癌症分期与治疗的系统和方法

专利名称：癌症分期与治疗的系统和方法
癌症分期与治疗的系统和方法
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本申请要求2008年2月19日提交的美国临时申请61/0 ,656的优先权，该申请 全部内容通过引用结合到本文中。技术领域
本文提供了治疗癌症的方法，更具体地提供了基于微小RNACmicr0RNA)的基因 表达对癌症进行差异治疗的方法。
背景技术：
在世界范围内，肺癌是男性和女性中与癌症相关死亡率的主要原因。虽然对晚 期非小细胞肺癌(NSCLC)的当前治疗令人失望，但使用抗血管新生治疗却越来越有希 望。已经以非选择方式对患者进行了一些此类抗血管新生治疗，包括靶向VEGF受体2 和3 (VEGFR-2/;3)的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，例如舒尼替尼和索拉非尼。
微小RNA(也称为miR或者miRNA)是长度在21到25个核苷酸的一类小 的非编码RNA，其近来与癌症生物学相关联(CaKn等，Proc Natl Acad Sci USA99 15524-15529,2002)。这些RNA片段通过与靶向mRNA的3，非翻译区(3，UTR)中 的互补序列结合在转录后调控基因表达(Kumar等，Nat Genet39 673-677，2007)。这 可最终导致蛋白质翻译的抑制并进而导致蛋白质表达的抑制(Eder等，NEng J Med 352 2446-2448, 2005)。由于miR的调节能力可极大影响细胞生理学，miR对蛋白质表达 的调控正在成为癌变研究中的一个重要领域Mcott等，J Biol Chem 282 1479-1486， 2007)。因此，需要通过miR表达预测个体患者中药效的方法。发明内容
一方面，本发明提供了一种使用微小RNA评估肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂敏感性 的方法。
在一实施方案中，本发明提供了一种通过评估患者样品中miR-497的表达并将 miR-497的降低表达与对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关联来评估癌细胞对酪氨酸激酶 抑制剂敏感性的方法。
在另一实施方案中，本发明提供了一种预测癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感 性从而对癌症治疗应用基于个性化药物的方法。
在另一实施方案中，本发明提供了一种预测癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感 性从而防止患者遭受可能无效的药物的副作用的方法。
在另一实施方案中，本发明提供了一种预测癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感 性从而防止癌症患者在可能无效的治疗上浪费时间的方法。
在另一实施方案中，本发明提供了一种评估肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的 试验，所述试验不需要肿瘤活检。
在一实施方案中，患者样品来自血液。在另一实施方案中，患者样品来自肿瘤 活检。
在另一实施方案中，通过mRNA检测方法例如RT-PCR、微阵列分析、或 Northern印迹法来评估表达。
在另一实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂特异性地抑制仅VEGFR2、仅 VEGFR3、VEGFR2和VEGFR3两者、或者与任何其他分子组合的VEGFR2或VEGFR3。在一实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂为舒尼替尼。在另一实施方案中，酪氨酸激酶抑制 剂为索拉非尼。
在另一实施方案中，所述癌细胞为非小细胞肺癌细胞。
在另一方面，本发明提供了一种涉及减缓癌细胞群扩散的方法，该方法包括 评估样品中miR-497的表达，将miR-497的降低表达与对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相 关联，以及使用酪氨酸激酶抑制剂治疗所述癌细胞群。
在一实施方案中，本发明提供了一种将miR-497的阳性表达与对酪氨酸激酶抑 制剂的抗性相关联的方法。在这种情况下，不施用酪氨酸激酶抑制剂。
在一实施方案中，样品取自人。在另一实施方案中，所述样品为血液组分。在 另一实施方案中，所述样品为肿瘤活组织。
在一实施方案中，显示癌细胞在染色体区域17p呈现杂合度缺失。
在一实施方案中，癌细胞为非小细胞肺癌细胞。
在一实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂特异性地抑制仅VEGFR2、仅 VEGFR3、VEGFR2和VEGFR3两者、或者与任何其它分子组合的VEGFR2或VEGFR3。
在另一实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂为舒尼替尼。
在另一实施方案中，所述癌细胞群包含非小细胞肺癌细胞。
在另一方面，本发明提供了有助于评估miR-497表达的试剂盒，所述试剂盒包 括一种能够特异性识别miR-497自身或miR-497基因产物的试剂。在一实施方案中，所 述试剂包含寡核苷酸。在另一实施方案中，所述试剂包含反义核酸。在另一实施方案 中，所述试剂与固体支持物结合。
在一实施方案中，所述试剂盒包含荧光标记。在另一实施方案中，所述试剂盒 包含能够识别除miR-497基因以外的基因或该基因的任何产物的试剂。
在另一方面，本发明提供了一种涉及评估癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的 方法，所述方法通过评估FGF1、HOXCIO、和/或LHFP单独或组合的表达，并将这些 产物的阳性表达与对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关联来进行。
在一实施方案中，样品来自患者血液。在另一实施方案中，样品来自肿瘤活 检。
在一实施方案中，使用例如RT-PCR、微阵列分析、或Northern印迹法等方法通 过测量mRNA表达来评估表达。在另一实施方案中，通过使用涉及特异性配体例如抗体 的方法测量蛋白质表达来评估表达。此类方法包括免疫组织化学方法、ELISA、和流式 细胞术。在另一实施方案中，使用质谱方法评估表达。
在一实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂为舒尼替尼。
在另一实施方案中，癌细胞为非小细胞肺癌细胞。
在另一方面，本发明提供了一种涉及减缓癌细胞群扩散的方法，该方法包括评 估样品中FGF1、HOXC10,和/或LHFP单独或组合的表达，将FGF1、HOXC10,禾口 /或LHFP的阳性表达与对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关联，以及使用酪氨酸激酶抑制剂 治疗所述癌细胞群。
在一实施方案中，本发明提供了一种将FGF1、HOXCIO、和/或LHFP的降低表达与对酪氨酸激酶抑制剂的抗性相关联的方法。在这种情况下，不施用酪氨酸激酶抑 制剂。
在一实施方案中，样品取自人。在另一实施方案中，样品为血液组分。在另一 实施方案中，样品为肿瘤活组织。在另一实施方案中，癌细胞为非小细胞肺癌细胞。在 另一实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂为舒尼替尼。
在另一方面，本发明提供了有助于评估FGF1、HOXCIO、和/或LHFP单独或 组合表达的试剂盒，所述试剂盒包括能够特异性识别FGFl、HOXCIO、和/或LHFP自 身或者FGF1、HOXCIO、和/或LHFP基因产物的试剂。在一实施方案中，所述试剂包含寡核苷酸。在另一实施方案中，所述试剂包含反义核酸。在另一实施方案中，所述试 剂与固体支持物结合。在另一实施方案中，所述试剂盒包含荧光标记。在另一实施方案 中，所述试剂盒包含能够识别除miR-497基因以外的基因或该基因的任何产物的试剂。


结合下面说明性附图通过参考详细说明可获得对本发明的更全面理解。在附图 中，相同的参考数字在全部附图中表示相同的元素或行为。
图1描述了 Western印迹图像，所述图像显示用miR-497模拟物或对照模拟微小 RNA转染的H;358细胞中VEGFR2和VEGFR3的表达。
图2描述了 Western印迹的密度测定结果，所述Western印迹显示用miR-497抑 制剂或模拟物、或对照抑制剂或模拟微小RNA转染的H358细胞中VEGFR2和VEGFR3的表达。
图3描述了 Western印迹的密度测定结果，所述Western印迹显示用miR-497抑 制剂或模拟物、或对照抑制剂或模拟微小RNA转染的H1703细胞中VEGFR2的表达。
图4描述了 Western印迹的密度测定结果，所述Western印迹显示用miR-497抑 制剂或模拟物、或对照抑制剂或模拟微小RNA转染的H520细胞中VEGFR2的表达。
图5描述了 Western印迹的密度测定结果，所述Western印迹显示用miR-497抑 制剂或模拟物、或对照抑制剂或模拟微小RNA转染的H157细胞中VEGFR2的表达。
图6描述了 Western印迹的密度测定结果，所述Western印迹显示用miR-497抑 制剂或模拟物、或对照抑制剂或模拟微小RNA转染的H1703细胞中VEGFR2的表达。
图7描述了 Western印迹的密度测定结果，所述Western印迹显示用miR-497抑 制剂或模拟物、或对照抑制剂或模拟微小RNA转染的H1703细胞中VEGFR2和VEGFR3 的表达。
图8描述了舒尼替尼处理对舒尼替尼敏感(H520和H1703)和舒尼替尼抗性 (H322c、H358, H157、和A549)细胞系活力的结果。
图9描述了舒尼替尼敏感(H520和H1703)和舒尼替尼抗性(H32&、H358、H157、和 A549)细胞系中 FGF1、LHFP> 禾Π HOXClO 的 qRT-PCR 分析结果。
详细说明
定义
除非特别说明，本说明书和权利要求中的单词和短语具有对于适用领域的技术 人员而言平实、普通和惯常的含义。
在以下描述中，为了说明目的，阐明了很多具体细节以提供本发明多方面的全 面理解。但是相关领域技术人员应理解，无需这些具体细节即可实践本发明。在其它情 况下，为避免混淆本发明，更一般性地显示或讨论已知的结构和装置。本公开的完整范 围不限于下面描述的实施例。
使用方法
技术领域：
本发明提供了组合使用miR-497模拟物与酪氨酸激酶抑制剂来评估癌细胞对药 物敏感性的方法。本发明还提供了基于癌细胞对miR-497的表达使用酪氨酸激酶抑制剂 治疗癌症的方法。另外，本发明提供了基于基因FGF1、HOXCIO、和LHFP中任意基因 的单独或组合的表达来评估癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的方法。
靶包括由细胞产生的和在细胞内、细胞表面表达或由细胞分泌的任何分子结 构。靶包括蛋白质、脂类、糖类、核酸(包括RNA分子和基因组DNA序列)、亚细 胞结构、糖蛋白、病毒、以及任何已知或尚未公开的其它类似结构，无论是单独的或组 合的。靶的示例包括但不限于，VEGFR2、VEGFR3、miR-497、FGFU HOXCIO、 LHFP、及其任何产物，包括mRNA和蛋白质。
癌细胞包括来自以下的细胞肿瘤、赘生物、癌症、前病变、细胞系、或具有 扩散和无限生长潜力的细胞的任何其它来源。癌细胞来自天然来源或由人工创造。当 置入动物宿主内时，癌细胞能够侵入其它组织并转移。癌细胞进一步包括任何已侵入其 它组织和/或转移的恶性细胞。就生物体而言，一个或多个癌细胞也可被称为癌症、肿 瘤、赘生物、异常生长物、恶性肿瘤、或本领域用于描述处于癌状态的细胞的任何其它 术语。
作为癌细胞来源的癌症包括但不限于实体瘤，例如纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂 肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管 内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤，结肠癌，结直肠 癌，肾癌，胰腺癌，骨癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，食道癌，胃癌，口腔癌，鼻腔 癌，喉癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺 癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞瘤，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞 瘤，胚胎癌，Wilms瘤，子宫颈癌，子宫癌，睾丸癌，小细胞肺癌，膀胱癌，肺癌，上 皮癌，神经胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管 膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，皮肤癌，黑色 素瘤，神经母细胞瘤，以及视网膜母细胞瘤。
作为癌细胞来源的其它癌症包括但不限于血源性癌症，例如急性淋巴细胞白血 病、急性淋巴细胞B细胞白血病、急性淋巴细胞T细胞白血病、急性成髓细胞白血病、 急性前髓细胞性白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、急性巨核细胞白血病、 急性粒-单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、淋巴细胞白血病、 骨髓性白血病、淋巴细胞性白血病、髓细胞性白血病、Hodgldn病、非Hodgldn淋巴瘤、 原发性巨球蛋白血症、重链病、以及真性红细胞增多症。
在一实施方案中，癌细胞来自非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC包括任何来自 肺组织的不包括小细胞肺癌的癌症。非小细胞肺癌的例子包括但不限于肺的腺癌、大细 胞癌、以及鳞状细胞癌。
癌细胞的扩散包括导致来自癌细胞的个体细胞的数量增加的任何过程。癌细胞 的扩散可能由于体外或体内的有丝分裂、增殖、或癌细胞扩散的任何其它形式。癌细胞 的扩散进一步包括侵入和转移。癌细胞可能物理上接近可能与其遗传上相同或不相同的 来自相同克隆或来自不同克隆的癌细胞。这种聚集可呈现集落、肿瘤或转移的形式，任 一所述形式可在体内或体外发生。减缓癌细胞的扩散可通过抑制促进扩散的细胞过程或 通过产生抑制扩散的细胞过程来实现。抑制扩散的过程包括减缓有丝分裂的过程和促进 细胞衰老或细胞死亡的过程。抑制扩散的具体过程的例子包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 依赖性和非依赖性途径、自噬、坏死、凋亡、以及线粒体依赖性和非依赖性过程，并进 一步包括尚未公开的任何此类过程。
通过使用应用于癌细胞以减缓癌细胞扩散的外部试剂实现对癌细胞扩散的抑 制。此类试剂包括天然或合成的配体、阻断剂、激动剂、拮抗剂、者受体激活剂、免疫 细胞(例如CD8+T细胞)、病毒、基因或蛋白质表达的抑制剂(例如SiRNA或miR)、小 分子、药用组合物、或者任何向癌细胞施用可导致癌细胞扩散减缓的其它物质组合物。 减缓癌细胞扩散的试剂的概念包括限制接近细胞存活所必需的任何天然或人工试剂，包 括必需营养物、配体、或细胞-细胞接触。这些试剂和条件的例子包括用抗血管新生抑 制剂的处理。
在一实施方案中，减缓癌细胞扩散的试剂包含酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。酪氨 酸激酶催化磷酸基团转移到特定蛋白质的酪氨酸残基。如果TKI抑制癌细胞的生长、 分化或分裂所需的激酶的作用，癌细胞的扩散被减缓。TKI包括以特异性或非特异性方 式抑制一种或多种酪氨酸激酶作用的任何试剂。TKI包括小分子，抗体，肽，或者直接 地、间接地、变构地、或以任何其它方式抑制酪氨酸残基磷酸化的任何物质。
酪氨酸激酶抑制剂的具体例子包括N-(三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰 胺、3-
喹唑 啉、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双甲氧基乙氧基)-4-氨基喹唑啉、BIBX1382、2， 3，9，10，11，12-六氢-10-(羟甲基)-10-羟基-9-甲基-9，12-环氧-IH-二吲哚[1， 2，3-fg 3，，2，，1，-kl]吡咯[3，4-i][l，6]苯并二氮芳辛-1-酮、SH268,染料木 黄酮、STI571、CEP2563、4-(3-氯苯基氨基)-5，6-二甲基-7H-吡咯[2，3_d]嘧啶甲 磺酸酯、4-(3-溴-4-羟苯基)氨基_6，7-二甲氧基喹唑啉、4-(4’ -羟苯基)氨基_6， 7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N_4_氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)_1_酞嗪胺、 N-[2-( 二乙基氨基)乙基]-5-[(Z)_(5-氟-1，2-二氢-2-氧-3H-吲哚-3-亚基)甲 基]-2，4-二甲基-IH-吡咯-3-甲酰胺(舒尼替尼)、4-[4-[[4_氯-3(三氟甲基)苯基] 氨甲酰氨基]苯氧基]_N-甲基-吡啶-2-甲酰胺(索拉非尼)、以及EMD121974。
在另一实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂对血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)和 血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)有活性。VEGFR2和VEGFR3是将血管新生所必需的 蛋白质磷酸化的酪氨酸激酶。酪氨酸激酶抑制剂可仅单独抑制VEGFR2或VEGFR3、或 抑制VEGFR2和VEGFR3两者而不抑制所有其它靶、或者抑制VEGFR2和/或VEGFR3 与一种或多种其它酪氨酸激酶或其它靶的组合。抑制VEGFR2和/或VEGFR3的酪氨 酸激酶抑制剂包括舒尼替尼和索拉非尼，但可以是仅靶向VEGFR2或其与任何其它酪 氨酸激酶组合的任何抑制剂；仅靶向VEGFR3或其与任何其它酪氨酸激酶组合的任何抑 制剂；或者靶向VEGFR2和VEGFR3而不靶向任何其它酪氨酸激酶或靶向VEGFR2和 VEGFR3与任何其它酪氨酸激酶的组合的任何抑制剂。 本文使用的VEGFR2具有如下序列。gcagcatcgg acaagacccc cagcacttgg gggttcaggc ccggcagggc gggcagaggg ctggaggccc aggctgggaa ctcatctggt tgaactctgg tggcacagga gtgtcctctt ccctctctgc agacttccca gctaggaaga gcaggactcc aggcccaagg ctcccggaat tccgtcacca cgactggcca gggccacgct ccagctgccc cggcccctcc ccctgagatt cagatgtcat ttagttcagc atccgcaggt gctggtcccg gggccagcac ttccatggga atgtctcttt ggcgacctcc tttcatcaca ctgggtggtg gcctggtccc tgttttccca cgaggaatct gtgggtctgg gagtcacaca gtgttggagg ttaaggcata cgagagcaga ggtctcccaa acgccctttc ctcctcaggc acacagctac tctccccacg agggctggct ggcctcaccc acccctgcac agttgaaggg aggggctgtg tttccatctc aaagaaggca tttgcagggt cctcttctgg gcctgaccaa acagccaact agcccctggg gtggccacca gtatgacagt attatacgct ggcaacacag aggcagcccg cacacctgcg cctgggtgtt gagagccatc ctgcaagtct ttttcaacag aacttcacag actgttagag ctgctgagaa gaatttgctt tccgaattca gcctggaagg cgcccaggga cagctgtact gagtctagat gactctgacc cccgccccag gtcaaggcca gcagagcagt cagtgcctct ggagaaggcc cttgctctcc cacctggccc agactccgag gagcctgggt ctggagctgc cggtctggtt cttcccttta gagcccggat ctgccacctg cggcccctcc caagccgtga accagctcat gagagatgaa cactgtggga tccactcagg aaggctcggg gctggcacaa aggaccaccc agcattgccc tgtgccaccc agcactcagt ggacattctg gggacctgcc ttcagccttt tcctgccctg tgcctgacat cagcaccctg gctggtcaga atgccgccct cccagaggag cagccgagag atcccctgaa ggctggaggc attctgctca ggacccctat cccagctcac agtgcccaac catctcacca ggagaaagag ccacatcccc acgttaggac cacggagact gaccaccacc ctgacccccc aaacccacgc accagacgct tgcaggacag gcgccgcgca gcgggcaggg gcttgcccgg ccgaccctcc cctccccacc tcccccactg cgcgttactc caggatatgc cgagtgcacg tataaggtca tcttcgtcgt ccccgtggac ctcccccttc ctctgcacgt cgtccaacgt gggactggcg tgtcaggctt ccctgggagg atctggaggt tgttctctgc agagaaccag cctggctcct ggcgcgcacc tctgctccct tctcctcact acccacccac gcatgtaccg ggaaaaaaac tactatgccc ttctagacca tgttctgaga aaagatcgaa aatatttaac aagagataat aataaatctg atgccggtct ttgtgtgtgt tgcgga(SEQ IDNO 2)
VEGFR3具有如下序列。
gcagcatcgg acaagacccc cagcacttgg gggttcaggc ccggcagggc gggcagaggg
ctggaggccc aggctgggaa ctcatctggt tgaactctgg tggcacagga gtgtcctctt
ccctctctgc agacttccca gctaggaaga gcaggactcc aggcccaagg ctcccggaat
tccgtcacca cgactggcca gggccacgct ccagctgccc cggcccctcc ccctgagatt
cagatgtcat ttagttcagc atccgcaggt gctggtcccg gggccagcac ttccatggga
atgtctcttt ggcgacctcc tttcatcaca ctgggtggtg gcctggtccc tgttttccca
cgaggaatct gtgggtctgg gagtcacaca gtgttggagg ttaaggcata cgagagcaga
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ggcctcaccc acccctgcac agttgaaggg aggggctgtg tttccatctc aaagaaggca
tttgcagggt cctcttctgg gcctgaccaa acagccaact agcccctggg gtggccacca
gtatgacagt attatacgct ggcaacacag aggcagcccg cacacctgcg cctgggtgtt
gagagccatc ctgcaagtct ttttcaacag aacttcacag actgttagag ctgctgagaa
gaatttgctt tccgaattca gcctggaagg cgcccaggga cagctgtact gagtctagat
gactctgacc cccgccccag gtcaaggcca gcagagcagt cagtgcctct ggagaaggcc
cttgctctcc cacctggccc agactccgag gagcctgggt ctggagctgc cggtctggtt
cttcccttta gagcccggat ctgccacctg cggcccctcc caagccgtga accagctcat
gagagatgaa cactgtggga tccactcagg aaggctcggg gctggcacaa aggaccaccc
agcattgccc tgtgccaccc agcactcagt ggacattctg gggacctgcc ttcagccttt
tcctgccctg tgcctgacat cagcaccctg gctggtcaga atgccgccct cccagaggag
cagccgagag atcccctgaa ggctggaggc attctgctca ggacccctat cccagctcac
agtgcccaac catctcacca ggagaaagag ccacatcccc acgttaggac cacggagact
gaccaccacc ctgacccccc aaacccacgc accagacgct tgcaggacag gcgccgcgca
gcgggcaggg gcttgcccgg ccgaccctcc cctccccacc tcccccactg cgcgttactc
caggatatgc cgagtgcacg tataaggtca tcttcgtcgt ccccgtggac ctcccccttc
ctctgcacgt cgtccaacgt gggactggcg tgtcaggctt ccctgggagg atctggaggt
tgttctctgc agagaaccag cctggctcct ggcgcgcacc tctgctccct tctcctcact
acccacccac gcatgtaccg ggaaaaaaac tactatgccc ttctagacca tgttctgaga
aaagatcgaa aatatttaac aagagataat aataaatctg atgccggtct ttgtgtgtgt
tgcgga (SEQID NO 3)
但是，预期可鉴定为VEGFR2或VEGFR3的任何序列，所述鉴定根据序列可被一种或多种酪氨酸激酶抑制剂抑制的能力、其可识别特定配体的能力、或其保持细胞内 信号的能力来进行。序列可显示这些特征中的任一特征及其任意组合。序列包括任何突 变、截短、或增加另外的核苷酸。序列在基因组、mRNA、或蛋白质水平，就VEGFR2 而言与SEQ ID N0.2具有至少60%、70%, 80%,或90%的一致性，就VEGFR3而言与 SEQIDN0.3 具有至少 60%、70%, 80%,或 90%的一致性。
微小RNA(miR)是具有18到36个核苷酸的非编码RNA，在一实施方案中其长 度为21到25个核苷酸，所述RNA通过与通常位于靶mRNA 3’非翻译区(UTR)的与 miR序列互补的序列结合来抑制基因表达。基因沉默的机制包括抑制蛋白质翻译和下调蛋白质表达。
本文使用的miR-497具有如下序列。
cagcagcaca cugugguuug u (SEQ ID NO 1)
但是，预期可鉴定为miR-497的任何序列，包括突变、截短、或增加一个或 多个核苷酸，所述序列能够结合VEGFR2或VEGFR3的3’ UTR,这种结合导致降低 VEGFR2或VEGFR3的表达。序列在基因组或mRNA水平与SEQID NO. 1具有至少 60%, 70%, 80%,或90%的一致性。miR-497的概念包括源自miR-497的一种或多种 非核苷酸小分子组合物，其能够特异性结合VEGFR2/3的3’ UTR,因此VEGFR2/3的 表达沉默。
虽然使用核酸序列例如cDNA、mRNA或蛋白质序列鉴定特定靶，但特定靶并 不限于所述确切序列的产物。事实上，使用核酸序列鉴定的特定靶包括使用与特定靶相 同方法评估表达时产生阳性表达的所有序列。在一实施方案中，如果使用免疫组织化 学分析评估样品中特定靶的表达，且如果样品表达的序列与用于鉴定特定靶的序列不同 (例如一个或多个核酸分子的变体)但仍然检测到阳性表达，则特定靶包括样品表达的序 列。
表达包括生产源自核酸模板的物质的所有过程。因此表达包括RNA转录、 mRNA剪接、蛋白质翻译、蛋白质折叠、翻译后修饰、膜转运、与其它分子的结合、向 蛋白质加入糖部分、磷酸化、蛋白质复合物形成、以及后续产生源自遗传物质的生物物 质的任何其它过程。表达还包括源自核酸模板的物质生成被主动或被动抑制的所有过 程。此类过程包括转录和翻译调控的所有方面。例子包括异染色质沉默、转录因子抑 制、任何形式的RNAi沉默、微小RNA沉默、选择性剪接、蛋白酶消化、翻译后修饰、 以及选择性蛋白质折叠。
通过很多本领域现在使用和有待开发的用于检测源自核酸模板的物质的方法评 估表达。此类方法的例子包括任何核酸检测方法，包括但不限于，微阵列分析、RNA 原位杂交、RNA酶保护试验、Northern印迹、反转录酶PCR、定量PCR、定量反转录 酶PCR、定量实时反转录酶PCR、或者已知的或尚未公开的检测特定核酸的任何其它方 法。其它例子包括使用抗体检测表达的任何方法，包括但不限于，流式细胞术、免疫组 织化学方法、ELISA、Western印迹、以及免疫亲和层析。抗体可为单克隆、多克隆、或 任何抗体片段，包括Fab、F(ab)2、Fv> scFv、噬菌体展示抗体、肽体、多特异性配体、 或特异性结合靶的任何其它试剂。所述方法还包括用于评估蛋白质表达的直接方法，包 括但不限于，HPLC、质谱、蛋白质微阵列分析、PAGE分析、等电点聚焦、2-D凝胶电 泳、以及酶测定。检测表达的样品包括单个细胞、整个器官或整个器官的任何部分，无 论在体外、间接体内、体内、或死后。
用于评估表达的其它方法包括使用能够特异性结合靶的天然或人工配体，包括 蛋白质、糖类、脂肪、核酸、催化位点、或其任意组合，例如酶、糖蛋白、细胞膜、病 毒、细胞、器官、细胞器、或构成与配体特异性结合的靶的任何其它多分子结构。所述 配体包括抗体、抗体复合物、偶联物、天然配体、小分子、纳米颗粒、或能够特异性结 合靶的任何其它分子实体。配体与标记物结合，所述标记物例如放射性同位素或其螯合 物、染料(荧光或非荧光)、染色剂、酶、金属、或能够帮助机器或人眼将表达靶的细胞与不表达靶的细胞相区分的任何其它物质。另外，可使用与能够杀死细胞的物质结合的 单体或多聚体配体评估表达。所述物质包括蛋白质或小分子毒素、细胞因子、细胞凋亡 前物质、成孔物质、放射性同位素、或能够杀死细胞的任何其它物质。
阳性表达包括表达特定靶的细胞与不表达特定靶的细胞之间的任何差异。阳性 表达的确切特征因方法而变，但其是操作特定方法的人所熟知的。使用探测器、包含探 测器的仪器、或者通过被辅助或没有辅助的人眼来评估阳性表达。例子包括但不限于 在IHC载玻片对表达靶的细胞的特异性染色、将来自样品的RNA与微阵列结合并使用能 够检测与所述微阵列结合的仪器检测、实时RT-PCR中掺入高比例的染料、使用流式细 胞仪检测表达靶的细胞上的荧光、Northern印迹膜上出现放射性标记带、通过RNA酶保 护试验检测标记的阻断RNA、通过细胞凋亡标记检测细胞死亡、通过肿瘤收缩检测细胞 死亡、或者已知或未公开的观察表达的任何其它方法。
降低表达造成阳性表达的缺乏，因此表达特定靶的细胞与不表达特定靶的细胞 之间没有显著差异。降低表达的概念进一步包括表达不足以达到或超过导致特定细胞或 生理反应的阈值、界限、或水平。例如，降低表达包括在试验细胞中特定靶的表达，该 表达相对于已知不表达所述靶的对照细胞而言是阳性表达。但是，由于所述试验细胞中 所述靶的表达不足以引起特定的生理反应(例如，使所述细胞对特定药物敏感)，所述试 验细胞中的表达仍然归类为降低表达。类似地，阳性表达的概念也包括足以引起生理反 应的表达。
还提供了在评估表达的任何生物样品中评估靶的表达的方法。根据是否评估种 系DNA、肿瘤DNA、mRNA、或任何形式蛋白的表达，本领域技术人员知道如何选择 特定的生物样品，以及如何收集所述样品。样品来源的例子包括但不限于，以下组织的 活组织检查或者其它体内或间接体内分析前列腺、乳房、皮肤、肌肉、筋膜、大脑、 子宫内膜、肺、头颈、胰腺、小肠、血液、肝、睾丸、卵巢、结肠、皮肤、胃、食道、 脾、淋巴结、骨髓、肾、胎盘、或胎儿组织。在一实施方案中，样品包含液体样品， 例如外周血、淋巴液、腹水、浆液、胸腔积液、痰、脑脊髓液、羊水、泪液、粪便、 或尿。在另一实施方案中，样品包含原发或转移NSCLC细胞。在另一实施方案中， 样品包含血液。可使用多种方法在血液和血液组分例如血清或血浆中容易地检测微小 RNA(Chen X 等，Cell Research 18983-984，2008 年 10 月)。
提供了有助于评估靶表达的试剂盒。此类试剂盒包含一种或多种指示靶的存在 的试剂。此类试剂盒的内容包括一种或多种以下单独的或组合的物质一种或多种能够 与靶内序列杂交的寡核苷酸引物，所述引物被进一步优化以用于基于PCR的方法；靶序 列全部或部分的反义探针；对靶mRNA、蛋白质、或其它可测基因产物具有特异性的配 体；标记物；缓冲液；或者在已知或尚未公开的评估靶表达的方法中有用的任何其它试 剂。实施例
实施例1
对VEGFR2或VEGFR3的3，UTR具有特异性的微小RNA (miR)的表达能够结 合所述UTR并沉默VEGFR2或VEGFR3 (VEGFR2/3)的表达。所述miR的阳性表达意味着降低的VEGFR2/3表达。降低VEGFR2/3表达的肿瘤对VEGFR2/3特异性的酪氨 酸激酶抑制剂具有抗性。相反地，如果肿瘤显示能够下调VEGFR-2/3的miR的降低表 达，则结果是更强的VEGFR-2/3表达，意味着所述肿瘤对VEGFR2/3特异性的酪氨酸激 酶抑制剂更加敏感。通过miR评估VEGFR2/3比直接评估VEGFR2/3蛋白质更有利。 miR表达可通过PCR和高通量测序方法快速评估。另外，miR可从血液中获得，且个体 miR的表达可在血浆、血清、或其它血液组分中容易地评估。所述试验允许多种疾病尤 其是癌症的简便的症状前监测。
对公用数据库的检索显示，根据其序列，miR有可能调控VEGFR-2/3表达 (Targetscan Database, Whitehead Institute for Biomedical Research, 2006-2008)。这包 括在两种基因的3’ UTR中搜索可能的miR结合位点。一种核心预测结合位点GCTGCT 在VEGFR2和VEGFR3两者的3’ UTR中都常见。使用种子序列，鉴定miR-497可能能 够调控VEGFR2/3。miR-497位于染色体17p。肺癌中常见染色体17p等位基因缺失的事 实(Tonon等，ProcNatlAcadSciUSA 102 9625-9630，2005)进一步导致选择miR-497。 17p等位基因缺失以50%几率在肺癌中发生。另外，染色体17p位于TP53基因座附近 (< 1MB),所述基因座通常在癌症中是杂合度缺失的常见位点(Chmara等，Anticancer Res24 4259-4263，2004)。
miR-497表达、VEGFR2/VEGFR3蛋白质和mRNA表达、以及特异性酪氨酸 激酶抑制剂舒尼替尼对VEGFR2/3的敏感性在源自非小细胞肺癌的6种细胞系(H1703、 A549, H520、H322C、H358,和H157)中评估并在表1(下面)中总结。
表 权利要求
1.评估癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的方法，所述方法包括 评估包含基因产物的样品中SEQIDN0.1的表达；以及将SEQ IDN0.1的降低表达与对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关联。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含肿瘤活组织。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含血液。
4.如权利要求1到3中任一项权利要求所述的方法，其中所述基因产物包含mRNA。
5.如权利要求4所述的方法，其中评估SEQID N0.1的表达包括使用RT-PCR。
6.如权利要求4所述的方法，其中评估SEQIDN0.1的表达包括使用微阵列。
7.如权利要求4所述的方法，其中评估SEQID N0.1的表达包括使用Northern印迹。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂抑制VEGFR2(SEQID N0.2)。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂抑制VEGFR3(SEQID N0.3)。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂为舒尼替尼。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂为索拉非尼。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述癌细胞为非小细胞肺癌细胞。
13.减缓癌细胞扩散的方法，其包括 评估样品中SEQ ID N0.1的表达；将SEQ ID N0.1的降低表达与对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关联；以及 施用有效量的所述酪氨酸激酶抑制剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述样品为人样品。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述样品包含血液组分。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述样品为肿瘤活组织。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述癌细胞在染色体区域17p包含杂合度缺失。
18.如权利要求13到17中任一项权利要求所述的方法，其中所述癌细胞为非小细胞 肺癌细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂为舒尼替尼。
20.有助于评估miR-497表达的试剂盒，其包括能够特异性识别miR-497或其产物的 试齐11°
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述试剂包含寡核苷酸。
22.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述试剂包含反义核酸。
23.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述试剂与固体支持物结合。
24.如权利要求20到23中任一项权利要求所述的试剂盒，其进一步包括荧光标记。
25.如权利要求20到24中任一权利要求所述的试剂盒，进一步包括能够特异性识别 第二种基因或其产物的试剂。
26.评估癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的方法，该方法包括评估样品中靶基因产物的表达，所述靶基因产物选自FGF1(SEQIDN0: 4)、 HOXdO(SEQ ID NO 5)禾口 LHFP (SEQ ID NO 6)；以及将所述靶基因产物的阳性表达与对酪氨酸激酶抑制剂的抗性相关联。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述样品包含肿瘤活组织。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述样品包含血液。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述癌细胞为非小细胞肺癌细胞。
30.如权利要求26到29中任一项权利要求所述的方法，其中所述基因产物包含 mRNAo
31.如权利要求30所述的方法，其中评估所述基因产物的表达包括使用RT-PCR。
32.如权利要求30所述的方法，其中评估所述基因产物的表达包括使用微阵列。
33.如权利要求30所述的方法，其中评估所述基因产物的表达包括使用Northern印迹。
34.如权利要求26到29中任一项权利要求所述的方法，其中所述基因产物包含蛋白质。
35.如权利要求34所述的方法，其中评估所述基因产物的表达包括使用能够特异性识 别所述基因产物的配体。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述配体包含抗体。
37.如权利要求36所述的方法，其中评估所述基因产物的表达包括使用免疫组织化学方法。
38.如权利要求36所述的方法，其中评估所述基因产物的表达包括使用ELISA。
39.如权利要求36所述的方法，其中评估所述基因产物的表达包括使用流式细胞术。
40.如权利要求26到29中任一权利要求所述的方法，其中评估所述基因产物的表达 包括使用质谱。
41.如权利要求26到40中任一项权利要求所述的方法，其中所述癌细胞为非小细胞 肺癌细胞。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂为舒尼替尼。
43.减缓个体内癌细胞扩散的方法，该方法包括评估样品中靶的表达，所述靶选自FGF1 (SEQ ID NO 4)、HOXCIO (SEQID NO 5)禾口 LHFP (SEQ ID NO 6)；将SEQ ID NO.l的降低表达与对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关联；以及 向所述个体施用有效量的所述酪氨酸激酶抑制剂。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述样品为人样品。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述样品包含血液组分。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述样品为肿瘤活组织。
47.如权利要求43到46中任一项权利要求所述的方法，其中所述癌细胞为非小细胞 肺癌细胞。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂为舒尼替尼。
49.有助于评估靶表达的试剂盒，所述靶选自FGF1(SEQ ID NO : 4)、HOXCIO (SEQ ID NO 5)和LHFP (SEQ ID NO: 6)，所述试剂盒包括能够特异性识别靶或其基因产物 的试剂，所述靶选自 FGF1 (SEQ ID NO 4)、HOXCIO (SEQID NO 5)和 LHFP (SEQ ID NO 6)。
50.如权利要求49所述的试剂盒，其中所述试剂包含寡核苷酸。
51.如权利要求49所述的试剂盒，其中所述试剂包含反义核酸。
52.如权利要求49所述的试剂盒，其中所述试剂包含抗体。
53.如权利要求49所述的试剂盒，其中所述试剂与固体支持物结合。
54.如权利要求49到53中任一项权利要求所述的试剂盒，其进一步包括荧光标记。
55.如权利要求49到54中任一项权利要求所述的试剂盒，其进一步包括能够特异性 识别第二种基因或其产物的试剂。
全文摘要
本发明公开了评估癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的方法。所述方法包括评估miR-497的表达，并将降低表达与对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关联。本发明还公开了评估细胞对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的方法，该方法包括评估FGF1、HOXC10、和/或LHFP的表达。本发明还公开了基于由所公开的方法获得的结果使用酪氨酸激酶抑制剂例如舒尼替尼治疗患者的方法和有助于所述方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102027131SQ200980113822
公开日2011年4月20日 申请日期2009年2月19日 优先权日2008年2月19日
发明者格伦·韦斯 申请人:翻译基因组学研究院