具有用于钴(i)胺素依赖性甲硫氨酸合酶的再激活系统的微生物的制作方法

专利名称：具有用于钴(i)胺素依赖性甲硫氨酸合酶的再激活系统的微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于产生甲硫氨酸的微生物。本发明特别是涉及棒状细菌如谷氨酸 棒杆菌(Corynebacterium glutanicum)和埃希氏菌属的细菌如大肠杆菌(Eschericia coli)，它们已经被遗传修饰以产生甲硫氨酸。
背景技术：
目前，甲硫氨酸在世界范围的年生产是约500，000吨。甲硫氨酸是禽类家畜和饲 料中的第一种限制性氨基酸，并且因为这个原因，其主要作为饲料补充物应用。与其他工业氨基酸相反，甲硫氨酸几乎独有地作为由化学合成产生的D-和L-甲 硫氨酸的外消旋物进行应用。由于动物可以代谢甲硫氨酸的两种立体异构体，可以直接饲 喂化学产生的外消旋混合物(D' Mello 和 Lewis，Effect of Nutrition Deficiencies in Animals :Amino Acids, Rechgigl (编著)，CRC Handbook Series in Nutrition and Food, 441-490，1978)。然而，在以独有地产生L-甲硫氨酸的生物技术方法来替代现有化学生产法方面 仍存在巨大的兴趣。这是由于以下事实在较低的补充水平上，L-甲硫氨酸是比D-甲硫氨 酸更好的硫氨基酸来源(Katz 和 Baker (1975) Poult. Sci. 545 :1667-74)。1667-74)。另外， 化学方法使用相当有害的化学品并产生大量的废物流。化学生产的全部这些缺点都可以通 过高效生物技术方法来避免。精细化学品如氨基酸、芳族化合物、维生素和辅因子的发酵生产如今一般在微 生物中进行，如谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒 裂殖酵母(Schizzosaccharomycs pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、黑曲 霉(Aspergillus niger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。氨基酸如谷氨酸因而使用发酵方法产生。已经证明某些微生物如大肠杆菌 (E. coli)和谷氨酸棒杆菌(C. glutamic·)对于这些目的是特别合适的。通过发酵产生氨 基酸也具有以下优点仅产生L-氨基酸并且避免了造成环境问题的化学品如溶剂，因为它 们一般用于化学合成中。现有技术中一些在微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中产生精细化学品如氨基 酸、脂类、维生素或糖类的尝试已经试着通过例如增加涉及相应精细化学品生物合成途径 的基因的表达来实现这个目标。通过上调涉及例如赖氨酸产生的生物合成途径的基因表达而增加赖氨酸产生的 尝试例如在 WO 02/10209、WO 2006008097、W02005059093 或 Cremer 等人(Appl. Environ. Microbiol, (1991)，57 (6)，1746-1752)中描述。然而，在鉴定代谢途径中可以用来有益地影响微生物如谷氨酸棒杆菌中甲硫氨酸 产生的其他靶方面存在着持续的兴趣。
发明目的和概述本发明的一个目的是提供在微生物中生产L-甲硫氨酸的方法。本发明的又一个目的是提供生产L-甲硫氨酸的微生物。将在后续描述中变得明显的本发明的这些及其他目的是通过独立权利要求的主 题来达成的。本发明的一些优选的实施方案在从属权利要求中阐述。根据本发明的一个方面，考虑了在微生物中生产L-甲硫氨酸的方法，该方法包括 培养微生物的步骤，所述微生物通过遗传修饰而衍生自起始生物体，从而所述微生物与所 述起始生物体相比具有增加量和/或活性的钴(I)胺素依赖性甲硫氨酸合酶I (MetH)再激 活系统。所述方法可以利用选自包含肠杆菌属(Eneterobacteria)、棒杆菌属 (Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)禾口链霉菌属 (Streptomyces)微生物的组中的微生物。特别优选使用物种谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。在本发明生产甲硫氨酸的优选方法之一中，使用了钴(I)胺素依赖性再激活系 统，其使用至少一种电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段；和/或至少一种电子转移还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段。在这些方法中，所述钴(I)胺素依赖性再激活系统的量和/或活性的增加可以通 过增加所述至少一种电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段或所述至少一种电 子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性来实现。钴(I)胺 素依赖性再激活系统的量和/或活性也可以通过增加至少所述一种电子转移蛋白、其功能 性同系物和/或功能性片段以及所述一种电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功 能性片段的量和/或活性来增加。任意前述因子的量和/或活性增加均可以通过与起始微 生物的比较来进行判断。在一些优选的实施方案中，电子传递蛋白将选自包含铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白、 其功能性同系物和/或功能性片段的组。电子传递蛋白还原酶将选自包含铁氧还蛋白还原 酶、黄素氧还蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的组。在本说明书中，特定蛋白可以通过编码该蛋白的基因的名称来提及。例如，“fdxC” 可以指基因fdxC或由基因fdxC所编码的蛋白。电子转移蛋白的典型例子包括例如谷氨酸棒杆菌的铁氧还蛋白，即fdxC(SEQ ID No. 1 和 2)、fdxD(SEQ ID No. :3 禾口 4)、fdxA(SEQ ID No. :5 和 6)、其功能性同系物和 / 或功能性片段。在大肠杆菌的情形中，电子传递蛋白包括例如fldA(SEQ ID No. :7和8)、 fIdB(SEQ ID No. :9和10)、其功能性同系物和/或功能性片段。在例如谷氨酸棒杆菌的情形中，电子转移蛋白还原酶的典型例子将是fprAl (SEQ ID No. :11 和 12)，fprA2(SEQ ID No. 13 和 14)、fprA3 (SEQ IDNo. 15 和 16)、f IdRl (SEQ ID No. :17和18)、其功能性同系物和/或功能性片段。在例如大肠杆菌的情形中，电子转 移蛋白还原酶的典型例子将是fldR(SEQ ID No. : 19和20)、其功能性同系物和/或功能性 片段。前述电子转移蛋白和/或电子转移蛋白还原酶的量和/或活性的增加可以通过如下方式实现，即依靠将各自微生物内存在的因子的量和/或活性增加到超过这些因子的内 源水平或者依靠源自所讨论微生物之外的其他来源的这些蛋白质。本发明方法的上述实施方案优选通过培养棒杆菌属和埃希氏菌属的微生物来进 行。可特别优选培养谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。可以向例如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌的野 生型菌株中引入上述遗传修饰。在一些优选的实施方案中，将向例如已被视为甲硫氨酸生 产菌株的谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌菌株中引入遗传改变。另一方面，本发明涉及微生物，该微生物已经通过遗传修饰而衍生自起始微生物 以产生增加量和/或活性的钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统。这些微生物可以进一步表征为这种钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统包含至少 一种电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段，和/或至少一种电子转移蛋白还原 酶、其功能性同系物和/或功能性片段。在这些微生物中，钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性的增加可以 通过增加至少一种所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段或者至少一种所 述电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性来实现。在另一个优选的实施方案中，微生物将被修饰以显示出至少一种所述电子转移蛋 白、其功能性同系物和/或功能性片段以及所述电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/ 或功能性片段的量和/或活性的增加。一般而言，为评价前述因子的量和/或活性的增加，进行相对于起始微生物的比较。微生物可以选自前述的组，该组包含肠杆菌属、棒杆菌属、埃希氏菌属、芽孢杆菌 属和链霉菌属。物种谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌可以再次是特别优选的。就电子转移蛋白而言，它可以选自包含黄素氧还蛋白、铁氧还蛋白、其功能性同系 物和/或功能性片段的组。对于谷氨酸棒杆菌，可以考虑前述包含fdxC、fdxD和fdxA以及 它们的同系物和/或片段的组。在大肠杆菌的情形中，可以考虑fldA和fldB以及它们的 功能性同系物和/或功能性片段。就电子传递蛋白还原酶而言，它可以选自包含铁氧还蛋白还原酶、黄素氧还蛋白 还原酶、其功能性同系物和功能性片段的组。在谷氨酸棒杆菌中，可以考虑fprAl、fprA2、 fprA3、fldRl、其功能性同系物和/或功能性片段。在大肠杆菌中，可以考虑fldR、其功能 性同系物和/或功能性片段。前述因子的量和/或活性的增加可以通过如下方式实现，即 将微生物内内源存在的因子的量和/或活性增加至超过其内源水平或引入来自其他来源 的这些因子。本发明还涉及前述微生物用于产生甲硫氨酸的用途。该微生物可以优选衍生自棒 杆菌属和埃希氏菌属。特别优选物种谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。可以在例如谷氨酸棒杆菌 和/或大肠杆菌的野生型菌株中或在已被视为甲硫氨酸生产菌株的菌株中引入遗传改变。 类似原理适用于其他微生物。发明详述本发明涉及产生L-甲硫氨酸的方法，包括培养经遗传修饰的微生物和任选地分 离甲硫氨酸的步骤。本发明也涉及能够产生L-甲硫氨酸的经遗传修饰的微生物。本发明基于以下发现不仅可以通过增加钴(I)胺素依赖性MetH的量和/或活性，还可以通过增加用于钴(I)胺素依赖性MetH的再激活系统的量和/或活性来增加微生 物中的甲硫氨酸产生。在甲硫氨酸的常规生物合成中，甲基从5-甲基四氢叶酸由统称为甲硫氨酸合酶 的酶转移至高半胱氨酸的步骤是限速步骤。甲硫氨酸合酶可以划分为钴⑴胺素依赖性甲硫氨酸合酶1(前述MetH，EC 2. 1. 1. 13)和钴(I)胺素非依赖性甲硫氨酸合酶II(MetE，EC 2. 1. 1. 14)。就钴(I)胺素 依赖性甲硫氨酸合酶MetH而言，已经观察到与MetH结合的钴(I)胺素辅因子被氧化成钴 (II)胺素(见例如 Hall 等人(2000) ,Biochemistry, 39，10，711-719)。令人惊讶地，本发明人发现钴(II)胺素结合的MetH到钴(I)胺素结合的MetH的 钴(I)胺素的还原增加可以导致微生物中甲硫氨酸合成增加。在大肠杆菌中，钴(I)胺素依赖性MetH的再激活由以下来介导，即向还原性再 甲基化供应还原等价物的黄素氧还蛋白以及向再循环黄素氧还蛋白供应还原等价物的 NADPH黄素氧还蛋白氧化还原酶(出于本发明的目的，其又命名为黄素氧还蛋白还原酶)。 令人惊讶地，本发明人发现衍生自大肠杆菌的这种再激活系统可以用于棒状细菌如其中钴 (I)胺素依赖性MetH的再激活迄今未知的谷氨酸棒杆菌。另外，本发明人已经鉴定出内源 性存在于棒状细菌如谷氨酸棒杆菌中的再激活系统。在详细描述本发明的示例性实施方案之前，提供以下定义。如本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一”也包括相应复数形式，除非上下 文另外明确说明。术语“约”和“大约”在本发明通常指本领域技术人员将会理解的精确度的水平或 区间从而仍确保所讨论特征的技术效果。就数值而言，这些术语一般表示与所示数值偏离 士 10%并且优选偏离士 5%。应当理解术语“包含”不是限制性的。出于本发明的目的，将术语“由……组成”视 为术语“包含”的优选实施方案。如果下文将一个组定义为包含至少某个数目的实施方案， 则这意味它也公开了优选仅由这些实施方案组成的组。类似地，如果在本发明中将一个组定义为包含“至少一个”实施方案，则这意味它 也公开了优选由具体提到的一个实施方案所组成的组。出于本发明的目的，术语“微生物”指原核生物和低等真核生物。本发明的微生物因而包含如本领域已知用于产生精细化学品如氨基酸、维生素、 酶辅因子等的微生物。它们可以选自如下的组，其包含肠杆菌属、棒杆菌属且优选其谷 氨酸棒杆菌、埃希氏菌属且优选其大肠杆菌、克雷伯氏菌属(Klebsiella，)、芽孢杆菌属 且优选其枯草芽孢杆菌、短杆菌属(Brevibacterium)、放线细菌属(actincAacteria)、 蓝细菌属(cyanobacteria)、变形菌门(proteobacteria)、盐杆菌属(halobacteria)、甲 烧球菌纲(methanococci)、分枝杆菌属(mycobacteria)、沙门氏菌属(salmonella)、志 贺氏菌属(shigella)、链霉菌属(str印tomyceae)、酵母属(Saccharomyces)及优选其 酿酒酵母(S. cerevisiae)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)及优选其粟酒裂殖酵母 (S. Pombe)、毕赤酵母属(Pichia)及优选其巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)、阿舒囊霄属(Ashbya)禾口曲霄属(Aspergillus)。本发明的优选的实施方案涉及使用选自棒状细菌如棒杆菌属细菌的微生物。特别优选的物种有谷氨酸棒杆菌、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、嗜乙酸 棒木干胃(Corynebacterium acetoacidophilum)、美棒If 胃(Corynebacterium callunae) Λ 产氛棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、热产 M 棒 If 菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)禾口 Corynebacterium effiziens0在本发明的优选实施方案中，宿主细胞可以选自如下组，其包含谷氨酸棒杆菌 ATCC13032、醋谷棒杆菌ATCC15806、嗜乙酸棒杆菌ATCC13870、热产氨棒杆菌FERMBP-1539、 W H ^ # ff Ir ATCC17965> Corynebacteriumeffiziens DSM 44547、Corynebacterium effiziens DSM 44549、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳酸发酵 短杆菌(Brevibacteriumlactoformentum)ATCCl3869> 叉枝短杆菌(Brevibacterium divarecatum)ATCC14020、谷氨酸棒杆菌KFCC10065和谷氨酸棒杆菌ATCC21608以及其通过 例如经典诱变与选择或通过定向诱变所衍生的菌株。其他特别优选的谷氨酸棒杆菌菌株可以选自如下组，其包含ATCC13058、 ATCC13059、ATCC13060、ATCC21492、ATCC21513、ATCC21526、ATCC21543、ATCC13287、 ATCC21851、ATCC21253、ATCC21514、ATCC21516、ATCC21299、ATCC21300、ATCC39684、 ATCC21488、ATCC21649、ATCC21650、ATCC19223、ATCC13869、ATCC21157、ATCC21158、 ATCC21159、ATCC21355、ATCC31808、ATCC21674、ATCC21562、ATCC21563、ATCC21564、 ATCC21565、ATCC21566、ATCC21567、ATCC21568、ATCC21569、ATCC21570、ATCC21571、 ATCC21572、ATCC21573、ATCC21579、ATCC19049、ATCC19050、ATCC19051、ATCC19052、 ATCC19053、ATCC19054、ATCC19055、ATCC19056、ATCC19057、ATCC19058、ATCC19059、 ATCC19060、ATCC19185、ATCC13286、ATCC21515、ATCC21527、ATCC21544、ATCC21492、NRRL B8183、NRRL W8182、B12NRRLB12416、NRRLB12417、NRRLB12418 和 NRRLB11476。缩写KFCC 代表 Korean Federaion of Culture Collection, ATCC 代表 American-Type Strain Culture Collection 以及缩写 DSM 代表 DeutscheSammlung von Mikroorganismen0缩写NRRL代表ARS cultures colIectionNorthern Regional Research Laboratory, Peorea, IL, USA。在本发明中，术语“再激活系统”指酶活性组合，其还原钴(II)胺素并允许钴(I) 胺素依赖性MetH开始或恢复其酶活性。在本发明中，钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统 的量和/或活性的增加意指形成前述再激活系统的酶活性组合的至少一种因子的量和/或 活性增加，从而与未经遗传影响的潜在内源性存在的再激活系统相比确保钴(II)胺素还 原成钴(I)胺素的速率和/或水平增加。如下文将进一步详细指出的那样，钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统一般由以下 组成，即优选向钴(I)胺素依赖性MetH的还原性再甲基化供应还原等价物的至少一种电子 传递蛋白和优选向再循环电子转移蛋白供应还原等价物的至少一种电子传递蛋白还原酶。本发明的电子传递蛋白可以优选选自铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白、其功能性片段 和/或功能性同系物的组。本领域技术人员会知道，电子转移蛋白如铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白是否可以实 际上用来增加钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性的问题将取决于特定生 物体。因此，下文将会显示出电子传递蛋白用于钴(I)胺素依赖性MetH的再激活的功能可以在大肠杆菌中由例如黄素氧还蛋白来达成，而在谷氨酸棒杆菌中相应的作用可以由铁氧 还蛋白来达成。根据本发明，也可称作电子传递蛋白氧化还原酶的电子传递蛋白还原酶可以选自 铁氧还蛋白(氧化)还原酶的组。这些酶也可称作NADPH:铁氧还蛋白(氧化)还原酶。所 述电子传递蛋白还原酶也可以选自包含黄素氧还蛋白(氧化)还原酶的组，该黄素氧还蛋 白(氧化)还原酶又可以称作NADPH:黄素氧还蛋白(氧化)还原酶。当然，所述电子传递 蛋白还原酶也可以选自前述还原酶的功能性同系物和/或功能性片段。就电子传递蛋白而言，本领域技术人员会理解，例如电子转移蛋白还原酶的量和/ 或活性的增加是否可以用来增加钴(I)胺素MetH依赖性再激活系统的量和/或活性的问 题将在某种程度上取决于特定生物体。因此，在大肠杆菌中，这种功能可以由黄素氧还蛋白 (氧化)还原酶来执行，而在谷氨酸棒杆菌中，本发明显示这种功能将由铁氧还蛋白还原酶 来达成。不过，可以在谷氨酸棒杆菌中通过例如过表达大肠杆菌黄素氧还蛋白和大肠杆菌 黄素氧还蛋白(氧化)还原酶来建立大肠杆菌钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统，而类似 地，可以在大肠杆菌中通过过表达谷氨酸棒杆菌铁氧还蛋白和谷氨酸棒杆菌铁氧还蛋白还 原酶来建立谷氨酸棒杆菌钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统。如将通过以下描述详细解释的那样，本发明主要涉及经遗传修饰以展示出某些酶 的量和/或活性的增加的微生物。术语“遗传修饰”和“遗传改变”以及它们在本发明意义范围内的语法上的变体意 指微生物已通过基因技术手段修饰以表达改变量的可以在各自微生物中天然存在的一种 或多种蛋白、在各自微生物中并不天然存在的一种或多种蛋白，或者与各自未修饰的微生 物蛋白相比具有改变活性的一种或多种蛋白。未修饰的微生物视为“起始生物体”，其遗传 改变产生了本发明的微生物。术语“起始生物体”因此可以指生物体的野生型。在谷氨酸棒杆菌的情形中，这可 以例如是ATCC13032。然而出于本发明的目的，术语“起始生物体”也可以指这样的生物体， 其与各自物种的野生型生物体相比已经携带遗传改变，但是其随后被进一步遗传修饰以产 生本发明的生物体。在谷氨酸棒杆菌的情形中，起始生物体因此可以是野生型谷氨酸棒杆菌菌株如 ATCC13032。然而，该起始生物体可以优选还是例如已经过工程化用于甲硫氨酸生产的谷氨 酸棒杆菌菌株。这种产甲硫氨酸的起始生物体可以例如衍生自野生型棒状细菌及优选衍生自在 以下基因ask*、homfbr和metH至少一个中含有遗传改变的野生型谷氨酸棒杆菌，其中所 述遗传改变引起这些基因任一的过表达，因而相对于缺少遗传改变时所产生的甲硫氨酸， 导致甲硫氨酸的生产增加。在优选的实施方案中，这种产甲硫氨酸起始生物体将同时在 Mkfl^homfto和metH中含有遗传改变，因相对于缺少遗传改变时所产生的甲硫氨酸，导致甲 硫氨酸的生产增加。在这些起始生物体中，一般将ask和hom的内源性拷贝变为反馈抗性等位基因，其 不再受由赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或这些氨基酸的组合所致的反馈抑制。这可以通过突变 和选择来完成或者通过以突变的等位基因对所述基因的指定遗传取代来完成，其中所述突 变的等位基因编码反馈抑制减弱或消除的蛋白。包括这些遗传改变的谷氨酸棒杆菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌DSM17322。本领域技术人员将知道针对下文所述那些用于产生谷氨酸棒 杆菌DSM17322的可选的遗传改变也可以用来实现ask "、Iiomfto和metH的过表达。出于本发明的目的，askfto表示反馈抗性天冬氨酸激酶。Homfto表示反馈抗性高丝 氨酸脱氢酶。MetH表示维生素B12依赖性甲硫氨酸合酶。在另一个优选的实施方案中，产甲硫氨酸的起始生物体可以衍生自野生型棒状细 菌且优选衍生自在至少一个以下基因aSkfto、h0mfto、metH、metA(也称作metX)、metY(也称 作metZ)和hskmutated中含有遗传改变的野生型谷氨酸棒杆菌，其中所述遗传改变引起这些 基因任一的过表达，因而相对于缺少遗传改变时所产生的甲硫氨酸，导致甲硫氨酸的生产 增加。在优选的实施方案中，这种产甲硫氨酸的起始生物体将同时在ask*、homfbr, metH、 metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)和hskmutated中含有遗传改变，因而相对于缺少遗 传改造变所产生的甲硫氨酸，导致甲硫氨酸的生产增加。在这些起始生物体中，ask、hom和hsk的内源性拷贝一般由askfto、hom "和 hskmutated取代，如上文对Mkfto和homfto所述那样。包括这些遗传改变的谷氨酸棒杆菌菌株 例如是谷氨酸棒杆菌M2014。本领域技术人员将知道对下文具体所述那些特异地用于产生 谷氨酸棒杆菌M2014的可选的遗传改变也可以用来实现ask "、hom "、metH、metA(也称作 metX)、metY(也称作 metZ)和 hskmutated 的过表达。出于本发明的目的，metA表示来自例如大肠杆菌的高丝氨酸琥珀酰转移酶。MetY 表示0-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。Hskmutated表示已经被突变以显示减弱的酶活性的高丝 氨酸激酶。这可以通过在相应于具有Genbank登录号Cgl 1184的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 的hsk的T190的位置用丝氨酸或丙氨酸替换苏氨酸来实现。可选或另外，可以用TTG起始 密码子取代ATG起始密码子。此类突变导致所得的hsk蛋白的酶活性与未突变的hsk基因 相比减弱。在另一个优选的实施方案中，产甲硫氨酸的起始生物体可以衍生自野生型棒状细 菌且优选衍生自这样的野生型谷氨酸棒杆菌，其在至少一个以下基因aSkfto、h0mfto、metH、 metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hskmutated和metF中含有遗传改变(其中所述遗 传改变引起这些基因任一的过表达)并与以下基因serA之一中减少此基因表达的遗传改 变组合，其中所述组合导致了相对于缺少该组合的甲硫氨酸生产相比，该微生物的甲硫氨 酸生产增加。在这些起始生物体中，ask、hom和hsk的内源性拷贝如上文所述那样被置换。包 括这些遗传改变的谷氨酸棒杆菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌0M469。本领域技术人员将知 道对下文具体所述那些用于产生谷氨酸棒杆菌0M469的可选的遗传改变也可以用来实现 askfbr、homfbr、metH、metA(也称作 metX)、metY(也称作 metZ) ^hskmutated 和 metF 的过表达以 及metQ的减少表达。在另一个优选的实施方案中，产甲硫氨酸的起始生物体可以衍生自野生型棒状细 菌且优选衍生自这样的野生型谷氨酸棒杆菌，其在至少一个以下基因aSkfto、h0mfto、metH、 metA(也称作metX)、metY(也称作metZ)、hskmutated和metF中含有遗传改变(其中所述遗 传改变引起任一这些基因的过表达)并与至少一个以下基因mcbR和metQ中减少任一这 些基因表达的遗传改变组合，其中所述组合导致相对于缺少所述组合时的甲硫氨酸生产， 该微生物的甲硫氨酸生产增加。在优选的实施方案中，这种产甲硫氨酸的起始生物体将同时在 askfbr、homftr、metH、metA(也称作 metX)、metY(也称作 metZ)、hskmutated 和 metF 中含 有引起任一这些基因过表达的遗传改变并与mcbR和metQ中减少任一这些基因表达的遗传 改变，其中所述组合导致相对于缺少所述组合时的甲硫氨酸生产，该微生物的甲硫氨酸生 产增加。在这些起始生物体中，aSk、hom和hsk的内源性拷贝一般如上文所述那样被置换， 而mcbR和metQ的内源性拷贝一般被功能性地破坏或缺失。包括这些遗传改变的谷氨酸棒 杆菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌0M469。本领域技术人员将知道对下文具体所述那些用于产 生谷氨酸棒杆菌0M469的可选的遗传改变也可以用来实现ask "、hom^, metH、metA (也称 作metX)、metY (也称作metZ)、hskmutated和metF的过表达以及mcbR及metQ的减少表达。出于本发明的目的，metF表示N5，10-亚甲基-四氢叶酸还原酶(EC1. 5. 1.20)。 McbR表示硫代谢TetR-型转录调节物(Genbank登录号AAP45010)。MetQ表示在甲硫氨酸 输入中发挥功能的D-甲硫氨酸结合脂蛋白。在又一个优选的实施方案中，产甲硫氨酸的起始生物体可以衍生自野生型棒状细 菌且优选衍生自这样的野生型谷氨酸棒杆菌，其在至少一个以下基因aSkfto、h0mfto、metH、 metA(也称作 metX)、metY(也称作 metZ)、hskmutated、metF、tkt、tal、zwf 和 6pgl 中含有遗传 改变(其中所述遗传改变引起任意这些基因的过表达)且与至少一个以下基因mCbR、metQ 和sda中减少任意这些基因表达的遗传改变组合，其中所述组合导致相对于缺少所述组合 时的甲硫氨酸生产，该微生物的甲硫氨酸生产增加。在优选的实施方案中，这种产生甲硫 氨酸的起始生物体将同时在askfto、homfto、metH、metA (也称作metX)、metY(也称作metZ)、 hskmutated、metF、tkt、tal、zwf和6pgl中含有遗传改变(其中所述遗传改变引起任意这些 基因的过表达)且与mcbR、metQ和sda中减少任意这些基因表达的遗传改变组合，其中所 述组合导致相对于缺少所述组合时的甲硫氨酸生产，该微生物的甲硫氨酸生产增加。包括这些遗传改变的谷氨酸棒杆菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌GK1259。本领域技 术人员将知道对下文具体所述那些用于产生谷氨酸棒杆菌GK1259的可选的遗传改变也可 以用来实现 askfbr、homfbr、metH、metA (也称作 metX)、metY (也称作 metZ)、hskmutated、metF、 tkt、tal、zwf和6pgl的过表达以及mcbR、metQ及sda的减少表达。出于本发明的目的，tkt表示转酮酶，tal表示转醛酶，zwf表示葡萄糖-6-磷酸脱 氢酶，6pgl表示6-磷酸-葡糖酸内酯酶以及sda表示丝氨酸脱氨酶(见表1)。本领域技 术人员理解为了增加zwf的量和/或活性，还要增加充当zwf的结构支架蛋白的opca的量 和/或活性。在GK1259中，这通过使用Psrai启动子来实现，所述Psrai启动子同时增加包含 tkt、tal, zwf和6pgl的磷酸戊糖操纵子的转录。如上文已经阐述的那样，本发明经遗传修饰的微生物的特征在于至少钴(I)胺素 MetH再激活系统的量和/或活性增加。为此，一般增加电子传递蛋白和/或电子传递蛋白 还原酶的量和/或活性。为此，可以使用例如铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白、铁氧还蛋白还原 酶、黄素氧还蛋白还原酶、前述因子的功能性同系物和片段。一般地，与各自的起始生物体相比，这些因子的量在本发明的微生物中增加了至 少约2%、至少约5%、至少约10%或至少约20%。在其他优选实施方案中，这些因子的量 增加了至少30%、至少50%或至少75%。在涉及微生物的更优选的实施方案中，这些因子 的量增加了至少约2倍、至少约5倍或至少约倍10。
与培养没有如下文所述那样经遗传修饰的各自起始生物体的情况相比，本发明的 方法和微生物可以用来产生更多的甲硫氨酸。本发明的微生物和方法也可以用来提高甲硫 氨酸合成的效率。术语“甲硫氨酸合成的效率”描述了甲硫氨酸的碳产量。该效率计算为以碳底物 形式进入系统的能量输入的百分数。在整个本发明中，这个值以百分值((mol甲硫氨酸) (mol碳底物K1X 100来给出。术语“提高甲硫氨酸合成的效率”因此涉及在起始生物体与 实际的棒状细菌之间的比较，其中至少一个下文所提及的酶的量和/或活性增加。依照本发明优选的碳源是糖，如单糖、二糖或多糖。例如，选自包含葡萄糖、果糖、 hanose、半乳糖、核糖、山梨糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素的组的糖可以充 当特别优选的碳源。本发明的方法和微生物也可以用来产生与起始生物体相比更多的甲硫氨酸。本发明的方法和微生物也可以用来以比起始生物体更快的速率产生甲硫氨酸。例 如，如果考虑常见的产生周期，则所述方法和微生物将允许以更快速度产生甲硫氨酸，即与 起始生物体相比，相同量的甲硫氨酸将在更早的时间点产生。这尤其适用于对数生长期。如果在摇瓶培育中培育该微生物，本发明的方法和微生物如谷氨酸棒杆菌允许产 生至少约3g甲硫氨酸/1个培养体积。如果在摇瓶培育中培育该微生物，则可以优选是至 少约4g甲硫氨酸/1个培养体积、至少约5g甲硫氨酸/1个培养体积或至少约7g甲硫氨 酸/1个培养体积的滴度。如果在摇瓶培育中培育该微生物，则更优选的数量值达到至少约 IOg甲硫氨酸/1个培养体积以及更优选达到至少约20g甲硫氨酸/1细胞群。如果在使用搅拌式和碳源补料发酵罐的发酵实验中培育该微生物，本发明的方法 和微生物如谷氨酸棒杆菌允许产生至少约25g甲硫氨酸/1个培养体积。如果在使用搅拌 式和碳源补料发酵罐的发酵实验中培育该菌株，则可以优选为至少约30g甲硫氨酸/1个培 养体积、至少约35g甲硫氨酸/1个培养体积或至少约40g甲硫氨酸/1个培养体积的滴度。 如果在使用搅拌式和碳源补料发酵罐的发酵实验中培育该微生物，则更优选的数量值达到 至少约50g甲硫氨酸/1个培养体积以及更优选地达到至少约60g甲硫氨酸/1细胞群。在优选的实施方案中，本发明的方法和微生物(如谷氨酸棒杆菌)与起始生物体 相比允许甲硫氨酸合成的效率和/或甲硫氨酸的量和/或甲硫氨酸合成的滴度和/或速率 提高至少约2%、至少约5%、至少约10%或至少约20%。在优选的实施方案中，与起始生物 体相比，甲硫氨酸合成的效率和/或甲硫氨酸的量和/或滴度和/或速率增加至少约30%、 至少约40%或至少约50%。更优选的是增加至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍和至少 约10倍。术语“标准条件”是指在标准培养基中培养微生物，该标准培养基中对于特定的化 合物而言没有富集。温度、PH和培育时间可以变动，将在下文更详细地描述。微生物的标准培养条件可以取自文献，包括教材如“Sambrook&Russell， Molecular Cloning-Α Laboratory Manual“ , Cold Spring HarborLaboratory Press，3 片反 (2001)”。“极限培养基”是仅含有用于野生型或突变细胞生长的必需物质即无机盐、碳源和 水的培养基。在突变细胞的情况下，极限培养基可以含有一种或多种基本上纯的化学化合 物添加剂以允许在产生此类化学品方面有缺陷的突变细胞的生长。
相反，“富集培养基"被设计为满足特定生物体的全部生长要求，即在极限培养 基的成分之外，它们还含有例如氨基酸、生长因子、酶辅因子等。如上文已经阐述的那样，本发明经遗传修饰的微生物的特征在于至少钴(I)胺素 MetH再激活系统的量和/或活性增加。为此，一般增加电子传递蛋白和/或电子传递蛋白 还原酶的量和/或活性。为此，可以使用例如铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白、铁氧还蛋白还原 酶、黄素氧还蛋白还原酶、前述因子的功能性同系物和片段。在优选的实施方案中，本发明的微生物和方法的特征在于额外地，与起始生物体 相比，一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性增加-metA/X,-metZ/Y,-metF,-metH,-thrA,-metE,和/或与起始生物体相比，一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功能性片 段的量和/或活性减少-metK,-thrB。此类微生物和方法特别对甲硫氨酸的生产有用。在特别优选的实施方案中，全部前述因子metA/X、metZ/Y、metF、metH、thrA和 metE的量和/或活性增加并且metK和thrB的量和活性减少。MetA/X指编码酶的基因，所述酶催化乙酰基或琥珀酰基从活化的乙酰辅酶A或各 自的琥珀酰辅酶A转移至高丝氨酸的OH基团以产生0-乙酰高丝氨酸或0-琥珀酰-高丝 氨酸(Genbank 登录号AF052652)。MetZ/Y指编码酶的基因，所述酶催化硫化物或甲基硫醇(methylmercaptane)转 移至0-乙酰高丝氨酸或0-琥珀酰-高丝氨酸以产生高半胱氨酸。酶metZ/Y利用磷酸吡 哆醛作为辅因子(Genbank登录号AF220150)。MetF涉及编码酶的基因，所述酶利用NADPH或NADH作为辅因子和氢负离子供体来 催化亚甲基四氢叶酸还原为甲基四氢叶酸(EC 1. 7. 99. 5，Genbank登录号AAH68531)。MetH涉及编码酶的基因，所述酶利用羟基钴胺素作为辅因子并利用SAM作为第 二辅因子催化从甲基四氢叶酸到高半胱氨酸的甲基转移(EC2. 1. 1. 13，Genbank登录号 Cgll507)。ThrA (高丝氨酸脱氢酶)涉及编码酶的基因，所述酶利用NADPH或NADH作为辅因 子催化天冬氨酸半醛的还原(EC 1. 1. 1.3，Genbank登录号:Cglll83、AAT03321、AAH68417、 AEB13106)。此酶可以以突变形式使用。ThrB (高丝氨酸激酶)涉及编码酶的基因，所述酶利用ATP作为辅因子催化高丝氨 酸磷酸化成磷酸高丝氨酸(EC 2. 7. 1. 39，Genbank登录号Cglll8;3)。此酶可以以突变形式使用。MetE涉及编码酶的基因，所述酶利用SAM作为辅因子催化从甲基四氢叶酸到高半胱氨酸上的甲基转移(EC 2. 1. 1. 14，Genbank登录号Cglll39)。MetK涉及编码酶的基因，所述酶利用ATP作为辅因子S-腺苷甲硫氨酸合酶催化 S-腺苷残基到甲硫氨酸上的转移(EC 2. 5. 1. 6，Genbank登录号Cgll603)。这些额外的修饰当然也可以引入上述起始生物体中。在本发明中，术语与起始生物体相比至少一种蛋白质(如铁氧还蛋白)的“量增 加”意指起始微生物经遗传修饰以表达更高量的例如上述酶之一。应当理解的是，增加例如 一种酶的量是指其中功能性酶的量增加的情况。在本发明中，如果酶如铁氧还蛋白能够催 化各自的反应，则它视为是功能性的。存在各种本领域技术人员所熟知的选择以在微生物如棒状细菌中增加蛋白的量。 这些选择包括增加编码各自蛋白质的核酸序列的拷贝数、增加此类核酸序列的转录和/或 翻译或其组合。这些各种选择将在下文更详细地讨论。术语至少一种蛋白质的“活性增加”意指将至少一种突变引入蛋白质各自的野生 型序列的情况，其与表达相同量的野生型蛋白质的情况相比，导致更多甲硫氨酸的产生。这 可以通过例如使用携带特异突变的酶实现，所述特异突变使得该酶的活性增加。此类突变 可以例如使所述酶负责反馈抑制的区域失活。通过例如引入非保守性点突变而使这些位置 突变，所述酶可不再提供反馈调节且因此如果例如更多的产物分子产生，则此酶的活性不 下调。另外，可以通过引入提高酶的催化周转的突变来增加所述酶的活性。此类突变可以 被引入编码各自酶的基因的内源性拷贝中或者其可以通过过表达来自编码此酶的外源核 酸序列的相应突变体来提供。此类突变可以包含点突变、缺失或插入。点突变可以是保守 性的(将一个氨基酸由具有相类似生物化学和物理化学性质的氨基酸置换)或非保守性的 (将一个氨基酸由在生物化学和物理化学性质方面不相类似的另一个氨基酸置换)。另外， 所述缺失可以仅包含2或3个氨基酸直至各自蛋白质的完整结构域。因此，术语至少一种酶的“活性增加”指这样的情况，其中将突变引入各自的野生 型序列以减少负调节机制如反馈抑制作用和/或增加酶的催化周转。蛋白质如酶的量和/或活性的增加可以因此通过不同途径实现，例如通过在转 录、翻译或蛋白水平关闭抑制性调节机制，和/或通过与起始生物体相比增加编码这种蛋 白质的核酸的基因表达，例如通过诱导内源性基因或通过引入编码该蛋白质的核酸序列。当然，可以将增加蛋白质如酶的量和/或活性的方法进行组合。因此，例如，可以 将一种棒状细菌的酶的内源性拷贝由编码其反馈不敏感形式的突变体来取代。如果这种经 突变的拷贝的转录设在强启动子的控制下，则各自酶的量和活性增加。应当理解在这种情 况下，该酶必须仍能够催化其通常参与的反应。编码蛋白质如酶的核酸序列可以是内源来源或外源来源的。因此，可以例如通过 以下方式增加蛋白质如铁氧还蛋白的量，所述方式为通过例如额外核酸序列的染色体整合 来增加天然存在于各自起始微生物内的核酸序列的表达，或者通过在内源基因之前使用强 启动子。可选或另外地，也可以通过表达编码这种酶来自另一种生物体的同系物的核酸序 列来增加蛋白质如铁氧还蛋白的量。将在下文提出后一种方案的例子。因此，可以例如通过过表达来自自主复制载体或来自额外插入的染色体拷贝 的各自的谷氨酸棒杆菌序列来增加谷氨酸棒杆菌中铁氧还蛋白的量(见下文)或者可 以使用来自例如Corynebacterium eff iciens、杰氏棒杆菌(C. jeikeium)、亚麻短杆菌(Brevibacterium linens)、黄色短杆菌(B. flavum)、乳糖发酵短杆菌(B. Iactofermentum) 等的相应酶并且通过例如使用自主复制载体来过表达该酶。在一些情况下，可以优选使用内源性酶，因为例如谷氨酸棒杆菌的内源性编码序 列对于其在谷氨酸棒杆菌中表达的密码子选择而言已经过优化。在以下描述中，如果申明某种蛋白质如特定酶的量和/或活性与起始生物体相比 应当减少，则上文的定义在经过必要修正后适用。蛋白质如酶的量和/或活性的减少可以通过以下方式实现，通过部分或完全缺失 编码各自蛋白的核酸序列、通过例如引入弱启动子而抑制转录、通过相应地修改密码子选 择而抑制翻译、通过将突变引入编码各自蛋白的核酸序列使所述蛋白无功能、和/或其组
I=I O在以下描述中，将利用术语“功能性同系物”。出于本发明的目的，术语“功能性同 系物”涉及这样的事实，即某种酶活性不仅可以由给定氨基酸序列的特定蛋白质来提供，还 可以由来自它(不)相关生物体的相似序列的蛋白质提供。例如，可以在谷氨酸棒杆菌中通过表达编码谷氨酸棒杆菌fdxC(SEQ IDN0. 1:核酸 序列，SEQ ID NO. 2 氨基酸序列，该基因的Genbank登录号1019087或Ncgl 1057及该蛋白 质的Genbank登录号NP_600330. 1)的核酸序列或通过其功能性同系物来增加铁氧还蛋白 的活性。来自其他生物体的蛋白质的同系物可以由技术人员通过同源性分析轻易地鉴定。 这可以通过确定相似性来完成，即确定推定同系物的氨基酸或核酸序列与所述基因或其编 码的蛋白质(例如，fdxC、fdxD、fdxA、fldA、fldB、fprAl、fprA2、fprA3、fldRl、fldR 的核 酸序列)的序列之间的百分比相同性。可以例如通过视检或通过使用基于同源性算法来确定百分比相同性。例如，为确定两个氨基酸序列的百分比相同性，算法将出于最佳比较目的来对所 述序列进行比对(例如，为了与另一蛋白氨基酸序列最佳比对，可以在一个蛋白的氨基酸 序列中引入缺口)。随后比较在相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当一个序列中的位置 由与另一序列中相应位置处相同的氨基酸残基所占据时，则所述分子在这个位置上是相同 的。这两个序列之间的百分比相同性是所述序列共有的相同位置数的函数(即％相同性= 相同位置#/位置总#乘以100)。用于这些目的多种计算机程序是本领域已知的。例如，可以通过使用Devereux等 A (1984) Nucl. Acids. Res. , 12 :387所描述的并且可从Universityof Wisconsin Genetics Computer Group (UffGCG)获得的GAP计算机程序比较序列信息来确定两个核酸或氨基酸序 列的百分比相同性。也可以通过使用(如Tatusova等人(1999)FEMS Microbiol. Lett., 174 :247 所描述的)BasicLocal Alignment Search iTool (BLAST )程序比对两个核酸或氨 基酸序列来确定百分比相同性。在本专利申请的申请日，可以在NCBI的BLAST网站(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)上找到提供BLAST程序的标准软件包。例如，如果使用任意的前述SEQ ID，则 可以执行基于核酸序列或氨基序列的BLAST检索并鉴定出在例如大肠杆菌、酿酒酵母、枯 草芽孢杆菌等中各自酶的密切相关同系物。例如，对于使用BLAST 程序的核酸序列比对， 默认设置如下匹配得分是2，错配罚分是-2，开放缺口罚分和延伸缺口罚分分别是5和2，gap. times, dropoff是50，预期是10，字体大小是11，并且过滤程序是OFF。相当的序列检索和分析可以在EMBL数据库(http://www. embl. org)或Expasy主 页(http://驟w. expasy.org/)进行。全部上述序列检索一般均以其数据库提供者在本申 请的申请日所预设的默认参数进行。也可以使用软件程序如美国威斯康辛州Madison的 DNA Star, Inc.的Laser Gene软件进行常规的同源性检索，其中所述软件使用CLUSTAL方 法(Higgins 等人(1989)，Comput. Appl. Biosci.，5 (2) 151)。技术人员理解如果两种蛋白质共享如上文所述的某种程度的相同性，它们将可能 执行相同功能(例如提供相同的酶活性)。在氨基酸水平上常见的下限一般是至少约25% 相同性。在核酸水平上，下限一般是至少50%。对两种类型的序列优选的相同性分数为至少约50%、至少约60%或至少约70%。 更优选的相同性水平是至少约80%、至少约90%或至少约95%。这些相同性水平被认为是 显著的。如本文中所用，术语“同源性”和“同源”不限于指定具有理论上共同遗传祖先的 蛋白质，也包括可以在遗传上不相关，却依然演化为执行相似功能和/或具有相似结构的 蛋白质。同系物应当是功能性的要求意指本文中所述的同系物涵盖基本上与参考蛋白具有 相同活性的同系物。对于具有功能同源性的蛋白质，并不必然要求它们在其氨基酸序列上 具有显著相同性，但是，具有功能同源性的蛋白质反而要定义为具有相似或相同活性(例 如酶活性)。优选地，如果来自如宿主棒状细菌之外另一种生物体的酶显示至少明显的相似 性，即在氨基酸水平上约50%序列相同性并且与其在棒状细菌中的对应物催化相同的反 应，则将认为该酶是功能性同系物。提供相同酶活性并在氨基酸水平上共享更高程度相同 性如至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%序列相同性的功能性同系物是进 一步优选的功能性同系物。本领域技术人员知道也可以使用来自例如棒状细菌的前述酶的片段或突变形式 及它们在其他生物体中功能性同系物的片段或突变形式，只要这些片段和突变形式显现相 同类型的功能活性即可。常见的功能活性片段会显示N-末端和/或C-末端缺失，而突变 形式一般包含缺失、插入或点突变。例如，如果大肠杆菌序列在氨基酸水平上与SEQ ID N0. 2显示上述相同性水平并 且显现相同酶活性，则会将其视为编码谷氨酸棒杆菌铁氧还蛋白fdxC的功能性同系物。示 例可以取自表1。也可以使用这些序列的片段或例如点突变体，只要所得蛋白质仍与全长酶 催化相同类型的反应即可。
曾力D微勿φ钴(ι) mmmmn. MetH wm^mmmm /如上文已经阐述的那样，本发明基于以下发现钴(I)胺素依赖性MetH再激活系 统的增加导致甲硫氨酸生产的改善并且可以用于微生物中甲硫氨酸生产的改善。上文已经进一步阐述在一些优选的实施方案中可以实现这种钴(I)胺素依赖性 MetH再激活系统的量和/或活性的增加，所述系统增加电子传递蛋白和/或电子传递蛋白 还原酶以及其功能性同系物和/或片段的量和/或活性。进一步已经指出铁氧还蛋白和黄 素氧还蛋白是此类电子转移蛋白的常见例子并且铁氧还蛋白还原酶和黄素氧还蛋白还原 酶是此类电子传递蛋白还原酶的常见例子。
现在将就这些优选实施方案中的一些来论述钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统 的量和/或活性的增加，即在物种如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中过表达前述因子中的一 些。本领域技术人员仍然会了解到这些具体例子不应解释为限制性的。本领域技术人员会 理解如何分离及鉴定在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌之外其他生物体中参与钴(I)胺素依赖 性MetH再激活的酶活性。本领域技术人员会进一步理解根据本说明如何例如在其他微生 物中表达本说明书中描述的铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白和它们各自的还原酶。如将从下文的实施方案实例中弄清楚的那样，微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌 包含铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶和黄素氧还蛋白还原酶的序列。在此类 微生物中，增加钴(I)胺素MetH再激活系统的量和/或活性可能需要通过例如过表达编码 这些酶活性的内源或外源核酸序列来提高这些酶的量和/或活性至超过各自起始生物体 的水平。本发明因此涉及谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌微生物以及此类微生物生产甲硫氨酸 的用途，在所述微生物中前述因子的量和/或活性增加。对包括例如铁氧还蛋白，黄素氧还 蛋白，铁氧还蛋白还原酶和黄素氧还蛋白还原酶在内的前述因子的量和/或活性的增加可 以通过例如提高编码此类因子的核酸序列的拷贝数、增加编码此类因子的序列的转录和/ 或翻译、或其组合来实现。在谷氨酸棒杆菌中，仅内源性因子可以参与钴(I)胺素依赖性MetH的再激活并且 因而被用于相应再激活系统量和/或活性的增加。电子传递蛋白包含fdXC、fdXD和fdxA。就fdxC而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No. 1中描述，而氨基酸序列在 SEQ ID No. 2中描述。基因库登录号对于该基因是geneID :1019087或Ncgll057，对于该蛋 白是 NP_600330. 1。就fdxD而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No. 3中描述，而氨基酸序列在 SEQ ID No. 4中描述。基因库登录号对于该基因是geneID :1020899或NCgU856，而对于该 蛋白质是NP_602147. 1。就fdxA而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No. 5中描述，而氨基酸序列在 SEQ ID No. 6中描述。基因库登录号对于该基因是geneID :1018555或NCgl05^，而对于该 蛋白质是NP_599787. 1。在谷氨酸棒杆菌中，电子传递蛋白还原酶可以选自fprAl、fprA2、fprA3和fldRl 的组，它们全部已经被标注为铁氧还蛋白还原酶。就fprAl而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No. 11中描述，而氨基酸序列 在SEQ ID No. 12中描述。基因库登录号对于该基因是geneID 1020760或NCgl2719，而对 于该蛋白质是NP_602009. 1。就fprA2而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No. 13中描述，而氨基酸序列 在SEQ ID No. 14中描述。基因库登录号对于该基因是geneID 1020699或NCgU658，而对 于该蛋白质是NP_601949. 1。就fprA3而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No. 15中描述，而氨基酸序列 在SEQ ID No. 16中描述。基因库登录号对于该基因是geneID 1020355或NCgl2322，而对 于该蛋白质是蛋白质_NP_601606. 1。就fldRl而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No. 17中描述，而氨基酸序列在SEQ ID No. 18中描述。基因库登录号对于该基因是NCgl2301或geneID 10203；34，而对 于该蛋白质是蛋白质_NP_601585. 1。这些因子的其他同系物可以通过使用例如BLAST算法执行前述同源性检索来加
以鉴定。就大肠杆菌而言，电子传递蛋白可以选自fldA或fldB的组。这些蛋白质已经被 标注为黄素氧还蛋白。就fldA而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No. 7中描述，而氨基酸序列在 SEQ ID No. 8 中描述。基因库登录号是 gl789262 或 EG10318，以及 Swiss-Prot P23243。就fldB而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No. 9中描述，而氨基酸序列在 SEQ ID No. 10 中描述。基因库登录号是 gl789262 或 EG12697，以及 Swiss-Prot P41050。在大肠杆菌中，所述电子传递蛋白还原酶可以由已经被标注为黄素氧还蛋白还原 酶的fldR编码。该基因也已经被赋予其他名称，包括fpr、flxR和mvrA。所述蛋白质也已 经被称作铁氧还蛋白还原酶。就这种因子而言，编码这种因子的核酸序列在SEQ ID No. 19 中描述，而氨基酸序列在SEQ IDNo. 20中描述。基因库登录号是gl790359或EG11518，以及 Swiss-ProtP28861。为增加谷氨酸棒杆菌中钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性，可 以增加谷氨酸棒杆菌中前述内源因子的量和/或活性并因此增加fdxC、fdxD、或fdxA和/ 或fprAl、fprA2、fprA3、和/或fldRl的量和/或活性。或者，可以过表达外源因子如大肠 杆菌因子并因此表达例如fldA和/或fldR。在谷氨酸棒杆菌中，可以优选过表达fdxC和 fprAl组合任选与谷氨酸棒杆菌metH组合以及过表达fldA和fldR任选与大肠杆菌metH 组合，或前述两个集合的组合。就大肠杆菌而言，可以再次表达上述内源因子或依赖已知用于例如谷氨酸棒杆菌 的外源因子。fldA、fldB，或fldR的过表达可以是足够的。然而，可以优选fldA和fldR过 表达。也可以利用例如fdxC和fprAl的过表达。就本发明涉及谷氨酸棒杆菌而言，其考虑了其中铁氧还蛋白或铁氧还蛋白还原酶 并且优选铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的量和/或活性增加的微生物。类似地，本发明 考虑了其中来自其他微生物的相应活性(如来自大肠杆菌的黄素氧还蛋白和/或黄素氧还 蛋白还原酶)增加的谷氨酸棒杆菌微生物。就大肠杆菌而言，本发明类似地考虑了其中黄素氧还蛋白或黄素氧还蛋白还原酶 并且优选黄素氧还蛋白和黄素氧还蛋白还原酶的量和/或活性增加的微生物。或者，可以 使用在谷氨酸棒杆菌中执行相当功能的因子如铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶。当然，也可以增加一种内源因子和一种外源因子的量和/或活性。因此，可以考虑 在谷氨酸棒杆菌中增加内源性铁氧还蛋白和大肠杆菌黄素氧还蛋白还原酶的量。或者，可 以在谷氨酸棒杆菌中增加大肠杆菌黄素氧还蛋白和内源性铁氧还蛋白还原酶的量和/或 活性。在大肠杆菌中，可以因此增加外源性谷氨酸棒杆菌铁氧还蛋白和内源性黄素氧还蛋 白还原酶的量和/或活性或者可以增加内源性黄素氧还蛋白和外源性谷氨酸棒杆菌铁氧 还蛋白还原酶的量和/或活性。本领域技术人员将意识到本发明的其他实施方案。上文提及的示例已经根据通常 编码天然形式的电子传递蛋白和电子传递蛋白还原酶如fdxC和fprAl的序列进行说明。然而，本领域技术人员将理解，无论内源性和/或外源性因子的量和/或活性是否将增加，仍 可以使用这些因子的功能性同系物和/或功能性片段。编码前述因子如fdxC的核酸序列的拷贝数可以在微生物中并且优选在谷氨酸棒 杆菌中增加，所述增加通过例如由自主复制质粒表达该序列或通过将各自核酸序列的额外 拷贝整合至微生物的基因组并且优选谷氨酸棒杆菌的基因组进行。在自主复制载体的情形中，这些可以稳定地维持在例如棒状细菌内。用于在谷 氨酸棒杆菌中表达多肽和酶如fdxC的典型载体包括pCliK、pB和ρΕΚΟ，如Bott，Μ.和 Eggeling, L. , eds., Handbook of Corynebacteriumglutamicum. CRC Press LLC, Boca Raton, FL ；Deb, J. K.等人(FEMS Microbiol. Lett. (1999), 175 (1), 11-20) ,Kirchner 0.等 人(J. Biotechnol. (2003)，104 (1-3)，287-299)、W02006069711 和 W02007012078 所述。在用于增加在棒状细菌中编码多肽的核酸序列拷贝数的另一种方法中，可以将编 码此类多肽的核酸序列的额外拷贝整合至谷氨酸棒杆菌的染色体中。染色体整合可以例如 在其中各自多肽的内源性拷贝所在的基因座处发生。另外和/或可选地，编码多肽的核酸 序列的染色体性倍增可以在棒状细菌基因组中的其他基因座处发生。在谷氨酸棒杆菌的情形中，存在本领域技术人员已知用于通过染色体整合增加基 因拷贝数的各种方法。一种这样的方法例如利用载体pKl9saCB并且已经在SchaferA，等 人J Bacteriol. 1994 176(23) :7309-7319的出版物中详细描述。用于编码多肽的核酸序 列的染色体整合的其他载体包括或是如W02005059093和W02007011845所述的pCLIK int
SacB0用于在微生物并且特别是谷氨酸棒杆菌中增加前述因子如fdxC的量和/或活性 的另一种优选方法是通过使用强启动子来增加编码序列的转录。如果使用强启动子增加了例如内源性铁氧还蛋白的活性，则术语"强启动子"意 指来自新引入的启动子的转录强于来自天然存在的内源性启动子的转录。然而，在例如未知此类酶的谷氨酸棒杆菌中表达黄素氧还蛋白fldA的情况下，可 以使用已知引起谷氨酸棒杆菌的内源性基因强表达的启动子。在这种背景下的优选启动子是启动子Psqd(SEQ ID No. 21)、Pgr。ES(SEQID No. 22), Peftu(SEQ ID No. 23)、噬菌体 SPOl 启动子 P15(SEQ ID No. 38)和有时又称作 lambdaPK 的 XPK(SEQ ID No.24)。在谷氨酸棒杆菌中，所述λ Pk启动子可以强于所述Psqd启动子。所 述Psrai启动子可以强于所述Psmes启动子，并且所述Psmes启动子可以弱于所述Pmu启动子 或所述P15启动子。所述Pmu启动子可以强于所述P-启动子。然而，一个启动子在任意生 物体中的强度并不必然是该启动子的固有属性，因为启动子强度可以根据通过遗传工程安 置该启动子的背景而大幅度变化。本发明因此也涉及包括培养上述微生物及任选分离甲硫氨酸的方法。下文将详细描述用于增加蛋白质的量和/或活性的方法。这些方法当然也可以应 用于因子如fdxC、fprAl和fldA。优选的实施方案涉及谷氨酸棒杆菌微生物，其显现出一种或多种铁氧还蛋白如 fdxC、fdxD、或fdxA的量和/或活性以及一种或多种铁氧还蛋白还原酶如fprAl、fprA2、 fprA3、和fldRl的量和/或活性的增加。本发明也优选涉及这些谷氨酸棒杆菌生物体在甲 硫氨酸生产中的用途。
可以用作起始生物体的常见谷氨酸棒杆菌菌株将是野生型菌株如ATCC13032。然 而，可以优选使用已经过遗传修饰的起始生物体以确保甲硫氨酸生产的增加。这种生物体 可以显现出DSM17323的特征并且因而显现出askfto、Komfbr和metH的量和/或活性增加。 优选的起始菌株也可以具有M2014的特征并且显现出ask "、homfbr, metH、metA、metY和 hskmutated的量和/或活性增加。其他优选的起始生物体可以具有0M469的特征并且显现 出 askfto、IiomfblMiiet^metAAmetYAhskmutated 和 metF 的量和 / 或活性增加并显现出 mcbR 和 metQ的量和/或活性减少。另外其他优选的起始生物体可以具有GK1259的特征并且显现 出 askfbr、homfbr、metH、metA、、metY、hskmutated、tkt (和任选地 g6pdh、zwfa 和 6pgl)和 metF 的量和/或活性增加并显现出mcbR、metQ和sda的量和/或活性减少或者具有M2616的 特征并且显现出 askfbr、hom^, metH、metA、、metY、hskmutated、tkt (和任选地 g6pdh、zwfa 和 6pgl)和metF的量和/或活性增加并显现出mcbR和metQ的量和/或活性减少。如上文已经说明的那样，本发明优选将前述遗传改变不仅引入野生型生物体中， 还引入已经就甲硫氨酸生产而进行了优化的起始生物体中。本发明一个特别优选的实施方 案涉及起始生物体，其中钴(I)胺素依赖性MetH的量和/或活性通过任意上述方法如利用 编码钴(I)胺素依赖性MetH的序列的拷贝数来增加。下表提供了在上文更详细地讨论过的一些酶的概览。提到的基因库登录号指 GenBank或其他可以在网址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/找到或登录的公共数据库。如 本领域所熟知那样，可以通过使用在相同网址上存在的“BLAST”程序使用来自下表的序列 作为“查询”找到下表中所列的任意基因或蛋白质的许多同系物。
权利要求
1.在微生物中产生甲硫氨酸的方法，包括至少以下步骤-培养一种微生物，其中该微生物通过遗传修饰而衍生自起始生物体，从而与所述起始 微生物相比，所述微生物显示了钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统的量和/或活性增加。
2.权利要求1的方法，其中钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统至少包含-选自包含铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白及其功能性同系物和/或功能性片段的组中的 一种电子传递蛋白；和-选自包含铁氧还蛋白还原酶、黄素氧还蛋白还原酶及其功能性同系物和/或功能性 片段的组中的一种电子转移蛋白还原酶；并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性 或至少所述电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性；或者 至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述一种电子转移蛋白还原 酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性与所述起始微生物相比增加。
3.权利要求2的方法，其中所述至少一种电子传递蛋白和/或所述至少一种电子转移蛋白还原酶内源性存 在于所述微生物中和/或衍生自另一种生物体。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述微生物选自包含如下属的组肠杆菌属(Eneterobacteria)、棒杆菌属 (Corynebacterium)且优选其谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、埃希氏菌 属且优选其大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌属(Klebsiella，)、芽孢杆菌属 (Bacillus)且优选其枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、短杆菌属(Brevibacterium)、 放线菌属(actinobacteria)、蓝细菌属(cyanobacteria)、变形菌门(proteobacteria)、 盐杆菌属(halobacteria)、甲烧球菌纲(methanococci)、分枝杆菌属(mycobacteria) > 沙门氏菌属(salmonella)、志贺氏菌属(shigella)、链霉菌属(str印tomyceae)、酵母属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵 母属(Kluyveromyces)、阿舒囊霉属(Ashbya)和曲霉属(Aspergillus)。
5.权利要求4的方法，其中所述微生物选自包含如下物种的组谷氨酸棒杆菌、醋谷棒杆菌 (Corynebacterium acetoglutamicum)、口誉乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilu m)、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)、 ffi H 蜜棒!f 菌(Corynebacteriummelassecola)禾口 Corynebacterium efficiens，优选谷氨酸棒杆菌。
6.权利要求5的方法，其中-所述至少一种电子传递蛋白选自包含fdxC、fdxD、fdxA及其功能性同系物和/或功 能性片段的组；和-所述至少一种电子转移蛋白还原酶选自包含fprAl、fprA2、fprA3、fldRl及其功能性 同系物和/或功能性片段的组；和并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性或至少所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性； 或者至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述电子转移蛋白氧化 还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在谷氨酸棒杆菌中与所述起始 微生物相比增加。
7.权利要求6的方法，其中至少fdxC、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性和/或至少fprAl、 其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在谷氨酸棒杆菌中与所述起始微生物 相比增加，优选在谷氨酸棒杆菌中至少fdxC、其功能性同系物和/或功能性片段和至少 fprAl、其功能性同系物和/或功能性片段二者的量和/或活性增加。
8.权利要求4的方法， 其中-所述至少一种电子传递蛋白选自包含fldA、fldB及其功能性同系物和/或功能性片 段的组；和-所述至少一种电子转移蛋白还原酶选自包含fldR及其功能性同系物和/或功能性片 段的组；并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性 或至少所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性； 或者至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述电子转移蛋白氧化 还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在大肠杆菌中与所述起始微生 物相比增加。
9.权利要求8的方法，其中至少fldA、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性和/或至少fldR、 其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在大肠杆菌中与所述起始微生物相比增 加，优选在谷氨酸棒杆菌中至少fldA、其功能性同系物和/或功能性片段和至少fldR、其功 能性同系物和/或功能性片段二者的量和/或活性增加。
10.权利要求1至9任一项的方法，其中与起始生物体相比，额外地一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功能性 片段的量和/或活性增加 -metA/X, -metZ/Y, -metF, -metH, -thrA, -metE,和/或其中与起始生物体相比，额外地一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功 能性片段的量和/或活性减少 -thrB, -metKo
11.微生物其中所述微生物通过遗传修饰而衍生自起始微生物，从而与所述起始微生物相比，所 述微生物具有增加量和/或活性的钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统。
12.权利要求11的微生物，其中钴(I)胺素依赖性MetH再激活系统包含至少-选自包含铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白及其功能性同系物和/或功能性片段的组中的 一种电子传递蛋白；和-选自包含铁氧还蛋白还原酶、黄素氧还蛋白还原酶及其功能性同系物和/或功能性 片段的组中的一种电子转移蛋白还原酶；并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性 或至少所述电子转移蛋白还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性；或者 至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述电子转移蛋白还原酶、 其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性与所述起始微生物相比增加。
13.权利要求11或12的微生物，其中所述至少一种电子传递蛋白和/或所述至少一种电子转移蛋白还原酶内源地存 在于所述微生物中和/或衍生自另一种生物体。
14.权利要求11至13任一项的微生物，其中所述微生物选自包含以下属的组肠杆菌属、棒杆菌属且优选其谷氨酸棒杆菌、 埃希氏菌属且优选其大肠杆菌、克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属且优选其枯草芽孢杆菌、短杆菌 属、放线菌属、蓝细菌属、变形菌门、盐杆菌属、甲烷球菌纲、分枝杆菌属、沙门氏菌属、志贺 氏菌属、链霉菌属、酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、阿舒囊霉属和曲霉属。
15.权利要求14的微生物，其中所述微生物选自包含以下物种的组谷氨酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、嗜乙酸棒杆菌、 热产氨棒杆菌、杰氏棒杆菌、栖糖蜜棒杆菌和Corynebacterium effiziens，优选谷氨酸棒 杆菌。
16.权利要求15的微生物，其中-所述至少一种电子传递蛋白选自包含fdXC、fdX、fdXA及其功能性同系物和/或功能 性片段的组；和-所述至少一种电子转移蛋白还原酶选自包含fprAl、fprA2、fprA3、fldRl及其功能性 同系物和/或功能性片段的组；和并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性 或至少所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性； 或者至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述电子转移蛋白氧化 还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在谷氨酸棒杆菌中与所述起始 微生物相比增加。
17.权利要求16的微生物，其中至少fdxC、其功能性同系物和/或功能性片段和/或至少fprAl、其功能性同系物 和/或功能性片段的量和/或活性在谷氨酸棒杆菌中与所述起始微生物相比增加，优选在 谷氨酸棒杆菌中至少fdxC、其功能性同系物和/或功能性片段和至少fprAl、其功能性同系物和/或功能性片段二者的量和/或活性增加。
18.权利要求17的微生物， 其中-所述至少一种电子传递蛋白选自包含fldA、fldB及其功能性同系物和/或功能性片 段的组；和-所述至少一种电子转移蛋白还原酶选自包含fldR及其功能性同系物和/或功能性片 段的组；和并且其中至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性 或至少所述电子转移蛋白氧化还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性； 或者至少所述电子转移蛋白、其功能性同系物和/或功能性片段和所述电子转移蛋白氧化 还原酶、其功能性同系物和/或功能性片段的量和/或活性在大肠杆菌中与所述起始微生 物相比增加。
19.权利要求18的微生物，其中至少fldA、其功能性同系物和/或功能性片段和/或至少fldR、其功能性同系物 和/或功能性片段的量和/或活性在大肠杆菌中与所述起始微生物相比增加，优选谷氨酸 棒杆菌中至少fldA、其功能性同系物和/或功能性片段和至少fldR、其功能性同系物和/ 或功能性片段二者的量和/或活性增加。
20.权利要求11至19任一项的微生物，其中与起始生物体相比，额外地一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功能性 片段的量和/或活性增加 -metA/X, -metZ/Y, -metF, -metH, -thrA, -metE,和/或其中与起始生物体相比，额外地一种或多种以下因子、其功能性同系物和/或功 能性片段的量和/或活性减少 -thrB, -metKo
21.权利要求11至20任一项的微生物用于产生甲硫氨酸的用途。
全文摘要
本发明涉及用于通过再激活MetH酶来产生甲硫氨酸的微生物和方法。
文档编号C12R1/15GK102149823SQ200980119537
公开日2011年8月10日 申请日期2009年5月28日 优先权日2008年5月28日
发明者A·黑罗尔德, C·克洛普罗格, H·施罗德, M·威廉斯, O·泽尔德, R·R·优卡姆, S·黑夫纳, T·A·帕特松 申请人:赢创德固赛有限公司