专利名称：用于检测细胞死亡的组合物和其使用方法
用于检测细胞死亡的组合物和其使用方法对相关申请案的引用本申请案依据35U. S. C. § 119(e)主张2008年7月30日申请的美国临时申请案 第61/084，861号的权益和优先权，该案全文(包括所有图式和说明书所有部分)以引用的 方式并入本文中。
背景技术：
细胞死亡是许多疾病以及治疗方法(例如癌症的治疗)的一个特征。因此，需要 能够测量细胞死亡，评估涉及细胞死亡的疾病的状态或者诱导细胞死亡的治疗的效果。近 年来，已经描述了两种截然不同的细胞死亡机制，称为凋亡和坏死。尽管这两种细胞死亡形 式在某些方面存在不同，但它们也可视为一个连续区的两种极端情况，由此晚期凋亡与坏
死一致。凋亡，也称为程序性细胞死亡，一般描述为一种能量相关性遗传控制过程，借助于 这一过程，经由内部调控的自杀程序而激活细胞死亡。凋亡的特征一般包括磷脂酰丝氨酸 外翻、膜完整性丧失、细胞质皱缩、染色质和核凝集、DNA降解，以及细胞经由出芽过程而分 裂成较小的凋亡小体。通常，由此产生的凋亡小体被巨噬细胞和邻近细胞吞噬，而不会诱发 炎性反应。评估凋亡常用的方法包括利用经荧光标记的膜联蛋白A5(也称为膜联蛋白V)染 色禾口末端尿苷脱氧核苷酸末端标记(terminal uridine deoxynucleotidylend-labeling, TUNEL)分析。坏死，也称为事故性细胞死亡(accidental cell death)，通常是由多种突发的严 重非生理性损伤(例如物理、化学和局部缺血损伤)中任一者诱导。这一过程一般是以渐 进式细胞肿胀、胞浆蛋白变性和凝结、亚细胞器分解和质膜完整性不可逆破坏为特征。此后 一特征使得细胞毒性组分和其它细胞组分渗漏，从而诱发局部炎性反应。膜完整性丧失(凋亡和坏死共有的特征)致使细胞内组分从细胞漏出。因此，已 经将例如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)蛋白质等细胞内组分的血清和血浆含 量用作细胞死亡(即，坏死和晚期凋亡)的代用标记。
发明内容
本发明至少部分基于本发明者得到的意外发现，S卩，包括LDH在内的脱氢酶不仅 会从死亡细胞中漏出，而且还会被死亡细胞吸收和保留。所述死亡细胞对脱氢酶的摄取使 得有可能借助经适当标记的脱氢酶检测和监测死亡细胞。此外，所述死亡细胞对脱氢酶的 摄取同样也使得有可能以选择性方式靶向这些细胞，以便递送以与脱氢酶的结合物形式提 供的试剂。以此方式递送到死亡细胞的试剂可包括治疗剂。本文描述的本发明的组合物和方法适用于在体内和体外检测和监测死亡细胞。在 一个实施例中，本发明适用于检测和监测经历凋亡的细胞，尤其包括处于早期凋亡阶段的 细胞。可使用所述检测和监测来评估以细胞死亡为特征的病状(尤其包括以凋亡性细胞死 亡为特征的病状)的状态。或者或另外，可使用所述检测和监测来评估以细胞死亡为特征或伴随细胞死亡的治疗(尤其包括以凋亡性细胞死亡为特征或伴随凋亡性细胞死亡的治 疗)的效果。例如，可以使用所述检测和监测来评估化疗和放射疗法在治疗癌症方面的效果。本文描述的本发明的组合物和方法还适用于将包括治疗剂在内的各种试剂选择 性递送到死亡细胞。在一个实施例中，本发明适用于将包括治疗剂在内的各种试剂选择性 递送到经历凋亡的细胞，尤其包括处于早期凋亡阶段的细胞。本文描述的本发明的组合物和方法还适用于治疗以细胞死亡(尤其包括凋亡性 细胞死亡)为特征的多种病状中的任一种。所述病状可包括需要减少细胞死亡的病状以及 需要增加细胞死亡的病状。本发明在一方面是关于分离的由脱氢酶连接于可检测标记构成的结合物，其中所 述可检测标记不是免疫球蛋白或其脱氢酶结合片段。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，脱氢酶是乳酸脱氢酶(LDH)。在 本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，脱氢酶是人LDH。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，脱氢酶是醇脱氢酶 (alcoholdehydrogenase,ADH)。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，脱氢酶是 人 ADH。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，脱氢酶是醛脱氢酶 (aldehydedehydrogenase，ALDH)。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，脱氢酶 是人ALDH。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，脱氢酶是苹果酸脱氢酶 (malatedehydrogenase, MDH)。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，脱氢酶是 人 MDH。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，可检测标记选自由以下各物组 成的群组荧光标记、放射性同位素、纳米粒子、发色团、染料、酶和造影剂，以及其任何组 合。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，可检测标记是荧光标记。在本发明这 一方面和其它方面，在一个实施例中，可检测标记是放射性同位素。在本发明这一方面和其 它方面，在一个实施例中，可检测标记是纳米粒子。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，本发明是关于一种包括本发明 的结合物的组合物。在一个实施例中，组合物是适于投予个体的药物组合物。本发明在一方面是关于一种分离的由脱氢酶连接于至少一种治疗剂构成的结 合物。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，治疗剂是抗凋亡剂，其选自由以 下各物组成的群组环肌酸、磷酸环肌酸、辅酶Q10、L-肉碱、谷胱甘肽、α-硫辛酸、卡 斯帕酶(caspase)抑制肽，和抗凋亡蛋白或肽片段，例如凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptoticprotein, IAPs)和抗凋亡BCL-2家族成员，及其任何组合。本发明在一方面是关于编码脱氢酶的多聚核苷酸，其可操作地连接到编码可检测 标记的多聚核苷酸。在一个实施例中，可检测标记是荧光蛋白。在一个实施例中，可检测标 记是酶。本发明在一方面是关于一种含有本发明的多聚核苷酸的载体。本发明在一方面是关于一种含有本发明的载体的宿主细胞。
本发明在一方面是关于一种检测经历细胞死亡的细胞的方法。根据本发明这一方 面的方法包括以下步骤使测试细胞群与由脱氢酶连接于可检测标记构成的结合物在适于 所述测试细胞群摄取所述结合物的条件下接触；和在所述测试细胞群中检测所述标记，其 中所述测试细胞群中所述标记的存在指示经历细胞死亡的细胞。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，细胞死亡是凋亡。在本发明这一 方面和其它方面，在一个实施例中，细胞死亡是坏死。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，方法步骤是在体外进行。在本发 明这一方面和其它方面，在一个实施例中，方法步骤是离体进行。在本发明这一方面和其它 方面，在一个实施例中，至少一个方法步骤是在体内进行。在本发明这一方面和其它方面， 在一个实施例中，方法步骤都是在体内进行。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，测试细胞群是从患有或怀疑患 有与凋亡或坏死相关的病状的个体获得。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，个体是人类。在本发明这一方面和其它方面，在一个实施例中，病状选自由以下各病状组成的 群组癌症；实体肿瘤和血液肿瘤中化疗、放射或激素诱导的细胞凋亡；对疗法具抗性的肿 瘤；急性心脏同种异体移植物排斥；急性心肌梗塞；蒽环类诱发的心脏毒性；致心律失常性 右心室发育不良；骨骼肌细胞凋亡；充血性心力衰竭；冠状动脉疾病；动脉粥样硬化；感染 性心内膜炎；心肌炎；心肌功能障碍；心肌缺血再灌注损伤；非心脏同种异体移植物排斥； 移植物抗宿主疾病；细菌感染；病毒感染；多器官功能障碍综合症；脓毒性休克；脑缺血再 灌注损伤，包括中风；黄斑变性；神经退化性疾病；中枢神经系统外伤；自体免疫性糖尿病； 类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮；炎性肠病；多发性硬化；其它自体免疫疾病；膜联蛋白 病；骨关节炎；肾衰竭；慢性肾萎缩和肾纤维化；肾小球损伤；和多囊肾病；以及其任何组
I=I O在一个实施例中，所述方法进一步包括以下步骤测量在测试细胞群中检测到的 标记的测试量；将在测试群中检测到的标记测试量与在参考细胞群中检测到的标记参考量 相比较；和确定(a)当测试量大于参考量时细胞死亡的量增加，或(b)当测试量小于参考量 时细胞死亡的量减少。本发明在一方面是关于一种治疗与细胞凋亡相关的病状的方法。根据本发明这一 方面的方法包括以下步骤对患有或怀疑患有与细胞凋亡有关的病状的个体投予有效治疗 所述病状的量的药物组合物，所述药物组合物包含由脱氢酶连接于至少一种治疗剂构成的 结合物。在一个实施例中，所述方法进一步包括监测个体体内的细胞凋亡的步骤。本发明在一方面是关于一种将试剂选择性递送到凋亡细胞的方法。根据本发明这 一方面的方法包括使凋亡细胞与由脱氢酶连接于至少一种试剂构成的结合物接触的步骤。在一个实施例中，试剂是抗凋亡剂。本发明在一方面是关于一种鉴别抗凋亡剂的方法。根据本发明这一方面的方法包 括以下步骤使测试细胞与测试剂和由脱氢酶连接于可检测标记构成的结合物在另外诱导 测试细胞凋亡的条件下接触；测量测试细胞中标记的测试量；将标记的测试量与参考细胞 中标记的参考量相比较，所述参考细胞已与所述结合物在另外诱导测试细胞凋亡的条件下接触；和当标记的测试量小于标记的参考量时，将测试剂鉴别为抗凋亡剂。本发明的每一限定都可涵盖本发明的各种实施例。因此，预期涉及任一要素或要 素组合的本发明的每一限定都可以包括在本发明各方面中。本发明的应用并不局限于以下 描述中所陈述或各图式中所说明的组分的构建和布置细节。本发明能够以其它实施例实践 或以不同方式进行。另外，本文使用的措辞和术语都是出于描述的目的，并且不应将其视为 限制。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”和其变化形式将涵盖后文 所列各项和其等效物以及额外各项。
图 1 是一组荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 柱形图，描述了使用经异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的膜联 蛋白V和经Cy5. 5标记的LDH测量的海拉(HeLa)细胞随时间的凋亡。图2是一组FACS柱形图，描述了使用经FITC标记的膜联蛋白V和经Cy5. 5标记 的LDH测量的RS4 ；11细胞的凋亡。图3是一组FACS柱形图，描述了在含有钙的膜联蛋白缓冲液或不含钙的磷酸盐缓 冲的生理盐水(phosphate-buffered saline, PBS)中使用经FITC标记的膜联蛋白V和经 Cy5. 5标记的LDH测量的海拉细胞的凋亡。图4是描述基于LDH的凋亡分析与基于膜联蛋白V的凋亡分析对血清的不敏感性 的比较图。图5是一组FACS柱形图，描述了经FITC标记的谷胱甘肽S-转移酶(glutathione Stransferase, GST)无法使凋亡的海拉细胞染色，而经FITC标记的利用三种人LDH同工型 (LDH-A、LDH-B和LDH-C)中每一种制备的GST融合蛋白可使凋亡的海拉细胞染色，未结合 的LDH-B探针也如此。图6是一组FACS柱形图，描述了利用经Alexa 680标记的醇脱氢酶(ADH)、醛脱氢 酶(ALDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)进行的凋亡海拉细胞的检测。图7是一对摄影图像，描述了用媒剂(左图)或紫杉醇(Taxol)(右图)处理的带 有原位乳房异种移植(MDA-MB43Q肿瘤的小鼠体内经标记LDH探针的积累。箭头指示肿瘤 的位置。图8提供在暴发性肝衰竭模型中LDH-B探针的示范性使用。㈧提供用抗Fas或 对照IgG抗体进行处理的图解以及由近红外体内成像获得的一系列图像；(B、C)提供的两 个图显示了在比较经抗Fas处理的动物与IgG对照处理的动物(每组η =幻时LDHB探针 和膜联蛋白V探针的定量结果。图9提供LDH探针用于使治疗诱导的细胞死亡成像的示范性使用。(A)描述了用 ΑΜΝ107(尼罗替尼(nilotinib))处理KU812 (BCR-ABL+)肿瘤的图解以及显示经AMN107处 理的动物中肿瘤消退的图；(B、C)提供的一系列图像和图说明了经AMN107处理的动物中 LDHB探针的摄取相比媒剂处理的对照组有所增加。箭头指示肿瘤的位置。
具体实施例方式凋亡是程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)的一种高度保守形式，在如器官发育、组织稳态和免疫系统调控等多种生理过程中起到重要作用，因为许多生物体 使用这一机制来选择性除去不必要的细胞。然而，当存活与死亡信号之间的生理平衡偏向 细胞死亡时，将进入凋亡程序并达到多种病理病状的顶点。据悉，过度凋亡会导致组织功 能性的渐进性丧失，如在急性心肌梗塞、慢性心力衰竭、同种异体移植物排斥、中风、神经退 化性病症(例如阿兹海默氏病(Alzheimer' s)、帕金森氏病(Parkinson' s)和亨廷顿 氏病(Huntington' s disease))和炎症中所出现的情况。相比之下，如系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus，SLE)和类风湿性关节炎等自体免疫疾病是以凋亡不足 为特征，这使得免疫活性细胞(即，自体反应性淋巴细胞)能够存活并且不适宜地损伤健康 器官。抗凋亡机制在癌症形成过程中也起到关键作用。此外，许多药物的有益或有害效应 都可能归因于其对凋亡过程的作用。因此，在体内无创监测凋亡发生的速率和程度将为临 床医生提供有关疾病活动性和治疗功效的相关临床信息。凋亡可分为早期凋亡和晚期凋亡。处于早期凋亡阶段的细胞通常对膜联蛋白V染 色呈阳性，而对例如碘化丙啶(propidium iodide,PI)等所谓的活体染色剂染色不呈阳性。 相比之下，处于晚期凋亡阶段的细胞以及坏死细胞常常对膜联蛋白V和PI都呈阳性。已经进行了包括临床试验在内的多种尝试来测量体外和体内的细胞凋亡。这些研 究中大部分都依赖于与将结合于磷脂酰丝氨酸的膜联蛋白V形成的各种结合物。膜联蛋白 V是结合钙和磷脂的膜联蛋白超家族的一个成员，这一家族中有至少13个成员已经在多种 生物体中得到鉴别。与其它膜联蛋白成员相同，膜联蛋白V广泛表达于真核生物体中。这种 蛋白质主要是在细胞内质膜的胞质侧上发现，但在健康人类的血液区室中的循环浓度极低 (l-6ng/ml)。此外，在多种细胞类型和组织中普遍表达这种蛋白质，包括心肌细胞、血管内 皮、红细胞、凝血细胞、淋巴细胞、胶质细胞、星形细胞、少突胶质细胞、雪旺氏细胞Gchwarm cell)、骨胳肌细胞、肝细胞、支气管、软骨细胞和成骨细胞。在活细胞的质膜内，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)残基呈不对称定 向，致使其仅仅暴露于细胞内区室，即，PS残基朝向内部。在细胞凋亡级联的早期，膜极性 丧失，由此导致PS残基暴露于质膜的细胞外侧。在这一阶段，膜联蛋白V结合于外部暴露 的PS残基，但膜不能自由地透过。小分子染料，例如碘化丙啶(PI)或台盼蓝(trypanblue) (即活体染料)，无法自由地扩散到细胞中。因此，早期凋亡细胞对膜联蛋白V染色呈阳性， 但对活体染料染色呈阴性。在晚期凋亡细胞和坏死细胞中，膜完整性丧失，由此使得活体染 料自由扩散到细胞中。因此，死亡细胞对于膜联蛋白V和活体染料都呈阳性。根据这些观察结果，最初曾用不同的荧光标签(例如FITC)来标记膜联蛋白V，而 现今常将膜联蛋白V用于组织学和细胞分选研究中，以鉴别和定量凋亡细胞。然而，所有这 些检测方法(例如显微镜检查、免疫组织化学法、流式细胞测量术、高通量筛选法)或是在 检测能力方面存在某些问题，或是在体外的适用性有限，并且通常需要如活组织检查等创 伤性取样技术。如TUNEL分析等其它方法在定量所述过程方面经常缺乏灵敏性，因为其检 测机制仅靶向处于凋亡级联的较晚阶段的细胞，而此时凋亡细胞的吞噬作用已经在体内发 生了。也曾经用例如99mTc或123I等放射性核素标签对膜联蛋白V进行放射性标记，以便 在体内进行细胞凋亡的无创检测和定量。最初利用正常和镰状红细胞、激活的血小板和组 织因子(tissue factor, TF)表达性成纤维细胞或卵巢癌细胞进行的体外研究明确证实了一个观点，即，可以利用经放射性标记的膜联蛋白V成功地检测早期凋亡。此后，在体内评 价动物和人体中经放射性标记的膜联蛋白V方面进行了包括临床试验在内的深入研究。这些使用经标记的膜联蛋白V测量细胞凋亡的尝试的结果证实是令人失望的。由 这些方法得到的动态范围相当有限，因为血清蛋白对膜联蛋白V结合具有抑制作用，并且 膜联蛋白V结合需要钙。此外，膜联蛋白V和相关试剂相当昂贵。本发明至少部分是基于经历凋亡和坏死的细胞能够吸收和保留脱氢酶。先前曾报 导过，死亡细胞会释放多种酶，包括LDH。而先前尚不了解且出乎预期的是，死亡细胞也吸收 和保留LDH。除LDH外，本发明者还发现，类似地，经历凋亡和坏死的细胞可吸收和保留各种 其它脱氢酶，至少包括醇脱氢酶、醛脱氢酶、苹果酸脱氢酶和各种人LDH的同工型(LDH-A、 LDH-B和LDH-C)。相比之下且如本文所揭示，这一现象是专门针对脱氢酶，因为谷胱甘肽S 转移酶(GST ；—种分子量大致等于LDH的非脱氢酶类酶)不能被死亡细胞吸收和保留，而 GST-LDH结合物能被死亡细胞吸收和保留。很明显，如本文所描述的，LDH探针不仅仅通过在膜完整性丧失后被动扩散到死亡 细胞中而充当活体染料。第一，LDH探针使处于早期凋亡阶段的细胞染色(即，膜联蛋白V 阳性、活体染料阴性)。第二，在彻底洗涤后，LDH探针不会自由扩散到细胞外。脱氢酶是普遍存在的高度保守的酶，其催化一个质子和一对电子从供体分子转移 到受体分子，由此氧化供体并还原受体。这些酶通常使用NAD/NADP或者黄素辅酶(例如 FAD或FMN)作为受体。脱氢酶特别包括(但不限于)乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶和苹 果酸脱氢酶。其它代表性脱氢酶列于表1中。表1.代表性脱氢酶的清单
权利要求
1.一种脱氢酶连接于可检测标记的分离的结合物，其中所述可检测标记不是免疫球蛋 白或其脱氢酶结合片段。
2.根据权利要求1所述的结合物，其中所述脱氢酶是乳酸脱氢酶(LDH)。
3.根据权利要求2所述的结合物，其中所述LDH为人LDH。
4.根据权利要求1所述的结合物，其中所述脱氢酶选自由以下组成的群组 醇脱氢酶(ADH)、醛脱氢酶(ALDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)。
5.根据权利要求4所述的结合物，其中所述脱氢酶为人脱氢酶。
6.根据权利要求1所述的结合物，其中所述可检测标记选自由以下组成的群组 荧光标记、放射性同位素、纳米粒子、发色团、染料、酶和造影剂。
7.根据权利要求6所述的结合物，其中所述标记为荧光标记。
8.根据权利要求6所述的结合物，其中所述标记为放射性同位素。
9.根据权利要求6所述的结合物，其中所述标记为纳米粒子。
10.一种组合物，其包含根据权利要求1至9中任一权利要求所述的结合物。
11.一种脱氢酶连接于至少一种治疗剂的分离的结合物。
12.根据权利要求11所述的结合物，其中所述脱氢酶是乳酸脱氢酶(LDH)。
13.根据权利要求12所述的结合物，其中所述LDH为人LDH。
14.根据权利要求11所述的结合物，其中所述脱氢酶选自由以下组成的群组 醇脱氢酶(ADH)、醛脱氢酶(ALDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)。
15.根据权利要求14所述的结合物，其中所述脱氢酶为人脱氢酶。
16.根据权利要求11所述的结合物，其中所述治疗剂为抗凋亡剂，其选自由以下组成 的群组环肌酸、磷酸环肌酸、辅酶Q10、L_肉碱、谷胱甘肽、α -硫辛酸、卡斯帕酶(caspase)抑 制肽和凋亡抑制蛋白(IAP)。
17.—种组合物，其包含根据权利要求11至14中任一权利要求所述的结合物。
18.—种编码脱氢酶的多聚核苷酸，其可操作地连接到编码可检测标记的多聚核苷酸。
19.根据权利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述脱氢酶是乳酸脱氢酶(LDH)。
20.根据权利要求19所述的多聚核苷酸，其中所述LDH为人LDH。
21.根据权利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述脱氢酶选自由以下组成的群组 醇脱氢酶(ADH)、醛脱氢酶(ALDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)。
22.根据权利要求21所述的多聚核苷酸，其中所述脱氢酶为人脱氢酶。
23.根据权利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述可检测标记为荧光蛋白。
24.根据权利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述可检测标记是酶。
25.—种载体，其包含根据权利要求18至M中任一权利要求所述的多聚核苷酸。
26.一种宿主细胞，其包含根据权利要求25所述的载体。
27.一种用于检测正经历细胞死亡的细胞的方法，所述方法包含使测试细胞群与脱氢酶连接于可检测标记的结合物在适于所述测试细胞群摄取所述 结合物的条件下接触；和在所述测试细胞群中检测所述标记，其中在所述测试细胞群中所述标记的存在指示正经历细胞死亡的细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述脱氢酶是乳酸脱氢酶(LDH)。
29.根据权利要求观所述的方法，其中所述LDH为人LDH。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述脱氢酶选自由以下组成的群组 醇脱氢酶(ADH)、醛脱氢酶(ALDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述脱氢酶为人脱氢酶。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述细胞死亡是凋亡。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述细胞死亡是坏死。
34.根据权利要求27所述的方法，其中所述接触和所述检测都是在体外进行的。
35.根据权利要求27所述的方法，其中所述接触和所述检测都是离体进行的。
36.根据权利要求27所述的方法，其中所述接触和所述检测中至少一者是在体内进行的。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述接触和所述检测都是在体内进行的。
38.根据权利要求27所述的方法，其中所述测试细胞群是从患有或怀疑患有与细胞凋 亡有关的病状的个体获得。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述病状选自由以下组成的群组癌症；实体肿瘤和血液肿瘤中化疗、放射或激素诱导的细胞凋亡；对疗法具抗性的肿 瘤；急性心脏同种异体移植物排斥；急性心肌梗塞；蒽环类诱发的心脏毒性；致心律失常性 右心室发育不良；骨骼肌细胞凋亡；充血性心力衰竭；冠状动脉疾病；动脉粥样硬化；感染 性心内膜炎；心肌炎；心肌功能障碍；心肌缺血再灌注损伤；非心脏同种异体移植物排斥； 细菌感染；病毒感染；多器官功能障碍综合症；脓毒性休克；脑缺血再灌注损伤；黄斑变性； 神经退化性疾病；中枢神经系统外伤；自体免疫性糖尿病；类风湿性关节炎；系统性红斑狼 疮；炎性肠病；多发性硬化；其它自体免疫疾病；膜联蛋白病；骨关节炎 ’肾衰竭；慢性肾萎 缩和肾纤维化；肾小球损伤；和多囊肾病。
40.根据权利要求27所述的方法，其进一步包含 测量在所述测试细胞群中检测到的标记的测试量；将在所述测试细胞群中检测到的所述标记测试量与在参考细胞群中检测到的标记参 考量相比较；和确定(a)当所述测试量大于所述参考量时细胞死亡的量增加，或(b)当所述测试量小 于所述参考量时细胞死亡的量减少。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述细胞死亡是凋亡。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述细胞死亡是坏死。
43.一种用于治疗与细胞凋亡有关的病状的方法，所述方法包含对患有或怀疑患有与细胞凋亡相关的病状的个体投予有效治疗所述病状的量的药物 组合物，所述药物组合物包含脱氢酶连接于至少一种治疗剂的结合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述脱氢酶是乳酸脱氢酶(LDH)。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述LDH为人LDH。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述脱氢酶选自由以下组成的群组 醇脱氢酶(ADH)、醛脱氢酶(ALDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述脱氢酶为人脱氢酶。
48.根据权利要求43所述的方法，其中所述病状选自由以下组成的群组癌症；实体肿瘤和血液肿瘤中化疗、放射或激素诱导的细胞凋亡；对疗法具抗性的肿 瘤；急性心脏同种异体移植物排斥；急性心肌梗塞；蒽环类诱发的心脏毒性；致心律失常性 右心室发育不良；骨骼肌细胞凋亡；充血性心力衰竭；冠状动脉疾病；动脉粥样硬化；感染 性心内膜炎；心肌炎；心肌功能障碍；心肌缺血再灌注损伤；非心脏同种异体移植物排斥； 细菌感染；病毒感染；多器官功能障碍综合症；脓毒性休克；脑缺血再灌注损伤；黄斑变性； 神经退化性疾病；中枢神经系统外伤；自体免疫性糖尿病；类风湿性关节炎；系统性红斑狼 疮；炎性肠病；多发性硬化；其它自体免疫疾病；膜联蛋白病；骨关节炎 ’肾衰竭；慢性肾萎 缩和肾纤维化；肾小球损伤；和多囊肾病。
49.根据权利要求43至48中任一权利要求所述的方法，其进一步包含监测所述个体体 内的细胞凋亡。
50.一种用于将试剂选择性递送到凋亡细胞的方法，所述方法包含 使凋亡细胞与脱氢酶连接于至少一种试剂的结合物接触。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述脱氢酶是乳酸脱氢酶(LDH)。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述LDH为人LDH。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述脱氢酶选自由以下组成的群组 醇脱氢酶(ADH)、醛脱氢酶(ALDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述脱氢酶为人脱氢酶。
55.根据权利要求50所述的方法，其中所述试剂为抗凋亡剂。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗凋亡剂选自由以下组成的群组 环肌酸、磷酸环肌酸、辅酶Q10、L_肉碱、谷胱甘肽、α -硫辛酸、卡斯帕酶抑制肽和凋亡抑制蛋白(IAP)。
57.一种用于鉴别抗凋亡剂的方法，其包含使测试细胞与测试剂和脱氢酶连接于可检测标记的结合物在另外诱导所述测试细胞 凋亡的条件下接触；测量所述测试细胞中标记的测试量；将所述标记测试量与参考细胞中标记的参考量相比较，所述参考细胞已与所述结合物 在另外诱导所述测试细胞凋亡的条件下接触；和当所述标记测试量小于所述标记参考量时，将所述测试剂鉴别为抗凋亡剂。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述脱氢酶是乳酸脱氢酶(LDH)。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述LDH为人LDH。
60.根据权利要求57所述的方法，其中所述脱氢酶选自由以下组成的群组 醇脱氢酶(ADH)、醛脱氢酶(ALDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述脱氢酶为人脱氢酶。
62.根据权利要求57所述的方法，其中所述可检测标记选自由以下组成的群组 荧光标记、放射性同位素、纳米粒子、发色团、染料、酶和造影剂。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述标记为荧光标记。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述标记为放射性同位素。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述标记为纳米粒子。
全文摘要
本发明提供在体外和体内检测细胞凋亡和坏死的化合物和其使用方法。还提供将试剂选择性递送到正经历细胞凋亡或坏死的细胞的化合物和其使用方法。所述化合物和方法是基于与例如乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶和苹果酸脱氢酶等脱氢酶形成的结合物。所述化合物和方法适用于诊断和治疗以细胞凋亡为特征的病状，包括癌症、心脏病、神经病(包括中风)和自体免疫性。所述化合物和方法将提供超越与基于膜联蛋白V的相应化合物和方法的截然不同的优势。本发明还提供用于筛选可调节(即，抑制或促进)细胞凋亡的化合物的方法。
文档编号C12Q1/32GK102105594SQ200980129095
公开日2011年6月22日 申请日期2009年7月29日 优先权日2008年7月30日
发明者安德鲁·孔, 帕拉布·班纳吉 申请人:达纳-法伯癌症研究所有限公司