专利名称：确定细胞对药物的敏感性的制作方法
确定细胞对药物的敏感性发明领域本发明涉及用于确定细胞对核苷类似物药物的敏感性的方法和试剂盒。
背景技术：
急性髓性白血病(AML)这一术语用于定义由于髓前体细胞的恶性转化导致的一系列各种症状的血液疾病。转化导致血液和骨髓中的未成熟和未分化细胞的增殖，并抑制正常的造血作用。对于AML患者的有效治疗目前仍是一个难题，临床结果经常难以预料和令人失望。仅有70%的新确诊并接受标准治疗方案的患者对于治疗有所反应。而且，这些患者中还有一大部分不能获得长期缓解，并发展出对于后续治疗的抗性。核苷类似物(NA)是一类广泛用于治疗某些癌症和病毒感染的抗代谢药物。这类化合物在结构上与体内的天然核苷相似，并且服从于相同的摄取和代谢机制，这使得它们被掺入到新合成的DNA中。这种DNA的掺杂导致DNA合成的抑制和链终止，从而导致细胞死亡。NA是需要被磷酸化为三磷酸形式才能形成有活性的核苷酸的前药。某些NA并不直接破坏DNA的复制。例如抗疱疹药物阿昔洛韦，它在被细胞摄取和磷酸化之后通过抑制DNA 聚合酶而破坏DNA的复制。核苷类似物阿糖胞苷(Ara-C)是一种活性最强的单一抗癌药剂，已经作为治疗 AML的主要疗法被应用了三十年以上。Ara-C在体内通过特异性的核苷转运蛋白hENTl被转运至细胞内，并迅速地被dCK磷酸化为其单磷酸形式。Ara-CMP被核苷激酶进一步磷酸化为其有活性的三磷酸形式Ara-CTP。Ara-CTP的抗增殖作用和细胞毒性作用是由于其能够干扰DNA聚合酶，并掺入至DNA链中，导致链终止和DNA合成的停止。高剂量Ara-C还可以导致细胞色素C在细胞溶质中的累积、线粒体膜功能的丧失和活性氧分子(reactive oxygen species)的增加。对Ara-C的化学抗性可能来自于多种影响Ara-CTP形成及其掺入DNA的水平的因素，所述因素包括低药物摄取、被胞苷脱氨酶转化为Ara-U或者活性代谢物被胞质核苷酶脱磷酸化等。对核苷类似物药物的抗性的基本机制为由于NA的不充分的三磷酸化。这一结果的主要原因是由于磷酸化酶(例如dCK)的水平降低、细胞摄取的效率不够高(例如hENTl 的水平降低)、NA降解酶(特别是胞苷脱氨酶cdd)的水平增高、以及三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)总量的增加。脱氧核糖核苷激酶(dNK)水平也被认为在药物抗性中起重要作用。Ara-C对大肠杆菌(Escherichia coli)没有作用，因为大肠杆菌没有dCK，并且可通过脱氧胞苷脱氨酶(cdd)将Ara-C脱氨基而形成Ara-尿嘧啶。Wang et al.，Antimicrob. Agents. Chemother.，1998,42 丨620-2625 描述了 cdd缺陷型 E. coli 突变体(S05218)的构建，该突变体通过表达人类dCK基因而在Ara-C的存在下表现出相对减少的生长。当在不存在可被dCK诱导的促进物IPTG的条件下检测时，Ara-C对于生长的作用完全消失，这表明在细菌中人类dCK的表达导致Ara-CTP掺入至细菌DNA中。在传统上，Ara-C效力的体外评估包括检测a)细胞死亡，b) S期活性的降低，或c) 在使白细胞瘤细胞接触Ara-C后使用AML克隆形成测定。这些方法均为非标准化方法，并且费时而昂贵，并不适用于常规筛选。因此，在使用包括Ara-C的治疗方案对患者进行治疗时并不会考虑患者对于药物的敏感性，患者可能受到令人虚弱的副作用的影响，所述副作用例如骨髓抑制、恶心、腹泻、呕吐以及发展出具有抗药性的继发性癌症。因此，需要简便、快速的预筛选测试方法来确定患者中核苷类似物药物的效力。发明概述本发明涉及用于确定细胞对脱氧核糖核苷激酶依赖性药物的抗性或敏感性的方法和试剂盒。根据本发明的第一方面，提供了用于在体外确定细胞系或患者样本对脱氧核糖核苷激酶依赖性药物的抗性或敏感性的方法，所述方法包括下述步骤(i)用脱氧核糖核苷激酶依赖性药物处理患者样本或细胞系或其部分；(ii)裂解来自步骤(i)中的患者样本或细胞系中的细胞；(iii)将部分来自步骤(ii)的细胞裂解物与引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌和脱氧核糖核苷激酶转录促进物混合；(iv)将部分来自步骤(ii)的细胞裂解物与引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌、脱氧核糖核苷激酶转录促进物和脱磷酸化剂混合；(ν)任选地，将部分来自步骤(ii)的细胞裂解物与引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌混合；以及(vi)检测步骤(iii)、(iv)和任选地步骤(ν)的每一步的混合物的生物发光，其中每一混合物的比较的生物发光水平提供了对所述药物的抗性或敏感性的量度。根据本发明的第二方面，提供了用于确定细胞系或患者样本对脱氧核糖核苷激酶依赖性药物的抗性或敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌、脱氧核糖核苷激酶转录促进物和脱磷酸化剂。根据本发明的第三方面，提供了脱磷酸化剂、脱氧核糖核苷激酶转录促进物和引入脱氧核糖核苷激酶基因的生物发光性报告物用于在离体条件下确定细胞系或患者样本对能被脱氧核糖核苷激酶磷酸化的药物的抗性或敏感性的用途。
参照附图对本发明作了描述，其中 图1为显示生物发光性细菌生物传感器对Ara-C的反应的示意图；图(A)对应的是通过0D600检测的生长水平，图(B)对应的是以相对光单位(RLU)检测的相同培养物中的发光水平； 图2为显示生物发光性生物传感器对低浓度Ara-C的反应的示意图； 图3为显示生物传感器对Ara-CTP的反应的示意图。图(A)对应的是细菌生物传感器对以不同浓度添加的Ara-CTP的反应。图(B)对应的是细菌生物传感器对于在测定开始时加入BAP、随后又加入不同浓度的Ara-CTP的反应； 图4为使用生物发光性细菌生物传感器进行细胞裂解测定的示意图，显示了对 Ara-C的细胞内反应； 图5为显示四种治疗应答曲线的示意图； 图6显示了 Ara-C敏感性KGl_a细胞对25 μ M的Ara-C和对对照的反应；以及 图7的两幅图显示了 25 μ M的Ara-C对于来自Ara-C反应性AML患者的外周血样 (图(C))和来自Ara-C抗性AML患者的外周血样(图(D))的效果。
发明的详细描述 本发明提供了用于快速确定患者细胞样本或细胞系对于抗癌药物和抗病毒药物的抗性或敏感性的方法。所述方法使用了对核苷类似物(NA)药物敏感的生物发光性报告细菌，所述核苷类似物(NA)药物依赖于脱氧核糖核苷激酶(dNK)进行细胞内磷酸化。
本发明涉及细胞裂解测定，所述测定使用生物发光性细菌作为药物活性的报告物，并对筛选对dNK磷酸化依赖性NA药物具有敏感性的病毒感染细胞和癌细胞的用途具有显著的潜在价值。所述测定适于用作药物治疗开始之前对临床样本的预筛选和用作减量疗法效力的指示。此外，所述测定可以重复地用于癌症复发的患者，以确定肿瘤是否经过无性进化，以及是否能够使用所述药物获得第二次的完全康复。
根据本发明的实施方案，将生物发光性报告细菌与经过药物处理的细胞裂解物混合，并检测由细菌发出的生物发光，从而确定细胞对所述药物的敏感性。脱氧胞苷脱氨酶 (cdd)-缺陷型细菌对核苷类似物药物具有敏感性，并且当它们存在时表现出生物发光的增加。
本文所用的术语“生物发光”指的是在存在分子氧(O2)和能量(NADH)的条件下， 通过荧光素酶的催化，在活生物体内由于有机化合物(荧光素)的氧化而产生可见光。发光的能力依赖于生物体的还原能力，因此只有有代谢活性的细菌才能产生光。
生物发光表型可以是内源性的，或者也可以通过例如引入并在组成型启动子控制下表达分离自发冷光杆菌(Photorhabdus luminescens)的IuxCDABE操纵子，而使大多数细菌具有生物发光表型。生物发光性细菌不需要外源性底物，并能够发光而作为细菌实时生理状态的直接指示。
低于0. 05 μ m的NA药物的细胞内浓度，可以通过生物发光性细菌光输出的显著增高而被检测出来，这一技术适用于在8小时或更短的时间范围内对临床NA剂量范围的反应进行定量。
本发明的细菌可为对NA药物敏感并表达能赋予生物发光表型的内源性或外源性基因的任何细菌。在优选的实施方案中，所述细菌不能使胞嘧啶脱氨生成尿嘧啶，在更优选的实施方案中，所述细菌不表达脱氧胞苷脱氨酶(cdd)。所述细菌优选地为E. coli，更优选地为E. coli MG 1655。MG 1655是野生型E. coli K-12衍生菌株。野生型MG 1655表达脱氧胞苷脱氨酶。因此，本发明的最优选的细菌为脱氧胞苷脱氨酶(cdd)-缺陷型的E. coli MG 1655菌株。这种菌株保藏于NCTC，保藏号为No. 13427。
本发明的方法在体外进行，即在患者体外进行。
本文所用的术语“患者细胞样本”指的是分离自患者的细胞。所述细胞样本的细胞应典型地为癌性细胞或被病毒感染的细胞，例如急性髓性白血病细胞。
术语“患者”指的是哺乳动物，包括非灵长类(例如牛、猪、马、猫、大鼠和小鼠)和灵长类(例如猿猴和人)动物，更优选地为人。
在优选实施方案中，所述样本材料为骨髓或获自外周血的白细胞，可通过例如常规的放血技术获得。
术语“细胞系”指的是永生化的离体细胞培养物。所述细胞系中的细胞应典型地为癌性细胞或被病毒感染的细胞，例如急性髓性白血病细胞。
术语“未处理的对照细胞”指的是未经脱氧核糖核苷激酶依赖性药物处理的患者细胞样本或细胞系中的细胞。
本发明的方法和试剂盒可用于确定对脱氧核糖核苷激酶依赖性药物即应用脱氧核糖核苷激酶(dNK)途径的NA药物的抗性或敏感性。表1提供了抗病毒药物和抗癌药物实例的非穷举列表，它们的作用机机理均依赖于通过dNK进行的磷酸化。
表 1
权利要求
1.在体外确定细胞系或患者样本对脱氧核糖核苷激酶依赖性药物的抗性或敏感性的方法，其中所述方法包括下述步骤(i)用脱氧核糖核苷激酶依赖性药物处理患者样本或细胞系或其部分； ( )裂解来自步骤(i)的患者样本或细胞系中的细胞；(iii)将部分来自步骤(ii)的细胞裂解物与引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告物细菌和脱氧核糖核苷激酶转录促进物混合；(iv)将部分来自步骤(ii)的细胞裂解物与引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌、脱氧核糖核苷激酶转录促进物和脱磷酸化剂混合；(ν)任选地，将部分来自步骤(ii)的细胞裂解物与引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌混合；以及(vi)检测步骤(iii)、(iv)和任选地步骤(ν)的每一步所得的混合物的生物发光，其中每一所述混合物的比较的生物发光水平提供了对所述药物的抗性或敏感性的量度。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括下述步骤a)对来自所述患者样本或细胞系的未经处理的细胞进行裂解；b)将部分来自步骤(a)的细胞裂解物与引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌和脱氧核糖核苷激酶转录促进物混合；c)将部分来自步骤(a)的细胞裂解物与引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌、脱氧核糖核苷激酶转录促进物和脱磷酸化剂混合；d)任选地，将部分来自步骤(ii)的细胞裂解物与引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌混合；以及e)检测步骤(b)、(c)和任选地步骤(d)的每一步的混合物的生物发光，并从权利要求 1的步骤(iii)、(iv)和任选地步骤(ν)的每一步中所检测的相应生物发光中分别减去步骤(b)、(C)和任选地步骤(d)的每一步的混合物的生物发光，其中针对每一测定的生物发光的所得值的比较提供了对所述药物的抗性或敏感性的量度。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中进行权利要求1的步骤(v)，并且其中通过下列通用公式对所述细胞系或患者样本的抗性或敏感性进行分类若生物发光LIP > LI且LIP > L且LI L，则所述细胞摄取并代谢所述药物； 若生物发光LIP > L且LI > L且LIP Li，则所述药物被摄取但并未被代谢； 若生物发光LIP > LI > L，则所述药物被摄取和部分地被代谢；以及若生物发光LIP ^ LI ^ L，则所述药物未被摄取，其中L =裂解物，LI =裂解物和转录促进物，LIP =裂解物和转录促进物和磷酸酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中进行权利要求1的步骤(ν)，并且其中使用下列公式对所述细胞系或患者样本的敏感性进行分类% Int = [T(n/m)] XlOO其中％ ^^二相互作用^，了二处理(药物)，以及 η = LIP 且 m = LI ；或 η = LIP 且 nd m = L ；或 η = LI 且 m = L ； 其中若当 η = LIP 且 m = LI 时％ ht 彡 10%，且当 η = LI 且 m = L 时％ Int < 10%，则所述患者样本或细胞系摄取并代谢所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物；若当 η = LIP 且 m = LI 时％ Int 彡 10%，且当 11 = 1^1且111 = 1^和11 = 1^1卩且111 = 1^ 二者时％ Int > 10%，则所述患者样本或细胞系摄取但并未代谢所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物；若当 η = LIP 且 m = LI 时％ ht 彡 10%，且当 η = LI 且 m = L 时％ Int > 10%，则所述患者样本或细胞系摄取并部分代谢所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物；以及若当η = LIP且m = LI和η = LI且m = L以及η = LIP且m = L三者时％ Int彡10%, 则所述患者样本或细胞系未摄取所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物。
5.根据权利要求2所述的方法，其中进行权利要求1的步骤(ν)，并且其中使用下述公式对所述细胞系或患者样本的抗性或敏感性进行分类% Int = [T (n/m)-C(n/m)]X100 其中% Int =相互作用0A ；T =处理(药物)；C =对照(无药物)，以及 η = LIP 且 m = LI ；或 η = LIP 且 m = L ；或 η = LI 且 m = L, 其中若当 η = LIP 且 m = LI 时％ ht 彡 10%，且当 η = LI 且 m = L 时％ Int < 10%，则所述患者样本或细胞系摄取并代谢所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物；若当 η = LIP 且 m = LI 时％ Int 彡 10%，且当 11 = 1^1且111 = 1^和11 = 1^1卩且111 = 1^ 二者时％ Int > 10%，则所述患者样本或细胞系摄取但并未代谢所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物；若当 η = LIP 且 m = LI 时％ ht 彡 10%，且当 η = LI 且 m = L 时％ Int > 10%，则所述患者样本或细胞系摄取并部分代谢所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物；以及若当η = LIP且m = LI和η = LI且m = L以及η = LIP且m = L 三者时％ Int ( 10%，则所述患者样本或细胞系未摄取所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中若当η = LIP且m = LI时％ Int彡5%，且当η = LI且m = 1^时％ Int ( 10%，则所述患者样本或细胞系摄取并代谢所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物；若当 η = LIP 且 m = LI 时％ Int 彡 10%，且当 11 = 1^1且111 = 1^和11 = 1^1卩且111 = 1^ 二者时％ Int > 5 %，则所述患者样本或细胞系摄取但并未代谢所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物；若当η = LIP且m = LI时％ Int彡5%，且当η = LI且m = L时％ Int > 5%，则所述患者样本或细胞系摄取并部分代谢所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物；若当η = LIP且m = LI和η = LI且m = L以及η = LIP且m = L三者时％ Int彡10%, 则患者样本或细胞系未摄取所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中不进行权利要求1的步骤(v)，并且其中使用下述公式对细胞系或患者样本的抗性进行分类若生物发光LIP ^ Li，则所述患者样本或细胞系对所述药物完全有抗性。
8.根据权利要求1所述的方法，其中不进行权利要求1的步骤(ν)，并且其中使用下述公式对所述细胞系或患者样本对所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物的抗性进行分类% Int = [T(n/m)] XlOO 其中η = LIP且m = Li，并且其中若％ Int < 10%，则所述者样本或细胞系对所述药物基本有抗性。
9.根据权利要求2所述的方法，其中不进行权利要求1的步骤(ν)，并且其中使用下述公式对所述细胞系或患者样本的抗性进行分类若生物发光[T(n)-C(n)] ^ [Τ (m)-C (m)]，则所述患者样本或细胞系对所述药物有抗性。
10.根据权利要求2所述的方法，其中不进行权利要求1的步骤(ν)，并且其中使用下述公式对所述细胞系或患者样本对所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物的抗性进行分类% Int = [T(n/m)-C(n/m)]X100 其中η = LIP且m = Li，并且其中若％ Int ( 10%，则所述患者样本或细胞系对所述药物基本有抗性。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述生物发光性报告细菌为E.coli MG 1655的脱氧胞苷脱氨酶(cdd)-缺陷型菌株。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物发光性报告细菌表达luxCDABE操纵子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物发光性报告细菌的保藏编号为 No. NCTC 13427ο
14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述脱氧核糖核苷激酶为胸苷激酶1、 胸苷激酶2、脱氧胞苷激酶或脱氧鸟苷激酶。
15.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述脱氧核糖核苷激酶为脱氧胞苷激酶。
16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述脱氧核糖核苷激酶诱导剂为 IPTG0
17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述脱磷酸化剂为碱性磷酸酶。
18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述脱磷酸化剂为细菌碱性磷酸酶、牛小肠碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶或牛小肠粘膜碱性磷酸酶。
19.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物为抗癌药物或抗病毒药物。
20.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述药物为Ara-C或氟达拉滨。
21.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述细胞系或患者样本的细胞为癌性细胞或被病毒感染的细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞为急性髓性白血病细胞。
23.用于确定细胞系或患者样本对脱氧核糖核苷激酶依赖性药物的抗性或敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含引入编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌、脱氧核糖核苷激酶转录促进物和脱磷酸化剂。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述生物发光性报告细菌为E.coli MG 1655 的脱氧胞苷脱氨酶(cdd)-缺陷型菌株。
25.根据权利要求23或权利要求M所述的试剂盒，其中所述生物发光性报告细菌表达 IuxCDABE操纵子。
26.根据权利要求25的试剂盒，其中所述生物发光性报告细菌的保藏编号为No.NCTC 13427。
27.根据权利要求23至沈中任一项所述的试剂盒，其中所述脱氧核糖核苷激酶为脱氧胞苷激酶。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的试剂盒，其中所述脱磷酸化剂为细菌碱性磷酸酶。
29.根据权利要求23至观中任一项所述的试剂盒，其中所述脱氧核糖核苷激酶诱导剂为 IPTG。
30.根据权利要求21至27中任一项所述的试剂盒，其中所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物为抗癌药物或抗病毒药物。
31.根据权利要求21至观中任一项所述的试剂盒，其中所述脱氧核糖核苷激酶依赖性药物为Ara-C或氟达拉滨。
32.脱磷酸化剂、脱氧核糖核苷激酶转录促进物以及引入脱氧核糖核苷激酶基因的生物发光性报告物用于在离体条件下确定细胞系或患者样本对药物的抗性或敏感性的用途， 其中所述药物能通过脱氧核糖核苷激酶而被磷酸化。
全文摘要
本发明提供了用于在体外确定细胞系或患者样本对脱氧核糖核苷激酶依赖性药物的敏感性的方法，其中所述方法包括下述步骤(i)用脱氧核糖核苷激酶依赖性药物处理患者样本或细胞系或其部分；(ii)裂解来自步骤(i)中的患者样本或细胞系中的细胞；(iii)任选地，将部分来自步骤(ii)的细胞裂解物与含有编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌混合；(iv)将部分来自步骤(ii)的细胞裂解物与含有编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌和脱氧核糖核苷激酶转录促进物混合；(v)将部分来自步骤(ii)的细胞裂解物与含有编码脱氧核糖核苷激酶的基因的生物发光性报告细菌、脱氧核糖核苷激酶转录促进物和脱磷酸化剂混合；以及(vi)检测步骤(iii)至(v)每一步所得的混合物的生物发光，其中每一混合物的比较的生物发光水平提供了对于所述药物的抗性或敏感性的量度。
文档编号C12Q1/02GK102186985SQ200980130139
公开日2011年9月14日 申请日期2009年8月10日 优先权日2008年8月8日
发明者维维安·克莱尔·索尔兹伯里, 哈比博·马哈芒德·欧罗什, 玛格丽特·安·史密斯, 保罗·约翰·伊诺瑟恩兹, 马克·威廉·鲁杜克, 阿什利·黛安·马丁 申请人:兰道克斯实验有限公司, 英国西英格兰大学