固定化酶的制造方法

专利名称：固定化酶的制造方法
技术领域：
本发明涉及制造固定化酶的方法。
背景技术：
甘油和脂肪酸作为原料进行酯化反应时，为了有效地使用酶，而使用在无机或 有机的载体上固定有脂质分解酶的固定化酶。然而，随着该固定化酶在反应中的长期 使用，其活性降低，因此必须其活性降低到某一程度的时侯进行回收，更换新的固定化酶。作为对回收的已用过的固定化酶进行有效利用的方法，有通过用碱完全除去附 着在固定化酶上的蛋白质等，并重复利用载体的方法(专利文献1)。另外，有通过使 用溶剂或溶剂和磷脂来对酯交换反应和酯转移反应中已使用的活性降低的固定化脂肪酶 进行湿润处理，控制参与反应的水分，从而使残留的脂肪酶重新活化的方法(专利文献 2)。但是，上述现有技术中，使用碱除去酶的方法限定了固定化载体，不能应用在 使用其它固定化载体的酶中。另外，使用溶剂或溶剂和磷脂对活性降低的固定化酶进行湿润处理的方法，其 并不是使因部分脂肪酶的脱附而造成活性降低的固定化酶再生的方法，终归只是再活化 残留的脂肪酶的方法。专利文献专利文献1 日本特开平1-187086号公报专利文献2:日本特开平9-56379号公报

发明内容
本发明提供一种固定化脂质分解酶的制造方法，将酯化反应中使用过的固定化 脂质分解酶和溶剂混合，进行洗净使得相对于100质量份的固定化载体，固定化脂质分 解酶中的油分残留量为50质量份以下，接着，使其接触碱溶液，然后回收固定化载体， 使脂质分解酶吸附在该固定化载体上。
具体实施例方式本发明涉及提供 制造固定化脂质分解酶的方法，有效利用已在酯化反应中使用 过的固定化酶的固定化载体，制造与使用前具有相同性能的固定化脂质分解酶。这里，已明确在使用固定化脂质分解酶来制造甘油二酯(以下，记为“DAG”) 的情况下，使用由上述现有技术再生的固定化酶的话，含DAG油脂的DAG纯度降低。 因此，本发明人对于DAG纯度降低的原因进行了各种研究讨论，发现原因在于，在再生 的固定化酶中残留有活性已降低的酶。具体而言，是因为即使脂质分解活性降低，转移 活性也仍有残留，因此经过从1，3-DAG向1，2-DAG的重排，生成甘油三酯(以下，记为“TAG”)，降低了 DAG的纯度。本发明人进一步研究讨论发现如果用溶剂洗净固 定化酶后，通过碱溶液处理的话，可以将活性已降低的酶从用于酯化反应后的固定化载 体上几乎完全脱附。而且发现在此之后，通过使新的脂质分解酶吸附在回收的固定化 载体上，可以制造作为目标产物的固定化脂质分解酶。根据本发明，可以有效利用在酯化反应中已使用过的固定化酶的固定化载体， 制造与使用前具有相同性能的固定化脂质分解酶。而且，如果采用通过本发明的方法制 造得到的固定化脂质分解酶，可以制造DAG纯度高的含DAG油脂。作为本发明的制造方法的对象固定化酶(已使用过的固定化酶)是在酯化反应中 使用的、脂质分解活性降低的固定化脂质分解酶。作为酯化反应，例如可以列举出下文 所示的甘油与脂肪 酸或与其低级烷基酯的酯化反应。作为本发明的制造方法的对象固定化酶中的固定化载体，可以列举出硅藻土 (celite)、硅藻土、高岭石、硅胶、分子筛、多孔质玻璃、活性碳、碳酸钙、陶瓷等无机 载体，陶瓷粉末、聚乙烯醇、聚丙烯、壳聚糖、离子交换树脂、疏水性吸附树脂、螯合 树脂、合成吸附树脂等有机高分子等；特别优选离子交换树脂。作为离子交换树脂，优选多孔质阴离子交换树脂。这样的多孔质载体由于具有 大的表面积，因而酶的吸附量大。树脂的粒径优选为100 1000 μ m，细孔径优选为 10 150nm。对于阴离子交换树脂，在专利文献1中记载了由于载体的疏水性而吸附强，酶 难以从该载体脱附，因而，难以使由于使用而失活的酶脱附，重复利用载体。对此， 本发明发现如果用溶剂洗净固定化酶后，用碱溶液处理，即使在疏水性吸附酶的载体 中，酶也容易脱附，并且吸附新的酶，因此可以重复利用载体。在本发明中，作为阴离子交换树脂的材质，可以列举出苯酚-甲醛类、聚苯乙 烯类、丙烯酰胺类、二乙烯基苯类等；特别是从良好地发挥本发明效果的观点出发，优 选酚醛树脂(例如，Rohmand Hass Co.制造的Duolite A-568)。在本发明中，作为脂质分解酶可以列举出脂肪酶。脂肪酶的种类可以任意选 择，但从制造DAG纯度高的含DAG油脂的观点出发，优选1，3位选择性脂肪酶。脂肪酶，当然可以使用来源于动物、植物的脂肪酶，也可以使用来源于微生物 的市售脂肪酶。作为来源于微生物的脂肪酶，可以列举出来源于根霉(Rhizopus)属、曲 霉(Aspergillus)属、毛霉(Mucor)属、根毛霉(Rhizomucor)属、假单胞菌(Pseudomonas) 属、地霉(Geotrichum)属、青霉(Penicillium)属、假丝酵母(Cimdida)属等的脂肪酶。作为用于洗净已用过的固定化酶的溶剂，可以列举出正己烷、丙酮、氯仿、乙 醇、甲醇、乙酸乙酯、乙腈、乙酸、戊烷、辛烷等；从酶的油分除去性的观点出发，优 选正己烷、丙酮、乙醇；特别从酶的油分除去性和溶剂除去性的观点出发，优选正己 焼。洗净方法可以列举出间歇式混合、连续式接触等，从操作性的观点出发，优选 间歇式混合。洗净后，优选通过过滤·减压蒸馏溶剂等方法从固定化酶中除去溶剂。洗净后的油分附着量变少，在碱处理工序中降低油分和碱的皂化，操作性变 好，从该观点出发，以相对于100质量份的固定化载体(以下，单独用“份”表示)， 洗净后固定化脂质分解酶中的油分残留量为50份以下的方式进行洗净。从同样的观点出发，洗净后的 固定化脂质分解酶中的油分残留量更优选为1 50份；从同样的观点和处 理成本的观点出发，特别优选为10 40份。洗净操作可以只进行一次，也可以重复多 次。相对于固定化载体质量，测定残留的油分质量，用下述计算式(1)求得相对于 100份固定化载体的质量比作为油分残留量。油分残留量=(a-b)/bX100(a:固定化酶质量，b:固定化载体质量) (1)通过溶剂洗净后，使固定化酶与碱溶液接触，使酶从已用过的固定化酶脱附。 作为在本发明中的碱溶液中使用的碱，例如可以列举出氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、 碳酸钾等；从已用过的酶的除去性的观点出发，优选氢氧化钠。与碱溶液的接触方法可以列举出间歇式混合、连续式接触等；从操作性的观点 出发，优选间歇式混合。接触方法可以列举出静置、搅拌、振荡等。从有效发挥制得的固定化酶的活性，防止DAG纯度降低的观点出发，用于使酶 从已用过的固定化酶中脱附的碱溶液的温度优选为0 70°C，更优选为30 65°C，特别 优选为40 60°C。另外，这里“DAG纯度”是指在DAG和TAG中的DAG的质量％ (以下，单独用“％”表示)，用式0八0/江八0+0八0)\100表示。另外，从有效发挥制得的固定化酶的活性，防止DAG纯度降低的观点出发，碱 溶液的浓度优选为0.25 2当量浓度，特别优选为0.8 1.5当量浓度。从有效发挥制得的固定化酶的活性，防止DAG纯度降低的观点出发，固定化酶 与碱溶液的接触时间优选为2 48小时，特别优选为20 30小时。使固定化酶与碱溶液接触后，优选通过水洗、pH处理等除去碱。在固定新的脂质分解酶的情况下，可以在固定化载体上直接吸附酶，但为了成 为能表现出高活性的吸附状态，优选在吸附酶前预先用脂溶性脂肪酸或其衍生物处理固 定化载体。作为脂溶性脂肪酸或其衍生物与固定化载体的接触方法，可以在水或有机溶 剂中直接添加上述物质；但为了使分散性良好，也可以使脂溶性脂肪酸或其衍生物暂且 在有机溶剂中分散、溶解，然后加入已分散在水中的载体。作为该有机溶剂，可以列举 出氯仿、己烷、乙醇等。脂溶性脂肪酸或其衍生物的使用质量，相对于100份的固定化 载体，优选为1 500份，特别优选为10 200份。接触温度优选为0 100°C，特别 优选为20 60°C。接触时间优选为5分钟 5小时左右。将该处理完成的载体过滤回 收，也可以干燥。干燥温度优选为室温 100°C，也可以进行减压干燥。预先处理载体的脂溶性脂肪酸或其衍生物中，作为脂溶性脂肪酸，可以列举出 碳原子数为4 24，优选碳原子数为8 18的饱和或不饱和的直链或支链的、具有或不 具有羟基的脂肪酸。具体而言，可以列举出癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、 α-亚麻酸、蓖麻油酸、异硬脂酸等。作为上述脂溶性脂肪酸的衍生物，可以列举出上述 脂溶性脂肪酸与一元醇或多元醇、或者与糖类的酯、磷脂以及在这些酯上加成了环氧乙 烷的物质等。具体而言，可以列举出上述脂肪酸的甲酯、乙酯、单甘油酯、二甘油酯、 它们的环氧乙烷加成物、聚甘油酯、失水山梨醇酯、蔗糖酯等。从固定在载体上的工序 方面考虑，优选上述脂溶性脂肪酸及其衍生物在常温(20°C)下都是液状。作为上述脂溶 性脂肪酸及其衍生物，也可以并用上述2种以上，也可以使用油菜籽脂肪酸、大豆脂肪 酸等天然来源的脂肪酸。
进行酶固定化的温度可以根据酶的特性决定，优选不引起酶失活的0 60°C， 特别优选为5 40°C。另外，固定化时使用的酶溶液的pH值只要在不引起酶变性的范围 内即可，可以根据温度相同时酶的特性决定，但优选pH值为3 9。为了维持该pH值 使用缓冲液，作为缓冲液，可以列举出醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。从固定化效率的观点出发，上述酶溶液中的酶浓度优选为酶的饱和溶解度以 下、且充分的浓度。另外，根据需要，作为酶溶液，也可以使用离心分离除去不溶部分 后的上清液、或者通过超滤精制得到的溶液等。另外，相对于100份固定化载体，使用 的酶量优选为5 1000份，特别优选为10 500份。从提高固定化酶的活性的观点、以及酶成本的观点出发，酶在固定化载体上的 吸附率越高越优选。酶吸附率优选为50%以上，更优选为80%，特别优选为92%，特别 更优选为94 99%。另外，这里“酶吸附率”是指相对于酶吸附前的酶溶液的活性， 酶吸附后的酶溶液(除去固定化酶的部分)的活性的残留率。在本发明中，优选在将脂质分解酶在固定化载体上吸附固定化后，不进行干燥，通过一边使其与脂溶性脂肪酸、脂肪酸三甘油酯或脂肪酸偏甘油酯等接触，一边进 行脱水，来调整残留水分量。从保存稳定性的观点出发，相对于100份固定化载体，残留水分量优选调整为 1 50份，特别优选调整为1 30份。作为用于调整残留水分量的脂溶性脂肪酸，优选菜籽油、大豆油、葵花籽油等 植物来源的液状油脂，或沙丁鱼油、金枪鱼油、鲣鱼油等从鱼油中生成的脂肪酸。另 夕卜，使用的脂肪酸、脂肪酸三甘油酯或脂肪酸偏甘油酯在采用了根据本发明的方法制得 的固定化酶的实际酯化反应中，优选选择作为油相基质。从制成与固定化酶充分接触，并且避免过量使用而造成的浪费，以及提高流动 性、提高脱水效率的观点出发，相对于100份固定化载体，用于调整残留水分量的脂肪 酸、脂肪酸三甘油酯或脂肪酸偏甘油酯的量优选为20 3000份，更优选为100 1000 份。如果使用通过本发明方法得到的固定化酶(以下，称为“本发明的固定化酶”) 制造DAG，则可以制备含高纯度DAG的油脂(DAG+TAG中DAG的比率高)。从生理 功能的观点出发，含DAG油脂的DAG纯度优选为50%以上，进一步优选为65%以上， 特别优选为80 100%，特别更优选为93 98%。另外，含DAG油脂中的TAG含量 优选为20%以下，更优选为10%以下，特别优选为5%以下，特别更优选为4%以下。另外，如果使用本发明的固定化酶制造DAG，可以得到与使用通过使酶吸附在 未使用的固定化载体上得到的固定化酶(以下，称为“新固定化酶”)制造DAG时，大 致相等的DAG纯度的含DAG油脂。使用本发明的固定化酶时的DAG纯度与使用新固定 化酶时的DAG纯度之差，即用下述计算式(2)定义的含DAG油脂的“DAG纯度之差” 优选为-0.9%以上，更优选为-0.7%以上，特别优选为-0.5%以上。DAG纯度之差=(使用本发明的固定化酶时的DAG纯度)_(使用新固定化酶时 的DAG纯度) (2)另外，使用本发明的固定化酶时的TAG含量与使用新固定化酶时的TAG含量之 差，即用下述计算式(3)定义的含DAG油脂中的“TAG含量之差”优选为0.6%以下，更优选为0.3%以下。TAG含量之差=(使用本发明的固定化酶时的TAG含量)_(使用新固定化酶时 的TAG含量) (3)作为本发明中的DAG的制造方法，可以列举出甘油与脂肪酸或与其低级烷基酯 的酯化反应。这里，作为酯化反应中使用的脂肪酸或其低级烷基酯，可以使用直链或支链的 碳原子数为4 22，优选碳原子数为8 18的饱和或不饱和脂肪酸；例如可以使用丁 酸、异戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈 酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、反油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、顺9-二十碳烯 酸(GadoleicAdd)、花生酸、山嵛酸、芥酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等。作为 与上述脂肪酸形成酯的低级醇，可以举出碳原子数为1 6的醇，例如可以列举出甲醇、 乙醇、1-丙醇、2-丙醇、正丁醇、2-丁醇或叔丁醇等。上述脂肪酸或其低级烷基酯可以 并用2种以上。另外，也可以使用上述脂肪酸的混合物例如大豆脂肪酸等天然来源的脂 肪酸。在该反应中，脂肪酸或其低级烷基酯与甘油的反应摩尔比R[R =脂肪酸或其低 级烷基酯(mol)/甘油(mol)]优选为1.5 3.0，更优选为1.6 2.8，特别优选为1.8 2.6。另外，酯化反应的反应温度没有特别限定，从反应效率的观点出发，优选为 20 80°C，特别优选为30 70°C。还从工业化生产效率的观点出发，反应时间优选为 10小时以内。通过酯化反应得到的含DAG油脂可以通过后处理作成制品。后处理优选进行脱 酸(除去未反应的脂肪酸和副生成的单酰甘油)、酸处理、水洗、脱臭各工序。脱酸工序 是指，通过对由酯化反应得到的含DAG油脂进行减压蒸馏，从反应生成物中除去未反应 的脂肪酸和副生成的单酰甘油。酸处理工序是指在上述脱酸油中添加柠檬酸等螯合剂， 混合，根据需要，进一步减压脱水的工序。另外，从使色相、风味更良好的观点出发， 得到的酸处理油可以进行与吸附剂接触的脱色工序。水洗工序是指在上述酸处理油中添 加水，强烈搅拌，进行油水分离操作的工序。水洗优选重复多次(例如3次)，得到水洗 油。脱臭工序是指对上述水洗油进行减压水蒸气蒸馏的工序。脱臭可以列举出间歇式、 连续式、半连续式等，除了单独用薄膜脱臭装置或浅盘式脱臭装置进行的方法以外，也 可以将使用了上述薄膜脱臭装置的脱臭处理和使用了浅盘式脱臭装置的脱臭处理组合进 行。
实施例
[固定化酶活性的测定方法]在设置有月牙状搅拌翼的4 口烧瓶中加入4份固定化酶，用大约20份大豆 脂肪酸洗净3次。其后，加入大豆脂肪酸，50°C下以400rpm搅拌15分钟。接着， 加入甘油开始反应，用真空泵减压。酯化反应在温度50°C ·搅拌400rpm ·真空度 400Pa的条件下进行，大豆脂肪酸和甘油以FA/GLY的摩尔比为2，加入合计量80份。 每30分钟对反应液进行取样，以及AV值·水分·甘油组成的分析，画出各组成(FA · GLY · MAG · DAG · TAG)随时间变化的图。当收率(DAG+TAG)达到70%时， 从时间变化曲线上读取并计算出时间和DAG纯度(DAG质量/(DAG+TAG质量)X100)。[新固定化酶A的制备] 将10 份 Duolite A-568 (Rohm and Hass Co.)放入 100 份 0.IN氢氧化钠水溶液中搅
拌1小时。过滤后，用100份蒸馏水洗净，用100份500mM醋酸缓冲液(pH值为6)调 节pH值平衡1次，用100份50mM醋酸缓冲液(pH值为6)调节pH值平衡2次。过滤 后，用40份乙醇进行乙醇置换。过滤后，加入10份大豆脂肪酸和40份乙醇的混合液， 搅拌30分钟。接着，用50份50mM醋酸缓冲液(pH值为6)每30分洗净1次共4次， 过滤，回收载体。其后，使10份脂肪酶(LilipaseA-lOFG，Nagase Chemtex Co。)与溶 解在180份50mM醋酸缓冲液(pH值为6)中的酶液接触2小时，进行固定化。固定化 后过滤，回收固定化酶，然后用50份50mM醋酸缓冲液(pH值为6)进行30分钟洗净， 除去没有固定化的酶和蛋白质，过滤，回收固定化酶。酶吸附率是98.0%。接着，使回 收的固定化酶与40份菜籽油接触16小时，过滤，回收油处理后的固定化酶。对于通过 以上操作制备得到的新固定化酶A，按上述“固定化酶活性的测定方法”测定其活性(以 下相同)，收率达到70%的时间是64.0分钟，DAG纯度是95.1%，TAG含量是3.4%。 结果在表1中表示。[新固定化酶B的制备]将10 份 Duolite A-568 (Rohm and Hass Co.)放入 100 份 0.IN氢氧化钠水溶液中搅
拌1小时。过滤后，用100份蒸馏水洗净，用100份500mM醋酸缓冲液(pH值为6)调 节pH值平衡1次，用100份50mM醋酸缓冲液(pH值为6)调节pH值平衡2次，过滤， 回收载体。其后，将12份脂肪酶(Palatase 20000L，Novozymes Japan Co.)与溶解在180 份50mM醋酸缓冲液(pH值为6)中的酶液接触2小时，进行固定化。固定化后过滤， 回收固定化酶，然后用50份50mM醋酸缓冲液(pH值为6)进行30分钟洗净，除去没有 固定化的酶和蛋白质，过滤，回收固定化酶。酶吸附率是99.8%。接着，使回收的固定 化酶与40份菜籽油接触16小时，过滤，回收油处理后的固定化酶。对通过以上操作制 备得到的新固定化酶B的活性进行测定，收率达到70%的时间是117.7分钟，DAG纯度 是97.0%，TAG含量是2.1%。结果在表2中表示。[已用过的固定化酶A的制备]使用上述新固定化酶A，在50°C进行相当于酯化反应时间1000小时的操作，制 备活性降低但具有残留活性的已用过的固定化酶A。此时，油分残留量相对于100份固定 化载体为150份。对已用过的固定化酶A的活性进行测定，收率达到70%的时间是220 分钟，DAG纯度是92.9%，TAG含量是5.0%。[已用过的固定化酶B的制备]使用上述新固定化酶B，在50°C进行相当于酯化反应时间1000小时的操作，制 备活性降低但具有残留活性的已用过的固定化酶B。此时，相对于100份固定化载体， 油分残留量是85.3份。对已用过的固定化酶B的活性进行测定，收率达到70%的时间是 290分钟，DAG纯度是93.9%，TAG含量是4.4%。[油分残留量的测定]相对于固定化酶a部分，用10质量倍的己烷、丙酮交替各洗净3次后，在70°C下放置15小时，进行脱溶剂处理，仅称量固定化载体的质量(b)，根据下述计算式求出 相对于100份固定化载体的质量比。油分残留量=(a-b)/bX100(a固定化酶质量，b:固定化载体质量)[酶吸附率的测定]使用脂肪酶 试剂盒S (大日本制药制造)，37°C下反应15分钟，对酶固定化操作 中的吸附前后的酶溶液的酶活性进行测定，酶吸附率用下述计算式求得。酶吸附率[% ]=(吸附前活性-吸附后活性)/吸附前活性X 100实施例1相对于10份已用过的固定化酶A(以干燥物为基准)，加入85份正己烷，搅拌 30分钟。洗净后的油分残留量相对于100份固定化载体为36.9份。减压蒸馏除去己烷 后，使其与100份IN氢氧化钠水溶液在50°C下接触24小时，进行残留酶的脱附。除 去氢氧化钠水溶液，用100份蒸馏水洗净后，加入4份10%醋酸水溶液和100份蒸馏水 中和。其后，用100份500mM醋酸缓冲液(pH值为6)调节pH值平衡1次，用100份 50mM醋酸缓冲液(pH值为6)调节pH值平衡2次。过滤后，用40份乙醇进行乙醇置 换。过滤后，加入10份大豆脂肪酸和40份乙醇的混合液，搅拌30分钟。接着，50份 50mM醋酸缓冲液(pH值为6)每30分钟洗净1次共4次，回收，过滤载体。其后，将 10份脂肪酶(Lilipase A-IOFG, Nagase Chemtex Co.)与溶解在180份50mM醋酸缓冲液 (pH值为6)中的酶液接触2小时，进行固定化。固定化后过滤，回收固定化酶，然后用 50份50mM醋酸缓冲液(pH值为6)进行30分钟洗净，除去没有固定化的酶和蛋白质， 过滤，回收固定化酶。酶吸附率是97.7%。接着，使回收的固定化酶与40份菜籽油接 触16小时，过滤，回收油处理的固定化酶。对通过以上操作制备得到的固定化酶的活性进行测定，收率达到70%的时间是 64.3分钟，DAG纯度是95.0%，DAG纯度之差是_0.1 %，TAG含量是3.5%，TAG含量 之差是0.1%。结果在表1中表示。实施例2除了与氢氧化钠水溶液的接触时间为2小时以外，其它与实施例1同样地制备固 定化酶。酶吸附率是95.5%。对得到的固定化酶的活性进行测定，收率达到70%的时 间是66.2分钟，DAG纯度是94.7%，DAG纯度之差是-0.4%，TAG含量是3.8%，TAG 含量之差是0.3%。结果在表1中表示。实施例3相对于10份已用过的固定化酶A(以干燥物为基准)，加入85份正己烷，搅拌 30分钟，减压蒸馏除去己烷。该操作进行2次，使用其油分残留量相对于100份固定化 载体为6.7份的物质，与实施例1同样地制备固定化酶。酶吸附率是96.7%。对得到的 固定化酶的活性进行测定，收率达到70%的时间是65.2分钟，DAG纯度是96.7%，DAG 纯度之差是1.6%，TAG含量是2.3%，TAG含量之差是_1.1%。结果在表1中表示。实施例4相对于10份已用过的固定化酶A(以干燥物为基准)，加入85份正己烷，搅拌 30分钟，减压蒸馏除去己烷。该操作进行3次，使用相对于100份固定化载体，其油分 残留量为2.4份的物质，与实施例1同样地制备固定化酶。酶吸附率是98.6%。对得到的固定化酶的活性进行测定，收率达到70%的时间是66.8分钟，DAG纯度是95.8%， DAG纯度之差是0.7%，TAG含量是2.9%，TAG含量之差是-0.5%。结果在表1中表示。实施例5相对于10份已用过的固定化酶B (以干燥物为基准)，加入85份正己烷，搅拌 30分钟。相对于100份固定化载体，洗净后的油分残留量是8.7份。减压蒸馏除去己 烷后，使其与100份IN氢氧化钠水溶液在50°C下接触24小时，进行残留酶的脱附。除 去氢氧化钠水溶液，用100份蒸馏水洗净后，加入4份10%醋酸水溶液和100份蒸馏水 中和。其后，用100份500mM醋酸缓冲液(pH值为6)调节pH值平衡1次，用100份 50mM醋酸缓冲液(pH值为6)调节pH值平衡2次，回收，过滤载体。其后，使12份 脂肪酶(Palatase 20000L, NovozymesJapan Co.)与溶解在份5OmM醋酸缓冲液(pH值 为6)中的酶液接触2小时，进行固定化。固定化后过滤，回收固定化酶，然后用50份 50mM醋酸缓冲液(pH值为6)进行30分钟洗净，除去没有固定化的酶和蛋白质，回收， 过滤固定化酶。酶吸附率是99.1%。接着，使回收的固定化酶与40份菜籽油接触16小 时，过滤，回收油处理的固定化酶。对得到的固定化酶的活性进行测定，收率达到70%的时间是86.8分钟，DAG纯 度是97.1%，DAG纯度之差是0.1%，TAG含量是2.1%，TAG含量之差是0.0%。结果 在表2中表示。比较例1不对上述已用过的固定化酶A进行己烷洗净，直接使其在50°C下与100份IN氢 氧化钠水溶液接触24小时，进行残留酶处理，在过滤时，液体的流动性差无法过滤，因 而不能制备固定化酶。比较例2相对于10份上述已用过的固定化酶A(以干燥物为基准)，用30份正己烷洗净， 相对于100份固定化载体，调节油分残留量为100份，然后使其在50°C下与100份IN氢 氧化钠水溶液接触24小时，进行残留酶处理，与比较例1同样流动性差无法过滤，因而 不能制备固定化酶。比较例3除了在实施例1中，己烷洗净后，不进行通过碱处理的酶脱附，进行乙醇置换 以外，其它与实施例1同样地制备固定化酶。酶吸附率是91.1%。对得到的固定化酶的 活性进行测定，收率达到70%的时间是69.5分钟，DAG纯度是92.6%，DAG纯度之差 是-2.5%，TAG含量是5.2%，TAG含量之差是1.8%。结果在表1中表示。比较例5除了在实施例5中，己烷洗净后，不进行通过碱处理的酶脱附，进行乙醇置换 以外，其它与实施例5同样地制备固定化酶。酶吸附率是93.8%。对得到的固定化酶的 活性进行测定，收率达到70%的时间是103.8分钟，DAG纯度是96.0%，DAG纯度之差 是-1.0%，TAG含量是2.8%，TAG含量之差是0.7%。结果在表2中表示。表 1
权利要求
1.一种固定化脂质分解酶的制造方法，将酯化反应中使用过的固定化脂质分解酶和 溶剂混合，进行洗净使得相对于100质量份的固定化载体，固定化脂质分解酶中的油分 残留量为50质量份以下，接着，使其接触碱溶液，然后回收固定化载体，使脂质分解酶 吸附在该固定化载体上。
2.如权利要求1所述的固定化脂质分解酶的制造方法，其中，碱溶液的温度为0 70°C，浓度为0.25 2当量浓度，接触时间为2 48小时。
3.如权利要求1或2所述的固定化脂质分解酶的制造方法， 其中，脂质分解酶是1，3位选择性脂肪酶。
4.如权利要求1或2所述的固定化脂质分解酶的制造方法， 其中，固定化载体为阴离子交换树脂。
5.一种甘油二酯的制造方法，其使用根据权利要求1或2所述的方法制得的固定化脂 质分解酶，使甘油与脂肪酸或其低级烷基酯反应。
全文摘要
本发明涉及固定化酶的制造方法。本发明提供一种制造固定化脂质分解酶的方法，有效利用已在酯化反应中使用过的固定化酶的固定化载体，制造与使用前具有相同性能的固定化脂质分解酶。本发明的固定化脂质分解酶的制造方法是将酯化反应中使用过的固定化脂质分解酶和溶剂混合，进行洗净使得相对于100质量份的固定化载体，固定化脂质分解酶中的油分残留量为50质量份以下，接着，使其接触碱溶液，然后回收固定化载体，使脂质分解酶吸附在该固定化载体上。
文档编号C12N11/00GK102016019SQ20098011406
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月20日 优先权日2008年4月21日
发明者加瀬实, 小松利照, 福原真平 申请人:花王株式会社