鉴定调节癌细胞中Wnt信号传导的化合物的方法

文档序号:580491阅读:644来源:国知局
专利名称:鉴定调节癌细胞中Wnt信号传导的化合物的方法
鉴定调节癌细胞中Wnt信号 传导的化合物的方法交叉引用本申请要求2008年5月7日提交的美国临时申请第61/051,322号的优先权,该 申请通过引用纳入本文。本发明涉及筛选作用于具有活性Wnt信号传导途径的细胞的化合物的试验。
背景技术
Wnt信号传导通过调节细胞增殖和分化影响基本发育途径,其在很多癌症中具 有活性,这些癌症包括结肠癌、白血病、乳腺癌、肝细胞癌、前列腺癌和黑色素瘤。在典型Wnt途径中,分泌型糖蛋白Wnt与Frizzled受体结合引起β-联蛋白在胞 质中累积,导致其易位至细胞核内,与LEF/TCF家族的HMG结合蛋白结合,激活Wnt 靶基因的转录。不存在Wnt信号传导时,β-联蛋白通过泛素途径连续降解,β-联 蛋白的转换由β-联蛋白降解复合物介导,其包括蛋白质APC、GSK3-i3和轴蛋白。 GSK3-i3磷酸化β-联蛋白,对其进行标记以供降解。在Wnt信号传导过程中,所述 β-联蛋白降解复合物被破坏,由此阻止了 β-联蛋白的磷酸化,使得β-联蛋白累积, 然后进入细胞核,与LET/TCF家族成员HMGDNA结合蛋白结合。尽管LEF/TCF家族成员LEF-1、TCF-I和TCF-4本身无法激活转录,但它们确 实能通过其HMG结构域与DNA结合并使DNA弯曲。在至少一些情况中,不存在β-联 蛋白时,LEF/TCF蛋白与DNA结合,募集转录阻抑蛋白。在Wnt信号传导过程中,细 胞核内有β-联蛋白可用时,联蛋白取代所述阻抑蛋白,介导与转录激活蛋白的相 互作用。Wnt途径的基因靶点包括c-Myc、细胞周期蛋白Dl、Cdx> MMP7、c_Myb、 c-Kit、PPAR σ、轴蛋白 2、Sp5、DKK4、BcI_X、LEF-I 本身和其它。LEF-K TCF-I和TCF-4是交替剪接基因。这些DNA结合蛋白的剪接变体导致 产生在其C末端尾部具有不同结构域的变体(J.Cell Sci 120 385-393 (2007))。此外, LEF-I和TCF-I均具有两个启动子各具有指导编码全长蛋白质的转录物表达的第一启 动子和指导N末端截短型表达的、位于基因的下游内含子内的第二启动子。LEF-I和 TCF-I的N末端截短型(δ N-LEF-I和δ N-TCF-l)缺乏这些蛋白质的β-联蛋白结合结 构域,但保留了其DNA结合结构域,允许这些LEF-I和TCF-I同种型作为显性失活体起 作用并下调典型Wnt信号传导途径。

发明内容
本文提供筛选化合物在癌细胞中调节Wnt信号传导能力的方法。在一个方面中,本文提供鉴定调节癌细胞中Wnt信号传导的化合物的方法,其 中所述方法包括提供包含启动子调控的报告基因的癌细胞,所述启动子受TCF/LEF和 β-联蛋白之间相互作用的调节;提供包含启动子调控的所述报告基因的非癌细胞,所 述启动子受TCF/LEF和β-联蛋白之间相互作用的调节;使所述癌细胞和非癌细胞接触 测试化合物;检测接触测试化合物的癌细胞中报告基因的信号和未接触测试化合物的癌 细胞中报告基因的信号,并检测接触测试化合物的非癌细胞中报告基因的信号和未接触测试化合物的非癌细胞中报告基因的信号。所述方法还包括鉴定测试化合物,其调节癌 细胞中报告基因表达的信号,但不调节非癌细胞中报告基因表达的信号。用于所述方法的癌细胞可以是任何癌细胞,非限制性例子可以是结肠癌细胞、 白血病细胞、淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、肺 癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、子宫颈癌细胞或头颈癌细胞。

用于该方法的非癌细胞可以是任何非癌细胞,非限制性例子可以是HEK293细 胞、COS-7细胞、CHO细胞、NIH/3T3细胞或非癌的结肠细胞、上皮细胞、皮肤细胞、 B细胞、前B细胞、T细胞、前T细胞、乳腺细胞、前列腺细胞、肝细胞、肺细胞、卵巢 细胞、子宫细胞或子宫颈细胞。受TCF/LEF和β -联蛋白之间相互作用调节的启动子是结合β _联蛋白或受其 作用的TCF/LEF蛋白上调、下调、抑制或激活的任何启动子,包括合成启动子、天然产 生的启动子、天然产生的启动子的一部分、天然产生的启动子的变体、嵌合启动子等。还提供鉴定调节Wnt信号传导的化合物的方法,其中所述方法包括提供包含 核酸构建体的细胞,所述核酸构建体包含编码Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因和启 动子调控的报告基因,所述启动子受TCF/LEF和β-联蛋白之间相互作用的调节;使所 述细胞接触测试化合物;相对于未接触测试化合物的对照细胞中报告基因表达的信号, 将具有调节接触测试化合物的细胞中报告基因表达的信号作用的测试化合物鉴定为调节 Wnt信号传导的化合物,其中在不存在包含编码Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因的 核酸构建体的细胞中未发现所述作用。在还有另一方面,提供鉴定调节Wnt信号传导的化合物的方法,包括提供包 含以下的细胞1)包含编码Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因的核酸构建体,所述基 因处于诱导型启动子的调控下,2)启动子调控的报告基因,所述启动子受TCF/LEF和 β-联蛋白之间相互作用的调节;诱导Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的表达;使所述细 胞接触测试化合物;鉴定相对于未接触测试化合物的对照细胞中报告基因表达的信号, 具有调节接触测试化合物的细胞中报告基因表达的信号作用的测试化合物,其中在未诱 导编码Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因的细胞中未获得所述作用。在这些方面,所述试验细胞包括含Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因的重组 构建体。Wnt激活蛋白是在细胞中表达时调节Wnt信号传导的任何蛋白质。Wnt激活 蛋白的非限制性例子包括β-联蛋白、APC、轴蛋白1、轴蛋白2、GSK3、Disheveled、 LRP5、LRP6、Frizzled或Wnt蛋白。Wnt调节蛋白是在细胞中表达时通过调控一个或多 个Wnt激活蛋白或一个或多个Wnt调节蛋白的表达来调节Wnt信号传导的任何蛋白质。 Wnt调节蛋白的非限制性例子包括β-联蛋白、TCF-I、TCF-2、TCF_3、TCF-4,以及 与TCF/LEF蛋白或β-联蛋白发生相互作用的转录阻抑蛋白,包括CtBP、Groucho > Pygo、p300和PITX2。在一些实施方式中,细胞中表达的Wnt激活蛋白或调节蛋白是所 述激活蛋白或调节蛋白的突变型。在一些实施方式中,所述Wnt激活蛋白(基因)是突 变型APC基因。在一些实施方式中,所述Wnt激活蛋白(基因)是突变型联蛋白基 因。用于本文所述试验的报告基因可以是任何报告基因,例如,碱性磷酸酶、β-半 乳糖苷酶、内酰胺酶、荧光蛋白、萤光素酶或CAT。在一些优选的实施方式中,用于所述方法的试验细胞包含至少两个报告基因,其中至少一个是启动子调控的对照报告 基因,所述启动子不受TCF/LEF和β-联蛋白相互作用的调控,例如组成型启动子。在 这些实施方式中,将操作性连接于受TCF/LEF和联蛋白之间相互作用调节的启动子 的报告基因表达的检测信号根据表达受组成型启动子调控的第二报告基因的检测信号标 准化。在另一方面,本发明包括鉴定调节 Wnt信号传导的化合物的方法,其采用负选 择鉴定破坏经由TCF/LEF和β _联蛋白相互作用的基因激活的化合物。所述方法包括 提供具有受启动子调控的报告基因的细胞,所述启动子受TCF/LEF和联蛋白之间相 互作用的调节,其中所述报告基因具有负选择性;使所述细胞接触测试化合物;使所述 细胞接触前药,所述前药由报告基因编码的蛋白质转化为活性药物;鉴定允许细胞在前 药存在下生长的测试化合物。本文还提供通过上述任何一种或多种方法鉴定得到的化合物。发明详述定义本文所用的癌性细胞或癌细胞是白血病细胞或衍生自癌肿瘤的细胞。非白血病 细胞是否为癌细胞的一个测试是鉴定裸鼠中的细胞接种物是否引起肿瘤。本文所用的
“正常”细胞是非癌细胞。正常或非癌细胞不衍生自癌肿瘤或白血病。“Wnt信号传导”或“Wnt途径信号传导”指一种细胞信号传导途径,该途径 引起受β-联蛋白禾口 TCF/LEF蛋白,如TCF-I、TCF-3、TCF-4或LEF-I相互作用调控 的基因表达。“参与Wnt信号传导的蛋白质”或“Wnt相关蛋白”可以是Wnt激活蛋白、Wnt 调节蛋白或Wnt靶基因。“Wnt相关基因”是编码参与Wnt信号传导的蛋白质的基因。 参与Wnt信号传导的蛋白质包括但不限于Wnt激活蛋白(促进或抑制导致Wnt靶基因表 达的β-联蛋白-TCF/LEF相互作用的蛋白质),包括Wnt、Frizzled、Disheveled、LRP5/ LRP6 (BMC Genomics7 148 (2006))、轴蛋白 _1 (Genomics 7 148 (2006))、β -联蛋白 (BMCGenomics 7 148(2006))、轴蛋白 _2、腺瘤性结肠息肉(APC)、GSK3-^ (BMC Genomics 7 148(2006));以及Wnt调节蛋白(调节Wnt靶基因表达的蛋白质),包 括 TCF-I (J.Biol.Chem.267 8530-8536(1992) ; MoI.Cell.Biol. 16 745-752(1996))、 TCF-3、TCF-4 (J.Biol.Chem.278 16169-16175(2003)); LEF-I (Nucl.Acids Res.28 1994-2003(2000) ; Devel.Dynamics 232 969-978(2005))、CtBPU Grouch、Pygo> PITX2和其它。Wnt靶基因包括但不限于LEF-I、c_myc、细胞周期蛋白Dl、cdx、MMP7、 c-myb、c-kit、PPARo、轴蛋白 2、BcI_X、sp5、siamois 和其它。“TCF/LEF” 指 TCF-I、TCF-3、TCF-4 或 LEF-I 中的任何一个,或 TCF-I、TCF-3、TCF-4 或 LEF-I 中
两个或多个的任何组合。本文所用的“Wnt-应答启动子”是受TCF/LEF蛋白和β-联蛋白相互作用 调控的启动子。所述启动子也可受除TCF/LEF蛋白和β-联蛋白外其它因子的调控。 Wnt-应答启动子的例子包括但不限于以下基因的启动子LEF-I、TCFU c_myc、 c-kit、MMP7、轴蛋白 2、sp5、DKK4、细胞周期蛋白 Dl、cdx、BcI_X 和 siamois。
本文所用的RNA “同种型”、转录物同种型或同种型转录物是通过同一基因的 可变剪接产生的RNA分子。因此这些转录物的序列不同。从RNA同种型翻译得到蛋白 质同种型,其具有不同的一级序列。“核酸分子构建体”、“核酸构建体”、“基因构建体”、“报告基因构建 体”、“剪接构建体”、“转录构建体”、“构建体”、“重组DNA分子”均指经分 离和操作将某些核酸序列切离、连接、删除、突变、扩展、延伸、复制或重组的核酸分 子,所述核酸序列可从生物体分离、从生物体分离的核酸模板复制、从生物体和合成核 酸片段合成或衍生得到。在本发明的方法中,包含、包括、携带或具有核酸分子或核酸 构建体的细胞是被转化、转染或感染(例如用病毒)的细胞,从而其包含之前分离的核酸 分子、重组核酸分子或基因构建体。本文提供的方法用来鉴定调节癌细 胞中Wnt信号传导的化合物。所述方法采用 细胞试验,其中将对测试化合物起反应的Wnt信号传导应答启动子调控的报告基因的活 性与测试化合物对非癌细胞的作用或测试化合物对Wnt信号传导途径不由细胞中引入的 Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的诱导作用活化的细胞的作用相比较。试验方式本文提供的细胞试验可以任何可行方式进行,但优选高通量鉴定试验以便筛选 大量化合物。优选地,所述试验在多孔板中进行,如例如,96孔、384孔或更多孔的 板,其中各孔盛有约5X IO3-IO5个细胞,通常为约104-5X 104个细胞。在优选的实施方 式中,采用报告基因进行所述试验,其中通过例如读取多孔板的发光计或荧光计检测报 告基因的信号。也优选包括自动分配装置(例如用于加入进行信号检测的试剂缓冲液) 的孔板读数计。对于用报告基因构建体或Wnt激活蛋白或调节蛋白基因构建体瞬时转染细胞的 试验,通常在转染后24-48小时加入测试化合物。在例如通过加入诱导物,如四环素或 多西环素诱导基因表达的试验中,可在加入诱导物之前、同时或之后加入测试化合物。 例如,可在加入诱导物后0-30分钟、30分钟-1小时、1-2小时、2-3小时、3_4小时、 4-6小时、6-8小时、8-10小时、10-12小时、12-16小时、16-20小时、20-24小时或 24-48小时加入测试化合物。可在加入化合物后的任何时间点读取报告基因信号,例如,加入化合物后30分 钟、30分钟-1小时、1-2小时、2-3小时、3-4小时、4_6小时、6_8小时、8_10小时、 10-12小时、12-16小时、16-20小时、20-24小时或24-48小时读取。所用测试化合物的浓度可从约10皮摩到约10微摩,例如从约1纳摩到约1微 摩。可在例如100纳摩到10微摩的浓度下进行初筛,可在较高或较低的浓度下或浓度范 围内进行之后的次级筛选。也可进行细胞试验以测定测试化合物对细胞代谢状态、增殖、生长或生存力的 作用。除本文所述的报告基因示值读数试验外,可对细胞进行一个或多个生存力试验、 细胞分裂试验、细胞周期试验、迁移试验、侵入试验、细胞死亡试验或凋亡试验。例 如,可采用MTT试验(例如,加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corp.)的 VYBRANT MTT细胞增殖检测试剂盒)或其衍生XTT试验(明尼苏达州圣保罗的MD 生物科学公司(MDBiosciences))或BrdU掺入法(ABSOLUTE-STM SBIP检测(英杰公司))监测细胞生长。可通过测定胞内ATP水平(ATPLITETM-M试剂盒(伯金艾尔莫公 司(Perkin Elmer))、细胞效价GIo (威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(PromegaCorp))) 或葡糖-6-磷酸活性(细胞活性毒性检测(英杰公司))或通过采用膜穿透性染料(DiOc 18)的试验鉴定细胞生存力(或细胞毒性)。在一些实施方式中,在单独的次级筛选中进 行细胞试验。在一些实施方式中,细胞试验与报告基因试验同时进行。例如,可在鉴 定报告基因表达的同一批孔内进行采用阿拉马蓝(Alamarblue) (Nasiry等,HumanReprod 22 1304-1309(2007))的生存力试验或检测胱冬酶活性的凋亡试验(例如,可从加利福 尼亚州山景城克隆泰克公司(Clantech)购得的APOALERT 胱冬酶检测试剂盒),只要 细胞试验的示值读数不同于报告基因的示值读数。细胞用于所述方法的癌细胞可以是任何癌细胞,非限制性例子可以是结肠癌细胞、 白血病细胞、淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、肺 癌细胞、卵巢癌细胞、子 宫癌细胞、子宫颈癌细胞或头颈癌细胞。白血病细胞的非限 制性例子包括Jurkat、HL60和K562细胞。结肠癌细胞的非限制性例子包括SW48、 SW480、SW116、CaCo—2、DLDU Colo320、Colo205、HT29 禾Π HT116 细胞。用于该方法的非癌细胞可以是任何非癌细胞,非限制性例子可以是ΗΕΚ293 细胞、COS-7细胞、CHO细胞、ΝΙΗ/3Τ3细胞或非癌的结肠细胞、小肠上皮细胞、 上皮细胞、皮肤细胞、B细胞、前B细胞、T细胞、前T细胞、乳腺细胞、前列腺细 胞、肝细胞、肺细胞、卵巢细胞或子宫颈细胞。非癌结肠(小肠上皮)细胞包括但不 限于NCM356 细胞和 NCM460 细胞(Stauffer 等,Amer.J.Surg. 169 190-195(1995); Battacharya 等,Amer.J.Gastr丄iv.Physiol.293 G429-437 (2007);两种细胞均可从英赛尔 公司(Incell)购得),以及 NCIEM 细胞(Baten 等,FASEB J. 6 2726(1992))。可用 SV40 的T抗原转化非癌细胞以改进其可转染性。分离原代细胞,可通过用SV40的T抗原或 hTERT稳定转染所述细胞使其永生化。报告基因报告基因包括可检测其表达的任何基因,例如通过检测蛋白质本身(例如荧光 蛋白)、基于亲和力检测蛋白质结构域(例如肽标签如flag标签,或通过“自标记标签” 肽序列的表达,例如结合荧光试剂的FLASH或“lumio”标签)或检测报告基因蛋白催 化的酶反应的产物。荧光蛋白包括但不限于藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白、 黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、青色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白。具有 不同激发和发射光谱的荧光蛋白的多样性使其在需要两个或多个报告基因的情况下特别 有用。为研究单个细胞中若干基因平行表达而设计的慢病毒载体已用来将位于不同病 毒构建体中的三个可检测性不同的荧光蛋白引入同一个细胞中(Weber等MoI Ther. 16 698-706(2008))。荧光蛋白检测是非侵入性的,可随时间推移在同一个样品上重复进 行。用于本发明方法中的荧光蛋白基因可以是荧光蛋白基因的突变型。例如,所述荧光 蛋白基因可以是人源化或相比野生型蛋白荧光增强的突变体,也可以是转换率较高的突 变体,从而报告基因测定可更精确地反映动态过程,如对调节化合物起反应而在剪接或 基因表达模式中发生的变化。
将底物转化为可检测产物的酶包括碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、β “内酰胺酶 和萤光素酶。例如,碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和β-内酰胺酶的底物可以是切割时 产生荧光化合物的偶联物。在一些实施方式中,可采用这些酶的分泌形式。可用于本发明方法的萤光素酶包括但不限于甲虫萤光素酶(包括叩头虫 (click beetle)和萤火虫萤光素酶)、海肾(Renilla)萤光素酶和长腹水蚤(Gaussia)萤 光素酶(Verhaegeb 等 Anal.Chem.74 4378-4385(2002) ; Tannous 等 MoI.Ther. 11 435-443(2005))。萤光素酶试验是定量的,显示很低的背景。除 分泌型长腹水蚤萤光素 酶外,萤光素酶试验通常需要裂解试验细胞。然而,在一些实施方式中,可采用膜穿透 性萤光素酶试剂避免细胞裂解。可在双报告基因试验中采用具有不同发射最佳(光谱) 的萤光素酶。例如,萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶具有可区分的信号,有试验缓冲液 可用从而允许串联读取两种萤光素酶的信号(普洛麦格公司,威斯康星州麦迪逊)。叩 头虫甲红色和绿色萤光素酶突变体也设计为具有不同发射光谱,从而可在同一试验中以 同一种底物缓冲液(普洛麦格公司,威斯康星州麦迪逊)采用两种叩头虫萤光素酶报告基 因。Wnt调节蛋白和激活蛋白在一些实施方式中,用于本发明方法的非癌细胞或癌细胞还包括含Wnt激活蛋 白或Wnt调节蛋白的基因的重组构建体。Wnt激活蛋白是在细胞中表达时调节Wnt信号 传导的任何蛋白质。Wnt激活蛋白的非限制性例子包括β-联蛋白、APC、轴蛋白1、轴 蛋白 2、GSK3、Disheveled、LRP5、LRP6、Frizzled 或 Wnt 蛋白。Wnt 调节蛋白是在细 胞中表达时通过调控一个或多个Wnt激活蛋白或一个或多个Wnt调节蛋白的表达来调节 Wnt信号传导的任何蛋白质。Wnt调节蛋白的非限制性例子包括β-联蛋白、TCF-I、 TCF-2、TCF-3、TCF-4,以及与TCF/LEF蛋白或β -联蛋白发生相互作用的转录阻抑 蛋白,包括CtBP、Groucho> Pygo> p300和PIX2。在一些实施方式中,在细胞中表达 的Wnt激活蛋白或调节蛋白是所述激活蛋白或调节蛋白的突变型。在一些实施方式中, 所述Wnt激活蛋白(基因)是突变型APC基因。在一些实施方式中,所述Wnt激活蛋 白(基因)是突变型联蛋白基因。基因转移和载体可将用于所述试验方法中的重组报告基因构建体或Wnt调节蛋白或激活蛋白表 达构建体瞬时转染入细胞,或可将其整合入宿主细胞。就瞬时转染或选择稳定整合体而 言,将重组报告基因构建体作为质粒引入细胞。可采用将DNA引入细胞的任何方法将 核酸构建体转染入细胞,所述方法包括例如,电穿孔、DNA生物射弹、脂质介导的转 染、紧密DNA介导的转染、脂质体、葡聚糖、免疫脂质体、脂质转染试剂、阳离子试剂 介导的转染、阳离子表面两亲性分子(CFA) (Nature Biotechnology 199614 ; 556)、多价 阳离子如精胺、阳离子脂质或聚赖氨酸、1,2,-二(油酰氧基)-3-(三甲铵基)丙烷 (DOTAP)-胆固醇复合物(Woff 和 Trabetskoy 1998Nature Biotechnology 16 421)及其组 合。通常通过在包含抗生素的介质上选择稳定整合体,包含报告基因构建体的质粒具有 对所述抗生素的耐性基因。在本发明一些优选的实施方式中,采用病毒载体递送系统将所述报告基因构建 体或Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白构建体引入细胞。例如,可采用腺病毒载体、腺病毒相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体或反转录病毒载体(包括慢病毒载体)将所述核酸 构建体引入细胞。病毒载体递送系统提供以下优势随机稳定的整合、转导可能反抗基 因递送方法的细胞的能力,以及重组基因的单个位点整合,提供更为可靠和一致的试验 系统。诱导型病毒表达载体包括例如美国专利第6,953,575号公开的载体。可用于将报告基因构建体和Wnt激活蛋白或调节蛋白基因引入细胞的反转 录病毒包括但不限于鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马感染性贫 血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、弗吉纳米肉瘤 病毒(FuSV)、莫罗尼(Moloney)小鼠白血病病毒(Mo_MLV)、FBR小鼠骨肉瘤病毒 (FBR MSV)、莫罗尼小鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、阿比尔森(Abelson)小鼠白血病病毒 (A-MLV)、禽类髓细胞瘤病病毒_29(MC29)、禽类成红细胞增多症病毒(AEV)和慢病 毒,这些病毒具有感染分裂和非分裂两种细胞的能力。

灵长类慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV)和猿免疫缺陷病毒(SIV)。非 灵长类慢病毒群包括原型“缓慢病毒”绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺病病毒 (VMV)以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马感染性贫血病毒(EIAV)和最近 描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。可采用一种以上反转录病毒(或慢病毒)感染同一个细胞,从而可能采用反转录 病毒引入多于一个报告基因构建体、Wnt调节蛋白基因、Wnt激活蛋白基因及它们的组 合。可通过用不同改造病毒的混合物感染细胞并选择携带各种病毒的细胞实现用三种反 转录病毒同时感染细胞(Weber等MoI Ther. 16 698-706(2008))。测试化合物测试化合物可以是小分子、肽、多肽、糖类、脂质或核酸分子。测试化合物可 以是天然或合成化合物文库的成员。例如,测试化合物可来自组合文库,即通过组合多 个化学构建块而化学合成或生物合成的不同化学化合物的集合。测试化合物也可包括多肽和肽,包括基于多肽的肽模拟物。测试化合物也可以 是转录启动子或增强子序列、或剪接界或增强子的核酸适体和核酸分子“诱杀剂”。在 一些实施方式中,测试化合物可以采用诱导三螺旋结构以抑制基因转录的核酸构建体的 形式(Helene (1991) Anticancer DragDes.6 569-584)。在一些实施方式中,测试化合物可包括针对一个或多个同种型Wnt激活蛋白、 调节蛋白或Wnt信号传导途径组分的RNAi构建体或反义寡核苷酸。在一些实施方式 中,测试化合物是包含针对参与Wnt信号传导的一个或多个同种型基因的一种或多种 核酶的核酸分子。RNAi构建体、反义寡核苷酸和核酶的设计、合成和使用参见例如, Dykxhoorn 等(2003)Nat.Rev.MoI.Cell.Biol.4 457-467; Hannon 等(2004) Nature 431 371-378 ; Sarver 等(1990) Science 247 1222-1225; Been 等(1986) Cell 47 207-216。例如,一些实施方式中的测试化合物是siRNA( “短干扰RNA”)分子或产生 SiRNA分子的核酸构建体。在一些实施方式中,将测试化合物作为一种或多种短发夹 RNA( "shRNA")或转录产生一种或多种shRNA的一个或多个DNA构建体引入细胞, 其中在细胞内加工所述shRNA以产生一种或多种SiRNA分子。可任选引入用于表达siRNA、shRNA、反义RNA、核酶的核酸构建体或产生三
螺旋结构的核酸作为RNA分子或重组DNA构建体。任选设计降低特定同种型的基因表达或剪接的DNA构建体,从而在细胞中自哺乳动物中具有转录活性的启动子开始表达所 需RNA分子。出于一些目的,优选采用基于病毒或质粒的核酸构建体引入所述测试化合 物。药物组合物及给药方法采用一种或多种生理上可接受的运载体配制药物组合物,所述运载体包括促进 将活性化合物加工为药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。适当的制剂依赖于所选的给 药途径。对药物组合物的总结参见例如,《雷明登药物科学与实践》(Remington: The Science and Practice of Pharmacy),第9版(宾夕法尼亚外丨伊斯顿马克出版公司 (Eahston,Pa. Mack PublishingCompany), 1995) ; Hoover, John E.,《雷明登药 物科学》(Remington ‘ sPharmaceutical Sciences),马克出版公司,宾夕法尼亚外丨伊斯 顿(MackPublishing Co., Easton, Pennsylvania) 1975 ; Liberman, H.A.禾口 Lachman, L.编,《药物剂型》(Pharmaceutical Dosage Forms),Marcel Decker 出版公司,纽约, 1980 ;以及《药物剂型和药物递送系统》(Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems),第 7 版(Lippincott Williams 和 Wilkins 出版公司,I"9)。本文提供的药物组合物包括一种或多种调节Wnt信号传导的化合物(“Wnt信号 传导调节物”)和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或运载体。此外,任选将Wnt信号传 导调节物作为与其它活性成分混合的药物组合物进行给药,如在联合治疗中那样。在一 些实施方式中,所述药物组合物包括其它药用或药学试剂、运载体、佐剂,如防腐剂、 稳定剂、润湿剂、乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐类和/或缓冲液。此外,所述 药物组合物也包含其它有治疗价值的物质。本文所用的药物组合物指Wnt信号传导调节物与其它化学组分如运载体、稳定 齐 、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。所述药物组合物促进 Wnt同种型表达调节物给予生物体。实施本文提供的治疗或使用方法中,将治疗有效量 的Wnt信号传导调节物以药物组合物的形式给予具有待治疗的状况、疾病或病症的哺乳 动物。在一些实施方式中,所述疾病是癌症。哺乳动物优选人。治疗有效量根据状况 的严重程度和所处阶段、对象的年龄和相对健康状况、所用Wnt信号传导调节物的效力 和其它因素而不同。任选单独使用或与作为混合物组分的一种或多种治疗剂联用Wnt信 号传导调节物。任选通过多种给药途径将本文所述的药物制剂给予对象,给药途径包括但不限 于口服、肠胃外(例如,静脉内、皮下、肌内)、鼻内、口腔含化、外用、直肠或透皮给 药途径。本文所述的药物组合物包括但不限于水性液体分散体、自身乳化分散体、固体 溶液、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉剂、速释制剂、控释制剂、速融制剂、片 齐U、胶囊、丸剂、迟释制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂以及速释和控释混 合制剂。一些实施方式中的药物组合物包括至少一种Wnt同种型表达调节物,作为游离 酸或游离碱形式或药学上可接受的盐形式的活性成分。此外,本文所述的方法和药物组 合物包括使用N-氧化物、晶形(也称为多晶型)以及这些Wnt同种型表达调节物具有同 种活性的活性代谢物。在一些情况中,Wnt同种型表达调节物以互变异构体形式存在。“运载体材料”包括制药学中任何常用的赋形剂, 应基于与本文公开化合物如Wnt同种型表达调节物的相容性和所需剂型的释放曲线性质对其进行选择。示范性运载 体材料包括例如,粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、 润滑剂、润湿剂、稀释剂等。本文所述包含Wnt信号传导调节物的药物组合物可配制为任何合适的剂型,包 括但不限于水性口服分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液等,就待治疗患 者口服摄取而言,包括固 体口服剂型、气溶胶、控释制剂、速融制剂、泡腾制剂、冻干 制剂、片剂、粉剂、丸剂、锭剂、胶囊、迟释制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、多颗粒 制剂以及速释和控释混合制剂。就吸入给药而言,所述Wnt信号传导调节物任选地采用气溶胶、雾剂或粉剂形 式。采用合适的推进剂,如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其 它合适的气体,在加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾形式方便地递送本文所述药物组合 物。在加压气溶胶的情况下,通过提供阀门递送计量用量来确定剂量单位。将例如(仅 是举例)用于吸入剂或吹入剂的明胶胶囊和药筒配制为包含Wnt同种型表达调节物和合适 的粉基,如乳糖或淀粉的粉末混合物。Wnt信号传导调节物透皮制剂的给药方式在例如美国专利第3,598,122、 3,598,123, 3,710,795, 3,731,683, 3,742,951, 3,814,097, 3,921,636, 3,972,995, 3,993,072, 3,993,073, 3,996,934, 4,031,894, 4,060,084, 4,069,307, 4,077,407, 4,201,211, 4,230,105, 4,292,299, 4,292,303, 5,336,168, 5,665,378, 5,837,280, 5,869,090、6,923,983、6,929,801 和 6,946,144 号中有描述。适用于肌内、皮下或静脉内注射的包含Wnt信号传导调节物的制剂包括生理上 可接受的无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液,以及用于重建为无菌可注射 溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性运载体、稀释剂、溶剂或载体的例子包 括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、克列莫佛(cremophor)等)、其合适的 混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯如油酸乙酯。例如,通过使用涂层如卵磷 月旨、在分散体的情况中通过保持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。 适合皮下注射的制剂还包含任选的添加剂,如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。就静脉内注射而言,任选地在水性溶液中配制Wnt信号传导调节物,优选生理 相容性缓冲液,如汉克液(Hank’ s solution)、林格液(Ringer’ ssolution)或生理盐水缓 冲液。就经粘膜给药而言,在制剂中采用适合要渗透的屏障的渗透剂。就其它肠胃外注 射而言,合适的制剂包括水性或非水性溶液,优选带有生理相容性缓冲液或赋形剂。胃肠外注射任选包括推注或连续输注。用于注射的制剂任选地以单位剂型提 供,例如,装在安瓿或多剂量容器中,添加有防腐剂。在一些实施方式中,本文所述 药物组合物采用适用于胃肠外注射的油性或水性载体中的无菌悬浮液、溶液或乳液的形 式,其包含配方试剂,如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于胃肠外给药的药物组合物 包括水溶性形式的Wnt信号传导调节物的水性溶液。此外,Wnt信号传导调节物的悬浮 液任选制备为合适的油性注射悬浮液。在一些实施方式中,将Wnt信号传导调节物局部给药,将其配制为各种可局部 给药的组合物,如溶液、悬浮液、洗液、凝胶、糊剂、药棒、香膏、乳膏或油膏。这样 的药物组合物任选包含增溶剂、稳定剂、张度增强剂、缓冲液和防腐剂。
也可任选将Wnt信号传导调节物配制为直肠组合物,如灌肠剂、直肠凝胶、直 肠泡沫、直肠气溶胶、栓剂、胶冻栓剂或滞留灌肠剂,其包含常规栓剂基料如可可油或 其它甘油酯,以及合成聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮、PEG等。鉴定调节癌细胞中Wnt信号传导的化合物的试验提供了鉴定调节癌细胞中Wnt信号传导的化合物的方法,其中所述方法包括 提供包含启动子调控的报告基因的癌细胞,所述启动子受TCF/LEF和β-联蛋白之间相 互作用的调节;提供包含启动子调控的所述报告基因的非癌细胞,所述启动子受TCF/ LEF和β-联蛋白之间相互作用的调节;使所述癌细胞和非癌细胞接触测试化合物;鉴 定调节癌细胞中报告基因表达的信号但不调节非癌细胞中报告基因表达的信号的测试化 合物。通过将细胞接触测试化合物时检测到的细胞信号与细胞未接触测试化合物时检测 到的信号作比较,确定对细胞中报告基因的信号的调节作用。用于所述方法的癌细胞可以是任何癌细胞,非限制性例子可以是结肠癌细胞、 白血病细胞、淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、肺 癌细胞、卵巢癌细胞、子宫颈癌细胞或头颈癌细胞。在一些实施方式中,所述癌细胞是 白血病细胞,例如,Jurkat细胞、HL60细胞或Κ562细胞。在一些实施方式中,所述癌细 胞是结肠癌细胞,例如,SW116细胞、SW48细胞、SW480细胞、Colo 320细胞、Colo 205细胞、ΗΤ-29细胞、ΗΤ-116细胞或CaC02细胞。用于该方法的非癌细胞可以是任何非癌细胞,非限制性例子可以是HEK293细 胞、COS-7细胞、CHO细胞、NIH/3T3细胞或非癌的结肠细胞、上皮细胞、皮肤细胞、 B细胞、T细胞、乳腺细胞、前列腺细胞、肝细胞、肺细胞、卵巢细胞、子宫细胞或子宫 颈细胞。非癌结肠细胞包括但不限于NCM 356细胞和NCM 460细胞(两种细胞均可 从英赛尔公司购得),以及NCIEM细胞(Baten等,FASEB J.6 2726 (1992))。在一些实施方式中,采用癌性结肠细胞和非癌性结肠细胞实施所述方法。受TCF/LEF和β -联蛋白之间相互作用调节的启动子是结合β -联蛋白或受其 作用的TCF/LEF蛋白上调、下调、抑制或激活的任何启动子,包括合成启动子、天然产 生的启动子、天然产生的启动子的一部分、嵌合启动子等。也包括WIN启动子。WIN启 动子是包含一个或多个Wnt应答元件(WRE)的合成启动子,所述应答元件发现于Wnt/ β-联蛋白途径激活的基因或在Wnt/β-联蛋白途径被组成性激活的癌细胞中过表达基因 的启动子中。本文提供的用于表达构建体的启动子包括WIN启动子、Wnt/β-联蛋白途 径激活的包含至少两个Wnt应答元件的基因天然启动子、带有至少两个或多个Wnt应答 元件并结合了侧接Wnt应答元件的合成序列的基因天然启动子的组合,以及带有两个或 多个Wnt应答元件并结合了另外的其它转录激活蛋白结合位点的天然启动子。用于所述 方法的合成启动子是包含还存在于“TOPFlash”启动子的Wnt应答元件的WIN启动子, 但所述WIN启动子包含散布于WRE之间的富含GC的区域(

图1)。图1显示癌症相关 的Wnt报告基因。除发现于Wnt/ β -联蛋白途径激活的基因或在Wnt/ β -联蛋白途径被 组成性激活的癌细胞中过表达基因的启动子中的一个或多个Wnt应答元件以外,合成启 动子可包含一个或多个富含GC的区域。以下启动子也可用于所述构建体Wnt/β-联 蛋白途径激活的包含至少两个(或多个)Wnt应答元件的基因天然启动子、带有至少两个 或多个Wnt应答元件并结合了侧接所述Wnt应答元件的合成序列的基因天然启动子的组合,以及带有两个或多个Wnt应答元件并结合了另外的其它转录激活蛋白结合位点的天 然启动子。受TCF/LEF和β -联蛋白之间相互作用调节的天然产生启动子的非限制性例子 包括但不限于LEF-I、c-myc、c_myb、c_kit、细胞周期蛋白Dl、cdx、MMP7、存活蛋 白、Siamois、轴蛋白2、DKK4和sp5的启动子。不想将本发明方法或采用本发明方法鉴定的Wnt调节化合物限制于任何特定机 理,但应理解,一些通过结合与β-联蛋白形成复合物的TCF/LEF蛋白激活的启动子也 可由联蛋白与TCF/LEF家族的 特定成员而非另一成员的相互作用激活。可通过可能 与TCF/LEF或β联蛋白发生或不发生相互作用的其它蛋白质调控受TCF/LEF-β联蛋白 调控的启动子。例如,LEF-I受TCF-4而非LEF-I本身调控,除非存在ΡΙΤΧ2,在该情况 中LEF-I与ΡΙΤΧ2相互作用诱导其本身的转录(Amen等MoI Cell.Biol.27 7560-7573)。 TCF-4E 调控 LEF-I 和 cdx,不受 LEF-I 调控。LEF-I 激活 Siamois,而 TCF-4E 不具该 功能(Hecht等J.Biol.Chem.278 3776-3785(2003))。在所述方法包括的实施方式中,鉴 定调节Wnt信号传导的化合物的试验鉴定两个或多个TCF/LEF-β联蛋白应答启动子的 表达,以确保所述化合物作用具有Wnt途径特异性。例如,待鉴定细胞可具有操作性连 接于WIN启动子的第一报告基因和操作性连接于轴蛋白2启动子的第二报告基因。第三 报告基因可操作性连接于组成型启动子以便标准化报告基因表达水平。在这些实施方式 中,鉴定为Wnt途径调节物的测试化合物是导致癌细胞而非正常细胞中一个或两个基因 表达水平差异的化合物。还提供一种方法,其中所述方法包括提供包含核酸构建体的细胞,所述构建 体含有编码Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因和启动子调控的报告基因,所述启动子 受TCF/LEF和β-联蛋白之间相互作用的调节;使所述细胞接触测试化合物;相对于未 接触测试化合物的对照细胞中报告基因表达的信号,将具有调节接触测试化合物的细胞 中报告基因表达的信号作用的测试化合物鉴定为调节Wnt信号传导的化合物,其中在不 存在包含编码Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因的核酸构建体的细胞中未发现所述作 用。在这些方面中,所述试验细胞包括含Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因的重 组构建体。Wnt激活蛋白是在细胞中表达时刺激或抑制Wnt信号传导的任何蛋白质。 Wnt激活蛋白的非限制性例子包括β-联蛋白、APC、轴蛋白1、轴蛋白2、GSK3、 Disheveled、LRP5、LRP6、Frizzled或Wnt蛋白。Wnt调节蛋白是在细胞中表达时通过 调控一个或多个Wnt激活蛋白或一个或多个Wnt调节蛋白的表达来调节Wnt信号传导的 任何蛋白质。Wnt调节蛋白的非限制性例子包括β-联蛋白、TCF-I、TCF-2、TCF-3、 TCF-4,以及与TCF/LEF蛋白或β _联蛋白发生相互作用的转录阻抑蛋白和转录增强 物,包括CtBP、Groucho> Pygo> p300和PIX2。在一些实施方式中,在细胞中表达 的Wnt激活蛋白或调节蛋白是所述激活蛋白或调节蛋白的突变型。在一些实施方式中, 所述Wnt激活蛋白(基因)是突变型APC基因。在一些实施方式中,所述Wnt激活蛋 白(基因)是突变型联蛋白基因。在另一方面,提供鉴定调节Wnt信号传导的化合物的方法,包括提供包含以 下的细胞1)包含编码Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因的核酸构建体,所述基因处于诱导型启动子的调控下,2)启动子调控的报告基因,所述启动子受TCF/LEF和β-联 蛋白之间相互作用的调节;诱导Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的表达;使所述细胞接触 测试化合物;相对于未接触测试化合物的对照细胞中报告基因表达的信号,鉴定具有调 节接触测试化合物的细胞中报告基因表达的信号的作用的测试化合物,其中在未诱导编 码Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因的细胞中未获得所述作用。用于本文所述试验的报告基因可以是任何报告基因,例如,碱性磷酸酶、β-半 乳糖苷酶、内酰胺酶、荧光蛋白、萤光素酶或CAT。在一些优选的实施方式中,用 于所述方法的试验细胞包含至少两个报告基因,其中至少一个是启动子调控的对照报告 基因,所述启动子不受TCF/LEF和β-联蛋白相互作用的调控,例如组成型启动子。在 这些实施方式中,将操作性连接于受TCF/LEF和联蛋白之间相互作用调节的启动子 的报告基因表达的信号检测根据表达受组成型启动子调控的第二报告基因的检测信号标 准化。具有重组Wnt激活蛋白或调节蛋白的细胞可以是癌细胞或非癌细胞。在所述 方法的优选实施方式中,其中在待测细胞中提供编码Wnt激活蛋白或调节蛋白的基因, 所述待测细胞是非癌细胞,其中Wnt信号传导途径被Wnt调节蛋白或激活蛋白的表达激 活。可通过具有Wnt应答启动子的报告基因表达评估存在或诱导Wnt激活蛋白或调节蛋 白的表达对Wnt信号传导途径的激活作用。报告基因表达是缺乏Wnt激活蛋白或调节蛋 白或未诱导Wnt激活蛋白或调节蛋白表达的同一类型细胞中表达的至少两倍表明所述细 胞具有激活的Wnt信号传导途径。所述非癌细胞可以是任何细胞,例如,HEK细胞、COS-7细胞、ΝΙΗ/3Τ3细 胞、CHO细胞等,但优选非癌T细胞、前T细胞、乳腺细胞、前列腺细胞、上皮细胞、 结肠细胞、小肠上皮细胞、皮肤细胞、肝细胞、肺细胞、卵巢细胞、子宫细胞或子宫颈 细胞,这些细胞中Wnt调节蛋白或激活蛋白的表达激活Wnt信号传导途径。例如,非癌 结肠或小肠上皮细胞,例如但不限于NCM 356细胞、NCM 460细胞和NCIEM细胞可用 于本文所述方法。试验细胞表达的Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白可以是激活Wnt途径的任何Wnt 激活蛋白或调节蛋白。在一些实施方式中,Wnt激活蛋白或调节蛋白是Wnt调节蛋白, 例如,包含 LEF1、TCFU TCF3、TCF4、CtBP> Pygo> Groucho> CtBP、ρ300 或这些 蛋白的截短型或突变型。在一些实施方式中,试验细胞表达的Wnt调节蛋白是LEF1、 TCFU TCF3或TCF4,或其截短型或突变型。在一些实施方式中,试验细胞表达的重 组Wnt调节蛋白是TCF-4E或LEF-I。在一些实施方式中,Wnt激活蛋白或调节蛋白是 β-联蛋白,或Wnt激活蛋白的突变型或截短型,例如,β-联蛋白、APC、轴蛋白1、 轴蛋白 2、GSK3 β , Disheveled、LRP5、LRP6、Frizzled 或 Wnt 的突变型。在某些实施 方式中,Wnt激活蛋白或调节蛋白是Wnt,如Wntl、Wnt3或Wnt 3a。在某些实施方式 中,Wnt激活蛋白或调节蛋白是Frizzled(Fz),如Fzl、Fz3、Fz5或Fz7。在某些实施方式中,试验细胞表达的Wnt激活蛋白或调节蛋白是激活Wnt信号 传导的突变型β-联蛋白,如缺乏外显子3磷酸化位点的突变型β-联蛋白,或激活Wnt 信号传导的突变型APC,如缺乏功能性β-联蛋白结合结构域的截短APC。在本发明的一些实施方式中, 试验细胞包含编码两种或多种Wnt激活蛋白或调节蛋白的核酸构建体。试验细胞可表达重组Wnt调节蛋白和激活蛋白的任何组合。在本 发明的一些实施方式中,将Wnt调节蛋白和Wnt激活蛋白引入试验细胞。例如,试验细 胞可包含编码β -联蛋白和LEF-I、TCF-4和截短APC基因或LEF-I和TCF-4的重组构 建体。在本发明的优选实施方式中,引入试验细胞的两个或多个Wnt调节蛋白或激活蛋 白激活Wnt途径。

在另一方面,本发明包括鉴定调节Wnt信号传导的化合物的方法,其采用负选 择鉴定破坏经由TCF/LEF和β _联蛋白相互作用的基因激活的化合物。所述方法包括 提供具有受启动子调控的报告基因的细胞,所述启动子受TCF/LEF和联蛋白之间相 互作用的调节,其中所述报告基因具有负选择性;使所述细胞接触测试化合物;使所述 细胞接触前药,所述前药由报告基因编码的蛋白质转化为活性药物;鉴定允许细胞在前 药存在下生长的测试化合物。在这些实施方式中,耐受负选择的细胞是Wnt途径被破坏的细胞。可用于负选择的报告基因包括但不限于将阿昔洛韦和更昔洛韦转化为毒性 化合物的胸苷激酶、将药物的头孢菌素偶联物(例如,C-Dox[头孢菌素多柔比星]和 CCM[7-(4-羧基丁酰氨基)-头孢菌素氮芥(mustard)])转化为其毒性形式的β _内酰胺 酶、将5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶、可将含磷酸盐的前药转化为其毒 性形式的碱性磷酸酶、将含硫酸盐的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶、将糖基化的 前药转化为游离药物的β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶和将含肽前药转化为游离药物的肽 酶。实施例1 调节癌细胞中Wnt信号传导途径的细胞试验SW480是具有产生截短APC蛋白的突变APC基因的结肠癌细胞系,导致联 蛋白累积失调。通过用包含处于WIN启动子,WinBeam调控下的萤火虫萤光素酶基因 的慢病毒载体稳定转化细胞系,产生报告基因细胞系CWinBeam-SW480,所述启动子基 于天然产生的Wnt应答启动子SP5的启动子序列(Naoko Fuiimura等JBC 2007的图3显示 SP5启动子)。此外,通过用处于WIN报告基因,WinVerve和WinThunder调控下的萤 火虫萤光素酶基因稳定转导SW480,产生其它两个报告基因细胞系cWinVerve-SW480和 cWinThunder-SW480,所述WinVerve报告基因基于天然产生的Wnt应答启动子DKK4的 启动子序列(图4),所述WinThunder报告基因是由12个或更多WRE组成的合成Wnt应 答DNA(图5)。在产生的细胞系中,在通过脂质转染将β-联蛋白的SiRNA而非siRNA 阴性对照引入细胞时,WIN启动子的萤光素酶活性消失(图6-8)。图6显示β-联蛋白的 SiRNA如何有效下调β _联蛋白表达并消除WinBeam萤光素酶活性。图7显示WinVerve 萤光素酶活性如何被β _联蛋白的SiRNA下调。图8显示cWinThunder活性如何被β -联 蛋白的SiRNA下调。采用同一细胞系,通过处于组成型启动子SV40调控下的萤火虫萤 光素酶基因的稳定转染产生对照报告基因,该启动子不受联蛋白的SiRNA影响(图 9)。图9显示SV40启动子活性不受β -联蛋白的SiRNA影响。在一些实施方式中,带有不同突变如β-联蛋白中突变的其它结肠癌细胞, HCT-116也可用来产生带有WIN启动子的稳定报告基因细胞系cWinB eam-HCT-116、 cWinVerve-HCT-116和cWinThunder-HCT-l 16,以及带有SV40的对照报告基因细胞(图 10-12)。 图10显示WinBeam如何在SW480、HCT-116和DLDl中具有组成型活性。图11显示WinVerve如何在SW480和HCT-116中具有组成型活性。图12显示SW480和HCT-116细胞中的WinThunder萤光素酶活性。在其它实施方式中,正常细胞如人胚胎肾 细胞系HEK293也可用来产生带有WIN启动子的稳定报告基因细胞系cWinBeam_293、 cWinVerve-293和cWinThunder-293,以及带有SV40的对照报告基因细胞(图13-15)。 图13显示WinBeam如何在293细胞中被β -联蛋白和Wnt激活蛋白激活。图14显示 WinVerve如何在293细胞中被β -联蛋白和Wnt激活蛋白激活。图15显示带有诱导型 β -联蛋白的293Trex细胞中的WinThunder活性。在正常细胞的情况中,通过加入外源Wnt激活蛋白或稳定表达与诱导型 “Tet-On”启动子连接的联蛋白获得功能性“Ε3”突变体来诱导报告基因活性。该
突变型β-联蛋白缺乏包含磷酸化位点S33、S37、Τ41和S45的外显子3结构域,因此 不是β-联蛋白降解复合物降解的目标,从而在细胞中形成组成型Wnt信号传导。所述 “Tet-On”启动子允许通过向培养物中加入四环素或四环素衍生物多西环素来进行可滴 定诱导,从而在抗生素调控下稳定表达活性联蛋白(图13-15)。将培养的cWinBeam细胞以每孔约10,000个细胞分配到384孔多孔板上。向 孔中加入化合物文库的化合物至终浓度达到50皮摩到10微摩。各细胞类型的一系列对 照孔只接受缓冲液或化合物溶剂。在加入化合物后24小时,通过加入BrightGlo萤光素 酶⑧报告基因检测试剂反应/裂解缓冲液,采用发光计读取光发射来鉴定WIN报告基因 (WinBeam、WinVerve和WinThunder)的活性和SV40萤光素酶。在两复板上,通过加入 细胞效价GIo试剂/裂解缓冲液,采用发光计读取光发射,鉴定细胞生存力(图16-18)。 图16显示采用WIN报告基因选择得到的化合物。图17显示如何采用WIN报告基因将 非特异性和毒性化合物排除在分析范围之外。图18显示如何将对WIN报告基因没有作 用的毒性和非特异性化合物排除在分析范围之外。如果测试化合物调节WinBeam报告基因活性但不影响SV40启动子活性,则鉴 定其为候选调节物。在其它实施方式中,如果测试化合物调节WinVerve和WinThunder 报告基因活性,则将其视作候选调节物。经细胞生存力试验读数所示影响细胞生存力的 测试化合物鉴定为毒性化合物(图16-18)。藉此鉴定为候选调节物的测试化合物用于重复筛选。在重复筛选中,将 cWinBeam细胞分配到两复96孔板的孔中,加入给定的测试化合物。如前所述在加入测 试化合物后4-48小时检验各孔。进行萤光素酶试验和细胞生存力试验。将在cWinBeam 报告基因细胞中引起WIN萤光素酶信号差异但不影响细胞生存力的测试化合物鉴定为 Wnt信号传导调节物。在其它实施方式中,如果测试化合物调节WinVerve和WinThunder 报告基因活性但不影响生存力,则将其视作候选调节物(图16-18)。实施例2:采用正常细胞或癌细胞和细胞表达的外源Wnt途径激活蛋白的细胞试 验用以下瞬时转染人胚胎肾细胞系HEK293 1)巨细胞病毒(CMV)启动子组成性 调控下的编码β-联蛋白的基因,其通过IRES与编码红色荧光蛋白的基因连接;和2) 包含轴蛋白2启动子调控下的绿色荧光蛋白(GFP)基因的报告基因构建体(图2)。通过 IRES与β-联蛋白基因连接的RFP基因提供用Wnt激活蛋白β-联蛋白基因转染细胞的 标记,以及标准化GFP报告基因信号的表达对照。所述RFP和GFP基因编码半衰期缩短的失稳RFP和GFP以供改进的试验(可从加利福尼亚州山景城的克隆泰克公司购得)。
将所述细胞分配到384孔板上,在转染后24小时向孔中加入化合物文库的测试 化合物至终浓度达到50皮摩到10微摩。一系列对照孔接受化合物缓冲液或溶剂,代替 测试化合物。在加入化合物后4、8、12和24小时的时间点采用荧光计鉴定细胞的RFP 和GFP表达。各孔的GFP信号根据该孔的RFP信号标准化。将增强或减弱标准化GFP 信号的测试化合物鉴定为调节Wnt信号传导的化合物。实施例3:采用正常细胞或癌细胞、细胞表达的外源Wnt途径激活蛋白和两个报 告基因的细胞试验用具有以下的三种不同慢病毒构建体转化正常人大肠上皮细胞系NCM460(英赛 尔公司,德克萨斯州圣安东尼奥)1)WIN启动子调控下的稳定整合绿色荧光蛋白基因 (图1) ; 2)sp5启动子调控下的稳定整合红色荧光蛋白基因(图3);和3)用于基因表达 标准化的组成型HSVtk启动子调控下的稳定整合的编码黄色荧光蛋白(YFP)的基因。所 述GFP、RFP和YFP基因编码失稳蛋白质以供更可靠的试验。所得NCM460/G,R, YFP-tet^联蛋白细胞系还具有4)与诱导型“Tet-On”启动子连接的编码β-联蛋白获 得功能性“Ε3”突变体的反转录病毒整合基因。该突变型联蛋白缺乏包含磷酸化位 点S33、S37、Τ41和S45的外显子3结构域,因此不是β -联蛋白降解复合物降解的目 标,从而在细胞中形成组成型Wnt信号传导。所述“Tet-On”启动子允许通过向培养物 中加入四环素或四环素衍生物多西环素进行可滴定诱导。悬浮培养NCM460/G,R,YFP-tet^联蛋白细胞,将其以每孔约10,000个细胞
分配到两复384孔多孔板上,通过加入0.5微克/毫升的多西环素诱导两复板之一各孔培 养物中的β联蛋白表达。在多西环素诱导后24小时,向两复板的孔中加入化合物文库 的测试化合物至终浓度达到1微摩。各细胞类型的一系列对照孔只接受缓冲液或溶剂。 在加入所述化合物后0、4、8、12和24小时读取GFP、RFP和YFP的荧光信号。根据接受测试化合物的两复板的各孔中YFP的信号标准化GFP和RFP各报告基 因表达的信号。将这些标准化值与未加入测试化合物的对照孔的标准化值进行比较,以 提供各测试化合物孔的测试化合物调节值(各测试化合物改变报告基因活性的程度的标 准化值)。就给定化合物而言,比较多西环素诱导和未诱导的NCM460/RLu,GLu-ind^ 联蛋白孔的调节值。将与加入未诱导细胞时相比,在加入诱导细胞时能引起显著不同调 节值(正或负)的化合物鉴定为调节Wnt信号传导的化合物。实施例4 :采用β -内酰胺酶的负选择筛选用包含WIN启动子调控下的β -内酰胺酶基因的AAV构建体稳定转染DLDl结 肠癌细胞系的细胞。采用产生荧光产物,例如香豆素头孢菌素荧光素(CCF2)的底物, 通过试验验证所述启动子的β-内酰胺酶表达。为检验抑制所述WIN启动子的化合物,将细胞以每孔10,000个细胞分配到384 孔板的孔中。向孔中加入测试化合物至浓度为1微摩。一系列对照孔接受缓冲液或化合 物溶剂,代替测试化合物。在加入测试化合物后24小时向各孔中加入C-Dox(多西环素 的头孢菌素衍生物),使浓度达到0.1-1微摩。将细胞再温育24小时,之后将培养基换 为不含测试化合物或前药的培养基。在24小时、2天和3天后检查孔中的细胞生存力和生长情况。鉴定细胞存活的孔为接受了调节Wnt信号传导的测试化合物的孔。
可采用胸苷激酶作为负选择性标记进行相同筛选,其中细胞在测试化合物存在 下温育后,向孔中加入的前药是例如阿昔洛韦或更昔洛韦。
权利要求
1.一种鉴定调节细胞中Wnt信号传导的化合物的方法,包括(a)提供包含启动子调控的报告基因的癌细胞,所述启动子受TCF/LEF和β-联蛋 白之间相互作用的调节;(b)提供包含启动子调控的所述报告基因的非癌细胞,所述启动子受TCF/LEF和 β-联蛋白之间相互作用的调节;(c)使(a)的癌细胞和(b)的非癌细胞接触测试化合物;和(d)检测接触测试化合物的癌细胞中报告基因表达的信号和未接触测试化合物的癌细 胞中报告基因表达的信号,并检测接触测试化合物的非癌细胞中报告基因表达的信号和 未接触测试化合物的非癌细胞中报告基因表达的信号;和(e)如果测试化合物调节癌细胞中报告基因表达的信号但不调节非癌细胞中报告基因 表达的信号,则将其鉴定为调节癌细胞中Wnt信号传导的化合物。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述癌细胞是结肠癌细胞、白血病细胞、 淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞或头颈癌细胞。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述细胞是结肠癌细胞、白血病细胞或淋 巴瘤细胞。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述细胞是白血病细胞。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述细胞是Jurkat细胞或K562细胞。
6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述细胞是结肠癌细胞。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述细胞是SW48、SW480、SW116、 CaC02、DLDU Colo320、Colo205、LS174T、HT-29 或 HT-116 细胞。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述非癌细胞是HEK293细胞、HeLa细 胞、C0S-7细胞、CHO细胞或NIH/3T3细胞。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述非癌细胞是小肠上皮细胞、非癌结肠 细胞、非癌淋巴细胞、非癌上皮细胞、非癌乳腺细胞、非癌前列腺细胞或非癌肝细胞。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述细胞是小肠上皮细胞。
11.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述细胞是正常人大肠上皮细胞 (NHLIEC)。
12.—种鉴定调节Wnt信号传导的化合物的方法,包括(a)提供包含核酸构建体的细胞,所述构建体含有编码Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白 的基因和启动子调控的报告基因,所述启动子受TCF/LEF和联蛋白之间相互作用的 调节;(b)使所述细胞接触测试化合物;和(c)相对于未接触测试化合物的对照细胞中报告基因表达的信号,将具有调节接触测 试化合物的细胞中报告基因表达的信号的作用的测试化合物鉴定为调节Wnt信号传导的 化合物,其中在不存在包含编码Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因的核酸构建体的细 胞中未发现所述作用。
13.—种鉴定调节Wnt信号传导的化合物的方法,包括(a)提供包含核酸构建体的细胞,所述核酸构建体包含诱导型启动子调控下的编码 Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因,还包含启动子调控的报告基因,所述启动子受TCF/LEF和β -联蛋白之间相互作用的调节;(b)诱导Wnt激活蛋白或Wnt调节蛋白的表达;(C)使所述细胞接触测试化合物;和(d)鉴定相对于未接触测试化合物的对照细胞中报告基因表达的信号,具有调节接触 测试化合物的细胞中报告基因表达的信号的作用的测试化合物,其中在未诱导编码Wnt 激活蛋白或Wnt调节蛋白的基因的细胞中未获得所述作用。
14.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述诱导型启动子是tet调控启动子。
15.如权利要求12或13所述的方法,其特征在于,所述细胞包含含有编码Wnt激活 蛋白的基因的核酸构建体。
16.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径激活蛋白包括Wnt蛋白、 Frizzled、Disheveled、LPR5、LPR6、β-联蛋白、APC、轴蛋白 1 或 GSK33,或这些 蛋白的同种型、截短型或突变型。
17.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径激活蛋白包括Wnt蛋白。
18.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径激活蛋白包括Wntl、 Wnt3 或 Wnt3a。
19.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径激活蛋白包括 Frizzled (Fz)。
20.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径激活蛋白包括Fzl、Fz3、 Fz5 或 Fz7。
21.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径激活蛋白包括β-联蛋 白,或截短或突变的β-联蛋白。
22.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径激活蛋白包括截短或突变 的 APC。
23.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径激活蛋白包括截短或突变 的轴蛋白。
24.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径激活蛋白包括截短或突变 的 GSK3 β。
25.如权利要求12或13所述的方法,其特征在于,所述细胞包含含有编码Wnt途径 调节蛋白的序列的核酸分子。
26.如权利要求25所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径调节蛋白包括LEF1、 TCF 1、TCF3、TCF4、CtBP> Pygo> Groucho> CtBP> ρ300 或这些蛋白的截短型或突变型。
27.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径调节蛋白包括LEF1,或 其同种型、截短型或突变型。
28.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径调节蛋白包括TCF1、 TCF3或TCF4,或它们的同种型、截短型或突变型。
29.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径调节蛋白包括TCF1,或 其同种型、截短型或突变型。
30.如权利要求29所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径调节蛋白包括TCF1-E,或其截短型或突变型。
31.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径调节蛋白包括TCF4,或 其同种型、截短型或突变型。
32.如权利要求31所述的方法,其特征在于,所述Wnt途径调节蛋白包括TCF4-E, 或其截短型或突变型。
33.如权利要求12或13所述的方法,其特征在于,所述细胞包含含有编码Wnt激活 蛋白和Wnt途径调节蛋白的基因的核酸构建体。
34.如权利要求12或13所述的方法,还包括对细胞进行细胞试验。
35.如权利要求34所述的方法,其特征在于,所述细胞试验是细胞生长试验、细胞死 亡试验、凋亡试验、迁移试验或侵入试验。
36.如之前任一项权利要求所述的方法,其特征在于,所述报告基因是萤光素酶基 因、半乳糖苷酶基因、内酰胺酶基因、编码CAT的基因、编码荧光蛋白的基因、 编码碱性磷酸酶的基因或编码胸苷激酶的基因。
37.如权利要求36所述的方法,其特征在于,所述报告基因是叩头虫萤光素酶基因、 萤火虫萤光素酶基因、海肾萤光素酶基因或长腹水蚤萤光素酶基因。
38.如权利要求36所述的方法,其特征在于,所述报告基因是编码绿色荧光蛋白的基 因、编码黄色荧光蛋白的基因、编码红色荧光蛋白的基因、编码橙色荧光蛋白的基因、 编码青色荧光蛋白的基因或编码蓝色荧光蛋白的基因。
39.如权利要求36所述的方法,其特征在于,所述报告基因是编码分泌型碱性磷酸 酶、分泌型半乳糖苷酶、分泌型内酰胺酶或分泌型萤光素酶的基因。
40.一种鉴定调节Wnt信号传导的化合物的方法,包括(a)提供包含启动子调控的报告基因的细胞,所述启动子受TCF/LEF和β-联蛋白 之间相互作用的调节,其中所述报告基因具有负选择性;(b)使所述细胞接触测试化合物;(c)使所述细胞接触前药,所述前药由报告基因编码的蛋白质转化为活性药物;和(d)鉴定允许细胞在前药存在下生长的测试化合物。
41.如权利要求40所述的方法,其特征在于,所述报告基因是胸苷激酶基因。
42.如权利要求41所述的方法,其特征在于,所述前药是更昔洛韦或阿昔洛韦。
43.如权利要求40所述的方法,其特征在于,所述报告基因是内酰胺酶基因。
44.如权利要求43所述的方法,其特征在于,所述前药是含头孢菌素的前药。
45.如权利要求44所述的方法,其特征在于,所述前药是偶联头孢菌素的苯二胺氮 芥、多柔比星、钼络合物、紫杉醇或长春花生物碱。
46.如权利要求45所述的方法,其特征在于,所述前药是头孢菌素多柔比星或 7- (4-羧基丁酰氨基)-头孢菌素氮芥。
47.如之前任一项权利要求所述的方法,其特征在于,所述受TCF/LEF和β-联蛋 白之间相互作用调节的启动子是包含一个或多个Wnt应答元件(WRE)和一个或多个富含 GC的区域的启动子。
48.如权利要求47所述的方法,其特征在于,所述受TCF/LEF和β-联蛋白之间相互作用调节的启动子是WIN启动子。
49.如之前任一项权利要求所述的方法,其特征在于,所述受TCF/LEF和β-联蛋白 之间相互作用调节的启动子是天然产生的启动子或其一部分。
50.如权利要求49所述的方法,其特征在于,所述受TCF/LEF和β-联蛋白之间相 互作用调节的启动子是轴蛋白2、cdx> sp5、DKK4、c-myc、细胞周期蛋白D1、存活蛋 白、MMP7、LEFl或TCFl启动子,或它们的一部分。
51.如权利要求1-38中任一项所述的方法,其特征在于,所述细胞还包含操作性连接 于受TCF/LEF和联蛋白之间相互作用调节的第二启动子的第二报告基因,其中第一 启动子和第二启动子不同。
52.如权利要求51所述的方法,其特征在于,所述第一启动子和所述第二启动子中至 少有一个是天然产生的启动子或其一部分。
53.如权利要求51所述的方法,其特征在于,所述第一启动子和所述第二启动子 中至少有一个是轴蛋白2、cdx> sp5、DKK4、c_myc、细胞周期蛋白D1、存活蛋白、 MMP7、LEFl或TCFl启动子,或它们启动子的一部分。
54.如权利要求8-52中任一项所述的方法,其特征在于,所述细胞是癌细胞。
55.如权利要求54所述的方法,其特征在于,所述细胞是结肠癌细胞、白血病细胞、 淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞或头颈癌细胞。
56.如权利要求55所述的方法,其特征在于,所述细胞是结肠癌细胞、白血病细胞或 淋巴瘤细胞。
57.如权利要求55所述的方法,其特征在于,所述细胞是白血病细胞。
58.如权利要求57所述的方法,其特征在于,所述细胞是Jurkat细胞或K562细胞。
59.如权利要求57所述的方法,其特征在于,所述细胞是结肠癌细胞。
60.如权利要求59所述的方法,其特征在于,所述细胞是SW48、SW480、SW116、 CaC02、DLDU Colo320、Colo205、LS174T、HT-29 或 HT-116 细胞。
61.如权利要求8-52中任一项所述的方法,其特征在于,所述细胞是非癌细胞。
62.如权利要求60所述的方法,其特征在于,所述细胞是HEK293细胞、COS细 胞、CHO细胞或3T3细胞。
63.如权利要求61所述的方法,其特征在于,所述细胞是非癌小肠上皮细胞、非癌 结肠细胞、非癌淋巴细胞、非癌上皮细胞、非癌乳腺细胞、非癌前列腺细胞或非癌肝细 胞。
64.如权利要求63所述的方法,其特征在于,所述细胞是非癌小肠上皮细胞。
65.如权利要求64所述的方法,其特征在于,所述细胞是正常人大肠上皮细胞 (NHLIEC)。
66.一种通过如权利要求1-65中任一项所述方法鉴定的化合物。
全文摘要
本文提供了筛选具有调节癌细胞中Wnt信号传导能力的化合物的方法。
文档编号C12Q1/68GK102027133SQ200980116859
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月6日 优先权日2008年5月7日
发明者C·F·巴罗嘉, D·卡森, D·卢, J·胡德 申请人:埃皮瑟瑞克斯有限公司, 温瑟瑞克斯有限公司
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