转染的细胞的生产方法

专利名称：转染的细胞的生产方法
技术领域：
本发明涉及生产含有其中导入了期望的基因的T细胞的细胞群体的方法，其在医 学领域是有用的。
背景技术：
生物体主要由免疫反应来保护免于几种生物学侵入，免疫系统由各种细胞和它们 产生的可溶性因子组成。在它们之中，白细胞，特别是淋巴细胞起到重要作用。这种淋巴细 胞被分成两种主要类型，B淋巴细胞(在下文也称为B细胞)和T淋巴细胞(在下文也称 为T细胞)，两者都特异性地识别抗原并作用于它们来防护生物体。在外周部，具有⑶(分化簇)4标记物的⑶4 T细胞或具有⑶8标记物的⑶8 T细 胞占据了 T细胞的大部分。大部分的CD4 T细胞被称为辅助T细胞(在下文中描述为Th)， 涉及抗体生产的辅助和各种免疫反应的诱导，通过抗原刺激分化成Thl型或Th2型，其分别 产生各种细胞因子。大部分CD8 T细胞通过抗原刺激分化成细胞毒性T细胞[Tc 细胞毒T 淋巴细胞；别名杀伤T细胞；在下文中也称为CTL]，其显示细胞毒性活性。作为在外科手术、化学治疗和放射治疗之后对于癌症的第四种治疗，免疫治疗是 令人感兴趣的。免疫治疗利用了人类本来拥有的免疫性，对患者的物理压力与其他疗法相 比更小。转移淋巴因子活化的细胞、NK T细胞、γ δ T细胞等等的疗法，所述细胞是通过对 根据各种方法离体(ex vivo)诱导的CTL、外周血淋巴细胞等等进行扩增获得的，树突状细 胞转移疗法、肽疫苗疗法和Thl细胞疗法，通过所述Thl细胞疗法抗原特异性CTL的体内诱 导是预期的，此外，免疫基因疗法，其中这些细胞离体用预计具有各种效果的基因转导并被 转移到体内，等等，被称为免疫疗法。一种细胞毒性T细胞(CTL)可以通过特异性T细胞受体(在下文中缩写为TCR) 识别复合物，所述复合物是由主要组织相容性复合体(在下文中缩写为MHC)和抗原肽编码 的、主要组织相容性复合体分子(MHC分子，对人类来说称为人类白细胞抗原；在下文中缩 写为HLA)的共轭物，并可以杀死在细胞表面呈递这种复合物的细胞。特异于目标抗原的细胞毒性活性可以通过将识别目标抗原的TCR的基因导入T细 胞例如CTL来赋予。根据这个发现，使用TCR基因的基因疗法正在尝试靶向各种抗原，例 如，MART 1 (非专利文献1)、gpl00 (非专利文献2)和mHAG HA-2抗原(非专利文献3)。此 外，基因疗法正在尝试利用编码来自人类的TCR、来自人类以外的生物体的TCR、识别目标 抗原的抗体的抗原识别点的嵌合受体、一组与TCR缔合来形成抗原识别复合物的分子(例 如，⑶3)、T细胞表面抗原(例如，⑶8和⑶28)和这些的部分的基因，作为要导入T细胞的 受体。纤连蛋白是在血液中、在细胞表面上、在动物组织的细胞外基质中存在的高分子 量糖蛋白，具有250，000的分子量，已知具有多种功能。在转移通过扩增CTL、外周血淋巴细 胞等等获得的淋巴因子活化细胞的免疫治疗中，所述CTL、外周血淋巴细胞等等通过IL-2 和抗⑶3抗体的刺激离体地获得，已经检查了纤连蛋白或其片段对一些问题的作用，例如，如何离体诱导的抗原特异的CTL的扩增时维持细胞毒性活性，以及如何有效地离体扩增淋 巴细胞(例如，专利文献1到3)。近年来，已经报道的是，在免疫治疗中，通过向生物体施用处于更为未分化状态的 幼稚T细胞或中央记忆T细胞，而不是施用终末分化的效应T细胞，可以预期更高得多的治 疗效果(例如，非专利文献4和5)。此外，利用树突状细胞转移疗法、肽疫苗疗法等等，在 其中抗原特异CTL的体内诱导是预期的，例如，在患有进展的癌症、被认为体内具有将成为 CTL的祖代的小群体幼稚T细胞的患者中，常常不能获得足够的效果。专利文献1 :W003/016511 册专利文献2 :W003/080817 册专利文献3 :W0 2005/019450 册非专利文献 1 Journal of Immunology, Volume 163，pp. 507—513 (1999)非专利文献 2 Journal of Immunology, Volume 170, pp. 2186-2194(2003)非专利文献3 :Blood, Volume 103，pp. 3530-3540 (2003)非专 利文献 4 Journal of Clinical Investigation, Volume 115, pp. 1616-1626(2005)非专利文献 5 Journal of Immunology, Volume 175，pp. 739-748 (2005)

发明内容
本发明要解决的问题本发明的目的是提供方便地生产细胞群体的方法，所述细胞群体中导入了期望的 基因，其在通过细胞疗法的疾病治疗中是有用的，以及生产细胞群体的方法，所述细胞群体 中以更高的效率导入了期望的基因。作为解决上述问题的认真研究的结果，本发明人发现，对于在含有纤连蛋白或其 片段和CD3配体的容器中培养的细胞群体，当导入携带期望基因的载体的操作在同一容器 中进行时，基因转移效率相比现有技术提高，完成了本发明。也就是说，本发明涉及[1] 一种生产细胞群体的方法，所述细胞群体中导入了期望的基因，所述方法包括 以下的步骤(1)在含有纤连蛋白或其片段和CD3配体的容器中培养含有T细胞和/或T细胞 的祖细胞的细胞群体的步骤；和(2)向步骤(1)的容器添加携带所述期望的基因的载体的步骤，[2]根据[1]的方法，其中，在步骤O)中，所述载体是逆转录病毒载体，[3]根据[1]的方法，其中，在步骤O)中，在添加载体之后，进行物理地提高载体 和细胞之间的接触频率的操作，[4]根据[3]的方法，其中，通过增加离心力或搅动所述容器的内容物物理地提高 载体和细胞之间的接触频率，[5]根据[1]的方法，进一步包括培养步骤O)中获得的转导的细胞群体的步骤，[6]根据[1]的方法，进一步包括从步骤( 中获得的转导的细胞群体分离期望的 亚细胞群体的步骤，
[7] 一种其中导入了期望的基因的细胞群体，其是可通过根据[1]到[6]的任一项 的方法获得的，[8] 一种药物，包含其中导入了期望的基因的细胞群体作为活性成分，所述细胞群 体是可通过根据[1]到W]的任一项的方法获得的，[9] 一种疾病的治疗或预防方法，包括向受试者施用有效量的其中导入了期望的 基因的细胞群体的步骤，所述细胞群体是可通过根据[1]到[6]的任一项的方法获得的，和[10]其中导入了期望的基因的细胞群体用于制备药物的用途，所述细胞群体是可 通过根据[1]到W]的任一项的方法获得的。发明效果根据本发明的生产方法，提供了含有高比例的其中导入了期望的基因的细胞的群 体。可通过所述生产方法获得的细胞群体在通过细胞疗法的疾病治疗中是极其有用的。附图的简要说明附

图1显示了 hGreen基因转移的效率；禾口附图2显示了 AcGFP基因转移的效率。实施发明的最佳方式在本发明中，“T细胞”是指一种细胞，也称为T淋巴细胞，在涉及免疫反应的淋巴 细胞之中，其来源于胸腺。T细胞包括辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、幼稚T细 胞、记忆T细胞、表达由α链和β链组成的TCR的α β T细胞、以及表达由、链和δ链 组成的TCR的、δΤ细胞。此外，具有分化成T细胞的能力的“Τ细胞的祖细胞”，也可以用 于本发明中。“含有T细胞和/或T细胞的祖细胞的细胞群体”的实例包括外周血单核细胞 (PBMC)、幼稚T细胞、记忆T细胞、造血干细胞、脐带血单核细胞，等等。此外，含有T细胞的 来自造血细胞的多种细胞群体可以用于本发明中。这些细胞可以通过细胞因子例如IL-2 在体内或离体活化。作为这些细胞，从生物体采集的那些、或通过体外培养获得的那些，例 如，通过本发明的方法获得的T细胞群体可以直接使用或在低温保存之后使用。此外，例 如，也可以使用通过多种诱导操作或分离操作从来自生物体的T细胞群体的制品中使用的 细胞获得的细胞群体，例如，通过从细胞如PBMCs分离CD8+或CD4+细胞获得的任何细胞群 体。注意到，在本发明的方法中，为了生产细胞群体，可以使用含细胞的材料，例如，血液，如 外周血和脐带血液，已经除去了例如红细胞或血浆的组分的血液，骨髓溶液等等。在本发明中，“纤连蛋白，，和其片段可以天然地获得或人工地合成，也就是说，非 天然的。纤连蛋白和其片段可以根据例如RuoslahtiE.，et al. Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) ,Volume 256, No. 14, pp7277-7281 (1981)所公开的，从来自天然 来源的物质，以基本上纯的形式制备。在此，此处描述的基本上纯的纤连蛋白或纤连蛋白片 段是指基本上不含有与纤连蛋白天然地在一起存在的其他蛋白质的蛋白。纤连蛋白和其片 段可以分别单独地、或以与几种蛋白质的混合物形式在本发明中使用。此外，可以使用纤连 蛋白片段的单独分子或具有不同结构的复数种片段的组合。注意到，虽然已知纤连蛋白存在许多剪接变体，本发明中使用的纤连蛋白可以是 任何变体，只要它显示了本发明的期望的效果。例如，在纤连蛋白来自血浆的情况下，存在 于细胞结合结构域的上游的称为ED-B的区域、存在于细胞结合结构域和肝素结合结构域 之间的称为ED-A的区域已知被删除；然而，来自血浆的这种纤连蛋白也可以用于本发明5中。可以用于本发明的纤连蛋白片段的有用的信息和片段的制备可以从Journal of Biochemistry(J. Biochem. ), Volume 110, pp284-291 (1991)> EMBO Journal(ΕΜΒ0 J. ) , Volume 4, No. 7， pp1755 — 1759 (1985)、 Biochemistry, Volume 25, No. 17， PP4936-4941 (1986)等等获得。此外，编码纤连蛋白的核苷酸序列和纤连蛋白的氨基酸序列 在 GenBank Accession No. NM_002026 和 NP_002017 中公开。纤连蛋白的结构域结构被分成七个结构域，此外，在其氨基酸序列中含有三种相 似的序列。整体由这些序列的每一种的重复构成。这三种相似的序列被分别称为I型、II 型和III型，在这之中，III型由71到96氨基酸残基组成，这些氨基酸残基的匹配率是17 到40%。在纤连蛋白中，存在14种III型序列，在这之中，第8、9和10种序列(以下分别称 为III-8、III-9和111-10)含在细胞结合结构域中，第12、13和14种序列(以下分别称为 III-12、III-13和111-14)含在肝素结合结构域中。此外，称为IIICS的区域存在于肝素结 合结构域的C-末端。包含具有对VLA-4的结合活性的25个氨基酸的区域，称为CS-1，存在 于IIICS中。可以用于本发明的纤连蛋白片段可以是含有III-7、8、9、11、12、13和CS-I的 任何结构域的片段，此外，可以是其中复数个结构域重复和连接的片段。例如，含有含VLA-5 配体的细胞粘附结构域、肝素结合结构域、为VLA-4的配体的CS-I结构域等等的片段被用 于本发明中。例如,在上述 J. Biochem.，Volume 110，pp284_291 (1991)中描述的 CH-271、 CH-296.H-271和Η496，以及其衍生物和变体被指出作为所述片段的实施例。上述CH-296 是以名称RetroNectin(注册商标)商业上可获得的。在下文中，具体地描述了本发明。1.本发明的生产方法本发明涉及生产细胞群体的方法，所述细胞群体中导入了期望的基因，所述方法 包括以下的步骤(1)在含有纤连蛋白或其片段和CD3配体的容器中培养含有T细胞的细胞群体的 步骤；和(2)向步骤(1)的容器添加携带期望的基因的载体的步骤。注意到，上述步骤(1)可能在此被描述为第一步骤，步骤( 被描述为第二步骤。本发明的方法产生的细胞群体是含有其中导入了期望的基因的T细胞的细胞群 体。对于要导入的期望的基因没有特别的限制，它可以根据基因导入的目的适当地选择。没 有任何特别的限制，编码多肽例如酶、抗体、结构蛋白、细胞因子、趋化因子、毒素或荧光蛋 白的基因，编码反义核酸的基因，产生RNA干扰的RNA，等等，可以通过本发明的方法导入。 在本发明的一个方面中，编码识别期望的抗原的受体的基因被指出作为实例。
上述“识别期望的抗原的受体，，是特异性识别目标抗原的蛋白质。来自人类的T 细胞受体(TCR)，来自人类以外的生物体的TCR，等等，被指出作为识别期望的抗原的受体 的实例。作为TCR，已知的是由α链和β链组成的异二聚体以及由Y链和δ链组成的异 二聚体，两者都可以在本发明中适当地使用。此外，嵌合受体、T细胞表面抗原(例如，CD8、 CD28)和其部分(重组TCR)也可以作为识别期望的抗原的受体适当地使用，在所述嵌合受 体中，这些TCR的抗原识别位点或识别期望的抗原的抗体的抗原识别位点与选自与TCR缔 合的一组分子的一种或更多种成分组合，来形成抗原识别复合物(例如，CD3()。受体可以是由一种分子组成的受体，或由复数种分子组成的同二聚的或异二聚的受体。作为由一种 分子组成的受体，具有scFv(单链Fv)的抗原识别位点的受体也可以适当地使用。虽然不 受特别的限制，识别期望的抗原的受体可以由识别期望的抗原的细胞外结构域、跨膜结构 域和转移信号的细胞内结构域构成，并可以进一步含有铰链或接头结构域。在本发明中，编 码识别期望的抗原的受体的基因是外源基因，是在导入该基因的T细胞中原本不存在或不 表达的基因。也就是说，“编码识别期望的抗原的受体的基因”是指被人工地导入本发明中 使用的T细胞的基因，包括来自与所述T细胞相同物种或不同物种的那些。含有用受体基 因转导的T细胞的细胞群体是含有识别所述期望的抗原的T细胞的细胞群体。所述细胞群 体是与没有导入编码所述受体的基因的细胞群体相比具有对抗原的高特异性的群体，并能 快速地应答所述期望的抗原的刺激。此外，在本发明的生产方法中，可以添加期望的抗原、 公知的蛋白质、细胞因子、趋化因子或其他组分，此外，通过添加分隔或分离步骤，细胞群体 可以被诱导、培养或分离。此外，生产含有这些细胞的细胞群体的方法也被包括在本发明的 方法中。在本发明的生产细胞群体的方法中，优选的是，培养的总时间是4到14天。注意， “培养的总时间”包括步骤(1)和O)，以及，例如，除了上述两个步骤之外为了提高细胞的 数量进行的培养步骤的时间。当培养的总时间是4到14天时，获得的细胞群体是具有提高 的细胞生长速度、提高的幼稚T样细胞的比例和提高的IFN-Y产生水平的细胞群体，适合 于用于细胞治疗的领域。注意的是，当培养的总时间少于4天，不能获得足够用于一般免疫 治疗的细胞数量。在本发明中，培养的总时间更优选的是5到14天，再更优选的7到14天。在本发明的生产细胞群体的方法中，第一步骤是其中含有T细胞的细胞群体被培 养在含有纤连蛋白或其片段和CD3配体的容器中的步骤。在开始培养之后，进行当前步骤 至少一天或更久，更优选的2到7天，再更优选的2到5天。注意的是，在本发明中，在存在 上述活性成分的情况下的培养不仅仅限于这个第一步骤，而根据需要可以对已经导入了期 望的基因的细胞进行。在本发明中，对培养时纤连蛋白、其片段或其混合物的浓度没有特别的限制，但 是，例如，0. 001到500 μ g/mL,特别是0. 01到500 μ g/mL是优选的。在本发明中，CD3配体没有特别的限制，只要它是具有结合CD3的活性的物 质，但是，例如，它可以是抗CD3抗体，特别优选地可以使用抗CD3单克隆抗体。例如， 0KT3 [Science, Volume 206，pp347_349 (1979)]被指出作为实例。对培养基中CD3配体的 浓度没有特别的限制，但是，例如，当使用抗CD3单克隆抗体时，例如，0. 001到100μ g/mL， 特别是0. 01到100 μ g/mL是优选的。另外，在本发明中，根据需要，细胞还可以通过添加其他共同刺激因子，例如⑶观 配体来共同刺激。期望的抗原、糖皮质激素诱导的TNF相关的受体配体(GITRL)、抗0拟8抗 体、⑶80、Β7-1、Β7-2等等被指出作为共同刺激因子的实例。本发明的方法中用于生产细胞群体使用的培养基没有特别的限制，只要它含有上 述活性成分，但可以使用通过混合T细胞扩增所必需的成分制备的公知的培养基。例如， 可以选择商业上可获得的培养基并适当地使用。这些培养基除了其原始成分之外可以含 有细胞因子、合适的蛋白质和其他成分。作为细胞因子，例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、 IFN-y等等被指出作为实例。优选的，使用含有IL-2的培养基。对培养基中IL-2的浓度没有特别的限制，但是其可以是，例如，优选的0.01到lX105U/mL，更优选的1到IXlO4U/ mL。此外，作为合适的蛋白质，例如，抗IL-4抗体被指出作为实例。此外，也可以添加淋巴 细胞刺激因子，例如凝集素。此外，虽然其中要导入期望的基因的细胞可以在转导之前通过 添加γ δ T细胞活化因子来活化，它也可以在转导之后活化。对γ δ T细胞活化因子没有 特别的限制，只要它们显示了对Y S T细胞的活化作用和生长促进作用，但是，例如，它们 可以是二膦酸的化合物，例如，帕米膦酸(pamidronate)和唑来磷酸(zoledronate)，焦磷 酸单酯化合物，例如异戊烯焦磷酸和2-甲基-3- 丁烯基-1-焦磷酸、phosphohalohydrins、 phospho印oxides，等等。对培养基中的组分的浓度没有特别的限制，只要获得了期望的效^ ο此外，血清或血浆可以添加到培养基中。虽然对添加到培养基中的数量没有特别 的限制，按体积0%到按体积20%作为实例给出，此外，使用的血清或血浆的数量可以取决 于培养阶段而变化。例如，以逐步的方式降低血清或血浆浓度是可能的。注意的是，血清或 血浆的来源可以是自体的(意味着所述来源与培养的细胞相同)或非自体的(意味着所述 来源与培养的细胞不同)；然而，从安全性的角度，适当地使用来自自体来源的那些。虽然对在本发明中培养的开始时细胞的数量没有特别的限制，其可以是，例如，优 选的10个细胞/mL到IX IO8个细胞/mL，更优选的IO2个细胞/mL到5 X IO7个细胞/mL， 再更优选的IO3个细胞/mL到2X IO7个细胞/mL。此外，对培养条件没有特别的限制，可以 使用用于细胞培养的常规的条件。例如，在如37°C和5% CO2的条件下培养在此是可能。此 外，以合适的间隔时间，通过添加新鲜的培养基来稀释细胞培养溶液，置换培养基，或置换 细胞培养工具是可能的。对本发明的细胞群体生产方法中使用的细胞培养工具没有特别的限制，但是，例 如，可以使用平板、烧瓶、袋子、大的培养容器、生物反应器，等等。注意的是，可以使用0)2气 体可渗透的细胞培养袋作为袋子。此外，当商业上制备大量细胞群体时，可以使用大的培养 容器。此外，虽然培养可以在开放系统或封闭系统中进行，从获得的细胞群体的安全性的角 度，优选的是在封闭系统中进行培养。注意的是，除了被溶解以共存于培养基中之外，纤连蛋白或其片段和CD3配体、其 他共同刺激因子、合适的蛋白质、细胞因子或培养基中含有的其他组分也可以固定在合适 的固相上，例如，细胞培养工具(包括用于开放系统和封闭系统的)，例如平板、烧瓶和袋 子、细胞培养支持物，例如珠子、膜或载玻片。对这些固相的材料没有特别的限制，只要它可 以用于细胞培养。当各种成分被固定在培养工具或细胞培养支持物上时，优选的，在培养中 使用的组分的数量与培养基的数量的比例被调节到与组分溶于培养基时使用的浓度相同 的比例；然而，这种比例没有限制，只要获得的期望的效果。对将纤连蛋白或其片段、CD3配体或其他组分固定在固相上的方法没有特别的限 制，但是，例如，这些物质可以通过在适当的缓冲溶液中使它们与固相接触来固定。此外，对于纤连蛋白的片段在固相上的固定，固定也可以根据WO 97/18318册和 WO 00/09168册中描述的方法来进行。当如上所述的各种组分或本发明中使用的活性成分在固相上固定时，活性成分等 等可以通过在根据本发明的方法培养T细胞群体之后仅仅从固相中分离T细胞群体来截 留，其可以防止活性成分等等混合到T细胞群体中。
在本发明生产细胞群体的方法中，第二步骤是一种步骤，其中带有期望的基因的 载体被添加到第一步骤的容器中，来将基因导入细胞。也就是说，第一步骤和第二步骤在相 同的容器中进行，不更换容器。载体的添加不限于一次，在第二步骤期间载体可以添加几 次。载体的添加可以通过合适的途径进行，例如，将含有载体的溶液添加到容器中的培养溶 液中，或用含有载体的培养基替换容器中的培养基。虽然对要导入细胞的期望的基因的数量没有限制，它可以是一种基因，或包括几 种基因的复数种基因。例如，根据要转导的细胞，可以同时地、预先地或随后地导入适合的 基因，如编码T细胞表面抗原的基因。例如，在α β TCR基因被导入γ δ T细胞中的情况下， 优选的是除了该基因之外还导入编码⑶8的基因。在本发明中，对携带期望的基因的载体没有特别的限制，但是，它可以选自公知的 载体并适当地使用。例如，利用病毒载体的方法和利用非病毒载体的方法都可以用于本发 明中。对于这些方法的细节已经公开了各种文献。虽然对上述病毒载体没有特别的限制，转导方法中通常使用的公知的病毒载体 可以使用，例如，逆转录病毒载体(包括慢病毒载体、伪型载体)、腺病毒载体、腺病毒相 关病毒载体、猿猴病毒载体、牛痘病毒载体、仙台病毒载体，等等。优选的，可以使用逆转 录病毒载体、腺病毒载体或慢病毒载体。作为病毒载体，缺乏复制能力、其在感染的细胞 中的自我复制被抑制的病毒载体是适合的。此外，用于改善基因转移效率的物质，例如， RetroNectin(注册商标，Takara Bio Inc.制造)也可以在转导时使用。虽然对本发明中使用的非病毒载体没有限制，例如，质粒载体可以用作非病毒载 体，并通过利用载体如脂质体、配体-聚赖氨酸等等的方法，或磷酸钙方法、电穿孔方法或 颗粒枪方法等等来导入。在本发明中，在存在纤连蛋白或其片段和CD3配体的情况下将期望的基因导入细 胞。本发明中使用的纤连蛋白或其片段具有提高逆转录病毒载体或慢病毒载体的基因转移 效率的作用。此外，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以将载体中的外源基因稳定地导入要 导入所述载体的细胞的染色体DNA中，并被用于基因治疗等等的目的。由于载体可以感染 处于分裂或生长中的细胞，它们特别适合于在本发明的生产方法的步骤中进行转导。例如，期望的基因可以被插入载体、质粒等中，用来表达处在适合的启动子控制下 的基因。此外，为了实现基因的高效转录，与启动子或转录起始位点协作的其他调节元件， 例如，增强子序列和/或终止子序列可以在载体中存在。此外，为了通过同源重组插入转导 目标T细胞的染色体，例如，基因可以置于侧翼序列之间，所述侧翼序列包含分别同源于染 色体中基因的期望目标插入位点两端存在的核苷酸序列。虽然第二步骤可以在第一步骤开始一定时间之后进行，它也可以与第一步骤的开 始同时地进行。在后一种情况中，含有T细胞的细胞群体和携带期望的基因的载体同时地 添加到含有纤连蛋白或其片段和CD3配体的容器中。在本发明的优选的方面，但不是限制 本发明，第二步骤在进行第一步骤之后至少一天或更久进行，更优选的1到7天，再更优选 的2到5天。所述第二步骤，但不是限制本发明，一般在进行第一步骤之后进行1到3天， 优选的1到2天。此外，为了在第二步骤中提高细胞和病毒之间的接触频率，物理地提高载体和细 胞之间的接触频率的操作可以在添加载体之后进行。例如，载体和细胞之间的接触频率可以通过向容器添加离心力来将载体和细胞移动到容器的底面，和通过搅动容器的内容物来 提高。内容物的搅动可以优选地通过振动或摇动容器来进行。向细胞中的基因转移效率 通过这些操作进一步提高。作为优选的方面，向含有载体的容器添加离心力被指出作为实 例。虽然要添加的离心力没有特别的限制，只要它处在细胞不承受过度的损伤和基因转移 效率改善的范围之内，一般地，250到2000Xg和优选的500到1500Xg是优选的。此外，3 到120分钟和特别是5到60分钟是添加离心力的合适的持续时间。本发明的方法特征在于在含有纤连蛋白或其片段和CD3配体的容器中培养含有 要被转导的T细胞的细胞群体，随后在同一容器中进行向细胞群体的转导。通常，在存在合 适的刺激因子的情况下进行预培养细胞，然后，细胞转移到另一个容器进行转导。根据本发 明，由于转移的细胞的损失或不必要的刺激可以被避免，基因转移的效率可以改善。特别 地，本发明的方法适合于利用封闭系统的培养容器的转导，例如细胞培养袋子。本发明用于生产细胞群体的方法可以进一步包括培养第二步骤中获得的转导的 细胞的步骤作为第三步骤。也就是说，载体可以在完成第二步骤之后移除(例如，通过用没 有载体的培养基置换培养基)，细胞的培养可以继续。上述步骤可以通过细胞培养的常规方法进行，例如，公知的T细胞培养方法。细胞 的培养可以在与上述第一步骤相同的条件下进行，或在除了在上述方法中使用纤连蛋白或 其片段和CD3配体作为活性成分之外与第一步骤中使用的条件类似的条件下进行。此外，本发明的生产方法也可以包括在每个步骤之前或之后将细胞群体分离成期 望的亚细胞群体的步骤。例如，如上所述，高比例的幼稚T样细胞被含在通过在存在本发明 的活性成分的情况下培养获得的细胞群体中。因而，通过进一步分离和获得表达期望的表 面抗原标记物的细胞，可以获得幼稚T样细胞或以更高比例含有幼稚T样细胞的T细胞群 体。此外，表达期望的基因的细胞可以在本发明的生产方法的第二步骤之后分离和获得。虽 然对分离操作没有特别的限制，分离可以通过利用例如细胞分选仪、磁性珠子、柱等等通过 公知的方法进行。此外，当有适合的手段时，可以选择含有导入了受体基因的细胞的亚细胞 群体。此外，通过从本发明的方法产生的细胞群体克隆T细胞，也可能维持稳定的T细 胞。此外，通过本发明的方法获得的细胞群体也可以用于通过本发明的方法或公知的方法 的另外培养来获得新的细胞群体。本发明的方法获得的细胞群体含有高比率的表达⑶45RA和表达⑶62L或CCR7的 细胞，也就是说，幼稚T样细胞，其是未分化的T细胞。虽然细胞群体的细胞毒性活性也可 以通过公知的体外测试来评估，通过本发明的生产方法获得的细胞群体在这样的评估系统 中不一定展现高细胞毒性活性，因为如上所述的本发明获得的T细胞群体以高比率含有未 分化的幼稚T样细胞。此外，与常规方法制备的细胞群体相比，本发明的方法生产的细胞群体具有生物 体中极好的生存力，在生物体中保持针对同一物种或不同物种的抗原的高活性。因此，本发 明的方法是用于过继性免疫疗法的新的T细胞扩增方法，包括用纤连蛋白或其片段刺激细 胞和导入期望的基因的步骤，本发明的方法获得的转导的T细胞被有效地移植到生物体中 并维持。也就是说，本发明的方法可以提供用于细胞治疗的细胞群体，其可以在生物体中维 持在高浓度很长时间，并且是更有用的，可以广泛地应用于基于T细胞的所有基因治疗方法。2.本发明的细胞群体、药物、治疗方法或预防方法和用途本发明的方法生产的细胞群体是可以取决于导入的基因显示期望的效果的细胞 群体。此外，与常规方法制备的细胞群体相比，维持了期望的基因的比例更高。例如，其中 导入了编码识别期望的抗原的受体的基因的细胞群体对于治疗多种疾病是有用的，因为它 展现了针对细胞的细胞毒性活性，所述细胞呈递由导入的受体基因编码的受体所识别的抗 原。虽然对于施用细胞群体的疾病没有特别的限制，例如，癌症(白血病、实体肿瘤等等)、 肝炎、由病毒引起的传染性疾病(流感病毒、HIV等等)、细菌(结核分枝杆菌、MRSA、VRE等 等)、真菌(曲霉属、假丝酵母属、隐球菌属等等)被指出作为实例。此外，本发明的方法生 产的细胞群体也可以用于在骨髓移植或辐射、用于缓解复发的白血病的供体淋巴细胞输注 等等之后的传染性疾病预防。此外，本发明提供了包含上述细胞群体作为活性成分的药物组合物(治疗试剂)。 含有细胞群体的治疗试剂适用于免疫治疗中。在免疫治疗中，例如，经由穿静脉的、穿动脉 的、皮下的、腹膜内的等的注射或滴注，施用适合于患者的治疗的T细胞。在上述疾病或供 体淋巴细胞输注的运用中，所述治疗试剂是极其有用的。根据药物领域中公知的方法，通 过与适合于胃肠外施用的公知的有机或无机载体、稀释剂、稳定剂等等混合作为活性成分 的本发明的方法制备的T细胞群体，所述治疗试剂可以被制备为，例如，滴注试剂或可注射 的。注意的是，本发明的细胞群体在治疗试剂中的含量、治疗试剂的剂量和治疗试剂的条 件可以根据公知的免疫疗法适当地确定。例如，虽然对药物中本发明的T细胞群体的含量 没有特别的限制，例如，其可以是优选的ι χ IO3到1 X IO11个细胞/mL、更优选的1 X IO4到 IX IOltl个细胞/mL，再更优选的IX IO5到IX IO9个细胞/mL。此外，虽然对本发明的药物 的剂量没有特别的限制，例如，其可以是对于成年人优选的IXlO6到IXlO12个细胞/天、 更优选的IXlO7到5X IO11个细胞/天，再更优选的IX IO8到2X IO11个细胞/天。此夕卜， 可以使用用所述治疗试剂的免疫疗法与通过施用公知药物的药物治疗或通过放射治疗或 外科手术的治疗的组合。此外，本发明提供了包含所述细胞群体作为活性成分的诊断试剂。例如，通过用本 发明的诊断试剂分析和筛选获自患者的细胞，容许对治疗效果、有效转基因的选择等等的 推断。本发明进一步提供了疾病的治疗方法或预防方法，包括向受试者施用有效量的通 过上述方法获得的细胞群体。虽然对此处的受试者没有特别的限制，优选的，患有上述疾病 的生物体(例如，人类患者或非人动物)被指出，为所述疾病施用本发明的方法制备的T细 胞群体。注意的是，含有其中导入了编码T细胞受体的基因的细胞群体作为活性成分的本 发明的治疗试剂，被施用给表达HLA分子的受试者，所述HLA分子相同于所述细胞群体表达 的HLA分子、或具有与所述细胞群体表达的HLA分子的最多三个基因座错配。此外，此处的有效量是T细胞群体的数量，与没有施用所述T细胞群体的受试者 相比，当所述T细胞群体被施用给受试者时所述数量发挥治疗或预防效果。虽然具体的有 效数量可能取决于剂型、施用方法、使用目的、受试者的年龄和体重、症状等等而变化，优选 的，它是类似于上文所述的药物的。施用方法也没有限制，但是，类似于上述药物，例如，通 过滴注、注射等等的施用是优选的。
此外，通过提供用至少一种刺激因子刺激的、通过如上所述的本发明的生产方法 获得的细胞群体，本发明可以生产含有活化的T细胞的细胞群体，所述至少一种刺激因子 选自由具有呈递抗原的能力的细胞、呈递抗原的细胞、抗原、CD3配体、CD28配体、细胞因 子、趋化因子或具有生产细胞因子能力的细胞构成的组。此外，本发明提供了通过上述生产 方法获得的细胞群体。含有上述获得的活化的T细胞的细胞群体可以用作药物组合物的 活性成分，类似于上述生产方法获得的T细胞群体。在此，对刺激因子的刺激没有特别的限 制，只要它是如下刺激，在其中通过所述刺激因子、本发明的生产方法获得的上述细胞群体 被活化，但是，例如，刺激可以通过在同时存在本发明的生产方法获得的T细胞群体和所述 刺激因子的情况下进行培养来提供。在本说明书中，对具有呈递抗原的能力的细胞没有特别的限制，只要它是一般被 用作抗原呈递细胞的细胞，但是，例如，树突状细胞、Y S T细胞、单核细胞、B细胞、T细胞、 巨噬细胞、成纤维细胞、郎格罕氏细胞和含有至少一种上述细胞的细胞群体，以及特别优选 的，树突状细胞、Y S T细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和含有至少一种上述细胞 的细胞群体被提出作为实例。此外，虽然具有呈递抗原的能力的细胞的来源可以是对于要 施用的患者是自体的或非自体的，自体的来源是优选的。在此，具有呈递抗原的能力的细胞 是指具有呈递抗原的能力的细胞，而不是呈递着抗原的细胞。在本说明书中，作为呈递着抗原的细胞，可以使用已经人工添加了合适的抗原的、 具有呈递上述抗原的能力的细胞，其中被导入基因以表达抗原的细胞，或采集自生物体、已 经呈递着抗原的细胞的任一。在本说明书中，对呈递的抗原没有特别的限制，只要它容许肽被呈递在抗原呈递 细胞上或被T细胞识别，容许T细胞被有效地活化，但是，例如，肽、糖肽、肿瘤细胞提取物、 肿瘤细胞超声降解物和肿瘤细胞热水提取物、来自病毒的核酸(DNA和RNA)等等、细菌、蛋 白质等等，被指出作为实例。此外，在此，提及的⑶3配体和⑶观配体被指出作为⑶3配体和⑶观配体的实例。 注意的是，通过向通过本发明的生产方法获得的细胞群体提供抗CD3抗体和抗CD^抗体的 共同刺激，可以制备具有细胞因子生产能力的活化的淋巴细胞群体。在本说明书中，细胞因子没有特别的限制，只要它可以作用于和活化T细胞，然 而，例如，IL-2、IFN-γ、TGF-β、IL-15、IL-7、IFN-α、IL-12、CD40L、IL-27 等等被指出作 为实例，从增强细胞免疫的角度来看，IL-2.IFN-Y和IL-12特别优选地被指出作为实例。在本说明书中，对趋化因子没有特别的限制，只要它作用于T细胞并展现迁移活 性，然而，例如，RANTES、CCL2UMIPl α ,MIPl β、CCL19、CXCL12、IP-IO 和 MIG 被指出作为实 例。在本说明书中，对具有产生细胞因子的能力的细胞没有特别的限制，只要它是具 有产生细胞因子的能力的细胞，但是，例如，从增强细胞免疫的角度来看，Thl细胞被指出作 为实例。通过向通过本发明的生产方法获得的T细胞群体添加抗原刺激，容许有用的抗原 特异性CTL的诱导，具有极高的细胞毒性活性和高抗原识别能力。此外，除了上述刺激因子 之外，培养可以在存在上述纤连蛋白、其片段或其混合物、或用于T细胞的培养的已知组分 的情况下进行。在本发明中生产的T细胞群体可以在生物体中长时间存活，是具有高治疗12效果的极其有用的T细胞群体。注意的是，在本说明书中，细胞或细胞群体的生产与细胞或细胞群体的培养是同 义的，是指一种过程，其包括细胞或细胞群体的诱导(活化)、维持、扩增的每个步骤，或组 合了这些步骤的步骤。实施例以下，将通过给出实施例来更具体地描述本发明；然而，本发明不仅仅限于以下实 施例。此外，在本说明书中描述的操作之中，基础的操作是根据在ColdSpring Harbor Laboratory, 2001 出片反白勺、T. Maniatis 入 IS 胃白勺 Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd ed.中描述的方法。实施例1 用ZsGreen表达逆转录病毒载体的转导的细胞的制备(1)病毒载体的制备ZsGreen表达逆转录病毒载体如下制备首先，使用具有SEQ ID 1的核苷酸序列 的A2引物和具有SEQ ID 2的核苷酸序列的ZsGreen引物，用pZsGreen (Clontech制造的) 作为模板进行PCR，获得含有编码hGreen的区域的扩增片段。这个片段插入到文献(Gene Therapy，February 21st，2008，online edition (PMID : 18288212))中描述的人类 T 细胞受 体表达载体MS-Wa的TCR受体β亚基基因的下游来获得pMS-abZ。(2)生产者细胞的制备从用 Retrovirus Packaging Kit(Takara Bio Inc.，Shiga, Japan 制造的)中含 有的质粒pGP和pE-eco、以及pMS-abZ转化的细胞制备嗜亲性逆转录病毒。在生产者 细胞PG13(ATCC# :CRL-10686)用获得的嗜亲性逆转录病毒感染三次之后，通过限制性稀释 来选择克隆来获得MS-abZ生产细胞。(3)病毒溶液的制备在从MS-abZ生产细胞系的培养物除去上清液之后，用5mL的PBS (磷酸盐缓冲盐 水)洗涤样品一次，MS-abZ生产细胞在室温下用1. 5mL胰蛋白酶/EDTA处理一分钟，悬浮 在含有10%胎儿牛血清和50单位/mL青霉素-50 μ g/mL链霉素的DMEM中。以5X IO6细 胞每一个Φ IOOmrn平皿(Iwaki制造的)进行接种。在培养M小时之后，除去培养物上清 液，将含有5mM 丁酸钠的SmL新鲜培养基添加到平皿中。进一步进行培养M小时，回收上 清液，用0. 45 μ m滤器过滤，保存在_80°C。这种上清液用作随后的实验中的MS-abZ病毒溶 液。(4)hGreen转导的细胞的制备在PBS中溶解纤连蛋白片段(ItetroNectin，Takara Bio Inc.制造的)达到25 μ g/ mL，抗 CD3 抗体(0KT3, Janssen Pharmaceutical K. K.)达至Ij 5 μ g/mL。以 0. 4mL/ 反应孑L 添加这种溶液到组织培养物处理的12孔平板中，容许在室温保持5小时。此后，除去溶液， 以ImL/孔用PBS洗涤平板两次，然后，通过添加ImL/孔的RPMI 1640并洗涤平板，获得纤 连蛋白片段/抗⑶3抗体固定的平板。此外，作为转导方法的阳性对照，在转导时将细胞重 新平板接种到另一个转导病毒结合平板上的方法(RN结合方法)中所使用的用于细胞的平 板，如下制备。纤连蛋白片段/抗⑶3溶液以1. 2mL/孔添加到组织培养物处理的6孔平板 中，容许在室温下保持5小时。此后，除去溶液，以2mL/孔用PBS洗涤平板两次，然后，通过添加2mL/孔的RPMI 1640来洗涤平板，获得纤连蛋白片段/抗CD3抗体固定的平板。在RN结合方法中使用的平板如下制备纤连蛋白片段溶于PBS中达到20μ g/mL，这个溶液以ImL/孔添加到未用组织培养 物处理的12孔平板，容许在4°C保持过夜。在除去溶液之后，PBS (2mL/孔)用于洗涤平板 两次，3mL两倍稀释的MS-abZ病毒溶液添加到反应孔，在32°C、2000Xg进行离心2小时。 在离心之后，除去病毒溶液，含有1.5%人血清白蛋白(HSA)的PBS(3mL/孔)洗涤平板两次 来制备病毒结合平板。在含有1 % 自体血菜、600IU/mL IL_2、0. 2 % HSA 和 2· 5 μ g/mLFungizone 的 GT-T503培养基(Takara Bio Inc.制造)中悬浮人类外周血单核细胞(PBMC)以达到 0. 3X IO6个细胞/mL，这个悬浮液添加到纤连蛋白片段/抗⑶3抗体固定的平板上，获得 0. 75mL/cm2来启动培养。转导操作如下进行。在细胞平板接种到纤连蛋白片段/抗CD3抗体固定的平板上 之后，在第0天、第1天和第2天将MS-abZ病毒溶液添加到每个反应孔以稀释两倍，容许保 持、或在1000 Xg离心1小时，进一步按原样培养直到第3天。在第3天，回收细胞，制备来 获得2 X IO5个细胞/mL，2mL的这种细胞悬浮液重新平板接种到M孔平板上，在(X)2孵化器中培养。相反，在RN结合方法中，在存在纤连蛋白片段/抗CD3抗体的情况下培养了 3天 的PBMC，被制备来分别获得1 X IOVcm2和2 X IO6个细胞/mL，2mL的这种细胞悬浮液添加到 病毒结合平板。平板在32°C、1000Xg离心10分钟之后，在37°C在CO2孵化器中进行培养 4小时。制备培养的细胞，以获得2X IO5个细胞/mL，2mL的这种细胞悬浮液平板接种到M 孔平板，在CO2孵化器中培养。在PBMC培养开始的第7天回收培养的细胞，以hGreen阳性细胞的比例来测量基 因转移效率。基因转移效率的测量结果在附图1中示出。对于基因转移效率，在从培养开始的 第1天添加病毒溶液的样品中观察到提高，在第2天添加溶液的样品中有更多的提高。此 外，当在添加病毒溶液之后增加离心操作时，基因转移效率进一步提高。实施例2 重复转导的作用(I)AcGFP表达病毒载体的制备AcGFP表达载体MT-AcGFP如下制备首先，利用具有SEQ ID 3的核苷酸序列的 AcGFP5引物和具有SEQ ID 4的核苷酸序列的AcGFP3引物，用pIRES2_AcGFP 1 (Clontech 制造的)作为模板进行PCR来获得扩增片段。将这个片段插入到pMT载体[在Gene TherapyVolume 7，pp797-804(2000)中描述的 pM 载体]的 MluI-BglII 位点来制备 pMT-AcGFP。(2)生产者细胞的制备从用 Retrovirus Packaging Kit (Takara B io Inc. , Shiga，Japan 制造的)中含 有的质粒pGP和pE-eco、以及pMT-AcGFP转化的细胞制备嗜亲性逆转录病毒。在用获 得的嗜亲性逆转录病毒感染生产者细胞PG13(ATCC# :CRL-10686)三次之后，通过限制稀释 获得几个克隆。根据通过实时PCR测量培养物上清液中病毒RNA的数量的结果选择克隆， 与上清液接触的培养细胞的AcGFP表达数量的测量结果充当指示物，来获得MT-AcGFP生产细胞。(3)病毒溶液的制备用与实施例1(3)相似的方法制备表达AcGFP的逆转录病毒。获得的上清液用作 随后的实验中的MT-AcGFP病毒溶液。(4) AcGFP转导的细胞的制备如实施例1(4)中描述的，纤连蛋白片段/抗⑶3抗体溶液以1.2mL/孔添加到组 织培养物处理的6孔平板，容许在室温保持5小时。此后，除去溶液，用PBS洗涤平板两次 (2mL/孔)，然后，通过添加aiiL/孔的RPMI1640来洗涤平板，获得纤连蛋白片段/抗⑶3抗 体固定的平板。在含有1 % 自体血菜、600IU/mL IL_2、0. 2 % HSA 和 2· 5 μ g/mLFungizone 的 GT-T503培养基(Takara Bio Inc.制造的)中悬浮PBMC以获得0. 3X IO6个细胞/mL，这 种悬浮液添加到纤连蛋白片段/抗⑶3抗体固定的平板以获得0. 75mL/cm2。(5)转导操作在将细胞平板接种到纤连蛋白片段/抗CD3抗体固定的平板上之后，在第2天将 MT-AcGFP病毒溶液添加到反应孔以稀释两倍，在1000 Xg离心一小时，培养直到第3天。此 外，在进行第二次转导操作的条件中，重复与第3天的相类似的操作。在第3天，如果转导 操作进行一次或两次，分别在第3天或第4天回收细胞，并制备来获得2 X IO5个细胞/mL， 其中2mL重新平板接种到M孔平板上并在CO2孵化器中培养。在从PBMC培养开始的第8天，回收培养的细胞，以AcGFP阳性细胞的比例来测量 基因转移效率。基因转移效率的测量结果在附图2中示出。对于AcGFP阳性率，在纤连蛋白片段 /抗⑶3抗体固定的平板的情况下，通过向同一平板重复病毒添加，观察到基因转移效率的提尚。实施例3 通过利用逆转录病毒载体的转导的细胞的制备在PBS 中溶解纤连蛋白片段 CH-296 [RetroNectin (注册商标)，Takara Bio Inc. 制造的]，以获得 25 μ g/mL，溶解抗 CD3 抗体(0KT3, Janssen Pharmaceutical K. K.)以获 得5 μ g/mL。以0. 4mL/反应孔添加这种溶液到组织培养物处理的12孔平板中，容许在室 温保持5小时。此后，除去溶液，用0. 5mL PBS洗涤反应孔两次，然后，用RPMI1640培养基 0. 5mL洗涤来获得OH96/抗⑶3抗体固定的平板。在含有1 %自体血浆、600IU/ml IL-2、 0. 2% HSA 和 2. 5 μ g/mLFungizone 的 GT-T503 培养基(Takara Bio Inc.制造的)(以下由 培养基表示)悬浮人类外周血单核细胞(PBMC)以获得0. 3 X IO6个细胞/mL，3mL的细胞悬 浮液添加到CH196/抗⑶3抗体固定的12孔平板，在37°C和5% CO2的条件下进行培养。作为对照1，在含有30ng/mL 0KT3的培养基中悬浮PBMC以获得0. 3 X IO6个细胞 /mL, 3mL的细胞悬浮液添加到12孔平板，在37°C和5% CO2的条件下进行培养。作为对照2，0KT3以5 μ g/mL的浓度固定在组织培养物处理的12孔平板上，在培 养基中悬浮PBMC以获得0. 3 X IO6细胞/mL，在37°C和5% CO2的条件下进行培养。作为对照3，在培养基中悬浮PBMC以获得0. 3 X IO6个细胞/mL，悬浮抗⑶3抗体/ 抗 CD^ 抗体固相珠子(Dynabeads M450CD3/CD28T-cell Expander, hvitrogen 制造的) 以获得0. 3 X IO6个细胞/mL，3mL的细胞悬浮液添加到12孔平板，在37°C和5% CO2的条件下进行培养。在开始培养的第2天，从每个孔除去1. 5mL的上清液，添加实施例2中制备的 1. 5mL MT-acGFP病毒溶液，在32°C、1000Xg的条件下进行转导1小时，在第3天和第7天 进行细胞培养物溶液的稀释，在第7天用流式细胞计作为^Green阳性细胞的比例分析基 因转移效率。此外，在第10天，回收细胞，通过锥虫蓝染色对细胞的数目计数，10天培养的 扩增速度根据第3天和第7天的稀释比来计算。分别地，基因转移效率的测量结果在表1 中示出，细胞生长速度在表2中示出。表1 在每种条件下的基因转移效率
权利要求
1.一种生产细胞群体的方法，所述细胞群体中导入了期望的基因，所述方法包括以下 的步骤(1)在含有纤连蛋白或其片段和CD3配体的容器中培养含有T细胞和/或T细胞的祖 细胞的细胞群体的步骤；和(2)向步骤(1)的容器添加携带所述期望的基因的载体的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中，在步骤O)中，所述载体是逆转录病毒载体。
3.根据权利要求1的方法，其中，在步骤( 中，在添加载体之后，进行物理地提高载体 和细胞之间的接触频率的操作。
4.根据权利要求3的方法，其中通过添加离心力或搅动所述容器的内容物物理地提高 所述载体和所述细胞之间的接触频率。
5.根据权利要求1的方法，进一步包括培养步骤( 中获得的转导的细胞群体的步骤。
6.根据权利要求1的方法，进一步包括从步骤O)中获得的转导的细胞群体分离期望 的亚细胞群体的步骤。
7.一种其中导入了期望的基因的细胞群体，其是可通过根据权利要求1到6的任一项 的方法获得的。
8.—种药物，包含其中导入了期望的基因的细胞群体作为活性成分，所述细胞群体是 可通过根据权利要求1到6的任一项的方法获得的。
9.一种疾病的治疗或预防方法，包括向受试者施用有效量的其中导入了期望的基因的 细胞群体的步骤，所述细胞群体是可通过根据权利要求1到6的任一项的方法获得的。
10.其中导入了期望的基因的细胞群体用于生产药物的用途，所述细胞群体是可通过 根据权利要求1到6的任一项的方法获得的。
全文摘要
公开的是生产其中导入了期望的基因的细胞群体的方法，其特征在于包括以下的步骤(1)和(2)(1)在含有纤连蛋白或其片段和CD3配体的容器中培养含有T细胞和/或T细胞的祖细胞的细胞群体；和(2)向步骤(1)的容器添加携带期望的基因的载体。通过在同一容器中进行步骤(1)和(2)，可以以高效率实现基因转移。
文档编号C12N15/09GK102046780SQ200980119390
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月27日 优先权日2008年3月27日
发明者加藤郁之进, 后藤优美, 峰野纯一, 户坂泰弘, 糠谷育卫 申请人:宝生物工程株式会社