分或域。本系统因此允许产生有效、经济地生产生物药所需的高产细胞。它具有多项优点-省时可以在数周内从预制的wildcard细胞系获得稳定的生产细胞系。-由于整合至预定的表达热点，能够更可靠地预计该生产细胞系的表达水平，并且 用于不同GOI都可以再现该水平。-高效，因为交换后获得的仅是表达GOI的细胞。-可有可无的载体序列在位点特异性整合期间不会有额外整合。_为了证实产生了物质，可以在数月内进行实验。在后期进展阶段，产品质量不会 改变，因为从一开始就能获得同质且遗传相同的细胞群体。因此，本发明第一方面是产生生产者细胞的方法，所述细胞用于生成重组基因产 物，尤其是多肽，所述方法包括以下步骤(a)提供靶载体，其包含(i)报告基因(RGl)，该基因与第一表达控制序列(Pl)可操作相连，(ii)第一选择标记基因(SMl)，该基因与第二表达控制序列(P2)可操作相连，(iii)第二非功能选择标记基因(SM2)，该基因未与表达控制序列可操作相连，其中序列(i)位于5'-位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之间，序列(iii)位于 3’ -位置，(iv)双链断裂_介导酶的第一和第二识别位点，其中第一识别位点位于第一表达 控制序列(Pl)和第一报告基因(RGl)之间，第二识别位点位于序列(ii)和序列(iii)之 间，(b)将所述靶载体引入宿主细胞，所用条件允许该靶载体随机整合到该宿主细胞 的基因组中，
(c)选出宿主细胞，所述细胞具有稳定整合的靶载体、并显示RGl的转录活性，优 选高水平稳定转录活性，(d)提供交换载体，该载体包含(i)目标基因(GOI)，和(ii)失活的第二选择标记基因(Δ SM2)，该基因与第三表达控制序列(Ρ3)可操作 相连，其中，交换载体包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它们允许与靶载 体的序列进行重组，(e)将交换载体引入步骤(C)获得的宿主细胞中，所用条件允许双链在(a) (iv)项 所述第一和/或第二识别位点处(优选第一和第二识别位点处)断裂、并允许交换载体通 过双链断裂介导的同源重组而整合到宿主细胞基因组中，其中，失活的第二选择标记基因(ASM2)因交换载体的整合而被激活，(f)选出生产者细胞，其具有通过与整合的靶载体同源重组而整合的交换载体，其 中所述生产者细胞表达GOI。本发明另一方面是生成通用的宿主细胞(wildcard细胞)的方法，其允许快速产 生适于大规模制备重组基因产物的高产生产细胞系。此方法包括(a)提供靶载体，其包含(i)报告基因(RGl)，该基因与第一表达控制序列(Pl)可操作相连，(ii)第一选择标记基因(SMl)，该基因与第二表达控制序列(P2)可操作相连，(iii)第二非功能选择标记基因(SM2)，该基因未与表达控制序列可操作相连，其中序列(i)位于5'-位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之间，序列(iii)位于 3’ -位置，(iv)双链断裂_介导酶(尤其兆碱基核酸酶)的第一和第二识别位点，其中第一 识别位点位于第一表达控制序列(Pl)和第一报告基因(RGl)之间，第二识别位点位于序列 (ii)和序列(iii)之间，(b)将所述靶载体引入宿主细胞，所用条件允许该靶载体随机整合到该宿主细胞 的基因组中，和(c)选出宿主细胞，所述细胞具有稳定整合的靶载体、并显示RGl的转录活性。本发明另一方面是制备重组基因产物的方法，包括以下步骤(a)提供wildcard宿主细胞，在其基因组中整合了表达盒，所述盒包含(i)报告基因(RGl)，该基因与第一表达控制序列(Pl)可操作相连，(ii)第一选择标记基因(SMl)，该基因与第二表达控制序列(P2)可操作相连，(iii)第二非功能选择标记基因(SM2)，该基因未与表达控制序列可操作相连，其中序列(i)位于5'-位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之间，序列(iii)位于 3’ -位置，(iv)双链断裂_介导酶的第一和第二识别位点，其中第一识别位点位于第一表达 控制序列(Pl)和第一报告基因(RGl)之间，第二识别位点位于序列(ii)和序列(iii)之 间，其中所述表达盒稳定整合到宿主细胞基因组中并显示报告基因(RGl)的转录活CN 101981196 A
说明书
5/19 页
性，(b)提供交换载体，该载体包含目标基因(GOI)，和失活的第二选择标记基因(Δ SM2)，该基因与第三表达控制序列(Ρ3)可操作相 连，其中，交换载体包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它们允许与靶载 体的序列重组，(c)将交换载体引入步骤(C)获得的宿主细胞中，所用条件允许双链在(a) (iv)项 所述第一和/或第二识别位点(优选第一和第二识别位点)处断裂、并允许交换载体通过 双链断裂介导的同源重组而整合到宿主细胞基因组中，其中，失活的第二选择标记基因(ASM2)因交换载体的整合而被激活，(d)选出生产者细胞，其具有通过与整合的靶载体同源重组而整合的交换载体，其 中所述生产者细胞表达GOI。本发明另一方面是产生用于制备重组基因产物的生产者宿主细胞的方法，包括以 下步骤(a)将含有双链断裂介导酶第一和第二识别位点的核酸序列通过定向同源重组而 引入宿主细胞基因组中支持转录活性的位置，(b)选出具有稳定整合的第一和第二识别位点的wildcard宿主细胞，(c)提供交换载体，该载体包含⑴目标基因(GOI)，和(ii)第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它们允许与第一和/或第二识别 位点的整合位点处的序列重组，(d)将交换载体引入步骤(b)获得的宿主细胞中，所用条件允许双链在(a)项所述 第一和/或第二识别位点处断裂、并允许交换载体通过双链断裂介导的同源重组而整合到 宿主细胞基因组中，和(e)选出生产者细胞，其具有通过同源重组而整合的交换载体，其中所述生产者细 胞表达GOI。本发明另一方面是制备用于引入目标基因(GOI)的wildcard宿主细胞的方法，包 括以下步骤(a)将含有双链断裂介导酶第一和第二识别位点的核酸序列通过定向同源重组而 引入宿主细胞基因组中支持转录活性的位置，(b)选出具有稳定整合的第一和第二识别位点的wildcard宿主细胞。本发明另一方面是制备重组基因产物的方法，包括(a)提供wildcard宿主细胞，在其基因组中整合了含有双链断裂介导酶第一和第 二识别位点的核酸序列，其中的核酸序列稳定整合到宿主细胞基因组中支持转录活性的位置，(b)提供交换载体，该载体包含(i)目标基因(GOI)，和(ii)第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它们允许与第一和/或第二识别位点的整合位点处的序列进行重组，(c)将交换载体引入步骤(a)提供的宿主细胞中，所用条件允许双链在(a)项所述 第一和/或第二识别位点处断裂、并允许交换载体通过双链断裂介导的同源重组而整合到 宿主细胞基因组中，和(d)选出生产者细胞，其具有通过同源重组而整合的交换载体，其中所述生产者细 胞表达GOI。本发明另一方面是靶载体，其包含(a)与第一表达控制序列(Pl)可操作相连的报告基因(RGl)，(b)与第二表达控制序列(P2)可操作相连的第一选择标记基因(SMl)，(c)未与表达控制序列可操作相连的非功能第二选择标记基因(SM2)，其中序列 (i)位于5'-位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之间，序列(iii)位于3’ -位置，双链断裂-介导酶尤其兆碱基核酸酶的第一和第二识别位点，其中第一识别位点 位于第一表达控制序列(Pl)和第一报告基因(RGl)之间，第二识别位点位于序列(ii)和 序列(iii)之间。本发明另一方面是交换载体，其包含⑴目标基因(GOI)，和(ii)失活的第二选择标记基因(Δ SM2)，该基因与第三表达控制序列(Ρ3)可操作 相连，其中，交换载体包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它们允许与宿主 细胞基因组中预定位点的序列(例如与靶载体的序列)进行重组。本发明的多个其它方面涉及可通过上述方法获得的、用于引入并有效表达目标基 因的、通用的wildcard宿主细胞，和用于用所述such wildcard宿主细胞和所述方法大规 模制备重组基因产物的高产生产细胞。4.发明详述4.1宿主细胞本发明涉及生成生产者宿主细胞或wildcard宿主细胞。优选宿主细胞是真核细 胞，例如酵母细胞，真菌细胞或脊椎动物细胞如昆虫或哺乳动物细胞。更优选地，宿主细胞 是哺乳动物细胞，例如啮齿动物细胞如小鼠、大鼠或仓鼠细胞或灵长类细胞如人类细胞。在 特别优先实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。进一步优先的细胞是NSO细 胞，杂交瘤，例如小鼠或小鼠/人细胞，HEK 293细胞或Per C6细胞。在具体实施方案中， 宿主细胞能在无血清的悬浮培养中以高细胞密度生长。4. 2载体系统本发明涉及不同载体的应用，即靶载体用于将报告基因盒引入宿主细胞以获得 wildcard宿主细胞，交换载体或整合载体用于将目标基因(GOI)引入wildcard宿主细胞以 产生生产者细胞。任选地，使用第三载体在宿主细胞中表达双链断裂介导酶。选出的载体应与相应宿主细胞兼容。因此，所述载体尤其适于真核细胞，优选地， 所述载体为非病毒载体，例如环状或线性质粒载体。4. 2.1 靶载体4. 2. 1. 1用于随机整合的靶载体
本发明的靶载体优选包含报告基因(RGl)和第一选择标记基因(SMl)。这两种基 因优选形成双顺反子表达盒，其中RGl与第一表达控制序列(Pl)可操作相连，SMl基因与 第二表达控制序列(P2)可操作相连。RGl优选位于SMl基因5’侧。此外，靶载体包含非功 能性第二选择标记基因(SM2)。此外，靶载体优选实质上不含元和细胞的序列元件。RGl可以是任何报告基因，其表达可检测的基因产物，例如酶或化学发光 (luminescent)基因产物。优选地，报告基因是能控制并定量其表达的基因。报告基因的典 型实例是碱性磷酸酶，例如分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，荧光素酶(Iuciferase)，β -半乳糖 苷酶或诸如GFP等荧光蛋白或它们的变体。RGl与第一表达控制序列(Pl)可操作相连，后者优选包含能驱动报告基因在宿主 细胞中表达的组成型启动子。在一个实施方案中，Pl可包含强效组成型启动子，例如CMV启 动子(如立即/早期启动子，带有来自人或鼠CMV病毒的增强子)，其可通过例如添加CMV 内含子A来额外增强，从而转录活性和mRNA稳定性增强。通常，允许在真核细胞中高水平重 组表达的任何控制序列都可以使用。这些序列可以是天然元件或天然元件的组合。此外， 还可以使用合成的启动子-元件。合适的第一表达控制序列(Pl)的进一步实例有，人延伸 因子Ialpha(EF-Ialpha)启动子(有和无相应的第一内含子)，衍生自劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV) LTR的启动子，或HIV2LTR或它们的衍生序列的组合。在另一实施方案中，Pl可包含减弱的启动子，其强度比野生型启动子减弱，例如改 变的CMV启动子。启动子强度可以减弱，例如通过修饰内含子A序列的表达增强效应来减 弱。这可以通过在内含子的3' _区插入短的异源核苷酸序列(例如，多达IOObp)来实现。 这些插入并不负面影响与交换载体的同源重组。通过选择交换载体中的合适序列，可以在 将交换载体插入宿主细胞基因组以后，将启动子的减弱形式用完全活化形式替换。第一选择标记基因(SMl)可以是任何能在宿主细胞中提供可选择的表型的选择 标记基因。例如，SMl可以是抗生素抗性基因如新霉素或潮霉素抗性基因。还可以使用选 择标记，诸如赋予对杀稻瘟素(blasticidin)、嘌呤霉素，乌苯苷(ouabain)的抗性的基因 或谷氨酰胺合成酶基因。SMl与第二表达控制序列(P2)可操作相连，后者优选包含组成型启动子，例如 SV-40启动子。在具体实施方案中，P2可包含减弱的启动子，即野生型启动子的减弱形式。 或者，或另外，SMl可以是减弱的选择标记基因，其与野生型选择标记基因相比活性减弱。通 过使用减弱的启动子和/或选择标记基因，有利于选出具有整合在整合位点的高转录活性 靶载体的宿主细胞。在另一实施方案中，SMl的表达是通过使用位于RGl编码序列3'-端与SMl编码 序列5'-端的IRES元件来实现的。此外，靶载体通常在RGl和SMl编码序列3'-包含聚腺苷酸化信号，例如牛生长 激素的聚腺苷酸化信号或SV-40的聚腺苷酸化信号。靶载体还包含未与表达控制序列可操作相连的第二非功能性选择标记基因 (SM2)。SM2位于RGl和SMl双顺反子表达盒的外部，优选位于该盒的3'-侧。在具体实 施方案中，SM2编码序列不含ATG起始密码子和/或上游终止密码子，优选在所有三个阅读 框中具有上游终止密码子。SM2可以是能在宿主细胞中提供可选择的表型的选择标记。优选地，SM2不同于SMl0例如，SM2可以是抗生素抗性基因如新霉素或潮霉素抗性基因。进一步的实例有，赋 予对杀稻瘟素、嘌呤霉素，乌苯苷的抗性的基因或谷氨酰胺合成酶基因。为了在靶载体中诱导特异性双链断裂，要包含双链断裂介导酶，尤其兆碱基核酸 酶的第一和第二识别位点、第一识别位点位于RGl编码序列与Pl之间，第二识别位点位于 SMl编码序列与非功能性序列SM2之间。靶载体上侧翼为两个识别位点的部分可称为交换 区。在具体实施方案中，第二识别位点可位于SMl终止密码子与后续聚腺苷酸化信号 之间(靶载体A)。在另一实施方案中，第二识别位点可位于SMl聚腺苷酸化信号与SM2编 码序列的起点之间(靶载体B)。所述两个识别位点可以具有相同的取向或彼此取向相反。在优选实施方案中，识 别位点上对应于野生型位点下游外显子的部分在切割后位于交换区以外。双链断裂介导酶优选兆碱基核酸酶或归巢核酸酶(homing nuclease)，其具有宿 主细胞基因组中罕见的识别位点，例如编码归巢核酸酶的组I内含子。优选地，兆碱基核酸 酶或归巢核酸酶具有宿主细胞基因组中非天然出现的识别位点。所述识别位点通常有至少 10个，优选至少12个核苷酸。更优选地，所述核酸酶具有18个核苷酸的识别位点，因此属 于内切核酸酶的十二肽家族。所述酶的实例见US 2005/0032223，其内容引入本文作参考。 优选地，兆碱基核酸酶选自 I-Scel，I-SceII, I-SceIII, 1-SceIV，I-CeuI, I-CreI, I-Ppol, I-TevI，I-TevII，I-TevIII，HO 和 Endo SceI0 更优选地，兆碱基核酸酶是 I-Scel。本发明靶载体的两个实例见

图1(靶载体Α)和图2 (靶载体B)。报告基因与包括 内含子A的增强型CMV启动子(eCMV)可操作相连。第一选择标记基因(SMl)与SV40启动 子(Psv40)可操作相连。第二选择标记基因(SM2)未与启动子可操作相连，因此不具有功 能。4. 2. 1. 2用于非随机整合的靶载体在本发明另一实施方案中，靶载体可额外包含第一 5’和第二 3' _同源序列，它 们侧翼于靶载体的上述遗传元件，并允许在宿主细胞的预定基因座位，即已知支持转录活 性的基因座位，例如免疫球蛋白基因座，进行非随机同源重组。在此实施方案中，报告基因 可与上述表达控制序列可操作相连，或者，当所选的侧翼同源序列允许在将报告基因(RGl) 与内源表达控制序列可操作相连的位置进行同源重组时，也可以缺乏表达控制序列。备选地，缺乏报告基因的靶载体可用于该实施方案。4. 2. 2交换载体交换载体优选包含目标基因(GOI)和灭活的第二选择标记基因(ASM2)例如其不 完整编码序列。目标基因可以是任何编码所需基因产物(尤其重组蛋白)的基因，但也可 以是重组核酸，例如所需RNA分子。优选地，GOI以不含功能性表达控制序列的形式存在。 更优选地，GOI在5’端包含部分表达控制序列，其与靶载体中第一表达控制序列(Pl)的 3'-引子部分(prime part)相同或基本相同。此外，优选适于GOI的聚腺苷酸化信号位 于靶载体所述编码序列的3’端。SM2的失活编码序列不允许产生功能性选择标记。为此，通常交换载体中SM2编码 序列的3'部分可以缺失。但SM2的失活编码序列与功能性表达控制序列，例如组成型启动 子如SV40启动子可操作相连。
在另一实施方案中，交换载体还包含第三选择标记基因(SM3)，其与GOI共转录。 为此，与IRES元件可操作相连的SM3编码序列可位于GOI编码序列3’端与聚腺苷酸化位 点之间。备选地，GOI和SM3的排列顺序可呼唤。在另一实施方案中，GOI和SM3由带不同 表达控制元件(启动子)的不同表达盒表达。SM3不同于SM2，其允许不依赖SM2而选择细 胞。因此，双重选择允许富集表达两种选择标记的细胞。这两种选择标记可以选自，但不限 于，赋予对潮霉素、新霉素、G418、杀稻瘟素、嘌呤霉素，乌苯苷的抗性的基因或谷氨酰胺合 成酶基因。对GOI 5’侧的部分启动子序列的长度和不完整SM2的长度进行选择，使得有可能 在靶载体上相应同源元件之间进行有效的同源重组。此外，交换载体包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，其允许与靶载体 的序列进行重组。各个同源序列的长度优选至少约500个核苷酸，更优选至少约700个核 苷酸。在特别优选实施方案中，5'-同源序列具有至少约1000个核苷酸，3'-同源序列 具有至少约700个核苷酸。同源序列的最大长度优选约2000个核苷酸。靶载体和交换载 体上同源序列之间的同一性程度，以整个序列来看，优选至少80%，更优选至少90%。最优 选地，同源序列基本相同，以便获得最大交换率。还优选交换载体的5'-同源序列不含功 能性启动子。交换载体的3' _同源序列优选不含功能性选择标记序列。额外地，交换载体可在第一 5' _和第二 3’ -同源序列限定的序列区以外包含第 四选择标记基因。第四选择标记基因是阴性选择标记基因，例如自杀基因如HSV-胸苷激 酶，其允许在也整合了阴性选择标记的宿主细胞基因组中对交换载体的任何随机整合进行 选择。所述交换载体的两个实例见图3(交换载体A)和图4(交换载体B)。目标基因 (GOI)与5 ‘-缺失的部分eCMV启动子(Δ CMV)可操作相连。第二选择标记(SM2)与SV40 启动子(Psv40)可操作相连。带有靶载体的同源序列用点线表示。交换载体B(图4)还包 含位于同源序列以外的自杀基因(HSV-tk)，以及可操作连接至IRES元件的与GOI基因共传 递的第三选择标记(SM3)。在另一实施方案中，交换载体可包含与表达控制序列可操作相连的活性第二选择 标记基因(SM2)，而不含失活的第二选择标记基因。4. 3 产生 Wildcard 细胞系4. 3.1随机整合为了产生wildcard宿主细胞，可以将4.2. 1. 1节所述的靶载体引入宿主细胞，所 用的引入条件允许该靶载体通过非同源重组，即随机重组而随机整合到宿主细胞的基因组 中。在特别优选实施方案中，靶载体在转染之前缺乏非必需的细菌元件。这将消除细 菌DNA元件介导的基因沉默效应。对转染条件进行选择，使仅单个整合位点被优先标记。此外，有利于单拷贝靶载体 的整合。对稳定转染的宿主细胞的选择通过使用SMl来促进，SMl通常是抗生素抗性基因 如新霉素或潮霉素抗性基因。因此，选择过程优选包括，在有抗生素存在的条件下培养转染 的细胞，所述抗生素是SMl介导的抗性所针对的抗生素。
下一步，选出整合了靶载体、并高水平表达报告基因(RGl)的宿主细胞。优选地， 通过有限稀释策略产生了用于此目的的克隆化或寡克隆化细胞群体。优选地，此步骤在无 血清培养条件下、用适应了悬浮生长的宿主细胞来进行。在该选择过程的优选实施方案中，以从优先衍生自1-5个细胞的细胞群体进行选 择后得到的密度来接种转染的细胞。扩增克隆化或寡克隆化细胞群体，用报告基因(RGl) 分析随机标记的基因组座位的转录活性。优选地，进行RGl表达的定量分析。根据RGl的表达水平选出高产克隆。为了得到从宿主细胞群体衍生的单细胞作为 潜在的wildcard细胞系，优先进行第二轮有限稀释克隆过程。在进一步优先的步骤中，根 据细胞的生长特性来选择细胞，特别优选的细胞在低倍增时间、尤其在无血清培养条件下， 表现出快速的生长速率。在优选实施方案中，选择过程可涉及以下步骤(i)从具有整合的靶载体的宿主细胞中选出高水平稳定表达报告基因(RGl)的那 些细胞；(ii)从(i)所获细胞中选出那些其表型允许在工业化培养条件(即动态培养系 统，如旋转器(spinner)，搅拌罐(stirred tank)，波反应器(wave-reactor)，流化床反应 器(fluidized-bed reactor)或固定床反应器(fixed-bed reactor))下有效地大规模培 养的细胞；和(iii)从(ii)所获细胞中选出那些用报告基因盒对目标基因表达盒进行有效交 换的细胞。对具有足够生产能力的合适〃 wildcard"细胞系的选择可通过筛选分泌型报告 蛋白的活性来进行，所述报告蛋白如人胎盘分泌型碱性磷酸酶(hSEAP)或其它合适的可定 量的报告蛋白。为了得到从宿主细胞群体衍生的单细胞作为潜在的wildcard细胞系，优选 进行第二轮有限稀释克隆。在另一实施方案中，高表达的wildcard宿主细胞的选择也可以用荧光蛋白如绿 色荧光蛋白(GFP)或变体来进行，所述变体即红色荧光蛋白(RFP)，蓝色荧光蛋白(BFP)，青 色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)，黄色荧光蛋白(YFP)或其它变体。借助表达 的报告蛋白，可以通过荧光激活细胞分选(fluorescent activated cell sorting，FACS)， 或用磁富集(MACS或类似技术)进行适当标记后，从转染细胞的群体中富集高表达的细胞。 经过数轮富集循环，可获得各个报告蛋白的高表达群体。最终的wildcard细胞优选还通过 这些富集的多克隆细胞群体的有限稀释克隆过程来产生。报告基因的其它优选例有，氯霉素转移酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶， 荧光素酶等等。在特别优选的实施方案中，选出〃超性能(outperformer) “ wildcard细胞系，其 报告基因表达水平优选至少10倍于、更优选至少20倍于、还更优选至少25倍于所得克隆 群体的平均表达水平。在另一优选实施方案中，分析了至少1000个，例如至少2000个或至少3000个
初步克隆化或寡克隆化细胞群体，以便鉴定高表达的wildcard宿主细胞系，例如超性能 wildcard宿主细胞系。优选的wildcard细胞系在高转录活性位点整合了单拷贝的靶载体。为了选出合适的wildcard细胞，优先考虑整合位点数和靶载体的整合拷贝数。对靶载体整合数和整合 位点数的分析可通过PCR-(优先通过实时定量PCR)和Southern印迹分析或原位杂交来进 行。在另一实施方案中，最终的wildcard host-cell除了携有稳定整合的靶载体以 外，可能还携有在交换反应期间用到的双链断裂(DSB)介导酶的表达盒。该表达盒可以是 靶载体的一个部分，或者可以作为不同的载体来引入。该表达盒优先包含诱导型启动子以 便能定时控制DSB-介导酶的表达。4. 3. 2非随机整合在另一实施方案中，DSB介导酶的第一和第二识别位点可通过定向同源重组引入 宿主细胞基因组的预定位点，所述位点已知支持转录活性，例如免疫球蛋白基因座。为此， 优选使用4. 2. 1. 2节所述的用于非随机整合的靶载体。选择过程可按4. 3. 1节所述来进行。但应注意，该实施方案的有些改良方案可能不需要选择过程，因为识别位点被引 入了已知支持转录活性的预定位点。4. Wildcard细胞内表达盒的交换为了进行表达盒的交换，将上述交换载体引入wildcard宿主细胞(即通过将靶载 体随机或非随机整合到宿主细胞基因组中获得的wildcard宿主细胞)，所用的引入条件允 许双链在靶载体的第一和/或第二识别位点处断裂。由此，交换载体通过双链断裂介导的 同源重组整合到宿主细胞基因组中。为此，wildcard宿主细胞优选与上述交换载体和另一载体共转染，所述另一载体 表达与靶载体中识别位点兼容的兆碱基核酸酶，尤其归巢核酸酶(HE)，例如I-SceI。备选 地，双链断裂介导酶可在用编码所需酶的相应mRNA转染后，或通过直接将此酶运送至宿主 细胞，而在该细胞中表达。所述酶切割靶载体中的识别位点。根据切割位点的个数，这将简单地打开基因组 中整合的靶载体(一个识别位点)或从靶载体释放可交换的表达盒(两个位于表达盒侧翼 的识别位点)。在这两种情况下，HE活性导致在wildcard细胞中靶载体内部的给定位置产 生双链断裂(DSB)。此DSB诱导出比内源同源重组(HR)频率高100-1000倍的HR。在此修复过程中， 转染的交换载体作为修复基质(repair matrix)来用，因为其同源序列伸展至表达盒侧翼。结果，整个表达盒包括RGl和SMl从wildcard细胞基因组剔除，被含有GOI的表 达盒替代，在另外的特别优选实施方案中，含有GOI的表达盒还含有经IRES元件与GOI偶 联的SM3。SM3还允许，无需分析GOI表达，而额外选出转录带有GOI和SM3的表达盒的细胞。HR的另一重要结果是激活靶载体中不含启动子的的SM2。由于与交换载体进行 HR, SM2将添加启动子、并因此促进SM2在成功修复的wildcard细胞中表达。由于启动子仅与交换载体中截短型ASM2可操作相连，它不向细胞传递抗性。同 源重组后，SM2被激活，允许有效选择已通过从交换载体弓I入表达盒而成功修复了双链断裂 情形的细胞。由于该单选(用SM2)或双选(用SM2和SM3)，无需过多筛选，就可产生高水平表 达GOI的生产者细胞同质群体。
由于wildcard细胞的基因组修饰仅限于在标记位置交换表达盒，细胞的表型不 受影响。甚至在需要由单细胞衍生的细胞群体的情况下，这可以在短时间内获得，因为对 选择后获得的群体进行的有限稀释很容易以高成功率进行。因此，本发明提供了快速且可重复地产生生产者宿主细胞的方法，所述细胞用于 获得大量的所需重组基因产物，例如重组蛋白或核酸。靶和交换载体通过同源重组进行交换反应的两个实例见图5和6。在另一实施方案中，交换载体可以引入wildcard宿主细胞基因组，其通过在基因 组的预定位置非随机整合DSB介导酶的第一和/或第二识别位点，优选通过用4. 2. 1. 2节 所述的靶载体，而获得。在该实施方案中，交换载体优选包含⑴目标基因(GOI)，和(ii)第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它们允许与第一和/或第二整合 位点的整合位点处的序列进行重组。更优选地，使用4. 2. 2节所述的交换载体。此外，以下附图和实施例更详细解释本发明。附1 一例靶载体(靶载体A)中遗传元件的图示该靶载体包含交换盒，所述盒带有CMV-启动子(Pl)驱动的报告基因(RGl)和 PSV40(P2)驱动的第一选择标记(SMl)，用于选择该载体对宿主细胞基因组的稳定整合。该 交换盒侧翼是归巢内切核酸酶(I-SceI)的两个识别位点。交换盒外的第二选择标记(SM2) 不含启动子，因此在该靶载体中不具有功能。图2另一例靶载体(靶载体B)中遗传元件的图示在改良版靶载体中，3' -I-SceI位点位于第一选择标记(SMl)的poly-A信号 (PA)之前。在I-SceI切割靶载体的再连接(末端连接(endjoning)而非同源重组)的情 况中，用PA-元件作为隔离子(isolator)，阻止SM2转录。此外，终止密码子位于不含启动 子的选择标记2 (SM2)之前，以便终止未能被pA元件终止的转录物翻译过程。图3 —例交换载体(交换载体A)中遗传元件的图示交换载体包含GOI的⑶S和选择标记(Δ SM2)的不完整⑶S。仅GOI⑶S之后有合 适的聚腺苷酸化信号。虽然SM2的不完整CDS由功能性组成型启动子P3(PSV40)驱动，但 该GOI在其5'-端仅含有与靶构建体中CMV-启动子3'-部分相同的部分启动子。图4另一例交换载体(交换载体B)中遗传元件的图示该实施方案中，交换载体除包含图3所示载体外，还包含第三选择标记(SM3)，该 标记的表达与GOI的表达经由IRES-元件而偶联。这允许通过用选择标记2和3进行双重 选择而分离出具有成功交换的表达盒的细胞。为了消除那些已在基因组中随机整合了完整的交换载体的细胞，本例的交换载体 包含HSV-TK-基因作为自杀基因。图5靶载体和交换载体通过同源重组(HR)进行的交换反应的图示位于标记的基因组位置、带有报告基因(RGl)和选择盒(SMl)的靶载体，在其侧翼 是归巢内切核酸酶识别位点(I-SceI)。启动子Pl由"增强子-PCMV-内含子"元件来代表。启动子P2由SV40-启动子(PSV40)来代表。交换载体携有GOI和非功能性选择标记 (ASM2)。用于通过同源重组(HR)修复归巢内切核酸酶介导的DSB的同源区在图中示出。 交换载体中的启动子P3由SV40-启动子(PSV40)来代表。下图显示表达盒成功交换后的标记的基因组位置。图6用第三选择标记(SM3)进行改良的交换反应的图示如图5所示进行交换载体与标记的基因组位置的靶载体之间的交换反应。在该 例中，交换载体除了含G0I，还包含第三选择标记(SM3)，该标记的表达与GOI的表达借 IRES-元件而偶联。图7在一组初步细胞克隆中测量hSEAP活性单个的克隆化或寡克隆化细胞群体(χ-轴)根据用于稳定整合靶载体的SMl活性 来选择。对细胞进行扩增，根据RGl (hSEAP)活性筛选随机标记的整合座位的转录活性。报 告子hSEAP的活性以ng/ml为单位在y-轴给出。A. 39个细胞群体中的hSEAP-活性分布。 B. 92个细胞群体中的hSEAP-活性分布。图8初步筛选潜在的通用宿主细胞如图7所示，通过在用靶载体转染后用SMl选择细胞，而产生细胞群体。这些信息 表明鉴定出了称为"超性能者"的所需高产细胞群体。鉴定是基于RGl (hSEAP)的表达。报 告子hSEAP的活性以ng/ml为单位在y-轴给出。图9次级筛选超性能01 A438超性能细胞以高表达RGl (hSEAP)为特征，从这些细胞起始，通过在无血清条件下 对单细胞进行有限稀释(LD)克隆操作，产生高表达的克隆化细胞群体。图A和B描绘了各 个克隆化细胞群体经RGl (hSEAP)活性证实的不同表达能力。报告子hSEAP的活性以ng/ml 为单位在y-轴给出。图B中的星号表示选出作为wildcard-细胞(标记为07-022)以备 后续使用的细胞克隆。选择是基于表达和生长特性。图10双链断裂介导的交换优化兆碱基核酸酶质粒量在事先形成的带有稳定整合的靶载体的wildcard细胞07-022中进行表达盒的交 换。借助DSB-介导的靶载体与交换载体之间的HR，来自标记的wildcard细胞的表达盒被 交换为GFP-IRES-SM3盒(以GFP为模型G0I)。该交换通过交换载体(ecv2)与兆碱基核 酸酶表达载体(Mnv)的共转染来进行。为了优化交换反应，用不同量的兆碱基核酸酶质粒 测试了恒量的交换载体。通过靶载体与交换载体之间同源重组进行的表达盒成功交换激活 了 SM2 (NeoR)。在用G418对2 X IO6进行11天的选择后，确定G418-抗性菌落的总数，以及 GFP-阳性菌落数。该图显示不同方案中的GFP-阳性细胞百分比。注意，方案5产生比方案 3多6倍的表达GFP的克隆化细胞。图11双链断裂介导的交换优化兆碱基核酸酶质粒量对图10所示方案获得的细胞，除用SM2活性进行选择以外，还用SM3 (ZeoR)活性 进行选择。双重选择之后，通过UV显微镜检确定双重耐药菌落的总数，以及GFP阳性菌落 数。方案5显示最高百分比(_94%)，有261个克隆显示双重抗性和亮GFP-表达细胞的最 高绝对数。图12双链断裂介导的交换优化兆碱基核酸酶质粒量克隆化细胞的实例，这些细胞是通过靶载体与交换载体之间由双链断裂(DSB)-诱导的同源重组，在wildcard-细胞中交换表达盒而获得的。此照片显示图10和 11中方案5所得GFP-阳性菌落的重叠图(可见光/紫外光)。比例尺表示100 μ m。图13从wildcard-细胞克隆01C090衍生的GFP-阳性菌落用另一 wildcard细胞群(01C090)按所述方法进行成功的盒交换的实例。此照片 显示盒交换、并根据SM2和SM3进行双重选择后获得的GFP-表达细胞。比例尺表示100 μ m。图14交换反应和双重选择后的GFP-阳性菌落 在已建立的wi Idcard-细胞克隆中，通过DSB-介导的表达盒交换进行成功的盒交 换的实例。以对比的方式显示了从wildcard-细胞克隆07-022 (A)和克隆08-018 (B)进行 交换或双重选择后获得的细胞。比例尺表示100 μ m。图15基于PCR证实交换反应来自三个不同的wildcard克隆(07-022，08-018，01C090)的DNA在交换反应之前 (泳道1，4，6)和交换反应之后(泳道3，5，7)用PCR进行分析。对于07-022，还分析了带 有随机整合的交换载体的对照(泳道2)。(A.) 368bp产物证实交换前存在hSEAP-表达盒 (泳道1，4，6)。交换后消失的条带(泳道3，5，7)表明彻底除去该表达盒。(B.)293bp产物 证实交换后存在GFP-表达盒(泳道3，5，7)，随机整合后也存在(泳道2)。(C.)971bp产 物仅在SM2完整(completion)后产生，因此表明通过HR进行了表达盒的交换(泳道3，5， 7)。相应的质粒用做阳性对照(泳道8)。注意，图(C)中的对照显示一条917bp的泳带，归 因于所用的质粒DNA。阴性对照包含水(泳道9)或来自亲本对照细胞的、未经任何修饰的 基因组DNA (泳道10)，以代替模板DNA。将不同琼脂糖凝胶的数据汇编(compiled)。
5.实施例5. 1生成载体系统5. 1. 1生成靶载体载体pcDNA3. 1 (+)上的原始CMV-启动子用NheI和NruI去除。载体pMG用XbaI 处理成平端后，用PacI取出带有内含子A的延伸型CMV-启动子。将该1. 7kb长片段连接 至经过NruI和NheI (与XbaI兼容)切割的pcDNA3. 1片段。由此产生载体CV001。5’ I-SceI通过衔接子引入CV001。互补寡核苷酸带有I-SceI位点 TAGGGATAACAGGGTAAT以及HindIII突出端，使其杂交并克隆至CVOO1的HindIII，得到 CV001-MN。pcDNA3. 1⑴的原始新霉素抗性(NeoR)基因在CV001-MN中被作为SMl的潮霉素 抗性(HygroR)基因替代。为此，从质粒扩增含polyA位点的HygroR基因，使HygroR-CDS缺 失5’端的前4个核苷酸(包括起始ATG)、并在其3 ‘-端包含PciI限制性位点。PciI消化 后，将PCR连接至BsaBI和PciI消化的非甲基化CV001-MN。通过克隆进BsaBI位点，Hygro R-⑶S因在载体5’端添加所丢失的ATGA而被补充完整。在所得载体CVOOl-MN-Hygro中引 入不含启动子的NeoR基因作为SM2。为此，从合适的质粒DNA经PCR扩增完整的NeoR-⑶S。 用5'-引物引入I-SceI位点，进而允许通过PciI进行NeoR-⑶S的克隆。3'-引物引入 BstZ171(TAC)位点。PciI和BstZ17I消化后，对PCR片段进行凝胶纯化，将其连接至已用相同的限制酶 切割的载体CVOOI-MN-Hygro。
为完成靶载体，给所得载体CV001-MN2-HygrO-NeO不佳分泌型碱性磷酸酶 (hSEAP)-基因作为RG1。通过KpnI和XbaI消化，从合适的载体上取出含poly-A信号的 hSEAP-CDS。将该片段克隆到载体CV001-MN2-Hygro-Neo的Kpnl和Xbal位点。最终的靶 载体称 pCTV-SAP-Hyg-01。5. 1.2牛成交换载体基于载体CV001生成图4的交换载体B。为了产生非功能截短型SM2，通过BstZ17I 和 BInI 消化，从 CV001 取出 NeoR-CDS。NeoR-CDS 用 631bp 的 BInI-Nael NeoR-片段。该 截短的NeoR-基因缺失该酶C末端24个氨基酸的编码序列，这部分对其功能而言很关键。在所得CVOOl-Δ NeoR载体中，通过BsmBI and MunI双重消化，取出CMV启动子的 5' _区，其包含增强子和RNA-聚合酶II启动子。这将主要留下CVOOl中CMV-内含子A 启动子元件的内含子A序列。用Klenow酶填充凹陷的3'-端后，该载体通过平末端移交 (relegation)而闭合。所得载体CVOOI-InA- Δ NeoR已准备好引入游离的可选择的GOI、并作为一般 性交换载体。作为GOI的例子，可选绿色荧光蛋白(GFP)。在本例中，GFP表达与第三选 择标记(SM3)的表达借IRES元件而偶联。作为SM3，选用零霉素(Zeocine)抗性基因 (ZeoR)。表达盒由L-GFP序列及其后的IRES元件组成，ZeoR⑶S以AgeI-SaII片段的形 式从载体pMono-Zeo-GFP (Invitrogen)取出。将该盒通过平端连接而放置到EcoRV切割的 CVOOl-InA-ANeoR 中。最终的载体称为 pCEV-GFP-Zeo-01。5. 2生成通用的Wildcard细胞系为产生潜在的wildcard细胞系，使用已适应无血清条件下悬浮生长、并能长至高 细胞密度(至少2-5 X IO6细胞/ml)的CHO细胞系。为了用靶载体pCTV-SAP-Hyg-01转染 悬浮细胞，采用Nucleofector技术。在核转染(nucleofection)之前，靶载体pCTV-SAP-Hyg-Ol用SspI消化，原因有-消除不想要的细菌元件(复制起点，氨苄青霉素抗性基因)以阻止由这些元件介 导的靶载体沉默。-增加宿主细胞基因组中靶载体相关功能性元件完整整合(intactintegration) 的可能性。SspI消化产生1. 698kb片段，其包含pUC ori以及AmpR基因的主要部分。剩余 的相关7. 41kb靶载体元件用QIAquick凝胶纯化试剂盒按厂家建议进行琼脂糖凝胶电泳纯 化。为了用凝胶纯化的靶载体进行核转染，确立了允许已适应悬浮培养的CHO细胞高 效转染的调节。一般而言，70-90%转染细胞的效率常规就可以实现。对经过核转染的细胞进行24h的回收，然后根据作为SMl的潮霉素磷酸转移酶 (HygroR)的表达选出具有稳定整合的靶载体的细胞。为了用潮霉素B (200 μ g/ml)进行选 择，将经过核转染的细胞转移到96-孔板，其密度允许分离单克隆或寡克隆细胞群体(有限 稀释)。这可以通过1-60个细胞/孔，最优选1-30个细胞/孔的密度来完成。这些单克隆或寡克隆细胞群体每一个代表靶载体的不同随机整合位点。这些整合 位点的转录活性用微滴板比色实验所测得的上清中hSEAP-报告基因的活性来确定。
当达到近70-80%铺满时，将所选细胞转移到24孔板进行进一步扩增。用上清分 析hSEAP-活性。内源碱性磷酸酶经65°C保温30min而灭活。hSEAP活性在hSEAP反应缓冲液(2M 二乙醇胺，ImM MgCl2, 20mM L-高精氨酸，pH 9.8)中于37°C进行测量。底物对硝基苯磷酸 (p-nitrophenol phosphate, 120mM)的水解通过读取0D405来测量。活性数据针对胎盘碱 性磷酸酶标准进行定量。大多数克隆显示极低的hSEAP报告子活性。所分离的具有稳定整合的靶载体的克 隆仅有一部分显示该报告子的高表达。这些初级克隆或寡克隆细胞群体中表达水平的变动 的典型分布，由图7A和B中概述的hSEAP-表达来显示。为了鉴定罕见的称为"超性能克 隆"的高表达克隆，分析了超过3000个初级克隆化/寡克隆化细胞群体。为确保用高表达克隆作为通用wiIdcard细胞，用显示最高hSEAP水平的克隆进 行再次有限稀释，以便鉴定出具有最大表达水平的亚克隆。针对第一轮有限稀释所得克隆 01A438显示了一个实例，作为超性能克隆(图8)。来自克隆01A438的细胞个体在第二轮 有限稀释中接种，以允许产生单细胞衍生的细胞群体。如图9A和B所示，所得多个亚克隆 总体上展示比大多数来自初步筛选的起始克隆更高的hSEAP表达。有可能在该组高表达 克隆中鉴定出那些具有最高hSEAP表达的克隆。在该阶段选择克隆进行进一步分析时，除 了考虑报告基因的表达，还考虑克隆的生长能力(倍增时间)。根据该额外标准，选出克隆 07-022(图9中用星号标记)。总之，为获得具有高水平hSEAP表达的宿主细胞系，通过无血清的有限稀释克隆 过程，产生了数千个克隆。由于随机整合至基因组，这些克隆中仅约50%展示可检测的 hSEAP表达。在这些hSEAP表达克隆中，仅0.3%的克隆被鉴定为高表达克隆，8卩"超性能 克隆"(比所有克隆的平均表达高25倍以上)。5. 3交换报告基因为了用RGl和SMl交换G0I，亚克隆07-022的wildcard细胞与图4的交换载体 pEV-GFP-Zeo-01以及用于罕见切割的归巢内切核酸酶I-SceI的表达载体一起转染。用绿 色荧光蛋白(GFP)编码序列作为G0I。GFP之前的可剪接型内含子A区具有足够的长度(1077bp)以允许有效同源重组， 但含有减弱的启动子活性。交换载体中的SMl是C-端截短型新霉素抗性基因(NeoR)。由于NeoR编码区缺失 163bp，所得截短的新霉素磷酸转移酶不赋予对G418的抗性。NeoR基因的5，端(719bp)足 以允许与靶载体中的完整NeoR进行同源重组。此策略允许在不产生NeoR细胞的情况下， 因交换载体的随机整合，而活化靶载体中不含启动子的NeoR基因。此系统允许选出，用交换载体作为修复基质，通过同源重组修复了归巢酶诱导的 DSB的细胞。作为额外的选择标记，SM3(零霉素抗性基因)借助GFP与Zeo抗性基因之间的 IRES元件，从GFP-表达盒表达。此SM3被用于确定交换载体的随机整合频率，并检查，是否无需表达盒的整合形 成交换载体，仅凭缺失靶载体中的交换区，就能由其它修复事件产生新霉素抗性细胞。为此，双重转染的细胞先用G418进行选择，记录所产生的克隆数，用UV显微镜检分析这些克隆的GFP表达。如图10所示，用G418进行11天的选择后，获得NeoR细胞的异质群体，其中 45-62%显示亮GFP表达，而其余NeoR细胞为GFP阴性。这些细胞可代表通过简单的末端连接或通过单侧同源重组进行的DSB修复。在后 一种情况下，仅邻接NeoR基因的DSB被HR修复，而邻接CMV-启动子的DSB被非同源的末 端连接修复。利用以零霉素进行的额外选择，根据与恒量交换质粒工转染的I-SceI表达质粒 Mnv的量，GFP阳性细胞级分增加至多达94% (图11)。当使用兆碱基核酸酶表达载体与交 换载体之间的最佳比例(图11的方案5)时，可检测到总共291个表达GFP的菌落。转染 并用G418和磷霉素进行选择后，得到2 X IO6个细胞进行铺板，这代表大约1X10_4的频率。 此前公开的双链断裂诱导的同源重组的频率是1-2，5X10_6，因此，我们的结果是令人意外 的好结果。总之，使用两种选择标记能选出展示亮GFP荧光的同质细胞群体(图12)。 除了克隆07-022，还用另一 wiIdcard克隆证实RGl和SMl对由GFP-IRES-ZeoR组 成的表达盒的交换能力(图13和14)。总体上，用hSEAP低表达的wildcard克隆进行交换，在用G418和零霉素进行双重 选择后，仅发现无荧光或弱荧光的细胞。。与此相反，用hSEAP高表达的wildcard克隆，导致表达盒通过所述兆碱基核酸 酶_介导的交换基质进行有效交换，并产生双重抗性的亮GFP表达细胞，如图13中克隆 01-C090 所示。Wildcard克隆08-018与克隆07-022的比较见图14。使用克隆08-018，能在兆碱 基核酸酶_介导的表达盒交换后，产生同质的GFP表达细胞群体。此GFP表达强度与衍生 自克隆07-022的细胞中所见相当。wildcard细胞经历基于兆碱基核酸酶的交换反应后衍生的细胞，可以在无血清的 悬浮培养中扩增，并用于生产目的。为了确保单细胞衍生的生产细胞系，可以在较少费力的情况下，用有限稀释快速 产生交换的细胞。5. 4分子鉴定为监控交换反应期间的分子事件，用三种不同引物组合(表1的PCR 1-3)进行基 于PCR的方案。表1用于分子鉴定的引物组合PCR 编号引物结合 5'-3'靶鉴定的表型PCR产物大 小(bp)1IntA-SEAP宿主wildcard细J包中 的靶载体SEAP+, HygroR GFP-3682IntA-GFP交换载体ZeoR GFP(+)2933SVlOP-3'Neo同源重组后活化的 SM2(NeoR)G418+ Zeo+ GFP+971用PCR 1在wildcard-宿主细胞基因组中检测到稳定整合的靶载体。用PCR 2证 实了，交换反应后，细胞中确实存在来自交换载体的表达盒。由于交换载体也可随机掺入， 用PCR 3证实靶构建体内部交换区3’端的同源重组。该PCR的5'-引物结合交换构建体 中的SV40启动子，3'-引物结合仅见于靶构建体、未见于交换构建体的NeoR基因的3'部 分。仅在同源重组激活了不含启动子的SM2(NeoR基因)后，PCR 3能产生971bp的PCR产 物。将不同PCR分析的结果组合，可证实来自靶构建体的表达盒的消除，以及来自交 换载体的表达盒的引入。图15显示了对三种不同的通用wildcard细胞系进行所述分析的结果，这三种细 胞系都成功进行了交换反应。在图(A.)中，靶构建体的存在通过结合CMV-启动子元件的 内含子中、以及结合hSEAP CDS 5'-区的引物证实。图(B.)用与图(A.)同样的内含子引 物以及与GFP CDS 5’区结合的引物证实了交换载体B的稳定整合的表达盒。相应PCR产 物的成功扩增表明通过HR或通过随机整合引入了表达盒。图(C.)显示，PCR证实靶载体 中活化的NeoR基因的存在，这是与交换载体进行HR的结果。由于该PCR的5'-引物结合 仅见于交换载体的SV40启动子，3'-引物结合仅见于靶构建体的NeoR CDS的3'部分，成 功的扩增表明，交换载体与靶载体在3' -I-SceI介导的DSB处发生了 HR。作为图(A.)和(B.)的阳性对照(泳道8)，分别使用靶载体和交换载体2。图(C.) 的阳性对照是带有相同的引物结合序列、但距离略有不同的载体(CVOOl)。因此，阳性对照 产生了比从基因组DNA预计的略小的PCR产物(917bp，而非971bp)。作为阴性对照，模板 DNA被水替换(泳道9)，或者，为检查CHO基因组DNA的非特异性扩增，使用来自无靶构建 体核转染的亲本CHO细胞系的DNA(泳道10)。对克隆07-022的鉴定最深入，除了起始细胞及其成功交换细胞的衍生物，还分析 了用于交换载体B随机整合的对照。该对照所用细胞克隆在仅有交换载体B的核转染之后 显示零霉素抗性和极弱的GFP荧光。对于克隆08-018和01C090，分析了起始细胞，以及成功交换的细胞，后者经历双
重选择后幸存，并展示亮GFP荧光。
对于所有克隆，hSEAP-⑶S的存在可以在起始细胞群体中清楚地证实(图A)。对 于克隆07-022，该⑶S的存在也可以在随机整合产生的细胞克隆中证实。经过兆碱基核 酸酶介导的交换反应后，在所测试的显示NeoR/ZeoR和亮GFP荧光的所有交换克隆中， hSEAP-⑶S不再能扩增。这表明所有分析例中消除了来自整合的靶载体的起始表达盒。根据该发现，来自交换载体的表达盒的存在也可以通过对仅仅那些进行了交换反 应的GFP-⑶S进行PCR来证实(图B泳道3，5，7)。所测试的克隆的起始细胞在该PCR实验 中为阴性(图B，泳道1，4，6)。该PCR实验并不特异于经HR引入GFP-表达盒。克隆07-022 的交换载体B随机整合的例子表明，这里用GFP-⑶S特异性引物也可以获得阳性信号。不同细胞群体进行交换反应后产生的GFP表达的亮度表明，在泳道3，5和7所用 细胞内标记的表达热点中引入了 GFP-⑶S。为了最终证实所观察到的表型是基于消除了靶载体中的表达盒、并在相同位置引 入了交换载体的表达盒，进行另外的PCR分析(图C.)。当靶载体中3' I-SceI介导的DSB 用交换载体2作为修复基质通过HR修复后，该PCR仅产生预计的971bp PCR产物。正如预 计仅见于双重抗性的亮GFP细胞的那样，可检测到预计的PCR产物(图C，泳道3，5，7)，但 在交换载体随机整合所产生的细胞中未检测到(图C，泳道2)。
权利要求
产生生产者宿主细胞的方法，所述细胞用于生成重组基因产物，所述方法包括以下步骤(a)提供靶载体，其包含(i)报告基因(RG1)，该基因与第一表达控制序列(P1)可操作相连，(ii)第一选择标记基因(SM1)，该基因与第二表达控制序列(P2)可操作相连，(iii)第二非功能选择标记基因(SM2)，该基因未与表达控制序列可操作相连，其中序列(i)位于5′ 位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之间，序列(iii)位于3’ 位置，(iv)双链断裂介导酶的第一和第二识别位点，其中第一识别位点位于第一表达控制序列(P1)和第一报告基因(RG1)之间，第二识别位点位于序列(ii)和序列(iii)之间，(b)将所述靶载体引入宿主细胞，所用条件允许该靶载体随机整合到该宿主细胞的基因组中，(c)选择具有稳定整合的靶载体、并显示报告基因(RG1)的转录活性的宿主细胞，(d)提供交换载体，该载体包含(i)目标基因(GOI)，和(ii)失活的第二选择标记基因(ΔSM2)，该基因与第三表达控制序列(P3)可操作相连，其中，交换载体包含第一5′ 同源序列和第二3′ 同源序列，它们允许与靶载体的序列进行重组，(e)将交换载体引入步骤(c)获得的宿主细胞中，所用条件允许双链在(a)(iv)项所述第一和/或第二识别位点处断裂、并允许交换载体通过双链断裂介导的同源重组而整合到宿主细胞基因组中，其中，失活的第二选择标记基因(ΔSM2)因交换载体与靶载体同源重组导致交换载体整合而被激活，(f)选出生产者细胞，其具有通过与整合的靶载体发生同源重组而整合的交换载体，其中所述生产者细胞表达GOI。
2.权利要求1的方法，其中的宿主细胞是真核细胞，尤其哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
3.权利要求1或2的方法，其中的报告基因(RGl)编码酶或化学发光或荧光基因产物。
4.权利要求1-3之一的方法，其中的第一表达控制序列(Pl)包含组成型启动子，例如 CMVo启动子，任选补充有CMV内含子A。
5.权利要求1-4之一的方法，其中第二表达控制序列(P2)包含组成型启动子，例如 SV40启动子，或IRES元件。
6.权利要求1-5之一的方法，其中失活的第二选择标记基因(SM2)无ATG起始密码子 和/或有上游终止密码子。
7.权利要求1-6之一的方法，其中双链断裂诱导酶是具有由至少10个、优选至少12 个、更优选18个核苷酸组成的识别位点的兆碱基核酸酶或归巢核酸酶，例如选自I-Scel， I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-CeuI, I-CreI, I-Ppol, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, HO 和 Endo SceI0
8.权利要求1-7之一的方法，其中第二识别位点位于转录隔离子(transcriptionalisolator)如 poly-A 位点之前。
9.权利要求1-8之一的方法，其中第一和第二识别位点彼此取向相反。
10.权利要求1-9之一的方法，其中选出以下细胞，在该细胞中，靶载体以单拷贝形式 具体整合至宿主细胞染色体的单个位点。
11.权利要求1-10之一的方法，其中的选择步骤(C)是基于选择第一选择标记基因 (SMl)的活性。
12.权利要求1-11之一的方法，其中选出具有较高的报告基因(RGl)转录活性的宿主 细胞。
13.权利要求1-12之一的方法，其中交换载体包含不带有功能性表达控制序列的目标 基因(GOI)，尤其带有与靶载体中第一表达控制序列(Pl)的3’部分实质相同的部分表达控 制序列。
14.权利要求1-13之一的方法，其中交换载体包含不完整的第二选择标记基因 (Δ SM2)，该基因与第三表达控制序列(Ρ3)可操作相连，该Ρ3具体包含组成型启动子，例如 SV40启动子。
15.权利要求1-14之一的方法，其中交换载体还包含(iii)第三选择标记基因(SM3)，其与GOI共转录。
16.权利要求1-15之一的方法，其中第一5'-同源序列具有至少约1000个核苷酸和 /或第二 3'-同源序列具有至少约700个核苷酸。
17.权利要求1-16之一的方法，其中交换载体中的第一5'-同源序列不含功能性表 达控制序列。
18.权利要求1-17之一的方法，其中交换载体中的第二3'-同源序列不含功能性选 择标记基因序列。
19.权利要求1-18之一的方法，其中交换载体还包含(iv)阴性选择标记基因，尤其自杀基因，例如HSV胸苷激酶基因，其位于由第一 5' _和第二 3' _同源序列限定的序列以外。
20.权利要求1-19之一的方法，还包括(i)在步骤(e)之前或期间，将包含编码双链断裂介导酶的核酸序列或mRNA的载体引 入宿主细胞，并表达此酶，以便允许进行步骤(e)，或( )在步骤(e)之前或期间，将双链断裂介导酶引入宿主细胞，并提供此酶，以便进行 步骤(e)。
21.权利要求15-20之一的方法，其中的选择步骤(f)是基于选择第二选择标记基因 (SM2)的活性。
22.权利要求1-21之一的方法，其中的选择步骤(f)是基于选择第二选择标记基因 (SM2)和第三选择标记基因(SM3)的活性。
23.权利要求1-22之一的方法，还包括表达目标基因(GOI)和获得所表达的基因产物。
24.产生用于引入目标基因(GOI)的wildcard宿主细胞的方法，包括(a)提供靶载体，其包含(i)报告基因(RGl)，该基因与第一表达控制序列(Pl)可操作相连，( )第一选择标记基因(SMl)，该基因与第二表达控制序列(P2)可操作相连，(iii)第二非功能选择标记基因(SM2)，该基因未与表达控制序列可操作相连，其中序列⑴位于5'-位置，序列(ii)位于⑴和(iii)之间，序列(iii)位于3’-位置，(iv)双链断裂介导酶尤其兆碱基核酸酶的第一和第二识别位点，其中第一识别位点位 于第一表达控制序列(Pl)和第一报告基因(RGl)之间，第二识别位点位于序列(ii)和序 列(iii)之间，(b)将所述靶载体引入宿主细胞，所用条件允许该靶载体随机整合到该宿主细胞的基 因组中，和(c)选择具有稳定整合的靶载体、并显示报告基因(RGl)的转录活性的宿主细胞。
25.制备重组基因产物的方法，包括以下步骤(a)提供wildcard宿主细胞，在其基因组中整合了表达盒，所述盒包含(i)报告基因(RGl)，该基因与第一表达控制序列(Pl)可操作相连，(ii)第一选择标记基因(SMl)，该基因与第二表达控制序列(P2)可操作相连，(iii)第二非功能选择标记基因(SM2)，该基因未与表达控制序列可操作相连，其中序列⑴位于5'-位置，序列(ii)位于⑴和(iii)之间，序列(iii)位于3’-位置，(iv)双链断裂介导酶的第一和第二识别位点，其中第一识别位点位于第一表达控制序 列(Pl)和第一报告基因(RGl)之间，第二识别位点位于序列(ii)和序列(iii)之间，其中所述表达盒稳定整合到宿主细胞基因组中并显示报告基因(RGl)的转录活性，(b)提供交换载体，该载体包含 ⑴目标基因(GOI)，和(ii)失活的第二选择标记基因(ASM2)，该基因与第三表达控制序列(P3)可操作相连，其中，交换载体包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它们允许与靶载体的 序列重组，(c)将交换载体引入步骤(a)提供的宿主细胞中，所用条件允许双链在(a)(iv)项所述 第一和/或第二识别位点处断裂、并允许交换载体通过双链断裂介导的同源重组而整合到 宿主细胞基因组中，其中，失活的第二选择标记基因(ASM2)因交换载体的整合而被激活，(d)选出生产者细胞，其具有通过与整合的靶载体发生同源重组而整合的交换载体，其 中所述生产者细胞表达GOI。
26.产生用于制备重组基因产物的生产者宿主细胞的方法，包括(a)将含有双链断裂介导酶第一和第二识别位点的核酸序列通过定向同源重组而引入 宿主细胞基因组中支持转录活性的位置，(b)选出具有稳定整合的第一和第二识别位点的wildcard宿主细胞，(c)提供交换载体，该载体包含 ⑴目标基因(GOI)，和(ii)第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它们允许与第一和/或第二识别位点 的整合位点处的序列重组，(d)将交换载体引入步骤(b)获得的宿主细胞中，所用条件允许双链在(a)项所述第一 和/或第二识别位点处断裂、并允许交换载体通过双链断裂介导的同源重组而整合到宿主 细胞基因组中，和(e)选出生产者细胞，其具有通过同源重组而整合的交换载体，其中所述生产者细胞表 达 G0I。
27.制备用于引入目标基因(GOI)的wildcard宿主细胞的方法，包括(a)将含有双链断裂介导酶第一和第二识别位点的核酸序列通过定向同源重组而引入 宿主细胞基因组中支持转录活性的位置，和(b)选出具有稳定整合的第一和第二识别位点的wildcard宿主细胞。
28.制备重组基因产物的方法(a)提供wildcard宿主细胞，在其基因组中整合了含有双链断裂介导酶第一和第二识 别位点的核酸序列，其中的核酸序列稳定整合到宿主细胞基因组中支持转录活性的位置，(b)提供交换载体，该载体包含 ⑴目标基因(GOI)，和(ii)第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它们允许与第一和/或第二识别位点 的整合位点处的序列重组，(c)将交换载体引入步骤(a)提供的宿主细胞中，所用条件允许双链在(a)项所述第一 和/或第二识别位点处断裂、并允许交换载体通过双链断裂介导的同源重组而整合到宿主 细胞基因组中，和(d)选出生产者细胞，其具有通过同源重组而整合的交换载体，其中所述生产者细胞表 达 G0I。
29.靶载体，其包含(a)与第一表达控制序列(Pl)可操作相连的报告基因(RGl)，(b)与第二表达控制序列(P2)可操作相连的第一选择标记基因(SMl)，(c)未与表达控制序列可操作相连的非功能第二选择标记基因(SM2)，其中序列(i)位 于5'-位置，序列(ii)位于(i)和(iii)之间，序列(iii)位于3’ -位置，(d)双链断裂_介导酶尤其兆碱基核酸酶的第一和第二识别位点，其中第一识别位点 位于第一表达控制序列(Pl)和第一报告基因(RGl)之间，第二识别位点位于序列(ii)和 序列(iii)之间。
30.交换载体，用于将目标基因(GOI)引入宿主细胞，其包含 ⑴目标基因(GOI)，和(ii)失活的第二选择标记基因(ASM2)，该基因与第三表达控制序列(P3)可操作相连，其中，交换载体包含第一 5'-同源序列和第二 3'-同源序列，它们允许与宿主细胞 基因组中预定位点的序列重组。
31.权利要求30的交换载体，其中的同源序列允许与权利要求29所述靶载体的序列重组。
32.用于制备重组基因产物的生产者细胞，其能通过权利要求1-23或26之一的方法获得。
33.用于引入目标基因(GOI)的wildcard宿主细胞，其能通过权利要求24或27的方法获得。
34.权利要求33的wildcard宿主细胞，还包含编码双链断裂介导酶的核酸序列，优选 与诱导型表达控制序列可操作相连。
35.权利要求33或34的wildcard宿主细胞与权利要求30或31的交换载体的组合。
36.权利要求33，34或35的wildcard宿主细胞用于制备生产者细胞系的用途。
37.权利要求32的生产者细胞或按照权利要求36所述获得的生产者细胞用于制备重 组基因产物的用途。
全文摘要
本发明属于在真核细胞中制备重组基因产物的领域。本发明涉及快速、可重复地生成适于大规模生产重组基因产物的生产细胞系的方法和物质。本发明包括特异性载体系统，遗传改造的宿主细胞和使用方法。
文档编号C12Q1/68GK101981196SQ200980111274
公开日2011年2月23日 申请日期2009年3月27日 优先权日2008年3月28日
发明者哈里·阿布茨, 安德烈亚斯·赫尔曼, 贝内迪克特·格罗伊利希 申请人:塞洛尼克股份公司