专利名称：使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产甲硫氨酸的方法
使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产甲硫氨
酸的方法本发明涉及利用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产甲硫氨酸的方法。背景目前世界范围内人工生产氨基酸甲硫氨酸的量为大约500，000吨。标准的工业生产方法不是通过发酵而是通过多步骤化学方法。甲硫氨酸在禽畜饲料中是第一限制性氨基酸，且由此主要用作饲料添加剂。现有技术已经公开了各种尝试，通过例如使用微生物如大肠杆菌的发酵产生甲硫氨酸。其它氨基酸如谷氨酸、赖氨酸和苏氨酸是通过例如发酵方法产生的。对于这些目的，经证实某些微生物如谷氨酸棒杆菌特别适用。通过发酵生产氨基酸具有特殊优势，即仅产生L-氨基酸且避免了环境问题化合物如典型用于化学合成中的溶剂。目前精细化合物的发酵生产典型是在微生物中进行，所述微生物如谷氨酸棒杆菌(C. glutamicum)、大肠杆菌(E. coli)、酿酒酵母(S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母 (S.pombe)、巴斯得毕赤酵母(P.pastoris)、黑曲霉(Aspergillusniger)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、Ashbya gossypii 或者 Gluconobacter oxydans。特别已知谷氨酸棒杆菌产生大量氨基酸例如L-谷氨酸和L-赖氨酸的能力(Kinoshita，S. (1985) Glutamic acid bacteria ;ρ·115-142 in :A. L. Demain and N. A.Solomon(ed. ),Biology of industrial microorganisms, Bejamin/cummings Publishing Co.，London)。 DB :STP现有技术领域中在微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中产生精细化合物如氨基酸、脂质、维生素或者碳水化合物的一些尝试，已经试图实现这个目标，通过增加参与各个精细化合物的生物合成途径的基因的表达而实现。如果已知例如氨基酸如甲硫氨酸或者赖氨酸的生物合成途径中某一步骤是限速的，则各个酶的过表达使得可以获得这样的微生物，其产生更多催化反应产物的微生物，并最终导致各个氨基酸的产量增加。相似地，如果已知例如希望的氨基酸的生物合成途径中某一酶促步骤由于其输送许多代谢能量导致不希望的副产物形成而是不合意的，可预期负调节各个酶活性的表达以仅利于最终导致希望的氨基酸形成的这个代谢反应。通过正调节和/或负调节参与甲硫氨酸或者赖氨酸的生物合成的基因的表达以增加例如甲硫氨酸产量的尝试在例如WO 02/10209,WO 2006/008097和WO 2005/059093中描述。异柠檬酸脱氢酶(ICD，优势也称作IDH, EC 1. 1. 1. 42，SEQ ID NO 3)是一种参与例如谷氨酸棒杆菌的柠檬酸循环(TCA)的酶(
图1)。其催化该循环的第三个步骤异柠檬酸的氧化脱羧作用，产生α-酮戊二酸盐和C02。Eikmanns等鉴别、克隆和鉴定了谷氨酸棒杆菌中编码I⑶的基因(Eikmanns，B. et al, J. Bacteriol. (1995) 177 :774_782)。谷氨酸棒杆菌中编码ICD的染色体icd基因由于敲除而失活，导致谷氨酸营养缺陷体(Eikmanns, B. et al.，J. Bacteriol. (1995) 177 774-782)。I⑶在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中的过表达不增强谷氨酸盐的产生(Eikmarms，B. et al.，J. Bacteriol. (1995) 177 :774-782)。然而，据 DE 10210967 报道，ICD 在大肠杆菌中的过表达导致苏氨酸的产量增加。对icd与编码谷氨酸脱氢酶的基因在谷氨酸棒杆菌中共表达报道了相矛盾的结果，同时Eikmarms未记录任何效果，改良的谷氨酸产量在 JP63214189 和 JP2520895 中报道。 即使鉴于报道的提高甲硫氨酸生产的尝试，仍需要另外的生产方法。发明目的和概述本发明的目的是提供另外的发酵方法和微生物，用于所述方法中使用迄今为止未知特性的工业重要微生物如谷氨酸棒杆菌产生甲硫氨酸。从接下来的本发明描述中清晰可见的这些及其它目的如独立的权利要求书中描述解释。所附权利要求书涉及优选的实施方案。本发明涉及使用异柠檬酸脱氢酶活性降低的细胞产生甲硫氨酸的方法。所述酶的负调节目前还未知导致甲硫氨酸的产量改良。所述生产方法中使用的细胞可以是原核细胞、低等真核细胞、分离的植物细胞、酵母细胞、分离的昆虫细胞或者分离的哺乳动物细胞，特别是细胞培养系统中的细胞。在本发明中，术语“微生物”用于这种细胞。为了进行本发明其中ICD活性降低的一种优选微生物是棒杆菌，其中ICD表达被降低，特别优选其中ICD表达被降低的谷氨酸棒杆菌。特别地，本发明提供了如下实施方案(1)利用与相应起始微生物相比异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性部分或者完全降低的微生物生产甲硫氨酸的方法；以及(2)从通过实施方案(1)的方法产生的甲硫氨酸中制备化合物和化合物终产物如聚合物的方法，包括在一个步骤中根据实施方案(1)的方法产生所述甲硫氨酸。附1 谷氨酸棒杆菌中产生甲硫氨酸的生物化学途径。序列表，FREETEXT
权利要求
1.生产甲硫氨酸的方法，该方法使用与相应的起始微生物相比异柠檬酸脱氢酶活性部分或者完全降低的微生物。
2.权利要求1的方法，其中异柠檬酸脱氢酶活性部分或者完全降低的微生物是重组微生物。
3.权利要求1或2的方法，其中异柠檬酸脱氢酶活性由于异柠檬酸脱氢酶表达的部分或者完全降低而降低。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌、优选谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032、ATCC 130321ysCfto或者ATCC 13286或者这些菌株的衍生物。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述甲硫氨酸是L-甲硫氨酸。
6.权利要求1-5任一项的方法，附有条件是异柠檬酸脱氢酶表达的降低不是由于修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的表达所致，而是由所述微生物的天然异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的表达所致，其中所述修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列衍生自未修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列，由此所述未修饰的核苷酸序列的至少一个密码子在修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列中根据微生物的密码子使用由使用频率较低的密码子置换。
全文摘要
本发明涉及利用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产甲硫氨酸的方法。
文档编号C12P13/12GK102159720SQ200980115377
公开日2011年8月17日 申请日期2009年4月27日 优先权日2008年4月30日
发明者A·黑罗尔德, C·克洛普罗格, H·施罗德, O·泽尔德, S·黑夫纳 申请人:赢创德固赛有限公司