在哺乳动物细胞培养中获得高活细胞密度的方法

专利名称：在哺乳动物细胞培养中获得高活细胞密度的方法
技术领域：
本发明涉及通过使用高葡萄糖进料在补料分批细胞培养中实现高活细胞密度和 长培养寿命的方法。这类方法可用于提高目的分泌蛋白质的产量。
背景技术：
哺乳动物细胞培养物是许多重组蛋白生产工艺的首选系统，因为它能够生产具有 适当的翻译后修饰的蛋白质。随着制造需求的增加，通过提高产物产量来改进工艺效率 的动机越来越强烈。在商业生产工艺中使生物治疗药物或其他蛋白质达到每升几克的生 产水平，要依靠同时优化哺乳动物细胞培养和工程方法两方面。目前高密度、无蛋白质的 哺乳动物细胞培养的固有问题是细胞死亡的问题，在典型的补料分批生物反应器中凋亡 可最高达80%，这种死亡是响应诸如营养物和生长因子缺损、氧损耗、毒素积累以及剪切 应力的条件而诱导产生的(Goswami 等人，Biotechnol Bioeng 62:632-640(1999))。凋 亡会限制最大活细胞密度，加速死亡期的开始和潜在地降低异源蛋白质产量(Chiang和 Sisk, Biotechnol Bioeng 91:779-792(2005) ；Figueroa 等人，Biotechnol Bioeng. 73 211-222(2001)， Metab Eng 5 :230-245(2003)， Biotechnol Bioeng 85 :589-600(2004)； Mercille 禾口 Massie，Biotechnol Bioeng 44:1140—1154(1994))。凋亡是信号传导途径的复杂网络的结果，这些途径从细胞内部和外部引发，以半 胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(胱天蛋白酶)的活化为顶峰，这些酶介导细胞死亡的最后阶段。 参见图1。已采用了各种防止凋亡的方法来在哺乳动物细胞培养的长期生产运行中维持 细胞存活力(Arden 和 Betenbaugh，Trends Biotechnol 22:174-180(2004) ；Vives 等人， Metab Eng 5 124-132 (2003)) 0通过培养基补加生长因子、水解物和限制性营养物来改变 胞外环境，已导致了蛋白质产量增加和凋亡减少(Burteau等人，In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39 :291-296(2003) ；Zhang 和 Robinson，Cytotechnology 48 :59-74 (2005)) 其他的 研究者则转向了化学和遗传策略来从细胞内部抑制凋亡信号转导级联(Sauerwald等人， Biotechnol Bioeng 77 :704-716(2002),Biotechnol Bioeng 81 :329-340(2003]) 研究者已发现，在癌细胞中被发现受到上调的基因的过量表达，可通过防止胱天 蛋白酶活化的上游的凋亡来延长生物反应器中生长的细胞的存活力(Goswami等人，同 ± ；Mastrangelo 等)κ, Trends Biotechnol 16 :88-95(1998) ；Meents 等)κ, Biotechnol Bioeng 80 :706-716(2002) ；Tey 等人，J Biotechnol 79:147-159(2000)和 Biotechnol Bioeng 68 :31-43 Q000))。生产用细胞系中这些蛋白质的上调有效地抑制了细胞内的凋亡 信号转导，从而限制细胞死亡，以维持存活力和在一些情况中提高生物治疗药物的产量。高密度、无蛋白质的哺乳动物细胞培养的另一个固有问题是废物积累及其对 细胞生长的有害影响的问题。细胞培养最普通的两种废产物是乳酸和氨。已设计出 多种策略来解决过量乳酸积累问题，包括1)维持低的培养基葡萄糖浓度(Kurokawa 等人，BiotechnolBioeng 44:95-103(1994) ；Xie 和 Wang，Biotechnol Bioeng 43: 1175-1189(1993) ；Zhang 等人，J Chem Technol Biotechnol 79 :171-181(2004) ；Zhou 等人，Biotechnol Bioeng 46 :579-587(1995)) ；2)给予另外的糖类，包括果糖(Martinelle φ 人，Biotechnol Bioeng 60 :508-517(1998) ；Altamirano 等人，J Biotechnol 110 171-1790004)和J Biotechnol 125 :547-556(2006) ；Walschin和Wu，J Biotechnol 131 168-176(2007)) ；3)通过同源重组或siRNA技术部分地敲除乳酸脱氢酶(LDH)表达；4)过 量表达丙酮酸羧化酶力)使用二氯乙酸(DCA)，这是一种丙酮酸脱氢酶(PDH)活化剂(通 过PDH激酶的抑制)；6)使用草氨酸，这是一种LDH竞争性抑制剂；和7)通过灌注进行去除 (美国专利申请公开No. 2009/0042253A1)。原来认为，许多凋亡途径蛋白质的唯一功能是在线粒体膜结合并通过调控线粒体 渗透性来调节凋亡。最近的发现已证实，参与凋亡信号转导的关键蛋白质会与控制细胞中 代谢和能量稳态的蛋白质发生相互作用并对其有影响。参见Majors等人，Metab Eng 9 317-326(2007)的综述；以及 White 等人，Nat Cell Biol 7 :1021-1028(2005) 在最近的 研究中，对过量表达Bcl-XL的CHO细胞的微阵列分析表明乳酸脱氢酶(糖异生作用中的关 键酶)被上调。某些细胞和病毒会产生在线粒体凋亡途径中起作用的抗凋亡基因。这些基因可 分成以下三组，即1)在途径早期起作用的那些，例如蛋白质的Bcl-2家族的成员；幻在途 径中期起作用以破坏或抑制凋亡体复合物的那些，例如Aven ；和3)在途径晚期起作用的那 些，例如胱天蛋白酶抑制剂如XIAP。已通过使大多数这些基因在哺乳动物表达系统中过量 表达来研究它们的功能，并且在一些情况中已确定了两种或更多种各自衍自途径的不同部 分的基因的组合过量表达的作用。例子包括DBcl-XL与XIAP缺失突变体(ΧΙΑΡΔ)在CHO 细胞中的相加效应(Figueroa 等人，Metab. Eng. 5 :230-245(2003)) ；2) E1B-19K 与 Aven 在 BHK 细胞中的相加效应(Nivitchanyong 等人，Biotechnol Bioeng 98 :825-841(2007))以 及3)8(；1-乂1^、六￥611与乂^^八的相加效应(Sauerwald 等人，同上“2003) ；Sauerwald 等人， Biotechnol Bioeng 94 =362-369 (2006)) 0但是，在这些研究中，没有调查抗凋亡基因对细 胞的代谢状态的影响。因此，需要在哺乳动物细胞培养系统中优化营养物消耗和代谢物积 累条件以实现活细胞密度、寿命和生产率的提高。


图1显示线粒体凋亡途径的组分。图2A-2C显示抗凋亡细胞系的表征。图3显示流式细胞术分析证实EA167和EAX197中的凋亡抗性。图 4A-4C 显示从 E1B-19K、E1B_19K+Aven 禾Π E1B_19K+Aven+XIAP Δ 的转染产生的 抗凋亡细胞系的生长曲线。监测了对照(·)、Ε64( ^)34167(^)和ΕΑΧ197(Ψ)的摇 瓶分批培养物的活细胞密度和存活率。图5A-5C显示从E1B-19K+AVEN士XIAPΔ的转染产生的抗凋亡细胞系的代谢曲线。 监测了对照(·)、ΕΑ167 ( ■)和ΕΑΧ197 ( ▼)细胞系的摇瓶分批培养物的各种代谢物。图6Α和6Β显示抗凋亡细胞系的每日乳酸补给。A) ( ·)，对照；ΕΑ167 □，未补 料；■，补乳酸)；B) ΕΑΧ197 ( Δ，未补料；▼，补乳酸)。图7A-7G显示对照以及抗凋亡细胞系ΕΑ167和ΕΑΧ197在存在或不存在乳酸补料 的情况下的生长和代谢曲线。对照(·)，ΕΑ167(□，未补料；■，补乳酸)，ΕΑΧ197(▲，未
4补料；▼，补乳酸)。图8A-8G显示抗凋亡细胞系在乳酸补料时消耗氨基酸的曲线图。对照(·)， EA167( □，未补料；·，补乳酸)，EAX197( ▲，未补料；▼，补乳酸)。图9A-9D显示对照和抗凋亡细胞系EAX 197在定制的培养基配方中高葡萄糖浓度 下培养的生长曲线和乳酸积累曲线。抗凋亡细胞系EAX197( ■)；对照细胞系( )。图IOA和IOB显示从在含有30mM或60mM葡萄糖的定制培养基配方中培养的从 EAX197和对照宿主细胞系产生的细胞系的抗体滴度。抗凋亡细胞系EAX197( ■)；对照细 胞系(□)。图1IA和1IB显示含有抗凋亡基因Bcl-2的细胞系在高和低细胞接种密度和含有 30mM或60mM葡萄糖的培养基的情况下的VCD (活细胞密度)和滴度。

发明内容
本发明的一个方面是在补料分批真核细胞培养中获得高活细胞密度的方法，所述 方法包括以下步骤a)培养表达一种或多种异源抗凋亡基因和一种或多种目的基因的真核细胞系； 和b)在细胞培养的指数期和稳定期维持高葡萄糖培养基进料。本发明的另一个方面是提高补料分批真核细胞培养中的分泌蛋白质的产量的方 法，所述方法包括以下步骤a)培养表达一种或多种异源抗凋亡基因和一种或多种目的基因的真核细胞系； 和b)在细胞培养的指数期和稳定期维持高葡萄糖培养基进料。
具体实施例方式本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)均以引用方式 并入本文，如同在本文中完整呈现。本文所用的术语“补料分配细胞培养”是指基于向培养物中补加生长限制性营养 物底物的细胞培养过程。补料分批策略通常用于生物工业过程以在生物反应器中达到高细 胞密度。但是，营养物如葡萄糖的加入会导致代谢废产物如乳酸和氨的形成。已报道ISmM 乳酸浓度(Kurano等人，1990)和8mM氨浓度(Hansen和Emborg，1994)对真核细胞生长具 有抑制作用。已设计了多种策略来解决分批补料细胞培养中的乳酸过量积累，这在以上进行了 讨论。在本发明中，提出了降低乳酸浓度及提高活细胞密度和存活力的另选策略。该方法 涉及在宿主细胞系中过量表达一种或多种抗凋亡基因。所产生的抗凋亡细胞系会刺激线粒 体呼吸，从而积累较少的乳酸。因此，这些细胞系当供给高浓度的葡萄糖时也能茁壮成长。 结果，这些抗凋亡细胞系的培养物能达到高活细胞密度。由于其抗凋亡特性，这些细胞系还 具有长寿命。本发明的方法可用于在补料分批细胞培养如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细 胞或杂交瘤细胞培养物中提高活细胞点和存活力。具体地讲，本发明的方法可用于提高CHO细胞培养物的完整活细胞计数(integrated viable cell count，IVCC)。本发明的方法包 括以下步骤培养表达一种或多种异源抗凋亡基因和一种或多种目的基因的细胞系；和在 细胞培养的指数期和稳定期维持高葡萄糖培养基进料。这些细胞系对于开发表达可用于治 疗、诊断或研究目的的目的蛋白质(如肽、肽融合物、生长因子、激素、抗体、设计的锚蛋白 重复蛋白质(designed ankyrin repeat proteins,DARPin)和其他多肽)的生产用细胞系 而言是优异的宿主。可用于本发明方法的CHO细胞系包括CHO-Kl (Invitrogen, Carlsbad, CA)和CHOK lSV(Lonza Biologies，Slough，英国)。可用于本发明方法的骨髓瘤细胞系包 括 NSO 和 Sp2/0。可用于本发明方法的细胞系表达一种或多种异源抗凋亡基因。具体地讲，E1B19K 编码基因(SEQ ID NO 1和2)和Aven编码基因(SEQ ID NO 3和4)是可用的。也可使用 XIAP Δ编码基因(SEQ ID NO :5和6)。这些抗凋亡基因分别是凋亡信号转导途径的早期、 中期和晚期的代表。此外，也可使用Bcl-2A编码基因(SEQ ID NO :7和8)。抗凋亡基因 的表达可通过本领域技术人员知道的转染技术实现。设想到，凋亡信号转导途径的这些阶 段的其他抗凋亡基因如MDM2 (SEQ ID NO :9禾口 10) ^P Bcl-XL (SEQ ID NO 11和12)也会在 本发明方法中有用。在本发明中，表达异源抗凋亡基因的细胞系的使用使得这些细胞系表达更少的 乳酸或者消耗积累的乳酸，从而在培养中维持高葡萄糖进料的同时达到完整活细胞计数 (IVCC)值比对照细胞系高约一倍。通过增加培养物中的生产用细胞系的活细胞密度，从生 物反应器运行获得的产物产量增加。这样增加的生产率可导致复杂生物制品的生产成本较 低，同时由于不存在非活细胞的细胞裂解而能产生优质的产物，因为裂解的细胞会释放出 能降解产物的蛋白酶。因此，这些细胞系对于开发表达目的(一种或多种)蛋白质的生产 用细胞系而言是优异的宿主。在本发明方法中，由于抗凋亡细胞系能够产生较少的乳酸或者消耗掉原本会作为 废物积累的乳酸，从而可以提供能在高葡萄糖条件下以及在葡萄糖耗尽后进行生长的培养 策略。在不同的实施例中，本发明的方法能造成分批补料细胞培养中最高活细胞密度增加、 寿命增加、分泌蛋白质滴度增加、完整活细胞计数增加、细胞钙流量减少和线粒体膜电势增 加。此外，对于从这些细胞系获得高生产率而言，不太必要使用曾被用来限制毒性乳酸和氨 的高水平的补料分批培养策略了。转染后，抗凋亡转基因的染色体整合位点能决定其表达水平。此外，当转染多个抗 凋亡基因时，某个特定抗凋亡转基因的表达水平会影响细胞所拥有的其他抗凋亡蛋白质的 活性，因为许多这些蛋白质直接或间接地发生相互作用以在细胞中引起生理变化。因此， 由于各个抗凋亡基因的协同作用，可能难以确定每个抗凋亡基因对具有多个基因的细胞系 的总体抗凋亡特性的定量贡献。另外，即使所有的细胞克隆都被转染相同的一组转基因，各 细胞克隆之间在抗凋亡特性方面也会存在明显的差异。从下文实例部分给出的结果明确知 道，每个受试的抗凋亡基因都对于改善其所转染的宿主细胞系的抗凋亡特性提供了增量积 极价值。在以上约束条件(constraint)内，三重转染子通常优于双重转染子，而后者又优 于只过量表达一种抗凋亡转基因的转染子。因此，在用适当的表达载体进行转染后，获得了具有ElB-19K、AVen和XIAPΔ的可 变表达水平的克隆。E1B-19K的表达水平相对较低，而具有高E1B-19K表达水平的稀罕克隆要么不稳定，要么生长品质差(数据未显示)。在下文的实例部分，在仅表达E1B-19K的 CHO细胞中只观察到有限的抗细胞死亡的保护作用(图4)。下文实例部分给出的数据证明，与仅表达E1B-19K的细胞系所获得的结果不同的 是，共表达Aven(EA167)或者Aven及XIAP Δ (ΕΑΧ197)的CHOKl细胞系表现出存活力、细胞 密度和IVCC的改善。下文实例部分给出的结果还证明，两种抗凋亡基因在CHO Kl中的表 达会导致在包括星形孢菌素和长时间分批培养在内的刺激存在的情况下，胱天蛋白酶活性 显著下降和线粒体膜电势改善。在下文实例部分，研究了 Ε1Β-19Κ (其为Bcl-XL的功能类似物)与Aven和XIAP Δ 的组合的表达对延迟细胞死亡的作用。XIAP Δ在这些转染细胞中的表达水平与细胞中已经 存在的内源野生型XIAP蛋白相比并不高，这可能是由于在这个系统中需要转染两个质粒。 尽管如此，在ΕΑΧ197中(除了 Aven和Ε1Β-19Κ之外)添加上XIAP Δ，结果使未补加乳酸 的培养物(图5和7)和补加乳酸的培养物(图7)中的最大活细胞密度都一致地增加。的 确，补加乳酸的ΕΑΧ197细胞系能够维持在几乎60%或60%以上的高存活率达14天，这比 ΕΑ167细胞多两天，比对照培养物多四天。ΧΙΑΡΔ的添加很可能提高细胞对胱天蛋白酶活 化的抗性，这在图3中由ΕΑΧ197即使在用星形孢菌素处理后其胱天蛋白酶活性也非常低得 到证实。此外，相比于野生型XIAP蛋白质，XIAP的突变体(ΧΙΑΡΔ)的使用可使凋亡抗性增 强。因此，即使该蛋白质在这些CHO细胞系中的表达并不高，但XIAP的缺失突变体(ΧΙΑΡΔ) 的保护能力可能是显著的。在下文的实例部分，研究了一种或多种抗凋亡基因在细胞代谢中的作用。测定了 表达ElB-19K连同Aven和/或XIAPΔ的抗凋亡细胞系中的营养物消耗和代谢物产量。具 体地讲，在抗凋亡细胞系与对照细胞系之间比较了两种最普通的细胞培养废产物(即乳酸 和氨)的积累。在下文给出的数据中发现，在CD-CHO培养基中进行的摇瓶分批培养中，在 接种后6-7天，对照细胞系积累2.8g/L(31mM)乳酸和12mM氨(图5)，这远高于据报道对 细胞生长具有抑制作用的18mM乳酸浓度(Kurano等人，同上)和8mM氨浓度(Hansen和 Emborg,同上)。这些浓度水平可能是CHO对照细胞系接种8天后所看到的存活率损失的一 部分原因。(图4)。虽然下文给出的数据显示抗凋亡细胞系在早期积累一些乳酸，但这些细胞系在指 数期开始消耗乳酸并继续增加VCD (活细胞密度)远超过对照培养物。在葡萄糖耗尽后能够 立即消耗乳酸的这一能力和凋亡抑制作用的增加，这两个因素任一个或者同时都有助于细 胞继续生长。此外，抗凋亡细胞仅在内源乳酸被耗尽时进入稳定期。为了确定乳酸的消耗 是否是这些经工程改造的细胞系的一般特性，将外源乳酸加到抗凋亡培养物以补充被耗尽 的乳酸(图6)。下文实例部分给出的结果显示，与对照培养物相比(分别对于未补加乳酸 的培养物和补加乳酸的培养物；图7A和B)，抗凋亡培养物消耗了加入的乳酸并维持高VCD 和存活率多出四至七天。对于培养过程而言一个附加好处是，抗凋亡细胞系的培养物中乳 酸水平较低将导致同渗容摩较低和PH较高，这两方面对于产品优质而言都是非常合乎需 要的。之前研究者已检测了杂交瘤、NSO骨髓瘤和CHO培养物中的乳酸消耗 (deZengotita 等人，2000 ；Zhou 等人，1995 和 1997 ；Burky 等人，2007 ；Pascoe 等人，2007)。 但是，这些细胞通常在指数期显示乳酸产生和在稳定期转向消耗，这提示乳酸可以一方面是中间副产物，另一方面是碳水化合物燃料来源(Burky等人，2007 ；Brooks等人，198 。在 下文给出的结果中，对照CHO培养物似乎在稳定期消耗一些乳酸，特别是在“高”葡萄糖培 养基中(图9)，如在之前的研究中所见到的。相比之下，抗凋亡细胞表现出截然不同的曲 线，其中乳酸在指数期消耗，细胞仅在外源乳酸被耗尽时进入稳定期。由乳酸脱氢酶(LDH)催化的丙酮酸向乳酸的转化是可逆的，但十分有利于乳酸形 成，平衡常数为3. 6X 104/M。但是，当糖酵解作用不能够跟上对三羧酸(TCA)的需求时，乳酸 可被转化回丙酮酸，这通过有利于该转化反应的几种LDH同工酶之一进行。被抗凋亡细胞 系消耗的乳酸很可能输送到TCA循环以供细胞能量和氨基酸生产。值得关注的是，抗凋亡 培养物的氨曲线与对照培养物不同，未补加乳酸的细胞系和补加乳酸的细胞系都出现氨产 量反复短暂下滑，并且氨产量总体下降。在TCA循环中氨基酸作为能源利用很可能会导致 氨的积累。因此，氨产量的降低提示，抗凋亡细胞系从氨基酸获得的能量占其TCA能量需求 的相对份额比对照细胞要低，鉴于抗凋亡细胞还消耗更多的乳酸作为碳源，这是合理的。但 应指出的是，氨的下滑是短暂的，抗凋亡细胞仍会利用氨基酸作为能源。的确，抗凋亡细胞 系对异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸这三种氨基酸(均为带支链的氨基酸)消耗得更快，且这个 消耗在补加乳酸的培养物中加剧(图8A-C)。由于抗凋亡细胞系相对于对照细胞系而言生 长延长，这三种氨基酸可形成抗凋亡细胞所需的脂肪酸和其他蛋白质的结构单元，且可作 为TCA循环的能量来源被分解代谢。对于甲硫氨酸也观察到有点类似的消耗曲线(图8D)。与被观察到下降的氨基酸形成对比的是，有些氨基酸被分泌，包括丙氨酸(短暂) 和天冬氨酸(在对照培养物中短暂)。一部分丙酮酸可被丙氨酸氨基转移酶转化成丙氨酸。 这个途径在抗凋亡细胞中可能更活跃，这导致丙氨酸浓度相对于对照细胞系有更大的上升 (图8B)。另一方面，天冬氨酸是天冬氨酸氨基酸家族的第一个成员，是通过用天冬氨酸转 氨酶转化TCA循环中间体草酰乙酸和谷氨酸而随同α-酮戊二酸一起形成的。它的水平在 对照细胞中仅在前六天增加，而在抗凋亡细胞系中连续被耗尽。由于这个反应是可逆的，天 冬氨酸在抗凋亡细胞系生长期早期的耗尽表明对于抗凋亡细胞系来说，TCA循环中的可逆 草酰乙酸产物可能有限。鉴于草酰乙酸还在TCA循环的初始步骤中与乙酰-CoA反应，抗凋 亡细胞系中丙酮酸流入来自乳酸的乙酰-CoA的流量的增加可提高对草酰乙酸的需求。相 比之下，在对照细胞系中对乙酰-CoA的需求可能较少，因为它们不消耗乳酸，因而它们从 草酰乙酸产生天冬氨酸。的确，这个对乙酰-CoA的需求的缺乏会促使在对照细胞中在细胞 培养的前七天乳酸作为乙酰-CoA的替代副产物而积累。或者，对照细胞中乳酸消耗的缺乏 会导致乙酰-CoA供应有限和天冬氨酸产量伴随增加。这些结果表明在表达抗凋亡基因的细胞系中TCA循环能量流动和转换(TCA cycle energetics)提高，尽管还有待更详细的代谢流分析来精确阐释细胞反应。不管被消耗的乳 酸的命运如何，在本发明中已证明抗凋亡细胞系能消耗积累的乳酸，这进而有助于增加它 们的寿命和IVCC。如果由于抗凋亡细胞系能通过消耗积累的乳酸来延长它们的寿命，因而抗凋亡细 胞系是独特的，那么有可能这些细胞系可在含有乳酸的培养基或者含有高于标准浓度的葡 萄糖的培养基中进行培养。虽然当乳酸作为唯一碳源提供时，在任一类型的细胞系中生长 和存活力都不能得到支持，但当乳酸作为葡萄糖之外的一种成分提供时(数据未显示)或 者当乳酸作为废产物积累时，在抗凋亡细胞系中观察到乳酸消耗。这提示抗凋亡细胞不能从丙酮酸进行糖异生作用或者从乳酸获得足够能量，但如果葡萄糖随乳酸一起提供则该细 胞能消耗葡萄糖同时也消耗积累的乳酸或补充到培养物中的乳酸。此外，在含有高葡萄糖 (60mM)的培养基中，抗凋亡细胞系的IVCC (以及VCD和存活率，图9A-C)显著高于对照细胞 系。这是由于这个事实在高葡萄糖的培养基中，对照细胞系积累超过20mM乳酸，这可能已 经导致中毒了。另一方面，抗凋亡细胞系在生长期的早期消耗乳酸，因而能够维持较高数目 的活细胞，体现为IVCC比对照细胞增加170% (图9C)。由于抗凋亡细胞系消耗了乳酸和实现了较高的IVCC，衍自抗凋亡宿主细胞系的表 达目的蛋白质(如治疗性抗体)的生产用细胞系比衍自对照细胞系的生产用细胞系实现了 显著更高的滴度。这种更高的滴度说明了在生产治疗药物或其他目的蛋白质的哺乳动物细 胞系中使用抗凋亡基因的潜在商业益处。本发明现结合以下具体的、非限制性实例进行描述。^M在以下实例中，在摇瓶培养物中分析过量表达抗凋亡基因的CHO细胞系的最高活 细胞密度、寿命、胱天蛋白酶-3活化和线粒体膜电势(MMP)。另外，将这些细胞系中的营养 物消耗和代谢物产量与对照细胞系进行比较，以确定抗凋亡基因的表达是否对哺乳动物细 胞培养系统中的营养物消耗和代谢物积累有任何影响。材料和方法细胞培养将CH0K1SV细胞系(LonzaBiologies，Slough，英国)(指定为对照细胞系 C1013A) 在含有30mM葡萄糖和补充有6mM L-谷氨酰胺(Invitrogen目录号10313-021)的CD-CHO 培养基(目录号10743-011，hvitrogen，Carlsl3ad，CA)中培养。在一些情况中，使用另一 含有不同浓度(包括60mM)的葡萄糖的无动物蛋白质的培养基(定义为高葡萄糖培养基)。 胎牛血清购自Hyclone Labs, Logan, UT(目录号SH30071. 03)。通过Cedex自动细胞计数 仪器armovatis，德国)监测细胞培养物。用以下公式计算完整活细胞计数(IVCC，细胞/ 天 /ml)IVCC (dl) = [VCD(dO)+VCD(dl)]/2+VCD(dO)，式中V⑶=活细胞密度质粒构建 pBUDCE4. 1载体被设计来组成型表达E1B-19K (EF-Ia启动子)(单独或者与 Aven (CMV启动子)一起)，并已得到描述(Nivitchanyong等人，2007)。表达XIAP Δ (CMV 启动子)的载体在Sauerwald等人，2002中描述。空白载体是指原始pBUDCE4. 1载体。模型抗体(Ab#l)表达载体通过将重链和轻链cDNA克隆到谷氨酰胺合酶(GS)表 达载体(根据研究许可证获自Lonza Biologies, Slough，英国)中来构建。抗凋亡细胞系的产生将CH0K1SV 细胞系的指数期培养物转染上l)pBUDCE4. 1 ；2)pBUDCE4. 1-E1B-19K ； 3) pBUDCE4. 1-E1B-19K-Aven ；及 4) pBUDCE4. 1-E1B_19K-Aven 和 pCMV-XIAP Δ。转染是用 Fugene (Roche,目录号1815075，瑞士巴塞尔)按照生产商的推荐进行。转染后两天，将细胞 接种在96孔板中的生长培养基中，该培养基含有300 μ g/ml博来霉素(Zeocin)(对于以上 转染1、2和3) ；300 μ g/ml博来霉素和400 μ g/ml潮霉素(对于转染4)，参见表1。如下所
9述从每个转染扩增出约200个抗生素抗性克隆并分析胱天蛋白酶3/7活性。有前途的克隆 在各自的抗生素不存在下传代十次进行稳定性试验。^ 1细月包系对照
空白
E64
EA63 EAl 12 EA167 EAl 90
EAX64
EAX99 EAX148 EAXl 97最初，通过将空白载体转染到CH0K1SV细胞系中并选择博来霉素抗性集落来产生 对照细胞系。这些细胞系与未转染的对照CH0K1SV相比IVCC平均低大约20%，因此随后在 所有实验中将CH0K1SV用作对照细胞系。然后使用最有前途的抗凋亡细胞系EAX197及对 照细胞系，用GS表达载体按照生产商的推荐来产生表达模型抗体的生产用细胞系。通过比 浊法(Beckman Array System)测量细胞培养物中的抗体。 抗凋亡细胞系的摇瓶培养将选定的抗凋亡细胞系按未补料分批模式在补充有6mM谷氨酰胺和必需的抗生 素选择剂的CD-CHO培养基中进行培养。在一些实验中，给抗凋亡细胞系的分批模式培养物 补加乳酸以补充它们耗尽的乳酸。另外，将选定的表达抗体的细胞系在补充有6mM谷氨酰 胺和60mM葡萄糖的定制配制的无动物蛋白质的培养基中进行培养。胱天蛋白酶3/7活件测定将每个克隆的大约3 X IO5个细胞接种在M孔板中的ImL生长培养基中。在接种 后第4天，将IX IO5个细胞一式三份转移到96孔板。加入星形孢菌素QyM fc)，将细胞 温育16小时，然后通过APO-ONE试剂盒(BD Labs)测定胱天蛋白酶3/7活性。在第10天 重复该程序，例外的是不加星形孢菌素。将在那两天时间胱天蛋白酶3/7活性都显著较低 的克隆扩增到摇瓶(SF)中。通过流式细胞术分析(参见下文)证实选定的克隆的抗凋亡 性质，而在一些情况中是通过测量线粒体膜电势来证实。通过流式细胞术分析抗凋亡克降从每个摇瓶将指数期培养物的大约IXlO6个细胞提取到M孔板中，与星形孢菌 素ΟμΜ fc) 一起温育16小时，收获并用PBS洗涤一次。然后将细胞与CytoPerm(目录号 2075KK, BD Bioscience) 一起温育以将它们固定和透化处理。进行PBS洗涤后，将细胞与
转染的栽体 无
pBUDCE4.1
过量表达的基因
无
无
pBUDCE4.1-ElB-19KE1B19K
pBUDCE4.1-ElB-19K-Aven E1B-19K, Aven
克隆选择方式
无
博来霉素 博来霉素 博来霉素
pBUDCE4.1 -El B-19K-Aven E1B-19K, Aven,
ΧΙΑΡΔ
和 pCMV-ΧΙΑΡΔ
博来霉素，潮霉素FITC标记的抗胱天蛋白酶3 (目录号68654，BD Bioscience)抗体一起温育，然后通过流式 细胞术对它们进行分析。线粒体膜电势(MMP)泖丨定在接种后第6天从摇瓶培养物提取细胞并将其与星形孢菌素(5 μ M fc) 一起温育 2小时。随后将它们洗涤，用亲脂性阳离子染料JC-I (Cayman Labs, Ann Arbor,MI)按照生 产商的推荐进行处理。将板在FL53fend FL595下进行读数，并计算比例。蛋白质印迹.从指定的细胞系收获大约IX IO7个细胞，在PBS中洗涤，并在含有NP-40、 120mM Tris-Hcl、150mM NaCl、0. 2mM PMSF 和 ImM EDTA 的 RIPA 缓冲液中裂解。将每个样品 的50微克胞质蛋白质荷载在4-12% NuPAGE梯度凝胶上，在Novex系统(Invitrogen)中通 过SDS-PAGE进行分离。将分离的蛋白质条带转移到硝酸纤维素上，用以下抗体进行分析
1)抗人E1B-19K 的抗小鼠抗体，1 40 稀释，(目录号 DP-17，CalBiochem，Gibbstown，MD)；
2)抗人Aven的抗兔抗体，1 1，000 稀释，(目录号 612521，BD Bioscience, San Jose, CA)； 和3)抗人XIAP的抗小鼠抗体(目录号616713，BD Bic^cience)。用购自商业来源的已知 数量的纯化E1B-19K、Aven和XIAP (各为约IOng)对以上方案(包括所用的抗体在内)进 行优化和标准化。用ECL检测试剂盒(GE Healthcare, Piscataway, NJ)显示蛋白质条带。
培养基中代谢物浓度的测定用YSI 2700自动分析仪测定所有关键代谢物和废产物的浓度。铵离子浓度通 过流动注射分析(Campmajo等人，1994)进行测定。氨基酸是用反相柱(Waters)通过 HPLC(Waters，Milford，MA)进行测量。实例1抗凋亡细胞系的产生和表征上表1显示了本研究所用的细胞系、在每种情况中进行转染以产生细胞系的表 达质粒和用于分离转染瘤的选择剂的列表。所列的细胞系代表从每次转染产生的多个克 隆。每个细胞系的名称来源于被转染到宿主细胞系中的抗凋亡基因。例如，EAX197是转染 E1B-19K (E), Aven(A)和XIAP Δ⑴的细胞系。“抗凋亡”字眼用来指已被一个或多个的这 些抗凋亡基因转染的细胞系。本研究使用的所有抗凋亡细胞系通过蛋白质印迹、胱天蛋白酶3/7活性和线粒体 膜电势(数据未显示)进行表征。单一转染子Ε64或者双重转染子ΕΑ63、ΕΑ112、ΕΑ167和 ΕΑ190所表达的Ε1Β-91Κ的水平都高于对照的未转染细胞系C1013A中观察到的背景水平。 在所有四个双重转染子中，细胞系ΕΑ112和ΕΑ167同时表达Ε1Β-19Κ( 19KDa)和Aven ( 55KDa)。细胞系EA63和EA190的E1B-19K表达水平显著，但Aven水平极低。在所有四个通 过转染双元载体PBUDCE4. 1-E1B-19K-Aven及pCMV-ΧΙΑΡΔ产生的细胞系即EAX64、EAX99、 EAX148和EAX197中，只有EAX197表达出可检测水平的所有三种蛋白质。在所有的泳道中(包括在以上未转染对照C1013A泳道中)都观察到位于重组 Aven上方的约55kDa的条带，这据认为是内源Aven蛋白，因为它用免疫后的血清能显现，但 用免疫前的血清不能显现(Sauerwald等人，2002，Chau等人，2000)。转染的Aven基因缺 乏前六个氨基酸，这已被证实不会损害蛋白质的生物活性。因此，转染的Aven比其内源对 等物稍小。观察到可能代表Aven的降解产物的40KDa条带，这在所有表达这个蛋白质连同E1B-19K的细胞系中观察到的。之前观察到Aven当与Bcl-XL —起过量表达时(Sauerwald 等人，200 或者与Bcl-2 —起过量表达时(Figueroa，未发表的观察结果)存在类似大小 的降解产物。另外，在三重转染子(包括过量表达ElB-19K、AVen和XIAPΔ的EAX197)中， Aven的表达显著较低。值得关注的是，转染的XIAP Δ的表达水平显著低于完整XIAP蛋白的内源水平。注 意，XIAP和ΧΙΑΡΔ之间表达水平的明显差异可部分地由这两种形式的抗凋亡蛋白的抗体 结合效率的差异来解释。内源XIAP和转基因XIAP Δ之间明显的表达水平差异使这个转染 蛋白在防止凋亡方面的贡献受到怀疑。的确，本研究提示，给定的抗凋亡基因的表达水平与 该蛋白质可能赋予细胞系的凋亡抑制作用的水平之间并不总是存在正相关性。通过APO-ONE对每个抗凋亡细胞系检查了胱天蛋白酶3/7活性，因为这个活性可 指示细胞系对凋亡的抵抗程度。简而言之，在这个测定中，促荧光底物(profluorescent substrate)Z-DEVD-Rl 10被胱天蛋白酶3/7以剂量依赖性方式切割。用星形孢菌素处理 EA167和EAX197以及对照细胞系的指数期培养物16小时以诱导凋亡，然后测量胱天蛋白酶 3/7。将星形孢菌素处理过的对照细胞中的胱天蛋白酶3/7活性特地设定为100%。在这些 条件下，EA167细胞和EAX197细胞的胱天蛋白酶活性分别为对照的30%和35%，这提示这 些细胞系至少部分地对凋亡诱导有抗性(图2A)。作为EA167和EAX197的抗凋亡性质的 进一步证据，将这两个细胞系和对照细胞系的星形孢菌素处理过的培养物用FITC缀合的 抗胱天蛋白酶3抗体进行标记，然后通过流式细胞术进行分析。从图3可见，所有这三个细 胞系，不管未处理过的还是用介质(DMSO)处理的，都具有或更低的胱天蛋白酶3阳性群 体。但是，在星形孢菌素处理后，91%的对照细胞群体为胱天蛋白酶3阳性。相比之下，只 有9%的衍自细胞系EAX197的群体和30%的衍自细胞系EA167的群体为胱天蛋白酶3阳 性，这证实了这两个细胞系的抗凋亡表型。为研究凋亡抗性是否会导致寿命增加，使多个EA细胞系在烧瓶中生长(批式)， 监测活细胞密度(V⑶)和完整活细胞计数(IVCC)。假设细胞的比生产率保持不变，完整活 细胞计数的增加可提高培养物的体积生产率。因此，IVCC可用作参数来筛选能充当生产用 细胞系的开发的宿主的优异抗凋亡细胞系。如图2B所示，具有较低相对胱天蛋白酶3/7活 性的细胞系趋向于产生具有较高IVCC的细胞系。虽然每个EA细胞系相对于对照都显示出 减低的胱天蛋白酶3/7活性，但IVCC与每个细胞系具有的胱天蛋白酶3/7水平之间没有严 格相关性。此外，在抗凋亡表型的程度方面，有些抗凋亡细胞系比它们的姊妹克隆更稳定。 EA167被选择作进一步研究，因为它不但具有很强的抗凋亡活性，而且能在摇瓶培养中茁壮 生长。另外，EA167是这一组中的最稳定的细胞系，由蛋白质印迹检测表明它以高水平表达 Aven0凋亡途径中的许多信号转导分子会与线粒体发生相互作用或者驻留在线粒体中。 在线粒体中，这些蛋白质与线粒体膜发生相互作用，通过调控线粒体渗透性来调节凋亡。因 此，线粒体膜电势(MMP)可充当细胞生理的另一监控指标，据以将EA167和EAX197的抗凋 亡特性与对照进行比较。由图2C的测定结果可见，EA167和EAX197的MMP都比对照细胞 系要尚。实例2E1B-19K对CH0K1SV的活细胞密度的效应
在图4中，将过量表达E1B-19K连同Aven的双重转染子(EA167)、过量表达 ElB-19K连同Aven和XIAPΔ的三重转染子(EAX197)以及仅过量表达E1B-19K的转染 子(E64)与对照(宿主)细胞系进行比较。对照细胞系的最高V⑶达到了 7. 7X IO6个细 胞/ml，E64(仅表达E1B-19K)的最高VCD为8. 9X IO6个细胞/ml，而EA167的最高VCD为 1. 4 X IO7个细胞/ml，EAX197的最高V⑶超过1. 5 X IO7个细胞/ml，相比于对照细胞系增加 190%以上。在接种后第8天和第9天，EA167和EAX197的存活率显示出剧烈下降，这大概 是由于营养物耗尽所致，而对照和E64细胞系的存活率下降较慢(图4B)。图4C显示了对 IVCC的净效应。对照细胞系的IVCC为4. 9X IO7个细胞/天/ml，E64的IVCC为5. 2X IO7 个细胞/天。EA167和EAX197两种抗凋亡细胞系的IVCC (分别为6. 3 X IO7个细胞/天和 6. 6XlO7个细胞/天)显著高于对照细胞系(EA167和EAX197分别高136%和140%)。除了 EA167和EAX197，还有几个其他的抗凋亡细胞系类似地表现出低乳酸产量的 表型(数据未显示)。另外，具有低乳酸产量的特性的野生型细胞系尽管稀罕，但也有报道 (Pascoe 等人，2007)。实例3抗凋亡细胞系的代谢曲线为了在分批培养中将抗凋亡细胞系EA167和EAX197的生理与对照细胞系进行比 较，监测了在分批培养开始时提供的关键营养物和氨基酸即葡萄糖、谷氨酸和谷氨酰胺的 水平。另外还监测了废产物氨和乳酸的积累。图5显示了当EAX197和EA167以及对照细 胞系在摇瓶中的商购CD-CHO培养基中以分批模式培养时这些代谢物的水平。如图5A所 示，接种后到第6天或第7天，所有三个细胞系的培养基都快速耗尽葡萄糖。在所有的天数 里，在抗凋亡细胞系和对照细胞系之间没有看出谷氨酰胺损耗上的显著差异，且三个细胞 系的谷氨酸水平都没有很大变化(数据未显示)。所有三个细胞系在最长达第4天的细胞 生长早期都显示出乳酸积累(图5B)。在对照细胞系中，乳酸继续增加到第6天为止(此 时达到2. 8g/L)，然后观察到轻微下降，乳酸浓度最终达到1. 8g/L。这个数量的乳酸预期能 降低培养物和生物反应器中的PH，而如果pH是通过加入碳酸氢盐来控制的话，则同渗容摩 会升高。所有这些特性，加上其他应激因子，都会对动物细胞造成有毒环境。相比之下，抗 凋亡细胞系中乳酸水平增加的时间较短，从第5天起快速下降，到第7天(EA167)或第8天 (EAX197)乳酸就完全消除。值得关注的是，在图5A中，这两个细胞系的乳酸降至0的时间 点紧靠VCD陡降的时间点之前，这提示细胞存活力的损失是由于培养基中缺乏任何可用的 葡萄糖或乳酸所致。抗凋亡细胞系和对照细胞系之间观察到的另一个差异是氨的曲线(图5C)。EA167 和EAX197中的氨水平在第6天稍微下降(此时乳酸的下降已经开始)，然后最终又增加。 但是，抗凋亡细胞系的总体氨水平低于对照细胞系，这是出乎意料的，因为抗凋亡细胞系与 对照细胞系相比达到了更高的IVCC，因此达到了更全面的细胞生长(图4C)。从以上数据明显看出，抗凋亡细胞系的特性与对照细胞系截然不同。但是，当在稍 微不同的实验条件下检查多个克隆时，在各个抗凋亡转染子之间观察到各种各样的表型。 由于在对照细胞系的克隆分离物中也存在表型变异性，有可能通过采用合适的筛选方案来 从对照细胞系选择稀罕的抗凋亡克隆。在这方面，Mattanovich和Borth(2006)综述了应 用细胞分选来从野生型(对照)细胞系分离具有所需特性的稀罕变体。
13
实例 4乳酸补料的作用在任何时间点在细胞培养物中存在的乳酸量取决于该细胞系分泌的乳酸量减去 它所消耗的乳酸量。为了确定抗凋亡细胞系是否实际上消耗乳酸或者在这些细胞系中净乳 酸产量是否较低，每日监测所有三个细胞系的培养物，并通过加入外源乳酸来消除抗凋亡 细胞系和对照细胞系之间乳酸浓度的任何大差异。如前所观察到，未补料的抗凋亡EA167 和EAX197中的乳酸水平在第5天开始下降(图6A和6B)，到第7天(EA67，未补料)或第8 天(EAX197，未补料)乳酸耗尽。对照细胞系的乳酸曲线继续上升到第6天为止，此后三天 乳酸水平稍微下降，但从未下降到零。在对抗凋亡培养物进行每日监测时，向各个补料分批 培养物加入乳酸，在第7天达2. 5g/L (对于EA167，图6A)和在第8天达2g/L (对于EAX197， 图6B)，以使乳酸水平与对照细胞系相似。即使在加入补充的乳酸的情况下，抗凋亡培养物 与对照相比从第6天到第12天乳酸水平也下降快得多。的确，在EA167补料培养物中从第 6天到第7天乳酸水平从2. 5g/L下降到0. 2g/L，而在对照培养物中同时间乳酸仅从2. 7g/ L下降到2. 4g/L。因此，在加入补充的乳酸后，抗凋亡细胞系与对照细胞系相比乳酸似乎以 更快的速度消耗至少7天。乳酸补加对V⑶和细胞存活率的影响分别在图7A和7B中显示，。如之前所观察 (图5A)，未补料的抗凋亡细胞系的VCD在第8天(EA167)和第9天(EAX197)起快速下降。 这大概是因为在这些培养物中有一种或多种必需的培养基成分(包括葡萄糖和/或乳酸) 已被耗尽。对照细胞系在第7天起表现出缓慢下降。但是，补加乳酸的培养物(EA167，乳酸 补料；EAX197，乳酸补料)表现出VCD下降慢得多，在一个细胞系(EAX197，乳酸补料)中， V⑶稳定在8 X IO6和IOX IO6个细胞/ml之间，直到第14天此培养物最终死亡。对于在培 养基中补加乳酸的这两个抗凋亡培养物，图7B显示的细胞存活率表现出类似的更为缓和 的下降。这些结果提示，抗凋亡细胞系能够同时有效利用内源乳酸和补加的乳酸来保持它 们的活细胞密度和存活力，而对照细胞系不能够实施类似的有效乳酸消耗策略。这个差异 反映在乳酸补料的抗凋亡细胞系的IVCC上，它们的IVCC比未补料的抗凋亡细胞系高几乎 180-220%，比对照培养物高约2；35% -250%。图7D-F中显示的其他营养物和代谢物中大多数表现出与图5的之前在未补料培 养物中观察到的曲线类似的曲线。在培养中的早期时间点葡萄糖和谷氨酰胺被快速消耗。 在未补加乳酸的培养物和补加乳酸的培养物中，在乳酸消耗开始的时间点，抗凋亡细胞系 的氨曲线再次表现出稍微下降。如在之前的实验中一样，即使在所有四个抗凋亡培养物中 IVCC都比对照高得多，但抗凋亡细胞系的最终氨水平都在对照水平之下。补加乳酸的培养 物和未补加乳酸的培养物之间谷氨酸水平有差异，补加乳酸的培养物的谷氨酸消耗比未补 加的细胞系和对照细胞系显著增加。实例 5抗凋亡细胞系合对照细胞系的氨基酸曲线在对照细胞系中以及在未补加乳酸的和补加乳酸的抗凋亡细胞系培养物中定期 监测二十种氨基酸每一种的浓度(表II和图8)。对于谷氨酰胺和谷氨酸之外的氨基酸的 消耗或产生，首先应声明的是，九种必需氨酸(苯丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、色氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和组氨酸)中没有一种被耗尽，如表II中所示。在抗凋亡(未补加的)细胞系培养物和对照细胞系培养物中，天冬氨酸、丝氨酸、色氨酸和半胱氨酸(以 斜体突出显示)几乎完全被耗尽。值得关注的是，所有三种带支链的氨基酸即异亮氨酸、亮 氨酸和缬氨酸(表II中的浅灰色阴影)被抗凋亡细胞系从培养基消耗的速度比对照细胞 快，且这个消耗在补加乳酸的培养物中更明显(图8A-D)。除了谷氨酸外，这三种氨基酸在 补加乳酸的培养物的培养基中的最终水平也很低。其他被消耗比例高的氨基酸(最终浓度 低于它们在培养基中的初始浓度的50%)包括酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸(图8D)和天冬 氨酸(图8E)。还值得考虑在对照细胞系和抗凋亡细胞系之间对被分泌到培养基中的氨基酸进 行比较。如图8E所示，对照细胞系在前六天时间里在培养基中积累天冬氨酸，而所有四个 抗凋亡培养物同期则出现天冬氨酸水平下降。另外，抗凋亡细胞系与对照细胞系相比在前 6天时间里分泌显著更多的丙氨酸(图8F)，而所有的细胞系在较后的时间都消耗掉丙氨 酸。还有，抗凋亡细胞系与对照细胞系相比在整个细胞培养过程中都产生更多的高半胱氨 酸(图8G)。实例6&錢 Hf_#T^〒倾·如果抗凋亡细胞系能利用乳酸，则有可能这些细胞系可以潜在地在会抑制对照细 胞的葡萄糖浓度(由于毒性水平的乳酸的积累)下茁壮生长。另外，有可能这些细胞系 的生长会被含有乳酸作为唯一碳源的培养基支持。不可能使用在之前的实验中使用过的 ⑶-CHO培养基，因为诸如高葡萄糖会导致无法承受的同渗容摩，因此这些实验必须采用新 的培养基。因此，我们将在之前的实验中表现出最高持续生长的EAX197的生长动力学，与 在含有60mM葡萄糖(高葡萄糖)或30mM乳酸的定制配制无动物蛋白质培养基中的对照细 胞系的生长动力学进行比较。在完全不存在葡萄糖的情况下，即在仅存在乳酸的情况下，抗 凋亡细胞系和对照细胞系都没有表现出持续的生长(数据未显示)。当两种细胞系在含有 “高”(60mM)浓度葡萄糖的相同定制配制的培养基中培养时，EAX197表现出比对照细胞系高 的VCD、存活率和IVCC，特别是在细胞培养的较后时间(图9A-C)。与在之前的CD-CHO培养 基中相比，EAX197细胞系表现出的相对于对照的IVCC总体提高较小(130% )，但由于在较 后时间里存活率提高，差异仍是显著的。在“高”葡萄糖中培养的这两个细胞系的乳酸曲线 在图9D中显示。与IVCC的情况一样，这两个细胞系的乳酸曲线与在CD-CHO培养基中观察 到的稍有不同(图5D)。与之前CD-CHO培养基的结果一致的是，抗凋亡细胞系在定制配制 的培养基中开始净乳酸消耗要早于对照(至第二天，如图9D所示)，且最大乳酸水平要低得 多(为1. 2g/L，相比之下对照细胞系为2. 4g/L)对照细胞表现出乳酸的净产生直到第5天 为止，此时对照细胞也开始消耗培养基中的乳酸。由于⑶-CHO培养基是具有专利组分的商 业配方，因此不可能精确比较两种配方中的培养基成分以了解不同配方中不同乳酸消耗曲 线的原因。实例7抗凋亡细胞系在高葡萄糖培养基中的生产率随后将抗凋亡细胞系EAX197连同对照细胞系用作宿主来开发表达模型抗体的生 产用细胞系。对每个细胞系考察了相等数目的克隆，然后将每个宿主产生的最佳克隆以摇 瓶分批模式比较抗体生产率。使用含有60mM(“高”)葡萄糖作为碳源的定制配制培养基以比较它们在高葡萄糖环境中的性能。在标准的培养基中(图10A)，衍自EAX197的生产用细 胞系具有489mg/L的滴度，这比具有337mg/L滴度的对照细胞系增加145%。相同的细胞系 在葡萄糖培养基中(图10B)具有687mg/L的滴度，这比对照细胞系(38%ig/L)增加178%。 产量的提高至少部分上是由于EAX197的IVCC与对照细胞系相比增加188%所致(数据未 显不)。实例8E1B19K+AVEN+/-XIAP A的过量表汰在阻断凋亡中的作用线粒体中的电位级联的主要激活物在图1中显示。在我们开发抗凋亡CHO细胞 系的尝试中，我们选择了三个在凋亡的早期、中期和晚期起作用的抗凋亡基因。这三个基 因是E1B19K (E)、AVEN(A)和XIAP Δ (X)。将广泛使用的转染宿主细胞系CH0K1SV转染上 E1B19K+AVEN加/不加XIAP Δ。筛选了大量的转染瘤，从每个转染选择几个克隆作进一步研 究。对这些细胞系的生长曲线的研究提示，它们达到非常高的VCD，且一般来讲它们的IVCC 比对照高约一倍。抗凋亡细胞系在接种后到第8天失去存活力，但自第10天起通过消耗乳 酸恢复存活力。表达E1B19K+AVEN士XIAPΔ的抗凋亡细胞系的培养物流体其氨和乳酸水平 减低或者不可检测，且从培养基耗尽谷氨酸。实例9使用Bcl_2d来增加抗体滴度以上结果证明，抗凋亡细胞系积累的乳酸比对照细胞少，且抗凋亡培养物的存活 率可在高葡萄糖培养基中保持。在以下摇瓶分批实验中，将表达Bcl-2d及抗体重链和轻链 的抗凋亡细胞系(C2088B)以不同的接种密度接种在标准(4. 8g/L)和高浓度葡萄糖(9. 5g/ L)中。结果显示当抗凋亡细胞系以le6个细胞/ml的密度接种在含有9. 5g/L葡萄糖的培 养基中时，在接种后第7天达到14e6个细胞/ml的最高V⑶(图11A)，抗体滴度为2g/L。 相比之下，在标准条件下培养的C2088B (0. 3e5个细胞/ml接种和4. 8g/L)的最高VCD为 7e6个细胞/ml，抗体滴度为lg/L(图11B)。这体现为高葡萄糖条件与标准条件(即在含有 4. 8g/L葡萄糖的培养基中接种密度为0. 3e6个细胞/ml)相比抗体滴度增加200%。本发明现已完整描述，但对于本领域的普通技术人员而言将显而易见的是，在不 脱离本发明所附权利要求的精神和范围的前提下，可对本发明进行多种修改和变型。
权利要求
1.一种提高补料分批真核细胞培养中的活细胞密度的方法，所述方法包括以下步骤a)培养表达一种或多种异源抗凋亡基因和一种或多种目的基因的真核细胞系；和b)在细胞培养的指数期和稳定期维持高葡萄糖培养基进料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述CHO细胞系是CHO-Kl。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述CHO细胞系是CH0-K1SV。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞系是骨髓瘤细胞系。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述骨髓瘤细胞系是NS0。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述骨髓瘤细胞系是Sp2/0。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞系是杂交瘤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述高葡萄糖培养基进料含有约60mM葡萄糖。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗凋亡基因为E1B19K和AVEN。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗凋亡基因还包括XIAPΔ。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗凋亡基因包括Bcl-2Δ。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述CHO细胞系在细胞培养指数期消耗积累的乳酸。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述CHO细胞系在细胞培养指数期分泌的乳酸比 不含一种或多种抗凋亡基因的CHO细胞系要少。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述最高活细胞密度(VCD)增加。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养物的寿命延长。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养物的滴度增加。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养物的完整活细胞计数(IVCC)增加。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞钙流量减少。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述线粒体膜电势增加。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述目的基因编码抗体重链和抗体轻链。
全文摘要
本发明公开了提高补料分批真核细胞培养物的存活率的方法。
文档编号C12N5/071GK102083961SQ200980122991
公开日2011年6月1日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月13日
发明者H·多赖, Y·S·邝 申请人:森托科尔奥索生物科技公司