用于预测对抗癌疗法的反应性的组合方法

专利名称：用于预测对抗癌疗法的反应性的组合方法
技术领域：
本发明涉及抗癌疗法领域。具体而言，本发明涉及预测对各种类型的抗癌疗法的 反应性的方法。具体而言，本发明涉及对罹患癌症个体的疗法的改进。
背景技术：
组织金属蛋白酶抑制剂-I (TIMP-I)组织金属蛋白酶抑制剂-1 (TIMP-I)是基质金属蛋白酶(MMP)的4种内源抑制剂 的家族成员之一，其基因位于X染色体上。TIMP-I是一种25kDa蛋白，其以1 1化学计量 比与大部分MMP结合。TIMP-I存在于多种组织和体液中并储存在血小板的α -颗粒中，并 在激活后被释放。虽然TIMP-I的主要功能被认为是抑制ΜΜΡ，但是已描述了 TIMP-I的一些 其他功能，例如抑制凋亡、调节细胞生长和血管生成。此外，一些研究已表明TIMP-I还可能 在导致恶性表型的早期过程中发挥作用。本发明人已描述对血浆TIMP-I的测量在检测早期结肠直肠癌中提供了高特异性 和高敏感性。另外，本发明人已证明，对术前或术后样本中血浆TIMP-I的测量在患有早期 结肠直肠癌的患者中形成了强的和阶段不依赖的预后信息。通过测量原发性乳腺癌组织中 的TIMP-I蛋白，本发明人或其他人已证明高的肿瘤组织总TIMP-I水平与更短患者存活时 间相关。已报道了 TIMP-I在调节凋亡中的作用，并提出了其发生的两条可能途径。这两种 途径都支持TIMP-I抑制凋亡的观点。第一，在体外和体内，胞外基质的蛋白水解降解导致乳腺上皮分化丧失和凋亡。这 表明，胞外基质的完整性和对细胞-基质相互作用的保护是确保乳腺上皮细胞存活的关键 因素。通过抑制MMP，TIMP-I能够抑制胞外基质的降解，从而可能抑制凋亡。通过将在乳 腺中过表达ΜΜΡ-3的小鼠与TIMP-I转基因小鼠杂交，Alexander和合作者证明了这样的 TIMP-I的凋亡抑制作用，观察到TIMP-I降低了由MMP-3诱导的乳腺上皮凋亡。基膜的微小 分解可造成蛋白水解活性所引起的凋亡，但也已经推测整联蛋白(integrin)介导的信号 传递发挥了部分作用。第二，不依赖MMP-抑制而出现的TIMP-I的抑制凋亡作用也已被证实。在人乳腺上 皮细胞中，内源性TIMP-I抑制由细胞粘附的消除所诱导的凋亡的能力已被证实。这表明， TIMP-I能够将细胞从凋亡中挽救回来而不需要稳定胞外基质和细胞-基质相互作用。已 经丧失全部MMP抑制作用的被还原或烷基化的TIMP-I仍然能够有效地抑制Burkitt’ s淋 巴瘤细胞系的凋亡，这一事实支持了抑制凋亡中不依赖MMP抑制。这种凋亡抑制作用的机 制目前尚不清楚，但是关于可能被TIMP-I调节的信号通路已有了不同的提议。在人乳腺上 皮细胞中TIMP-I的过表达与黏着斑激酶(FAK)——一种通常参与传导细胞存活信号的激 酶——的更有效活化和组成活性相关。同时，Burkitt’s淋巴瘤细胞中TIMP-I蛋白表达的 上调增加抗凋亡蛋白Bcl-\的表达。据推测，对细胞信号转导的调节是通过TIMP-I与细 胞表面受体的相互作用介导的，因为Burkitt’ s淋巴瘤细胞中TIMP-I的抗凋亡作用通过单克隆抗体中和所分泌的TIMP-I而被消除。这种观点由证明TIMP-I与位于乳腺上皮细胞表 面的CD63结合的研究进一步支持。因此，TIMP-I似乎能够通过两种不同的机制抑制凋亡。通过抑制MMP，TIMP-I稳 定了胞外基质和细胞-基质相互作用，从而抑制由胞外基质分解引起的凋亡。但是，TIMP-I 还通过不依赖其抑制胞外基质的蛋白水解降解的能力的机制来抑制凋亡。后一机制可以通 过TIMP-I与细胞表面调节参与凋亡的细胞内信号通路的受体的相互作用来介导。本发明人的两项临床研究已提出检测TIMP-I蛋白的预测价值(Schrohl et al.， 2006 and Sorensen et al. 2007)。在khrohl等人的研究中，使用ELISA在乳癌提取物中 测量了 TIMP-I蛋白。这些作者描述到，高TIMP-I蛋白水平与患有转移性乳癌的患者缺乏对 化学疗法的反应性有关。在Sorensen等人的研究中，这些作者描述了由ELISA确定的血浆 TIMP-I蛋白水平的预测价值。该研究的结果表明，与血浆中有低TIMP-I蛋白水平的患者相 比，患有转移性结肠直肠癌并有高血浆TIMP-I水平的患者在基于依立替康(irinotecan) 的化学疗法治疗后客观反应率(objective response rate)和存活都下降。这两项研究与 本发明人获得的临床前数据一致，表明TIMP-I基因缺乏的癌细胞对化学疗法的敏感性增 力口 (Davidsen et al. 2006)。拓扑异构酶II αΤ0Ρ2Α基因位于染色体17q21上，与HER2在同一个扩增子，它在其中编码拓扑异构 酶IIa。该酶参与对DNA拓扑结构的调节，并且在转录、复制和重组过程中对遗传物质的完 整性是重要的。在这些过程中，拓扑异构酶II α催化双链DNA的断裂和复合。拓扑异构酶 IIa的表达依赖于细胞周期，与静止细胞系相比指数增长时具有显著较高水平。已证明， 所述酶的量与细胞增殖有关。癌基因活化的主要遗传机制是通过扩增(amplification)导 致蛋白过表达并为肿瘤提供选择生长优势的基因。T0P2A基因的扩增被报道存在于7-14% 的乳癌患者中并以相似频率缺失。相比之下，HER2癌基因在20-30%的乳癌患者中扩增 (Harris et al. 2002)。拓扑异构酶II α是蒽环类的药理学靶标，多项研究已表明Τ0Ρ2Α基因畸变—— 特别是扩增——可以预测原发性乳癌患者对基于蒽环类的化学疗法的反应性(Park et al. 2003, Press et al. 2005，Tanner et al. 2005，Knoop et al. 2005)。对于 T0P2A 缺失 的患者可用的数据较少，但也已经观察到对该患者群的更好的治疗结果。但是，对T0P2A扩 增或缺失的分析仅能将大约20%的乳癌患者群鉴定为对蒽环类敏感。在估计50%的高风 险乳癌患者可从辅助性蒽环类受益的情况下，该数值应可预见。在一项研究中发现T0P2A扩增和拓扑异构酶II α蛋白之间的重要关联。拓扑异 构酶II α蛋白的过表达出现在93%的Τ0Ρ2Α扩增病例中。然而，相反地，仅有20%的过表 达病例有扩增。其他研究未表明相似的相关性(Petit et al. 2004,Mueller et al. 2004， Durbecq et al. 2004)。Jergensen等人公开了关于在乳癌中疗法选择的药物诊断可能性综述，包括 T0P2A基因和HER-2基因畸变的预测价值。该综述陈述道，许多临床研究已经表明具有 T0P2A基因畸变——特别是扩增——的肿瘤患者，与具有正常T0P2A基因状态的患者相 比可从基于蒽环类的化学疗法获得显著更好的效果。WO 2007/112746公开了使用T0P2A 基因畸变对高风险乳癌患者进行预后评估的方法。所述用于进行预后评估的方法包括确定T0P2A基因畸变状态的步骤和在后期估计患者无复发存活概率或总存活概率的步骤， 所述估计的基础是与确定状态对应的预先限定的风险率(hazard ratio)或预先确定的 Kaplan-Meier曲线。公知的是，术语预后涵盖未治疗患者中的疾病结局，因此预后评估与预 测评估不同，后一术语涵盖患者从具体治疗受益的可能性。

发明内容
因此，从上述内容看来，本领域中需要可鉴定将从蒽环类治疗中受益的其他患者 的其他预测性标记。因此，本发明的一个目标涉及对以拓扑异构酶II α抑制剂疗法——例如含有蒽环 类的拓扑异构酶II α抑制剂疗法——治疗的患者选择的改进。具体而言，本发明的一个目标是提供一种通过鉴定相关比例的乳癌患者而解决现 有技术的上述问题的方法，在所述患者中拓扑异构酶II α抑制剂疗法有效的可能性将很
尚ο因此，本发明的一个方面涉及用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α 抑制剂疗法的反应性的方法，所述方法包括以下步骤a.在从所述个体获得的样本中确定，在所述样本中包含的肿瘤细胞中不存在 TIMP-I蛋白，或者在所述样本的肿瘤细胞中存在TIMP-I DNA畸变，并且b.确定在染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中存在任何染色体DNA畸变，或者 存在所述扩增子中包含的基因的异常蛋白表达c.若染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中存在染色体DNA畸变，以及/或者所 述扩增子中包含的基因的蛋白表达在所述肿瘤细胞中是异常的，以及/或者若所述肿瘤细 胞不存在TIMP-I蛋白，以及/或者若所述肿瘤细胞在所述TIMP-I基因的两个等位基因之 一或两个上包含所述TIMP-I DNA畸变，则将所述个体归类为具有高的对拓扑异构酶II α 抑制剂疗法有反应的可能性，并且d.若在所述T0P2A/HER2扩增子中不存在染色体DNA畸变，或者没有所述扩增子中 包含的任何基因编码的蛋白在所述肿瘤细胞中异常地表达，以及若TIMP-I蛋白存在于所 述肿瘤细胞中以及/或者若所述TIMP-I的两个等位基因都不包含所述TIMP-I DNA畸变， 则将所述个体归类为具有低的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性。第二方面涉及一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α抑制剂疗法 的反应性的方法，所述方法包括以下步骤a.在从所述个体获得的样本中确定，在所述样本中包含的肿瘤细胞中不存在 TIMP-I蛋白，并且b.确定在所述样本的肿瘤细胞中存在任何T0P2A DNA畸变c.若T0P2A DNA畸变存在，以及/或者若所述肿瘤细胞不存在TIMP-1蛋白，则将 所述个体归类为具有高的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性，并且d.若没有T0P2A DNA畸变存在，以及若TIMP-1蛋白存在于所述肿瘤细胞中，则将 所述个体归类为具有低的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性。在一个实施方案中，所述癌症选自乳癌、肉瘤、卵巢癌和肺癌。在一个优选实施方 案中，所述癌症为乳癌。
本发明的另一个方面涉及一种在个体中治疗癌症的方法。包括a.根据前述权利要求任一项预测对拓扑异构酶II α抑制剂疗法的反应性，并且b.为具有高的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性的所述个体选择一 种拓扑异构酶II α抑制剂疗法，c.对所述个体实施所述拓扑异构酶II α抑制剂疗法。在一个实施方案中，在所述治疗方法中使用的拓扑异构酶II α抑制剂为蒽环类， 例如4-表柔比星G-Epirubricin)，在另一个实施方案中它与环磷酰胺和5-氟尿嘧啶组合 使用或与紫杉烷组合使用。本发明的又一方面提供了一种用于预测对拓扑异构酶II α抑制剂疗法的反应性 的试剂盒，包括a.适合用于确定生物样本中T0P2A/HER2扩增子中的染色体DNA畸变——例如 T0P2A或HER2 DNA畸变——的试剂，以及b.适合用于确定生物样本中的TIMP-I DNA畸变或者确定TIMP-I蛋白水平的试 剂。
具体实施例方式已经公知的是，在乳癌细胞中测量T0P2A DNA畸变可预测从辅助性含蒽环类的化 学治疗药物方案获得的益处(Knoop et al JCO 2005)。然而，由于仅有大约20%的原发性 乳癌患者会在其肿瘤细胞中出现T0P2A DNA畸变，该方法仅能鉴定出20%的乳癌患者群具 有增加的从辅助性蒽环类治疗受益的可能性。考虑到已知有大约50%的原发性乳癌患者从 蒽环类治疗受益，该数值应可预见。许多其他可能的预测标记已与T0P2A DNA畸变测量结合，例如HER2，但对于所鉴 定亚群中的无病存活期(disease free survival)或总存活期(overall survival),这两 种生物标记之间未出现累加效应(Knoop et al. , JCO 2005)。因此，目前，没有生物标记 (DNA、mRNA或蛋白)在与T0P2A DNA畸变结合时显示比仅T0P2A DNA畸变测量更优的对从 蒽环类治疗受益的预测。这一点进一步得到了 0’ Malley等人2009的支持，他们表明结合 T0P2A和HER DNA测量不能将所述预测价值提高到高于两种标记分别得到的预测价值。以前已经报道，在来自转移乳癌患者的原发性肿瘤中TIMP-I蛋白的高肿瘤提取 物蛋白水平与获得对化学疗法(含有蒽环类和不含蒽环类的药物组合)的客观反应性 (objective response)的可能性降低有关。这种可能性随TIMP-1的表达增加而降低。通 过 ELISA 测量 TIMP-I 蛋白(Schrohl et al.，Clin Cancer Res 2006)。Serensenet al.Clin Cancer Res 2007涉及化学疗法对患有转移结肠直肠癌的 患者的作用。在此研究中，TIMP-I与CEA结合——所述研究表明与CEA的结合并未带来任 何累加效应。本发明人首次发现，在乳癌细胞中缺乏TIMP-I免疫反应性与从辅助性蒽环类治 疗而不是含非蒽环类的化学疗法中受益的可能性相关。在一项包括649名高风险乳癌患者 的回顾性研究中，本发明人证明，与肿瘤细胞缺乏TIMP-I免疫反应性且接受含非蒽环类的 化学疗法方案(CMF)的辅助性治疗的患者或者肿瘤细胞显现TIMP-I免疫反应性且接受含 蒽环类或非蒽环类的化学疗法的辅助性治疗的患者相比，肿瘤细胞缺乏TIMP-I免疫反应性的患者从辅助性蒽环类治疗受益最大。因此，本发明使得能够鉴定具有高的从辅助性蒽环类治疗受益的可能性的高风险 乳癌患者乳癌细胞中缺乏TIMP-I免疫反应性鉴定出大约20%的患者具有高的从辅助性 蒽环类治疗受益的可能性。实际上，通过TIMP-I免疫组织化学，有可能鉴定出大约20%的 被安排进行辅助性治疗的患者具有高的从所述治疗受益的可能性。另一方面，TIMP-I免疫 组织化学还使得能够鉴定出大约80%的被安排进行辅助性含蒽环类治疗的患者在用毒性 弱得多的CMF治疗也将同样表现良好。或者，可用在乳癌辅助性治疗中使用的蒽环类之外 的任何其他活性药物治疗这80%的患者，所述活性药物例如紫杉烷、氨甲喋呤、环磷酰胺、 5-氟尿嘧啶和吉西他滨(gemcitabine)(实施例1)。本发明人首次报道，在相同肿瘤细胞中结合TIMP-I乳癌细胞免疫反应性测量和 T0P2A DNA畸变测量可得到累加预测价值，即这两项检测的每一项均鉴定出大约20%的 患者具有高的从辅助性含蒽环类的化学疗法受益的可能性，由于在这两个患者群之间仅有 4%的重叠，结合测定的效果是累加的。因此，本发明使得能够鉴定出几乎两倍的乳癌患者具有高的从辅助性蒽环类治疗 受益的可能性T0P2A DNA畸变测量可鉴定出大约20%的患者具有高的从辅助性蒽环类治 疗受益的可能性，缺乏TIMP-I免疫反应性测定鉴定出大约20%的患者具有高的从辅助性 蒽环类治疗受益的可能性。实际上，通过结合测定，将有可能鉴定出大约40 %的被安排进行 辅助性治疗的患者具有高的从所述治疗中受益的可能性。另一方面，所述结合测定还使得 能够鉴定出大约60%的被安排进行辅助性含蒽环类治疗的患者在用毒性弱得多的CMF治 疗也将同样表现良好。或者，可用在乳癌辅助性治疗中使用的蒽环类之外的任何其他活性 药物治疗这60%的患者，所述活性药物例如紫杉烷、氨甲喋呤、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶和吉 西他滨(实施例3)。本发明人最近发现乳癌细胞中有TIMP-I基因畸变(缺失和扩增)。本申请公开了一项随机接受以环磷酰胺、氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(CMF)，或者环 磷酰胺、4-表柔比星和5-氟尿嘧啶(CEF)辅助性治疗的641名乳癌患者中的T0P2A基因畸 变和TIMP-I蛋白的肿瘤细胞含量的研究。满足点(endpoint)是无病存活期((DFS)。如 以前对本组患者的报道(Knoop et al), T0P2A畸变可预测从CEF而非从CMF受益(DFS增 加)。当使用VT7抗TIMP-I的单克隆抗体进行TIMP-I免疫组织化学分析时，本发明人发现 大约80%的患者的肿瘤细胞表现出TIMP-I免疫反应性。剩余20%的肿瘤没有TIMP-I肿 瘤细胞免疫反应性。当进行统计存活期分析时，发现肿瘤细胞缺乏TIMP-I免疫反应性与满 足点DFS显著相关，患者有更长的DFS。相反地，在接受CMF的患者中没有观察到DFS差异 与TIMP-I免疫反应性相关。当将T0P2A和TIMP-I分析的结果结合时，可以看到这两种生物标记在预测对CEF 的反应性时是累加的，而在CMF治疗的患者中没有观察到这两种生物标记的结合效应。所 述累加效应是基于这样的事实，即具有T0P2A基因畸变的患者和其肿瘤细胞缺乏TIMP-I免 疫反应性的患者之间重叠很少(重叠4%)。由于这两组的数量几乎相等，因此这两种生物 标记的结合使得能够被预测为CEF反应者的患者的数量加倍，同时并不减弱每种生物标记 的预测价值的效力。这意味着通过使用结合的T0P2A和TIMP-I测试，可以鉴定将从辅助性蒽环类治疗受益最大的患者。另一方面，所述结合测试还可用于鉴定接受含非蒽环类化学疗法方案同 样表现良好或者接受另一药物结合(例如包含紫杉烷的结合)表现甚至更好的大约60%患 者。应当以T0P2A与HER2结合时缺乏累加效应(Knoop et al 2005)和在结肠直肠癌药物 预测中TIMP与CEA结合时缺乏累加效应(Serensen et al.，2007)的角度看待本发明。为了将现有的方法扩展用于对乳癌患者进行疗法效果预测，除了本领域目前可用 的方法，本文公开了进行这类预测的新方法，其中所述预测的基础是确定的T0P2A基因畸 变状态(其中术语“状态”是指畸变的存在与否，并且如果畸变存在，则指畸变的类型—— 扩增或缺失)，或者T0P2A蛋白状态，和对TIMP-I蛋白或TIMP-I DNA畸变的确定。本发明 的实施方案可包含以下步骤在来自患者的乳癌组织样本中确定T0P2A基因和TIMP-I基因 的畸变状态或蛋白状态；并且基于这类测试的结果，可估计与含非蒽环类化学疗法相比，个 体患者从含有蒽环类的化学疗法受益的可能性。例如，应向癌细胞中T0P2A畸变和/或无TIMP-I免疫反应性的患者提供含有蒽环 类的化学疗法，而其余患者接受蒽环类或非蒽环类将表现同样好。基于蒽环类的剧毒性，向 所述其余患者提供含非蒽环类的化学疗法方案应是正确的。因此，本发明给出的方法是基于所述的意外发现，即通过引入对乳癌细胞中的 TIMP-I肿瘤细胞免疫反应性的分析，有可能使在乳癌患者中的T0P2A检测的预测价值几乎 加倍。本发明的基础是一种用于预测癌症患者是否将从抗癌疗法受益的方法，其中所述 抗癌疗法的功效取决于肿瘤细胞中的肿瘤组织T0P2A基因畸变和癌细胞中TIMP-I免疫反 应性的不存在，所述方法包括确定来自患者肿瘤组织的细胞是否有T0P2A基因畸变或者缺 乏TIMP-I免疫反应性，并且若观察到T0P2A DNA畸变或免疫反应性的缺乏，那么确定所述 患者将最有可能从具体抗癌疗法受益。在本申请中，所述抗癌疗法优选指拓扑异构酶II抑制剂疗法。本发明的预测方法优选包括，通过测量选自肿瘤组织样本、血液样本、血浆样本、 血清样本、尿液样本、粪便样本、唾液样本和来自胸腔或腹腔的浆液样本的样本来确定来自 患者肿瘤组织的细胞是否具有T0P2A基因畸变和/或缺乏TIMP-I免疫反应性。所述检测 方法通过DNA水平检测，例如原位杂交、RNA印迹、QRT-PCR和差异展示的mRNA水平检测和 例如蛋白印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、ELISA和RIA的蛋白水平检测便利地进行。为建立TIMP-I蛋白的阈值水平以便于确定个体患者对拓扑异构酶II α抑制剂治 疗的抗性/敏感性，可进行回顾性/前瞻性临床试验。回顾性地，保存的肿瘤组织或血液或尿液，或者唾液或任何其他体液获自其癌症 疾病出现复发的患者，并且已知所述患者对具体抗癌治疗怎样反应。对于肿瘤组织提取物， 将所述组织勻浆并测量每个患者个体样本的TIMP-I蛋白水平。对于体液，可将样本稀释然 后通过本文所述的一种方法确定TIMP-I蛋白的浓度。对于福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤 组织，可对原发肿瘤或取自转移病灶的组织进行常规免疫组织化学。因此，本发明的一方面涉及一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α 抑制剂疗法的反应性的方法，所述方法包括以下步骤a)在从所述个体获得的样本中确定，在所述样本中包含的肿瘤细胞中不存在 TIMP-I蛋白，或者在所述样本的肿瘤细胞中存在TIMP-I DNA畸变，并且
b)确定在染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中存在任何染色体DNA畸变，或者 存在所述扩增子中包含的基因的异常蛋白表达c)若染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中存在染色体DNA畸变，以及/或者所 述扩增子中包含的基因的蛋白表达在所述肿瘤细胞中是异常的，以及/或者若所述肿瘤细 胞不存在TIMP-I蛋白，以及/或者若所述肿瘤细胞在TIMP-I基因的两个等位基因之一或 两个上包含所述TIMP-I DNA畸变，则将所述个体归类为具有高的对拓扑异构酶II α抑制 剂疗法有反应的可能性，并且d)若T0P2A/HER2扩增子中不存在染色体DNA畸变，或者没有所述扩增子中包含的 任何基因编码的蛋白在所述肿瘤细胞中异常地表达，以及若 ΜΡ-1蛋白存在于所述肿瘤 细胞中以及/或者若TIMP-I的两个等位基因都不包含所述TIMP-I DNA畸变，则将所述个 体归类为具有低的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性。上文提到的在染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子包括T0P2A基因和HER2基因。因此，本发明的一个实施方案涉及在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α 抑制剂疗法的反应性，其中在染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中的染色体DNA畸变是 T0P2A DNA畸变，所述扩增子中包含的基因的蛋白表达是拓扑异构酶II α表达。本发明的另一个实施方案涉及在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α抑制 剂疗法的反应性，其中在染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中的染色体DNA畸变是HER2 DNA畸变，所述扩增子中包含的基因的蛋白表达是ErbB2表达。在一个优选实施方案中，所述方法包括以下步骤a.在从所述个体获得的样本中确定，在所述样本中包含的肿瘤细胞中不存在 TIMP-I蛋白，并且b.确定在所述样本的肿瘤细胞中存在任何T0P2A DNA畸变c.若T0P2A DNA畸变存在，以及/或者若所述肿瘤细胞不存在TIMP-1蛋白，则将 所述个体归类为具有高的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性，并且d.若没有T0P2A DNA畸变存在，以及若TIMP-1蛋白存在于所述肿瘤细胞中，则将 所述个体归类为具有低的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性。本发明的一个实施方案是一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α 抑制剂疗法的反应性的方法，所述方法包括以下步骤a.在从所述个体获得的样本中确定，在所述样本中包含的肿瘤细胞中不存在 TIMP-I蛋白，并且b.确定在所述样本的肿瘤细胞中存在任何HER2 DNA畸变c.若HER2 DNA畸变存在，以及/或者若所述肿瘤细胞不存在TIMP-1蛋白，则将所 述个体归类为具有高的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性，并且d.若没有HER2 DNA畸变存在，以及若TIMP-1蛋白存在于所述肿瘤细胞中，则将所 述个体归类为具有低的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性。本发明的一个实施方案是一种在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α抑制 剂疗法的反应性的方法，所述方法包括以下步骤a.在从所述个体获得的样本中确定，在所述样本中包含的肿瘤细胞中存在TIMP-I DNA畸变，并且
b.确定所述样本的肿瘤细胞中存在任何T0P2A DNA畸变c.若T0P2A DNA畸变存在，以及/或者若所述肿瘤细胞在TIMP-I基因的两个等位 基因之一或两个上包含所述TIMP-I DNA畸变，则将所述个体归类为具有高的对拓扑异构酶 IIa抑制剂疗法有反应的可能性，并且d.若没有T0P2A DNA畸变存在，以及若所述TIMP-1基因的两个等位基因都不包含 所述TIMP-I DNA畸变，则将所述个体归类为具有低的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反 应的可能性。本发明的另一个实施方案是一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶 II α抑制剂疗法的反应性的方法，所述方法包括以下步骤a.在从所述个体获得的样本中确定，在所述样本中包含的肿瘤细胞中存在TIMP-I DNA畸变，并且b.确定所述样本的肿瘤细胞中存在任何HER2 DNA畸变c.若HER2 DNA畸变存在，以及/或者若所述肿瘤细胞在所述TIMP-1基因的两个 等位基因之一或两个上包含所述TIMP-I DNA畸变，则将所述个体归类为具有高的对拓扑异 构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性，并且d.若HER2 DNA畸变不存在，以及若TIMP-1基因的两个等位基因都不包含所述 TIMP-I DNA畸变，则将所述个体归类为具有低的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的 可能性。Τ0Ρ2Α基因和HER2基因都位于染色体17q21的T0P2A/HER2扩增子上，而TIMP-I 基因位于X染色体上。所述方法提供一种在不降低风险率的情况下鉴定癌症患者数目几乎两倍于常规 方法的手段，所述癌症患者具有高的从抗癌疗法例如CEF治疗受益的可能性。在本发明的一个实施方案中，包含所述生物标记(HER2、T0P2A和TIMP-1)的样本 选自肿瘤组织样本、血液样本、血浆样本、血清样本、尿液样本、粪便样本、唾液样本和来自 胸腔或腹腔的浆液样本及其组合。本发明的一个实施方案涉及一种用于在患有癌症的个体中预测对抗癌疗法的反 应性的方法，所述癌症选自乳癌、肉瘤、卵巢癌和肺癌。在一个实施方案中，所述肉瘤可以是软组织肉瘤。在另一个实施方案中，所述肺癌可以是非小细胞肺癌。在一个优选实施方案中，在本发明涉及一种用于在患有乳癌的个体中预测对抗癌 疗法的反应性的方法。测量DNA畸变的方法与DNA畸变有关的畸变可通过DNA测量例如但不限于原位杂交、PCR方法、差异展 示、DNA斑点印迹、DNA印迹或其组合来确定。因此，在一个实施方案中，DNA基因畸变的水平可通过DNA测量例如但不限于原位 杂交、PCR方法、差异展示、DNA斑点印迹、DNA印迹或其组合来确定。在一个优选实施方案中，所述原位杂交通过FISH(荧光原位杂交)来确定。在又一个优选实施方案中，DNA畸变通过FISH来确定，所述FISH包括分别使用包 括靶向所述T0P2A基因区的一部分和/或所述HER2基因区和/或所述TIMP-I基因区的一部分的标记DNA探针的探针混合物，以及包括靶向染色体17和X染色体着丝粒区的荧光素 标记探针的探针混合物。与蛋白表达异常的异常可通过蛋白印迹、免疫组织化学、ELISA或RIA确定。因此，在一个实施方案中，异常蛋白表达通过蛋白水平测量确定，所述蛋白水平测 量例如蛋白印迹、免疫组织化学、ELISA或RIA。DNA畸变和/或异常蛋白表达还可反映为RNA水平，例如有关基因的mRNA转录物， 如导致无功能转录物的一级转录物的异常剪接。因此，导致RNA畸变的DNA畸变可通过RNA例如mRNA测量确定，例如但不局限于 RNA印迹、RNA斑点和定量PCR方法。因此，在一个实施方案中，肿瘤细胞中的DNA畸变或蛋白表达与所述样本的肿瘤 细胞中的异常mRNA水平有关。DNA 畸变DNA畸变是指染色体(包括染色体的特定区例如扩增子)内的任何DNA畸变；以 及基因或基因区内的任何DNA畸变。DNA畸变包括DNA扩增、DNA缺失、基因点突变和易位、 DNA表遗(印igenetic)修饰如DNA甲基化以及其组合。DNA畸变包括导致所述DNA下游异 常转录或由所述DNA编码的蛋白异常表达的任何DNA畸变。缺失或扩增意义上的DNA畸变 是指所述基因的全部或部分缺失或扩增。表遗畸变可导致有关基因的沉默，并反映在缺乏 所述基因编码的蛋白或至少蛋白表达异常。因此，一个实施方案涉及一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α 抑制剂疗法的反应性的方法，包括确定Τ0Ρ2Α基因畸变，其中所述基因畸变选自Τ0Ρ2Α DNA 扩增、Τ0Ρ2Α DNA缺失、Τ0Ρ2Α基因点突变和Τ0Ρ2Α DNA易位、Τ0Ρ2Α DNA表遗修饰例如DNA 甲基化以及其组合。在一个具体实施方案中，肿瘤细胞中的Τ0Ρ2Α DNA畸变或拓扑异构酶II α蛋白增 加与所述样本的肿瘤细胞中的Τ0Ρ2Α mRNA水平异常有关。再一个实施方案涉及一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α抑制 剂疗法的反应性的方法，包括确定HER2基因畸变，其中所述HER2基因畸变选自HER2基因 扩增、HER2 DNA缺失、HER2基因点突变和HER2 DNA易位、HER2 DNA表遗修饰如DNA甲基化 以及其组合。在一个具体实施方案中，肿瘤细胞中的HER2 DNA畸变或ErbB2蛋白增加与所述样 本的肿瘤细胞中HER2 mRNA水平异常有关。再一个实施方案涉及一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α抑制 剂疗法的反应性的方法，包括确定TIMP-I基因畸变，其中所述肿瘤细胞包含至少一种导致 TIMP-I蛋白表达缺乏的TIMP-I DNA畸变，所述TIMP-I DNA畸变选自TIMP-I等位基因之一 缺失、TIMP-I的两个等位基因缺失、TIMP-I等位基因之一部分缺失、TIMP-I的两个等位基 因部分缺失、TIMP-I DNA点突变、TIMP-I DNA倒位、TIMP-I DNA易位、TIMP-I DNA表遗修 饰如DNA甲基化以及其组合。在一个具体实施方案中，肿瘤细胞中所述任何的TIMP-I DNA畸变或不存在 TIMP-I蛋白与所述样本的肿瘤细胞中TIMP-I mRNA水平异常——例如所述样本中不存在 TIMP-I mRNA-有关。
在本文中术语“不存在TIMP-I蛋白”应理解为在所述癌细胞和/或肿瘤组织基 质细胞中完全没有TIMP-I免疫反应性。然而，应说明的是，在其癌细胞和/或肿瘤组织基 质细胞中有弱TIMP-I免疫反应性的患者比在其癌细胞和/或肿瘤组织基质细胞中有较强 TIMP-I免疫反应性的患者更多地从蒽环类受益，而具有弱TIMP-I免疫反应性的患者比在 其癌细胞和/或肿瘤组织基质细胞中完全没有TIMP-I免疫反应性的患者更少地从蒽环类 治疗受益。可通过简单的显微术来进行TIMP-I免疫反应性(阳性细胞的数目和/或强度) 评估，但也可以通过数字化分析仪来客观地估计。将所述细胞分类为0、+1、+2和+3。0应理解为癌细胞和/或肿瘤组织基质细胞无 TIMP-I免疫反应性，+1应理解为癌细胞和/或肿瘤组织基质细胞具有弱TIMP-I免疫反应 性。+2应理解为癌细胞和/或肿瘤组织基质细胞具有TIMP-I免疫反应性。+3应理解为癌 细胞和/或肿瘤组织基质细胞具有强的TIMP-I免疫反应性。在本发明的一个实施方案中客观地评估了分类和区分TIMP-I免疫反应性的方 法。所述评估是基于TIMP-I免疫反应性细胞(癌和/或肿瘤组织基质细胞)的数目和/ 或免疫反应性的强度。可通过简单的显微术来进行TIMP-I免疫反应性(阳性细胞的数目 和/或强度)评估，但也可以通过数字化分析仪来客观地估计。因此，在本发明的一个优选实施方案中，若所述免疫反应性低于+1，例如低于 +0. 9，例如低于+0. 8，例如低于+0. 7，例如低于0. 6，例如低于0. 5，例如低于0. 4，例如低于 0. 3，例如低于0. 2，例如低于0. 1，则癌细胞和/或肿瘤组织基质细胞不存在TIMP-I。因此，在本发明的一个优选实施方案中，若所述免疫反应性为0，则癌细胞和/或 肿瘤组织基质细胞不存在TIMP-I。因此，在本发明的一个优选实施方案中，若TIMP-I免疫反应性水平低于+2，例如 低于+1. 9，例如低于+1. 8，例如低于+1. 7，例如低于1. 6，例如低于1. 5，例如低于1. 4，例如 低于1. 3，例如低于1. 2，例如低于+1，如低于+0. 9，例如低于+0. 8，例如低于+0. 7，例如低 于0. 6，例如低于0. 5，例如低于0. 4，例如低于0. 3，例如低于0. 2，例如低于0. 1，则患者有 可能从蒽环类(例如拓扑异构酶II α )受益。优选在0-+2的范围内，例如在0. 1-+1. 5的 范围内，例如在+0. 5-+1.2的范围内，例如在0-+0. 5的范围内，例如在0-+1的范围内。在一个优选实施方案中，若TIMP-I免疫反应性水平低于+1，例如低于+0. 9，例如 低于+0. 8，例如低于0. 7，例如低于0. 6，例如低于0. 5，例如低于0. 4，例如低于0. 3，例如低 于0.2，例如低于0.1，则患者有可能从蒽环类(例如拓扑异构酶IIa抑制剂)受益。在一个优选实施方案中，若TIMP-I蛋白水平为0，则患者有可能从蒽环类(例如拓 扑异构酶II α抑制剂)受益。应理解的是，TIMP-I免疫反应性与存在于癌细胞和/或肿瘤组织基质细胞中的 TIMP-I蛋白量类似。在另一个实施方案中，与参照样本相比，TIMP-I基因扩增了多于参照样本的1. 1 倍，例如多于1. 2倍，例如多于1. 3倍，例如多于1. 4倍，例如多于1. 5倍，例如多于1. 6倍， 例如多于1. 7倍，例如多于1. 8倍，例如多于1. 9倍，例如多于，例如多于3倍，例如多于4 倍，例如多于5倍，例如多于6倍，例如多于7倍，例如多于8倍，例如多于9倍，例如多于10 倍，例如多于15倍，例如多于20倍，例如多于30倍，例如多于40倍，例如多于50倍，例如 多于100倍。在本发明的一个实施方案中，与参照样本相比，TIMP-I基因扩增了 1.1-2.0，例如 1. 2-1. 9，例如 1. 3-1. 8，例如 1. 4-1. 7，例如 1. 5-1. 7，例如 1. 7-1. 9，例如 1. 8-1. 9。在另一个实施方案中，与参照样本相比，T0P2A基因扩增了多于参照样本的1. 1 倍，例如多于1. 2倍，例如多于1. 3倍，例如多于1. 4倍，例如多于1. 5倍，例如多于1. 6倍， 例如多于1. 7倍，例如多于1. 8倍，例如多于1. 9倍，例如多于，例如多于3倍，例如多于4 倍，例如多于5倍，例如多于6倍，例如多于7倍，例如多于8倍，例如多于9倍，例如多于10 倍，例如多于15倍，例如多于20倍，例如多于30倍，例如多于40倍，例如多于50倍，例如 多于100倍。在本发明的一个实施方案中，与参照样本相比，T0P2A基因扩增了 1. 1-2.0，例 如 1. 2-1. 9，例如 1. 3-1. 8，例如 1. 4-1. 7，例如 1. 5-1. 7，例如 1. 7-1. 9，例如 1. 8-1. 9。在另一个实施方案中，与参照样本相比，HER2基因扩增了多于参照样本的1. 1倍， 如多于1.2倍，例如多于1.3倍，例如多于1.4倍，例如多于1.5倍，例如多于1.6倍，例如 多于1.7倍，例如多于1.8倍，例如多于1.9倍，例如多于，例如多于3倍，例如多于4倍，例 如多于5倍例如多于6倍，例如多于7倍，例如多于8倍，例如多于9倍，例如多于10倍， 例如多于15倍，例如多于20倍，例如多于30倍，例如多于40倍，例如多于50倍，例如多 于100倍。在本发明的一个实施方案中，与参照样本相比，HER2基因扩增了 1. 1-2.0，例如 1. 2-1. 9，例如 1. 3-1. 8，例如 1. 4-1. 7，例如 1. 5-1. 7，例如 1. 7-1. 9，例如 1. 8-1. 9。蛋白表达异常蛋白表达异常是指所述蛋白表达中的任何异常，例如所述蛋白的水平、不存在所 述蛋白、功能性方面的功能异常(例如导致蛋白无功能的突变)和所述蛋白的细胞定位方 面的功能异常。不存在一般是指在样本中和所述样本的肿瘤细胞中不存在可检测的蛋白。在一个实施方案中，所述蛋白表达异常被确定为超过对照样本的参照水平的倍 数。在另一个实施方案中，所述蛋白表达异常被确定为低于参照水平的倍数。在另一个涉及拓扑异构酶II α蛋白表达异常的实施方案中，与参照样本相比，拓 扑异构酶II α蛋白过表达了多于参照样本的2倍，例如多于3倍，例如多于4倍，例如多于 5倍，例如多于6倍，例如多于7倍，例如多于8倍，例如多于9倍，例如多于10倍，例如多于 15倍，例如多于20倍，例如多于30倍，例如多于40倍，例如多于50倍，例如多于100倍。在另一个涉及ErbB2蛋白表达异常的实施方案中，与参照样本相比，ErbB2蛋白过 表达了多于参照样本的2倍，例如多于3倍，例如多于4倍，例如多于5倍，例如多于6倍， 例如多于7倍，例如多于8倍，例如多于9倍，例如多于10倍，例如多于15倍，例如多于20 倍，例如多于30倍，例如多于40倍，例如多于50倍，例如多于100倍。本发明的一个优选实施方案是一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶 IIa抑制剂疗法的反应性的方法，其中所述肿瘤细胞不存在TIMP-I蛋白。参照“参照(reference)，，是指任何合适的参照，例如对来自非癌症个体或肿瘤中的非 恶性细胞(例如肿瘤组织基质细胞)的相应生物样本库的相应测量值。一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α抑制剂疗法的反应性的方 法，其中将获自一个群体的参照用于确定DNA畸变水平或蛋白表达水平。所述参照可用于设置样本中的信号例如TIMP_l、ErbB2或拓扑异构酶II α免疫反 应性的基线，以确定111^-1丄计82或拓扑异构酶11(1蛋白是否在样本(例如应用于ELISA测定的样本)中异常表达。在一个具体实施方案中，将所述参照用于设置基线值/分隔值(cut-off value)， 用于确定样本中是否存在TIMP-I蛋白，例如用于通过蛋白印迹、免疫组织化学、ELISA、流 式细胞术或RIA确定是否存在TIMP-I蛋白。在一个实施方案中，所述参照选自样本内参照、样本间参照和内参。本发明的方法的一个实施例包括确定有关基因的DNA畸变，其中包括靶向同一染 色体的参照。因此，对于染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中的DNA畸变，这样的在 T0P2A基因或HER2基因中的DNA畸变，可使用靶向染色体17的着丝粒区的参照来检测有关 基因的等位基因是否已缺失或扩增。因此，根据本发明，一个实施方案涉及一种用于预测对拓扑异构酶II α抑制剂疗 法的反应性的方法，其中通过原位杂交例如FISH(荧光原位杂交)检测DNA畸变。在另一个实施方案中，所述DNA畸变被确定为与所述样本中包含的内参序列的平 均比值。在一个实施方案中，对于肿瘤组织样本，所述内参是所述样本中包含的二倍体非恶 性细胞。在本发明的一个优选实施方案中，所述肿瘤组织样本是肿瘤组织基质细胞。在又一实施方案中，所述参照是标记的探针信号，例如靶向染色体17和/或X染 色体的着丝粒区的荧光素标记的或得克萨斯红-5标记的探针信号。在一个具体实施方 案中，所述探针是肽核酸(PNA)基探针。该类参照适合应用于FISH，例如用于确定染色体 17q21的T0P2A/HER2扩增子中的DNA畸变(例如T0P2A基因或HER2基因中的DNA畸变) 的FISH测定。在另一个实施方案中，将相似类型的参照用于FISH测定中，来确定TIMP-I 基因中的DNA畸变。DNA畸变可被确定为与所述样本中包含的参照序列的平均比值。因此，在一个实施方案中，所述DNA畸变被确定为与所述样本中包含的内参序列 的平均比值。在一个实施方案中，所述内参序列位于染色体17的着丝粒区。在一个具体实施方案中，所述内参序列是染色体Χα-卫星(Cen X)。可使用与基因特异探针结合相应的信号和与参照探针的着丝粒区探针结合相应 的信号的比值来确定DNA畸变例如DNA基因等位基因的缺失或基因扩增。因此，在一个实施方案中，若TIMP-l/Cen X的平均比值小于0. 8，则所述样本的肿 瘤细胞含有TIMP-I基因缺失，若所述比值大于0. 8且小于2. 0则为正常。在本发明的一 个实施方案中，TIMP-l/Cen X的平均比值小于0. 7，例如小于0. 6，例如小于0. 5，例如小于 0. 4，例如小于0. 3，例如小于0. 2，例如小于0. 1，例如在0. 1-0. 8的范围内，例如在0. 2-0. 7 的范围内，例如在0. 3-0. 6的范围内，例如在0. 4-0. 5的范围内，并且若所述比值大于0. 8 且小于2.0则为正常。在另一个实施方案中，若TOP2A/Cen X的平均比值小于0. 8则所述肿瘤细胞含有 T0P2A基因缺失，或者若TOP2A/Cen X的平均比值大于2. 0则所述肿瘤细胞含有T0P2A基因 扩增，并且若所述比值大于0. 8且小于2. 0则为正常。在本发明的一个实施方案中，T0P2A/ Cen X的平均比值小于0. 7，例如小于0. 6，例如小于0. 5，例如小于0. 4，例如小于0. 3，例 如小于0.2，例如小于0. 1，例如在0. 1-0.8的范围内，例如在0. 2-0.7的范围内，例如在 0. 3-0. 6的范围内，例如在0. 4-0. 5的范围内，并且若所述比值大于0. 8且小于2. 0则为正常。在第三个实施方案中，若TOP2A/Cen X平均比值小于0. 8则所述肿瘤细胞含有 HER2基因缺失，或者若HER2/Cen X平均比值大于2. 0则所述肿瘤细胞含有HER2基因扩增， 并且若所述比值大于0. 8且小于2. 0则为正常。在本发明的一个实施方案中，HER2/Cen X 的平均比值小于0. 7，例如小于0. 6，例如小于0. 5，例如小于0. 4例如小于0. 3，例如小于 0. 2，例如小于0. 1，例如在0. 1-0. 8的范围内，例如在0. 2-0. 7的范围内，例如在0. 3-0. 6的 范围内，例如在0. 4-0. 5的范围内，并且若所述比值大于0. 8且小于2. 0则为正常。在另一个实施方案中，将参照用于确定DNA畸变水平或蛋白表达水平。所述参照 可获自于一个群体，例如非癌症个体群或癌症个体的组合群，例如一组CMF治疗的癌症个 体。在再一实施方案中，所述参照是正常的二倍体遗传背景。例如，对于确定T0P2A DNA基因扩增或T0P2A DNA基因缺失意义上的T0P2A DNA 畸变水平的合适参照是来自非癌症个体的相应生物样本中的T0P2A DNA等位基因的平均信 号，或者是所述肿瘤样本的非恶性细胞中的平均信号。在一个实施方案中，对DNA畸变或蛋白异常的确定在来自于所述个体的留存 (archive)材料如含有肿瘤组织的石蜡块上进行。拓扑异构酶II α抑制剂疗法在一个实施方案中，所述拓扑异构酶II α抑制剂疗法包括向患有癌症的个体给 予包含至少一种拓扑异构酶II α抑制剂的组合物。在一个优选实施方案中，用于拓扑异 构酶II α抑制剂疗法的组合物包含至少一种选自如下的蒽环类4-表柔比星、柔红霉素、 柔红霉素(脂质体型)、多柔比星、多柔比星(脂质体型)、表柔比星、去甲氧基柔红霉素 (Idarubicin)和米托蒽醌。所述拓扑异构酶II α抑制剂可单独给药或与至少一种其他化学治疗物组合给 药。在本发明的一个实施方案中，所述拓扑异构酶II α抑制剂疗法是CEF治疗，其中CEF 是指环磷酰胺、4-表柔比星和5-氟尿嘧啶。在另一个实施方案中，拓扑异构酶II α抑制剂 疗法是除以拓扑异构酶II α抑制剂之外还以环磷酰胺、紫杉烷和/或5-氟尿嘧啶治疗。用于所述拓扑异构酶II α抑制剂疗法中的任何化合物都可以前药的形式给药。 因此，在一个实施方案中，至少一种选自环磷酰胺、紫杉烷、5-氟尿嘧啶和扑异构酶II α抑 制剂例如蒽环类的药物是所述药物的前药形式。所述拓扑异构酶II α抑制剂疗法可以是脂质体胶囊化的。在一个实施方案中，所述拓扑异构酶II α抑制剂疗法包括凋亡或有丝分裂崩溃 的诱导剂。在另一实施方案中，所述拓扑异构酶II α抑制剂疗法选自新辅助性疗法、辅助性 治疗和转移性疾病的疗法。治疗癌症的方法本发明的另一方面涉及基于对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性的预 测进行的癌症治疗。所述方面涉及一种在个体中治疗癌症的方法，包括a.根据前述任一项权利要求预测对拓扑异构酶II α抑制剂疗法的反应性，
b.为具有高的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性的所述个体选择一 种拓扑异构酶II α抑制剂疗法，并且c.对所述个体施用所述拓扑异构酶II α抑制剂疗法。在所述治疗方法的一个实施方案中，所述拓扑异构酶II α抑制剂是选自但不限 于如下的蒽环类4-表柔比星、柔红霉素、柔红霉素(脂质体型)、多柔比星、多柔比星(脂 质体型)、表柔比星、去甲氧基柔红霉素和米托蒽醌，或者它们的组合。在另一个实施方案中，所述拓扑异构酶II α抑制剂疗法包含于一种还包含环磷 酰胺和5-氟尿嘧啶的组合物中。在另一个实施方案中，所述拓扑异构酶II α抑制剂疗法包含于一种还包含紫杉 烷的组合物中。试剂盒本发明的第三方面涉及一种用于预测对拓扑异构酶II α抑制剂疗法的反应性的 试剂盒，包括a.适合用于确定生物样本中T0P2A/HER2扩增子中的染色体DNA畸变——例如 T0P2A或HER2 DNA畸变——的试剂，以及b.适合用于确定生物样本中的TIMP-I DNA畸变或者确定TIMP-I蛋白水平的试 剂。应注意的是，在本发明的一方面的上下文中描述的实施方案和特征也可适用于本 发明的其他方面。本申请中引用的所有专利和非专利参考文献都以引用的方式全文纳入本文。下面，将在如下非限制性实施例中进一步详细地描述本发明。风险率“风险率” (HR)是指从治疗例如拓扑异构酶II α抑制剂疗法中受益——例如如无 病存活期延长——的可能性。在本发明的一个实施方案中，HR描述了以从CMF治疗中受益为参照，从CEF治疗 受益的可能性。HR为1是指在接受治疗的组和参照组之间无差别。因此，HR为0. 5是指与 CMF治疗的患者相比，CEF治疗的患者出现复发的风险降低50%。纳入置信区间以改善评 估的统计效力。实施例1的表1举例说明了风险率的用途，以评估从例如拓扑异构酶II α抑制剂 疗法的治疗受益的可能性。将参照组(本例中是CMF治疗的患者)的HR设为1。因此，本发明的一个优选实施方案涉及一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑 异构酶II α抑制剂疗法的反应性的方法，其中对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可 能性通过风险率确定。定义在进一步详细讨论本发明之前，首先定义以下的术语和约定“抗癌疗法”这一术语用于目的在于治愈或减轻癌症的任何非手术治疗方案。虽 然实例在以下列出，但是抗癌疗法可以是化学疗法、放射疗法、抗激素疗法和/或生物学疗 法。“拓扑异构酶II α抑制剂疗法”是指包括使用至少一种拓扑异构酶II α抑制剂的抗癌化学疗法。拓扑异构酶II α抑制剂可与其他化学疗法药物例如环磷酰胺、紫杉烷和/ 或5-氟尿嘧啶组合给药。“蒽环类”是指一组拓扑异构酶II α抑制剂4-表柔比星、柔红霉素、柔红霉素(脂 质体型)、多柔比星、多柔比星(脂质体型)、表柔比星，去甲氧基柔红霉素和米托蒽醌。将通过以下的非限制性附图和实施例在下文描述本发明。


图IA示出的Kaplan Meier曲线图显示了接受辅助性CEF的患者的无病存活期。 根据以癌细胞中+或-免疫反应性评分的肿瘤细胞TIMP-I免疫反应性将患者分类。在选 择时间点的风险患者的数目在χ-轴下方给出。图IB示出的Kaplan Meier曲线图显示了接受辅助性CMF的患者的无病存活期。 根据以癌细胞中+或-免疫反应性评分的肿瘤细胞TIMP-I免疫反应性将患者分类。在选 择时间点的风险患者的数目在χ-轴下方给出。图IC示出的Kaplan Meier曲线显示了以CEF或CMF治疗的其癌细胞中无TIMP-1 免疫反应性的患者的无病存活期。图2A示出的Kaplan Meier曲线图显示了接受辅助性CEF的患者的无病存活期。 根据是否存在肿瘤细胞T0P2A DNA畸变将患者分类。在选择时间点的风险患者的数目在 χ-轴下方给出。图2B示出的Kaplan Meier曲线图显示了接受辅助性CMF的患者的无病存活期。 根据是否存在肿瘤细胞T0P2A DNA畸变将患者分类。在选择时间点的风险患者的数目在 χ-轴下方给出。图2C示出的Kaplan Meier曲线显示了以CEF或CMF治疗的其癌细胞中有T0P2A DNA畸变的患者的无病存活期。图3A示出的Kaplan Meier曲线图显示了接受辅助性CEF的患者的无病存活期。 根据以癌细胞中+或-免疫反应性评分的肿瘤细胞TIMP-I免疫反应性以及存在(不正常) 或不存在(正常)T0P2A DNA畸变将患者分类。在选择时间点的风险患者的数目在χ-轴下 方给出。图;3Β示出的Kaplan Meier曲线图显示了接受辅助性CMF的患者的无病存活期。 根据以癌细胞中+或-免疫反应性评分的肿瘤细胞TIMP-I免疫反应性以及存在(不正常) 或不存在(正常)T0P2A DNA畸变将患者分类。在选择时间点的风险患者的数目在χ-轴下 方给出。图3C示出的Kaplan Meier曲线显示了以CEF或CMF治疗的其癌细胞中没有 TIMP-I免疫反应性和/或有T0P2A DNA畸变的患者的无病存活期。图 4A 和 4B以 CMF 或 CEF 治疗的 HT (HER2 和 TIMP-1)状态(图 4A)和 2T (T0P2A 和 TIMP-1)状 ( 4B) TW^C^yilft^^l^ySSi (invasive disease-free survival) ^Kaplan Meier曲线。图 5A 和 5BForest曲线图示出在具有HER2阳性和HER2阴性肿瘤的患者之间、在具有T0P2ADNA异常和非异常(正常)肿瘤的患者之间、在具有TIMP-I阳性和阴性肿瘤的患者之间、在 具有HT反应型和非反应型肿瘤的患者之间以及在具有2T反应型和无反应型肿瘤的患者之 间的无浸润性疾病存活期(图5A)和总存活期(图5B)的治疗效果的风险率估值比较。图 6A-D该图显示了 TIMP-I免疫组织化学实例。6A 大部分上皮癌细胞是TIMP-I阳性的。 6B:上皮癌细胞中分散的和聚集的TIMP-I免疫反应性。6C:阴性对照。6D:成纤维细胞而 不是上皮癌细胞中的TIMP-I免疫反应性。图 7A 和 7B已知TIMP-I状态的乳癌患者的可能的无浸润性疾病存活期(IDFS)(图7A)和总 存活期(OS)(图7B)。T+和T-分别是指在其乳癌细胞中有和没有TIMP-I免疫反应性的患 者。CEF和CMF是指接受的辅助性化学疗法。图 8A 和 8BForest曲线图显示了在TIMP-1亚群和ER亚群患者中以CMF为基线的CEF效应的 多变量模型的风险率。图8A:IDFS;图8B:0S。图 9TIMP-I FISH分析显示了在上皮乳癌细胞中TIMP-I DNA扩增。 实施例在本文中使用了下列缩写DBCG 丹麦乳癌合作组织(Danish Breast Cancer Cooperative Group)CMF 环磷酰胺、氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶CEF 环磷酰胺、4-表柔比星和5-氟尿嘧啶CAF 环磷酰胺、4-表柔比星和5-氟尿嘧啶T0P2A正常在T0P2A基因中未发现DNA畸变HER2正常在HER2基因中未发现DNA畸变HT-敏感型HER2基因扩增，或者Her2免疫组织化学3+和TIMP-I阴性2T-敏感型T0P2A基因畸变和TIMP-1阴性TMA:组织微阵列ER或ER免疫染色雌激素或孕酮受体染色FISH:荧光原位杂交IHC:免疫组织化学IDFS 无浸润性疾病存活期OS 总存活期实施例1在患有原发性乳癌的患者(n = 647)中，从TIMP-I肿瘤细胞免疫反应性的缺乏预 测辅助性基于蒽环类的化学疗法的效果。方法患者和方法简而言之，DBCG (丹麦乳癌合作组织)试验89D是一项比较CEF (环磷酰胺、表柔比星和氟尿嘧啶)与CMF(环磷酰胺、氨甲喋呤和氟尿嘧啶)的开放标记的随机III期试验。 89D试验准入者为结阳性(或肿瘤大小> 5cm)且激素受体阴性的乳癌患者，以及结阴性且 II或III级恶性肿瘤的绝经前患者。所有患者都签署所述试验的知情同意书。DBCG89D试 验不包括结阳性、激素受体阳性的肿瘤患者。这些患者被纳入内分泌治疗试验中。DBCG准 备了原始方案和生物标记补充方案，在其实施之前丹麦国家生物医学研究伦理委员会(The Danish National Committee on Biomedical Research Ethics)批准了所述原始方案禾口补 充方案。病理学评价病理学操作包括依照WHO进行组织学类型分类，检查肿瘤边界及对皮肤和深筋膜 的侵入情况，测量肿瘤总大小、鉴定出的淋巴结的转移数目和总数目。对所有浸润性导管癌 的恶性程度分级。然后对所有切片通过免疫组织化学集中地分析ER，并且将这些集中获取 的ER数据用于本分析中。染色肿瘤细胞> 10%的肿瘤被认为是ER阳性。留存肿瘤组织的回顾性收集和TMA’ s的建立从1990年6月至1998年1月，DBCG试验89D随机选择12 名患者，其中 980名招募自丹麦。来自参加所述试验的806名丹麦患者的留存石蜡包埋组织块在 2001年9月和2002年8月间从研究部位收集并集中保存。通过来自Histopathology Ltd(AH-diagnostics, Denmark)的 TMA-builder 从仍可评估的 797 块组织块中的 707 土夬 成功地建立了组织微阵列(TMA)。在苏木精染色切片上鉴定出供者蜡块(donor block)的 目标区域，并且将两个2mm的组织芯(tissue core)转移至受者TMA蜡块(recipient TMA block)。为了定位，用肾组织芯标记上面的角。对于本研究，共有659个肿瘤用于TIMP-I 分析。肿瘤缺少(659-707)是由于它们之前被用于其他研究中，无剩余组织用于本研究。表7显示患者在研究中的流向TIMP-I免疫染色包括了抗重组人TIMP-I的小鼠单克隆抗体(克隆VT7)。本发明先前已经验证所 述抗体可用于免疫染色。所述VT7抗体为IgG1亚型，其使用浓度为0.25 μ g/ml。另外，将 抗三硝基酚半抗原的无关IgG1单克隆抗体(TNP抗体)用作对照。每个免疫组织化学试验 都包括阳性对照病例(已知含有TIMP-I的人乳腺癌)。用于IHC染色的试剂购自Dako A/ S，依照制造商的说明书使用。简言之，将石蜡切片Qym)在二甲苯中脱蜡，并通过一系列梯度乙醇再水化。通 过如下方式进行抗原修复将所述切片在PH为6. 00的IOmM柠檬酸盐缓冲液中在普通微 波炉中煮沸10分钟，然后在室温下在热缓冲液中30分钟。为阻断内源过氧化物酶活性，用
的过氧化氢处理所述切片10分钟。在4°C下将切片与第一抗体孵育过夜。用Advance HRP (代码K4068)检测所述单克隆抗体，并通过将所述切片与DAB+(代码K5007)孵育5分 钟使反应物显现。在孵育之间以含有0. 5% Triton χ-100的pH 7. 6的TBS进行洗涤。将 所述切片用Mayer’ s苏木精衬染，所有染色操作都手工进行。使用符号+和-作为上皮乳癌细胞中的TIMP-I免疫反应性的测量值，半定量地评 定组织切片的免疫染色。未包括对信号强度的评分。对组织切片的评分通过两位独立的病 理学家(GW和EB)盲评。不一致时通过一块观察切片达成意见一致。统计方法
将所述免疫染色结果转至DBCG秘书处(DBCG secretariat)进行统计分析。以 Kaplan-Meier 的可能回访估时(estimate of potential follow—up)量化回 访时间。IDFS(无浸润性疾病存活期)是主要满足点，OS(总存活期)是二级满足点。IDFS 被定义为从随机选择到不考虑定位的浸润性乳癌复发、第二原发浸润癌(second primary invasive cancer)或任何原因引起的死亡经历的时间。OS被定义为从随机选择到任何原 因引起的死亡经历的时间。使用Kaplan-Meier估计值和log rank测试来分析IDFS和0S。 以未调整估计的或者使用Cox比例风险模型评估调整的风险率量化治疗方案和集中评定 的TIMP-I对IDFS和OS的效应。还使用Wald检验，将多变量Cox比例风险模型应用于研 究治疗和TIMP-I之间的相互作用。所述多变量模型包括TIMP-1、绝经状态(menopausal status)、肿瘤大小、阳性淋巴结、组织类型和级别、中央ER激素受体状态(central ER hormone receptor status)、治疗方案以及TIMP-I和治疗之间的相互作用。组织类型和级 别以及ER受体状态不满足所述比例风险假设，这些作为分类变量纳入所述模型。用排除未 知项的X2-检验检测有和没有关于生物标记信息的患者之间的差异、治疗方案之间的差异 以及TIMP-I状态和临床病理学变量之间的相关性。P值是双尾的。用SAS 9 · 1程序包进 行统计分析。结果所研究的肿瘤样本的总数为659，其中12名未接受CMF或CEF，使得647名患者的 终数目用于后续的分析。这些患者中有357名接受CMF，290名接受CEF。表7显示了 DBCG 89D研究中丹麦部分招募的初始患者的流向，以及本发明人最后如何将总共647名患者纳 入在最终的分析中。在进行本分析时(2007年8月1日)，308名(48%)已死亡，312名 (48% )发生了与IDFS相应的事件。对于接受CEF的患者，有123名已死亡，1 名发生了与IDFS相应的事件。在CMF治疗的患者中，185名(52%)已死亡，183 名(51% )发生了 IDFS事件。IDFS的中位可能回访时间(median potential follow-up) 为9. 8年，而OS的为13. 8年。表5显示了拟进行治疗的群体的基线特征。可以看出，与其余患者相比，纳入本研 究的患者肿瘤显著较大(P < 0. 0001)，恶性级别显著较高(P = 0. 02)。其他典型基线特征 没有发现显著差异。在将647名患者分为两个治疗组时(CMF与CEF)，未观察到基线特征的 差异，表明虽然大约1/3的患者未被纳入本研究，但纳入本研究的患者保持了平衡的分布。75%的肿瘤样本显示了阳性的TIMP-I免疫反应性。免疫反应性的模式从几乎所 有上皮癌细胞都显示TIMP-I免疫反应性(图6A)，到分散和集中的TIMP-I免疫反应性(图 6B) (TIMP-1阳性)，再到完全没有TIMP-I肿瘤细胞免疫反应性(未显示)。在一些肿瘤 中，观察到了不同肿瘤组织基质细胞TIMP-I免疫反应性，但是若这些肿瘤缺乏上皮癌细胞 TIMP-I免疫反应性，就将其计为TIMP-I阴性(图6D)。图6C是阴性对照。表6显示了具有TIMP-I阳性肿瘤细胞的患者和具有TIMP-1阴性肿瘤细胞的患者 之间的基线特征。具有TIMP-I阳性肿瘤细胞的患者有显著更多的肿瘤阳性腋淋巴结(p = 0. 02)和显著更多的ER阳性肿瘤(P = 0. 04)。在TIMP-I阴性肿瘤中(n = 160)，大部分是 ER阴性的(n = 107)。然而，在TIMP-I阳性肿瘤(n = 487)中也有大部分为ER阴性的(η =四4)。这表明，即使TIMP-I阴性主要出现在ER阴性肿瘤中，TIMP-I也不是ER通常的代 言物(surrogate)。在TIMP-I阴性/阳性患者之间没能证明存在基线特征的其他差异。
所述多变量分析(调整的)包括治疗组别(treatment arm)、绝经状态、肿瘤大小、 阳性腋淋巴结的数目、组织类型和恶性分级、集中测量的ER和TIMP-I肿瘤细胞免疫反应 性。如上所述，组织类型和级别以及ER受体状态不满足所述比例风险假设，因此这些作为 分类变量纳入所述多变量模型中。本发明人首先在纳入本研究的647名患者中分析了 CEF 和CMF对IDFS和OS的效应。因此，没有考虑肿瘤细胞中的TIMP-I免疫反应性。与接受 CMF的患者(未显示)相比，接受CEF的患者具有更高的IDFS(调整的HR :0. 78(95% CI 0. 62-0. 98 ；ρ = 0. 03))和更高的 OS (调整的 HR = 0. 77(95% CI 0. 61-0. 97 ；ρ = 0. 03))。 这些数据与原始研究没有不同(IDFS =HR = 0. 76，OS =HR = O. 73) (Ejlertsen et al. 2007)， 表明所研究的亚群可代表整个研究组。然后，本发明人对全部患者群(n = 647)分析了 TIMP-I癌细胞免疫反应性与IDFS 和OS之间的联系。对于IDFS，在TIMP-I阳性患者和TIMP-I阴性患者之间未发现显著差 异；未调整的 HR = 1. 18(95% CI :0. 91-1. 54 ；ρ = 0. 22)和调整的 HR = 0. 95(95% CI 0. 72-1. 24 ；ρ = 0. 69)。OS 的数据为未调整的 HR = 1. 17(95% CI :0. 89-1. 53 ；ρ = 0. 25) 和调整的 HR = 0. 97(95% CI :0. 73-1. 28 ；ρ = 0. 82)。接着进行了亚群分析，考虑两个不同的治疗组别和肿瘤细胞TIMP-I免疫反应性。 在CEF治疗的患者中((n = 290)，TIMP-I阳性肿瘤的个体比TIMP-I阴性肿瘤的个体有显著 较短的 IDFS ；未调整的 HR = 1. 56(95% CI :1. 01-2. 41,ρ = 0. 047)(图 7Α)。相反，在 CMF 治疗的患者中(n = 347)，在TIMP-I阳性个体和TIMP-I阴性个体未发现在IDFS方面有差 异；未调整的 HR = 0. 97(95% CI :0. 69-1. 35 ；ρ = 0. 84)(图 7Α)。OS 的相应数据为:CEF 未调整的HR= 1.41 (95% CI :0.91-2. 18 ；ρ = 0. 13)和 CMF 的为未调整的HR= 1. 02(95% CI 0. 72-1. 43 ；ρ = 0. 93)(图 7B)。在多变量分析中，在用CEF治疗的TIMP-I阳性患者和TIMP-1阴性患者之间未见 在IDFS方面有显著差异未调整的HR= 1. 30(95% CI :0. 83-2. 02 ；ρ = 0. 25)并且未见在 OS方面有显著差异调整的HR = 1. 21 (95% CI :0. 77-1. 90 ；ρ = 0. 42)。在CMF治疗的患 者也未见有显著差异；IDFS 调整的R = O. 76(95% CI :0. 54-1. 07 ；ρ = 0. 12)或OS 调整 的 HR = 0. 84(95% CI :0. 59-1. 19 ；ρ = 0. 32)。当比较具有TIMP-I免疫反应性癌细胞组中的CEF和CMF治疗的患者的IDFS时，两 个治疗组之间的HR为调整的HR = 0. 88(95% CI :0. 68-1. 13 ；ρ = 0. 32)(图8Α)。OS的相 应数据为调整的 HR = O. 83 (95% CI :0. 64-1.08 ；ρ = 0. 17)(图 8Β)。相反，对比 CEF和 CMF 治疗的缺乏TIMP-I癌细胞免疫反应性的患者之间的IDFS显示了调整的HR = 0. 51 (95% CI 0. 31-0. 84 ；ρ = 0. 0085)(图 8A)禾口 OS 调整的 HR = 0. 58 (95 % CI 0. 35-0. 96 ；ρ = 0. 03)(图8Β)，偏向CEF治疗的患者。就IDFS和OS将未简化的Cox比例风险模型用于测 试治疗效应和TIMP-I之间的相互作用。对于IDFS和0S，检测到不显著的TIMP-I谱(阳性 或阴性免疫反应性)与治疗(CEF或CMF)之间的相互作用=IDFS(p = 0. 06)(图8Α)，OS(ρ =0. 21)(图 8Β)。讨论本研究首次证明，原发性乳癌中TIMP-I癌细胞免疫反应性的缺乏与含有辅助性 表柔比星的辅助性疗法的有利效果(与CMF相比)有关，表明TIMP-I免疫反应性对蒽环类 有预测价值。与CMF相比，对TIMP-I阴性患者的基于蒽环类的辅助性治疗显著地降低复发风险49%，降低死亡率42%。因TIMP-I单克隆抗体VT7在免疫染色方面的优势，该抗体在以前被从一组TIMP-I 抗体中选出。VT7识别位于169-174位氨基酸之间的线性TIMP-I表位。对VT7免疫染色彻 底评价其灵敏性和特异性(VT7不结合TIMP-2、3或4)，并且优化染色条件中的抗原修复方 案、抗体浓度和孵育时间等。此外，测试了固定时间04-72小时)的可能影响。在每个TMA 中，使用了相同IgGl亚型(TNP抗体)的阴性对照抗体，在每次测定中包括了已知TIMP-I 阳性乳癌切片作为阳性对照。与原始89D试验中包括的980名丹麦患者相比，在本分析中包括的647名患者的 特征中仅观察到很小的差异，这表明本分析的647名患者可代表总的DBCG 89D丹麦研究群 体。在原始89D试验中报道的全部有利之处都重现于本研究中，这进一步支持了所述647 名患者可代表DBCG试验89D中的全部丹麦患者群体。本发明人之前已公布，与表达TIMP-I的野生型鼠纤维肉瘤细胞相比，来自TIMP-I 基因缺陷小鼠的鼠纤维肉瘤细胞在体外对鬼白亚乙基苷(一种拓扑异构酶II抑制剂)显 著更敏感。通过进行凋亡试验，证明了 TIMP-I可保护纤维肉瘤细胞，避免凋亡。其他人也 已证明TIMP-I可保护，避免化学疗法诱导的凋亡。目前还不清楚本研究中TIMP-I为何可 预测对CEF的(而非对CMF的)敏感性/抗性。已有提议涉及可能由TIMP-I调节的信号 传递通路。在MCFlOA乳腺上皮细胞系中，TIMP-I过表达显示可通过酪氨酸磷酸化诱导黏 着斑激酶(FAK)的组成型活化。FAK以前已显示是磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3激酶)的上游 调节物，导致bcl-2家族成员的调节，这是一个已很清楚的导致细胞存活的信号传递通路。 磷酸化的FAK结合并从而激活PI-3激酶，PI-3激酶接着活化Akt-激酶。Akt磷酸化蛋白 Bad，结果蛋白Bad被捕获蛋白14_3_3隔离在细胞质中，因此不能与bcl_2和相互 作用并抑制bcl-2和bcl-\。Bcl-2和bcl-X^是位于线粒体膜上的蛋白，当这些抗凋亡蛋 白被活化后可抑制Bax，从而阻止细胞色素c从线粒体释放。这接着阻止胱冬酶(caspase) 级联的活化，因而阻止凋亡。因此，TIMP-I可通过如下方式抑制凋亡，即如营养因子一样启 动包括FAK、PI-3激酶、Akt和bcl-2家族成员的存活通路，导致对胱冬酶活化的抑制，从而 抑制凋亡。通过检测取自DBCG 89D试验招募的患者的肿瘤组织的TIMP-I免疫反应性，本发 明人现在已证明在其乳癌细胞中缺乏TIMP-I免疫反应性并且接受含有蒽环类的组合化学 疗法的患者比接受CMF治疗的患者有显著更好的结果。在所述多变量分析中，当用CEF而 非CMF治疗时，具有TIMP-I阴性肿瘤的患者复发的风险降低49%，死亡风险降低42%。这 些临床结果因此另外支持了发明人的设想——TIMP-I蛋白与对蒽环类治疗的敏感性/抗 性相关。然而，仍需独立研究来确证TIMP-I免疫反应性与蒽环类在辅助环境中的敏感性/ 抗性之间的相关性。此外，目前发明人正在比较TIMP-I结果与HER2和T0P2A基因畸变测 定的结果，两者都与对蒽环类的敏感性相关。本发明人以前已公布，在原发性乳癌中TIMP-I蛋白水平带有预后信息。因此，可 推测观察到的TIMP-I免疫反应性对IDFS的效应是否为预后性或预测性的。由于在CMF 患者中未观察到TIMP-I免疫反应性的效应，而仅在CEF治疗的患者中观察到TIMP-I免疫 反应性的效应，本发明的结果表明TIMP-I免疫反应性带有一些预测价值并且本研究因此 符合发明人的临床前观察。在以前的预后研究中，TIMP-I蛋白提取自整个肿瘤，所测量的TIMP-I蛋白因此可能来自污染血液、肿瘤组织基质细胞、细胞外基质和癌细胞。相反，在本 研究中，只有位于上皮癌细胞中的TIMP-I蛋白被纳入最终的分析当中，这可能是本研究和 以前的研究之间存在差异的另一个原因。总之，本研究首次证明了在上皮癌细胞中缺乏TIMP-I蛋白免疫反应性的肿瘤对 蒽环类治疗比对CMF治疗更敏感。进一步的研究将旨在确定TIMP-I免疫反应性、HER2、 T0P2A和蒽环类效应之间的相互关系。此外，将在独立的患者群中验证本研究的结果。实施例2T0P2A和TIMP-1肿瘤细胞基因畸变和TIMP-1肿瘤细胞蛋白免疫反应性的组合预 测价值的临床研究方法647名患者的样本取自一项随机研究，在所述研究中随机选择高风险乳癌患者进 行采用CMF或CEF的辅助性治疗。满足点是无浸润性疾病存活期(IDFS)。组织微阵列组成的患者样本从福尔马林固定的石蜡包埋的患者原发性肿瘤组织 制备。所有样本都有一个标识号。如以前所述检测T0P2A基因畸变(Koop et al. 2005)。使用标准FISH技术检测TIMP-I基因畸变。通过使用UCSC基因组浏览器(http:// genome.ucsc.edu)分析TIMP-1基因周围4001Λ区域鉴定BAC(细菌人工染色体)克隆 (RP11-466C12)。BAC克隆覆盖以前鉴定的基因ARAF野生型等位基因(ARAF)，人突触蛋 白I (SYNl)，组织金属蛋白酶-I(TIMP-I)抑制剂，补体因子备解素(CFP)，ELK1，遍在表达 转录物(ubiquitously expressed transcript) (UXT)和 AK094108。将所述克隆在补加 12.5yg/mL 氯霉素(Sigma Aldrich, Denmark)的 LB 培养基(Sigma Aldrich, Denmark)中 培养，并根据BAC DNA的碱纯化法纯化(Poulsen 2004) (Poulsen TS，2004)。通过计算机上 BamHI消化来自UCSC的DNA序列验证所述克隆，并与如酶制造商(Invitrogen，Denmark)所 荐的纯化的BAC克隆的BamHI核酸内切酶消化物比较。如制造商(RocheDiagnostics GmBH，Mannheim，Germany)所述，用得克萨斯 红-5-dCTP (Millipore Corporation, Temecula, California, USA)通过切口平移标记探针 BAC DNA。总计IOng/ μ L标记的DNA用于FISH，并且通过使用特异PNA寡聚体实现对源自 重复序列的不需要的背景染色的抑制(Nielsen，KV et al.，2004)。以荧光素标记的对染 色体Xa-卫星序列(CenX PNA探针)特异的PNA混合物作为染色体X拷贝数的参照。PNA 由Dako A/S提供。图1显示的示意图表示染色体X和被BAC DNA覆盖的Xpll区的一部分 的定位以及被CenX PNA探针覆盖的着丝粒X区。如制造商(K5599，Dako A/S,Denmark)所 述并加以修改，使用组织学FISH附属试剂盒(Histology FISH accessory kit)进行FISH。 预处理步骤不是通过使用水浴完成，而是使用微波炉(Whirlpool，Denmark, model JT356 with 6 th sense)进行。切片淹没在足量的IX预处理缓冲液中以完全覆盖切片，用蒸汽功 能(6th sense)处理10分钟，然后在室温(RT)下处理15分钟，然后再根据组织学FISH附 属试剂盒提供的方法继续实验。对FISH的评价使用配备了 IOOX油浸物镜(数字光圈)的Leica显微镜(Le ica，Denmark)对杂 交信号评分。将双带通荧光过滤器(Chromotechnology，Brattleboro, VT)用于同时显示FITC和得克萨斯红信号。对基于DAPI衬染的形态完整的60个不重叠的间期细胞核进行 评分，以确定每个TIMP-I和CenX探针的杂交信号的数目。TIMP-I的扩增被定义为TIMP-I 信号与CenX信号的平均比值(=扩增水平)为2或更大(比值彡2)。若所述比值小于 0. 8 (比值< 0. 8)，则TIMP-I被定义为缺失。因此，正常的TIMP-I基因/CenX比值被定义 为(0.8彡比值< 2)之间。对TIMP-I免疫反应性的评价依据以前已公开的方法(Serensenet al 2005)，使用TIMP-I单克隆抗体VT7进 行了 TIMP-I蛋白的免疫组织化学。将重组人TIMP-I的小鼠单克隆抗体(克隆VT7，IgG1) (Moller Sorensen, et al. 2005 ；Sorensen, et al. 2006)以 0. 4 μ g/ml 的浓度使用。所有的切片都由两名不知道患者临床史的独立病理学家进行评价。对每个样本评 价肿瘤细胞免疫反应性存在或不存在，从而计分为+或_。然后，将所有的数据转至丹麦乳癌合作组织秘书处，进行统计分析。结果290名患者已接受CEF，;357名已接受CMF。其中，216/290和271/357被发现为 TIMP-I免疫反应性阳性，61/290和78/357有T0P2基因畸变(扩增或缺失)。M名患者的 T0P2A DNA状态未知。根据TIMP-I肿瘤细胞免疫反应性分类的患者的无病存活期的Kaplan Meier曲线 图显示于图IA和B中。图IB显示了，在接受CMF的患者中，TIMP-I肿瘤细胞反应性对DFS 无影响(P = 0. 84)。相反，在接受CEF的患者中，缺乏肿瘤细胞TIMP-I免疫反应性与DFS 的显著升高有关(P = 0. 047)(图1A)。相反，在其肿瘤细胞中有TIMP-I免疫反应性的患者 具有与CMF治疗的患者相当的DFS(p = 0. 46)。如从显示CEF治疗的患者的无病存活期的图IA可见，其肿瘤细胞中无TIMP-I免 疫反应性的患者在无病存活期方面确实显著较好。例如，在5年回访时，大约72%的TIMP-I 阴性患者没有发生疾病复发，而仅有60%的TIMP-I阳性患者无病。图IB显示接受CMF并根据肿瘤细胞是否显示TIMP-I免疫反应性分类的患者的无 病存活期。这两组之间的无病存活期没有差别。在对T0P2A基因畸变进行分析时发现(图2A和B)，在接受CMF的患者中T0P2A基 因畸变状态对DFS没有影响(图2B)。相反，在接受CEF的患者中，那些有T0P2A基因畸变 (扩增或缺失)的患者与接受CMF的T0P2A基因畸变的患者相比有显著改善的DFS (图2A)。如从显示CMF治疗的患者的无病存活期的图2B可见，T0P2A DNA畸变的患者比无 T0P2A DNA畸变的患者表现更糟糕。然而，从显示接受CEF并根据T0P2A DNA畸变分类的患 者的无病存活期的图2A来看，可以看出所述曲线(T0P2A DNA畸变的患者)比接受CMF的 患者表现更好(图2B)。在其癌细胞中有阴性TIMP-I免疫反应性的患者中，似乎仅M/160(15% )的患者 有T0P2A基因畸变。因此，本发明人分析了具有T0P2A畸变或缺乏TIMP-I免疫反应性对DFS 的组合效应。结果显示，现在能够鉴定几乎两倍于T0P2A单独分析所鉴定的具有高的可从 CEF治疗(与CMF治疗相比)受益的可能性的患者数目并且不降低风险率。表1显示包括 95%置信区间的个体的调整的风险比。所有数值都是基于风险率被设置为1的CMF组。HR为1意味着组与组之间没有差别。本发明人将组合的CMF组用作参照。因此，该表显示在亚群中从CEF治疗的受益，作为对比的是CMF治疗。从表1可见，以CEF治疗的有T0P2A DNA畸变或TIMP-1阴性患者具有小于1的HR， 并且95%置信区间不超过1。这意味着这些患者(T0P2A DNA畸变和/或TIMP-I阴性)显 著更多地从CEF治疗受益，作为对比的是以CMF治疗。HR为0. 54意味着所述患者(T0P2A DNA畸变和/或TIMP-I阴性)受益的机会为46%。从该表还看出，T0P2A DNA畸变(扩增 或缺失)的HR和肿瘤细胞无TIMP-I免疫反应性的患者具有几乎类似的HR。本发明是这样 的，即并不总是相同的患者有T0P2A DNA畸变或无TIMP-I免疫反应性。那么，当对T0P2A DNA畸变和/或无TIMP-I免疫反应性的患者组观察HR时，尽管这个亚群的患者数目几乎是 可由T0P2A DNA畸变单独鉴定的患者数目的两倍，但所述HR几乎保持相同(0. 48，95%置 信区间034-069)。也就是说，通过将T0P2A DNA畸变测量和TIMP-I蛋白免疫反应性测量 结合，与仅T0P2A DNA畸变测量相比，可鉴定几乎两倍的具有高的从CEF受益的可能性的患 者ο通过组合方法有可能鉴定出43%的具有大于50%的提高的从CEF治疗受益的可 能性的患者，作为对比的是从CMF治疗受益(风险率为0. 48)，这大约是通过仅单独分析 T0P2A DNA畸变所能鉴定数目的2倍。图3A和B显示在将T0P2A DNA畸变和TIMP-I免疫反应性相结合时的DFS的Kaplan Meir曲线。在观察图;3B时可见，当用CMF治疗时，有T0P2A DNA畸变和/或缺乏肿瘤细胞 TIMP-I蛋白免疫反应性的患者比无T0P2A DNA畸变和其肿瘤细胞中有TIMP-I蛋白免疫 反应性的患者表现更糟糕。然而，若用CEF治疗患者(图3A)，T0P2A DNA畸变和/或缺乏 TIMP-I蛋白免疫反应性的患者比用CMF治疗的患者表现得好的多。因此，有T0P2A DNA畸 变和/或缺乏TIMP-I蛋白免疫反应性并用CEF治疗的患者比有T0P2A DNA畸变和/或缺 乏TIMP-I蛋白免疫反应性并用CMF治疗的患者表现更好。图9显示的TIMP-I FISH分析显示了在上皮乳癌细胞中的TIMP-1 DNA扩增。讨论该研究证明了，TIMP-I蛋白缺乏或浓度降低以及/或者T0P2A基因畸变赋予对一 些类型的化学疗法的敏感性。该研究所依赖的样本获自具有完整临床回访的大前瞻性研究(Ejlertsen et al.，Eur J Cancer 2005)。以前已描述了 T0P2A FISH分析和TIMP-I免疫组织化学技术。该研究的结果清楚地证明了结合T0P2A基因畸变检测和TIMP-I免疫组织化学在 预测患有原发性高风险乳癌患者从用CEF的辅助性治疗受益的累加效应，而未在用CMF治 疗的患者中观察到受益，这表明所述组合检测在预测从含有蒽环类化学疗法受益中的价 值。实施例3高风险乳癌患者的HER2、T0P2A和TIMP-I和对含有辅助蒽环类化学疗法的反应性方法以前已详细地描述了 DBCG 89D试验及其生物学子研究(Ejlertsen at al. 2007 and Knoop et al. 2005)。简而言之，DBCG试验89D是开放标记的随机III期试验，比较了 都是以3周间隔静脉注射9个周期的CMF(环磷酰胺600mg/m2、氨甲喋呤40mg/m2和氟尿嘧啶600mg/m2)和CEF(环磷酰胺600mg/m2、表柔比星60mg/m2和氟尿嘧啶600mg/m2)。89D试 验准入者为激素受体阴性且结阳性(或肿瘤大小> 5cm)的乳癌患者，以及结阴性的绝经前 肿瘤患者(条件是她们有II或III级恶性肿瘤)。有高激素反应性肿瘤的患者被纳入DBCG 试验89B和89C，执行同步的准入标准。DBCG准备了原始方案和生物标记补充方案，在其实 施之前丹麦国家生物医学研究理论委员会批准所述原始方案和补充方案(V. 200. 1616/89， KF 12 295 003)。对HER2、ER和TIMP-1免疫反应性的集中评估通过TMA-builder (Histopathology Ltd, AH-diagnostics)从福尔马林固定石赌 包埋肿瘤块制备组织微阵列(TMA)。在苏木精染色切片上鉴定供者蜡块的目标区域，并且 将两个2mm的组织芯转移至受者TMA蜡块。在室温下用ER1D5 (Dako)抗体和"Tech-mate 500 (Dako)在3μπιΤΜΑ切片上进行ER免疫染色。ER表达被记录为染色肿瘤细胞的百分比， 不考虑强度，结果分为阳性(彡10%染色细胞)或阴性(<10% )。使用Here印Test (Dako) 在整个切片上测量HER2表达，并因此记作0、1+、2+或3+。如以前描述(Sorensen et al. 2006)进行TIMP-I免疫染色。简而言之，将切片以TIMP-I小鼠单克隆抗体VT7孵育。以 小鼠/兔Envision+(代码K5007,DAK0 A/S)检测VT7，并通过将切片以DAB+(代码K5007, DAKO A/S)孵育2个3分钟的时间使所述反应物显现。使用符号+和-半定量地评定组织 切片的免疫染色，作为对上皮乳癌细胞中TIMP-I免疫反应性的一个量度。不包括对信号强 度的评分。对组织切片的评分通过两位独立的病理学家(GW和EB)盲评。不一致时通过一 块观察切片达成意见一致。T0P2A 和 HER2 FISH通过FISH(T0P2A pharmDX 和 HER2 pharmDX、DAKO A/S)显示 T0P2A 和 HER2 拷贝 数。至少对60个基因信号进行了评分，并且若包括了细胞核则对所有信号评分。此外对同 一细胞核中的着丝粒17信号进行评分，并计算基因与着丝粒17的比值。根据比值< 0. 8、 0. 8-1. 9和> 2. O将肿瘤评定为T0P2A/HER2缺失、正常或扩增。统计方法以Kaplan-Meier的可能回访估时量化回访时间。无浸润性疾病存活期(IDFS)是 主要满足点，IDFS被定义为从随机选择到不考虑定位的浸润性乳癌复发、任何原因引起的 第二原发浸润癌(second primary invasive cancer)或死亡经历的时间。总存活期(OS)是 二级满足点，被定义为从随机选择到任何原因引起的死亡经历的时间。使用Kaplan-Meier 估计值和log rank测试来分析IDFS和OS。以未调整估计的或者使用Cox比例风险模型评 估调整的风险率量化TIMP-I与HER2或T0P2A生物标记状态的组合对IDFS和OS的效应。 还基于以前针对相同患者材料开发的模型，将Cox比例风险模型应用于多变量分析。所述 多变量模型包括TIMP-I、T0P2A、HER2、ER、肿瘤大小、阳性淋巴结、组织类型和级别、绝经状 态和用CMF或CEF的治疗。根据拟合优度步骤(goodness-of-fit procedure)的结果调整 IDFS和OS的Cox比例风险模型，将ER激素受体状态以及组织类型和级别纳入作为分类变 量。在另外的模型中研究了生物标记(HT、2T、TIMP-1、T0P2A*HER2)和治疗方案(CMF或 CEF)之间的相互作用，并使用了 Wald检验。用X 2-检验(排除未知项)检验了有和没有关于生物标记信息的患者之间的差 异、治疗方案之间的差异以及HT(HER2阳性和/或缺乏TIMP-I免疫反应性)或2T生物标记状态与包括HER2状态的临床病理学变量之间的相关性。P值是双尾的。若HER2阳性/ 或缺乏TIMP-I免疫反应性则将肿瘤分类为HT反应型，否则分类为HT非反应型。若肿瘤具 有T0P2A畸变和/或缺乏TIMP-I免疫反应性则被分类为2T反应型，否则被分类为2T无反 应型。用SAS 9 · 1程序包进行统计分析。DBCG负责研究设计和协作、组织收集、生物标记分析、数据收集、分析和报告。 ER1D5 抗体、Here印Test、HER2 phamDX 和 T0P2A phamDX 试剂盒和技术协助由 DAKO A/ S (Glostrup，丹麦)无偿提供。结果从1990年6月至1998年1月，DBCG试验89D招募了 12 名患者。IDFS的中位可 能回访估时为9. 8年，而OS的为13. 8年。在2001年，DBCG完成了对福尔马林固定石蜡包 埋的原发性乳癌组织块的回顾性收集，它们获自于在丹麦招募的980名参与者中的821名 (84% )，并且在708 (72% )名患者中成功构建了 TMA。总计623名患者可进行HER2、T0P2A 和TIMP-I分析。623名可评估的患者与357名不可评估的患者在绝经期状态、肿瘤大小、恶 性级别和ER状态方面显著不同(ρ < 0. 05)。可评估患者和不可评估患者之间的阳性淋巴 结数目和组织类型未显示明显不同。治疗效应与原始研究中观测到的效应(IDFS:风险率 0. 76 和 OS 风险率 0. 73) (Ejlertsen et al. 2007)相似，对于 IDFS (调整的风险率，0. 80 ； 95%置信区间(Cl)，0.63 至 1. 01 ；P = 0. 06)和 OS(调整的风险率，0. 79 ；95% Cl，0.62 至 1.00 ；P = 0. 05)，风险率偏向 CEF。在可评估的623名患者中，188人(33% )具有HER2阳性肿瘤，139人(22% )具 有T0P2A畸变肿瘤，154人(25% )具有TIMP-I阴性肿瘤。435名HER2阴性患者中仅在33 人(8 % )中检测到T0P2A畸变(表2)。相反，在HER2阴性患者的123人( % )中以及 484名T0P2A正常患者的130人(27% )中检测到TIMP-I免疫反应性。表2显示了根据成 功进行HER2、T0P2A和TIMP-I的623名患者的2T状态的基线特征。将TIMP-I 与 T0P2A 或 HER2 整合借助HER2和TIMP-I，将311 (50% )患者分为HT蒽环类反应型，例如具有HER2阳 性肿瘤谱、TIMP-I阴性肿瘤谱，或者HER2阳性和TIMP-I阴性肿瘤谱。具有HT反应谱的患 者显著更经常在绝经后(P < 0. 05)，并且具有阳性淋巴结，肿瘤大于2cm和ER阴性的肿瘤。 有HT反应谱的患者有与肿瘤为HT非反应型的患者类似的IDFS(风险率，1. 22 ；95% Cl， 0. 97 至 1. 52 ；P = 0. 09)和较差的 OS(风险率，1. 33 ；95% Cl, 1. 06 至 1. 67 ；P = 0. 01)。在 多变量分析中，对绝经状态、肿瘤大小、阳性淋巴结数目、组织类型和级别、ER和T0P2A状态 以及治疗的调整改变了 IDFS的风险率(风险率，1.03 ；95% Cl，0. 80至1. 33 ；P = 0. 81)和 OS 的风险率(风险率，1. 05 ；95% CI，0. 81 至 1. 36 ；P = 0. 73)。通过整合使用T0P2A和TIMP-Uf沈9(43% )名患者分类为2T蒽环类反应型，例 如具有T0P2A畸变和/或缺乏TIMP-I免疫反应性(表2)。2T反应谱与ER阴性、HER2阳 性和较大肿瘤大小相关(都P <0.01)。与具有2T无反应谱的患者相比，具有2T反应性 谱的患者的IDFS降低(风险率，1.26 ；95% CI,1.01至1. 58 ；P = 0.04)，OS降低(风险 率，1. 34 ；95% Cl，1. 07至1. 69 ；P = 0. 01)。在多变量分析中，对绝经状态、肿瘤大小、阳性 淋巴结数目、组织类型和级别、ER表达和HER2状态以及治疗的调整改变了 IDFS的风险率 (1. 19 ；95% CI，0. 93 至 1. 51 ；P = 0. 71)和 OS 的风险率(1. 18 ；95% CI，0. 927 至 1. 51 ；P=0. 18)。治疗随单一生物标记和谱的不一致性(Heterogeneity)在所述多变量Cox回归分析中，本发明人进一步检查了治疗效果随HER2状态、 T0P2A状态、TIMP-I免疫反应性、HT谱或2T谱的不一致性。对于HER2和TIMP-1，用CEF 与用CMF相比没有显示IDFS和OS改善的统计学上显著的相互作用。如以前报道的，对于 IDFS (P = 0. 004)和OS (P = 0. 03)，观察到了 T0P2A状态和治疗效果之间的显著相互作用。若用CEF治疗，有分类为HT反应型(HER2阳性或TIMP-1阴性)的肿瘤的患者在 IDFS方面有边界显著的改善(图4A，表4)，并且在OS方面有统计显著的改善。相反,在有 HT无反应谱的患者中，没有观察到与CMF相比从CEF显著受益。在对结状态、肿瘤大小、组 织级别、ER状态、T0P2A状态、HER2状态、TIMP-I表达和绝经状态进行调整以后，在具有HT 反应谱的患者中因使用CEF保持了更有利的IDFS和OS (P值分别=0. 036和0. 047 ；图5)。在具有2T反应谱的患者中，CEF比CMF显著改善了 IDFS和OS (图4B，表4)，这与 2T非反应型患者相反。针对患者和肿瘤特征调整的多变量分析证实了，与CMF相比，具有2T 反应谱的患者在IDFS (图5A)和OS (图5B)两方面从CEF受益。相反，在具有2T无反应谱 的患者中，使用CMF出现了更有利结果的不显著趋势(图幻。在2T谱和治疗效果之间有高 统计显著性的相互作用，具有2T反应(T0P2A畸变或TIMP-I阴性)谱的269名(43% )患 者使用 CEF 比使用 CMF 在 IDFS (Wald 检验，P < 0. 0001)和 OS (Wald test, P = O. 004)方 面表现更有利的结果(图5)。讨论通常公认的是，只要有可能，对疗法的选择就应指向针对每名乳癌患者个体的肿 瘤内的特定靶标。然而，经常需要引入化学疗法，而化学疗法被认为靶特异性较差。尽管蒽 环类在辅助性治疗中的优势已被证实，但是它们的作用机制仍未充分阐明。然而，在提出的 各种机制中，与拓扑异构酶Π-a的相互作用和对凋亡的抑制似乎在临床相关的蒽环类浓 度下出现。本发明人进行了组合T0P2A和TIMP-I谱的开发，并且以前在DBCG 89D试验中 分别地检查了它们的预测特性。在本研究中，在具有HER2阳性肿瘤的188名患者中，106人(56% )有异常的T0P2A 状态，相比之下，8% (33/435)具有HER2阴性肿瘤。由于在HER2阳性群体中包含大量的具 有T0P2A畸变肿瘤的患者，因此将这两个标记结合是不可行的。通过将T0P2A和TIMP-I整 合为2T谱，43%的患者被分类为蒽环类反应型，相比之下，单独使用T0P2A为22%，单独使 用TIMP-I为25%。对于所述具有2T反应谱的43%患者，CEF的使用与IDFS事件相对降 低52%和死亡率相对降低46%有关。相反，在剩余具有2T无反应谱的57%患者中未观察从CMF显著受益。具有2T反应 谱和无反应谱的患者之间的差别幅度以及这些评估的准确度大至足以使临床重要差别明 显。治疗和2T谱之间高统计显著性的相互作用的结果支持该论断。具有T0P2A和TIMP-I 反应谱的4%患者似乎未现不同的结果。HER2是关于对蒽环类敏感性最常使用的生物标记，并且多数T0P2A畸变在HER2阳 性肿瘤中被观察到。为了比较，本发明人将HER2和 ΜΡ-1联合起来，若肿瘤缺乏TIMP-I 免疫反应性并且/或者是HER2阳性，则将患者分类为HT蒽环类反应型。具有HT反应谱的50%患者从CEF受益大大多于从CMF受益，这种不一致性被HT谱和治疗之间的统计学显著相互作用确证。本发明人未发现以TIMP-I或HER2作为单一标 记的不同治疗效果的证据，这一点强调了整合生物标记的效力。总之，基于T0P2A和TIMP-I的2T谱的结合分析表明，通过结合，这两种生物标记 可鉴定显著地从用表柔比星替代CMF中的氨甲喋呤受益的若不是几乎全部也是大部分的 患者。2T谱比单独的HER2、T0P2A和TIMP-I分离出更多的蒽环类反应亚群。表1危险率95%置信区间
权利要求
1.一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α抑制剂疗法的反应性的方 法，所述方法包括以下步骤a.在从所述个体获得的样本中确定，在所述样本中包含的肿瘤细胞中不存在TIMP-I 蛋白，或者在所述样本的肿瘤细胞中存在TIMP-I的DNA畸变，并且b.确定在染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中存在任何染色体DNA畸变，或者存在 所述扩增子中包含的基因的异常蛋白表达c.若染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中存在染色体DNA畸变，以及/或者所述扩 增子中包含的基因的蛋白表达在所述肿瘤细胞中是异常的，以及/或者所述肿瘤细胞不存 在TIMP-I蛋白，以及/或者若所述肿瘤细胞在所述TIMP-I基因的两个等位基因之一或两 个上包含所述TIMP-I DNA畸变，则将所述个体归类为具有高的对拓扑异构酶II α抑制剂 疗法有反应的可能性，并且d.若在所述T0P2A/HER2扩增子中不存在染色体DNA畸变，或者没有所述扩增子中包含 的任何基因编码的蛋白在所述肿瘤细胞中异常地表达，以及若TIMP-I蛋白存在于所述肿 瘤细胞中，以及/或者若所述TIMP-I的两个等位基因都不包含所述TIMP-I DNA畸变，则将 所述个体归类为具有低的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性。
2.权利要求1的方法，其中所述染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中的染色体DNA 畸变是T0P2A DNA畸变，并且所述扩增子中包含的基因的蛋白表达是拓扑异构酶II α表 达。
3.权利要求1的方法，其中所述在染色体17q21上的T0P2A/HER2扩增子中的染色体 DNA畸变是HER2 DNA畸变，并且所述扩增子中包含的基因的蛋白表达是ErbB2表达。
4.一种用于在患有癌症的个体中预测对拓扑异构酶II α抑制剂疗法的反应性的方 法，所述方法包括以下步骤a.在从所述个体获得的样本中确定，在所述样本中包含的肿瘤细胞中不存在TIMP-I 蛋白，并且b.确定在所述样本的肿瘤细胞中存在任何T0P2ADNA畸变c.若T0P2ADNA畸变存在，以及/或者若所述肿瘤细胞不存在TIMP-I蛋白，则将所述 个体归类为有具有高的对拓扑异构酶II α抑制剂疗法有反应的可能性，并且d.若没有T0P2ADNA畸变存在，以及若TIMP-I蛋白存在于所述肿瘤细胞中，则将所述 个体归类为具有低的对拓扑异构酶Π α抑制剂疗法有反应的可能性。
5.权利要求1的方法，其中将从一个群体获取的参照用于确定DNA畸变或蛋白表达的 水平。
6.权利要求5的方法，其中所述参照是存在于肿瘤组织基质细胞中的正常二倍体遗传曲旦 冃足°
7.权利要求2的方法，所述Τ0Ρ2Α基因畸变选自Τ0Ρ2ΑDNA扩增、Τ0Ρ2Α DNA缺失、 Τ0Ρ2Α基因点突变和Τ0Ρ2Α DNA易位、Τ0Ρ2Α DNA的表遗修饰例如DNA甲基化及其组合。
8.权利要求2的方法，其中与参照样本相比，拓扑异构酶IIα蛋白过表达了多于参照 样本的2倍，例如多于3倍，例如多于4倍，例如多于5倍，例如多于6倍，例如多于7倍，例 如多于8倍，例如多于9倍，例如多于10倍，例如多于15倍，例如多于20倍，例如多于30 倍，例如多于40倍，例如多于50倍，例如多于100倍。
9.权利要求2的方法，其中与参照样本相比，T0P2A基因扩增了多于参照样本的2倍， 例如多于3倍，例如多于4倍，例如多于5倍，例如多于6倍，例如多于7倍，例如多于8倍， 例如多于9倍，例如多于10倍，例如多于15倍，例如多于20倍，例如多于30倍，例如多于 40倍，例如多于50倍，例如多于100倍。
10.权利要求2的方法，其中所述肿瘤细胞中的T0P2ADNA畸变或拓扑异构酶II α蛋 白增加与所述样本的肿瘤细胞中的异常Τ0Ρ2Α mRNA水平有关。
11.权利要求3的方法，所述所述HER2基因畸变选自HER2基因扩增、HER2DNA缺失、 HER2基因点突变和HER2DNA易位、HER2DNA的表遗修饰例如DNA甲基化及其组合。
12.权利要求3的方法，其中与对照样本相比，ErbB2蛋白过表达了多于对照样本的2 倍，例如多于3倍，例如多于4倍，例如多于5倍，例如多于6倍，例如多于7倍，例如多于8 倍，例如多于9倍，例如多于10倍，例如多于15倍，例如多于20倍，例如多于30倍，例如多 于40倍，例如多于50倍，例如多于100倍。
13.权利要求3的方法，其中与对照样本相比，HER2基因扩增了多于对照样本的2倍， 例如多于3倍，例如多于4倍，例如多于5倍，例如多于6倍，例如多于7倍，例如多于8倍， 例如多于9倍，例如多于10倍，例如多于15倍，例如多于20倍，例如多于30倍，例如多于 40倍，例如多于50倍，例如多于100倍。
14.权利要求1的方法，其中与对照样本相比，TIMP-I基因扩增了多于对照样本的2 倍，例如多于3倍，例如多于4倍，例如多于5倍，例如多于6倍，例如多于7倍，例如多于8 倍，例如多于9倍，例如多于10倍，例如多于15倍，例如多于20倍，例如多于30倍，例如多 于40倍，例如多于50倍，例如多于100倍。
15.权利要求3的方法，其中肿瘤细胞中的任何HER2DNA畸变或ErbB2蛋白增加与所 述样本的肿瘤细胞中异常的HER2 mRNA水平有关。
16.前述权利要求任一项的方法，其中所述肿瘤细胞包含至少一种选自如下的TIMP-I DNA畸变=TIMP-I等位基因之一缺失、TIMP-I的两个等位基因缺失、TIMP-I等位基因之一 部分缺失、TIMP-I的两个等位基因部分缺失、TIMP-I DNA点突变、TIMP-I DNA倒位、TIMP-I DNA易位、TIMP-I DNA表遗修饰例如DNA甲基化及其组合。
17.前述权利要求任一项的方法，其中所述肿瘤细胞不存在TIMP-I蛋白。
18.权利要求1的方法，其中DNA基因畸变水平通过DNA检测例如但不局限于原位杂 交、PCR方法、差异展示、DNA-斑点印迹、DNA印迹或其组合来确定。
19.权利要求18的方法，其中所述原位杂交通过FISH(荧光原位杂交)来确定。
20.权利要求19的方法，其中FISH包括分别使用包括靶向所述T0P2A基因区的一部分 或所述HER2基因区或所述TIMP-I基因区的一部分的标记DNA探针的探针混合物，以及包 括靶向染色体17和X染色体着丝粒区的荧光素标记探针的探针混合物。
21.权利要求19的方法，其中所述DNA畸变被确定为与所述样本中包含的内参序列的 平均比值。
22.权利要求21的方法，其中所述内参序列是染色体Xa-卫星(CenX)。
23.权利要求22的方法，其中若TIMP-l/CenX的平均比值小于0. 8，则所述肿瘤细胞 含有TIMP-I基因缺失，若所述比值大于0. 8且小于2. 0则为正常。
24.权利要求22的方法，其中若TOP2A/CenX的平均比值小于0. 8则所述肿瘤细胞含有T0P2A基因缺失，或若TOP2A/Cen X的平均比值大于2. 0则所述肿瘤细胞含有T0P2A基 因扩增，并且若所述比值大于0. 8小于2. 0则正常。
25.权利要求22的方法，其中若HER2/CenX的平均比值小于0. 8则所述肿瘤细胞含 有HER2基因缺失，或若HER2/Cen X的平均比值大于2. 0则所述肿瘤细胞含有HER2基因扩 增，若所述比值大于0. 8小于2. 0则正常。
26.前述权利要求任一项的方法，其中基因表达的水平通过mRNA测量例如但不局限于 RNA印迹、RNA斑点和定量PCR方法确定。
27.前述权利要求任一项的方法，其中异常蛋白表达通过蛋白水平测量例如蛋白印迹、 免疫组织化学、ELISA和RIA确定。
28.前述权利要求任一项的方法，其中所述对DNA畸变或蛋白异常的确定在来自于所 述个体的留存材料——如含有肿瘤组织的石蜡块——上进行。
29.前述权利要求任一项的方法，其中所述癌症选自乳癌、肉瘤、卵巢癌和非小细胞肺癌。
30.前述权利要求任一项的方法，其中所述样本选自肿瘤组织样本、血液样本、血浆样 本、血清样本、尿液样本、粪便样本、唾液样本和来自胸腔或腹腔的浆液样本及其组合。
31.权利要求1的方法，其中所述拓扑异构酶IIα抑制剂疗法包含凋亡或有丝分裂崩 溃的诱导剂。
32.权利要求1和31任一项的方法，其中所述拓扑异构酶IIa抑制剂疗法选自新辅助 性疗法、辅助性治疗和转移性疾病的疗法。
33.权利要求1和31-32任一项的方法，其中所述拓扑异构酶IIα抑制剂是蒽环类。
34.权利要求33的方法，其中所述拓蒽环类选自但不局限于4-表柔比星、柔红霉素、柔 红霉素(脂质体型)、多柔比星、多柔比星(脂质体型)、表柔比星、去甲氧基柔红霉素和米 托蒽醌，或其组合。
35.权利要求34的方法，其中所述拓扑异构酶IIα抑制剂包含于一种还包含环磷酰 胺、紫杉烷和5-氟尿嘧啶的组合物中。
36.权利要求35的方法，其中至少一种环磷酰胺、紫杉烷和/或5-氟尿嘧啶是前药的 形式。
37.权利要求1-32任一项的方法，其中所述拓扑异构酶IIα抑制剂疗法是4_表柔比
38.前述权利要求任一项的方法，其中对拓扑异构酶IIα抑制剂疗法有反应的可能性 通过风险率方法确定。
39.一种在个体中治疗癌症的方法，包括a.根据前述权利要求任一项预测对拓扑异构酶IIα抑制剂疗法的反应性，并且b.为具有高的对拓扑异构酶IIα抑制剂疗法有反应的可能性的所述个体选择一种拓 扑异构酶II α抑制剂疗法，c.对所述个体实施所述拓扑异构酶IIα抑制剂疗法。
40.权利要求39的方法，其中所述拓扑异构酶IIα抑制剂是选自但不局限于4_表柔 比星、柔红霉素、柔红霉素(脂质体型)、多柔比星、多柔比星(脂质体型)、表柔比星、去甲 氧基柔红霉素和米托蒽醌、或其组合的蒽环类。
41.权利要求40的方法，其中所述拓扑异构酶IIa抑制剂疗法包含于一种还包含环磷 酰胺和5-氟尿嘧啶和/或紫杉烷的组合物中。
42.一种用于预测对拓扑异构酶II α抑制剂疗法的反应性的试剂盒，包括a.适合用于确定生物样本中T0P2A/HER2扩增子中的染色体DNA畸变——例如T0P2A 或HER2DNA畸变——的试剂，以及b.适合用于确定生物样本中的TIMP-1DNA畸变或者确定TIMP-I蛋白水平的试剂。
全文摘要
本发明提供预测患有癌症的个体对拓扑异构酶IIα抑制剂疗法的反应性的方法，其中所述方法包括以下步骤与确定染色体17q21上的TOP2A/HER2扩增子中的包括TOP2A和HER2的DNA畸变或TOP2A和ErbB2蛋白表达异常一起组合确定TIMP-1 DNA畸变/TIMP-1蛋白畸变。还提供通过使用所述拓扑异构酶IIα抑制剂疗法治疗癌症的方法。本发明还包括应用所述预测患有癌症的个体对拓扑异构酶IIα抑制剂疗法的反应性的方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102099493SQ200980128443
公开日2011年6月15日 申请日期2009年5月20日 优先权日2008年5月20日
发明者K·V·尼尔森, N·A·布伦纳 申请人:达科丹麦股份公司