分离自籼稻ir64的杂交型组氨酸激酶基因，及其克隆产物的制作方法

专利名称：分离自籼稻ir64的杂交型组氨酸激酶基因，及其克隆产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因，及其克隆产物。具体地是，本发明涉及一种分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因，该基因具 有渗透感应能力，可被多重胁迫诱导，且可以改善作物的多重抗逆性，生产的作物以这种方 式可对多个非生物环境胁迫条件产生因应行动，从而既保持了作物的产量，又具有更高的 经济价值。本发明还涉及一种籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的分离方法、其序列表和 至少利用酵母表达载体和植物表达载体的克隆方法。本发明还涉及利用酵母表达载体和植物表达载体克隆分离自籼稻IR64的杂交型 组氨酸激酶基因的克隆产物。本发明还涉及一种通过采用分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因而提高作 物多重抗逆性的方法，及具有改善的多重抗逆性的作物。本发明还涉及应用分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因来提高作物的多重 抗逆性。本发明还涉及分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的功能特点。
背景技术：
水稻是全球人类消费的重要主食作物。水稻的基因组大小约为40Mb，其相比于其 他谷类作物要小，这使得水稻为谷类作物的理想模型。其他谷类作物的基因型大小因种类 而异，为约430Mb至约17000Mb，例如小麦的基因型大小约为16，900Mb，玉米约为2，600Mb, 高粱约为735Mb。据观察，环境胁迫是由生物因素如病毒、细菌、真菌、昆虫或线虫造成；或者是由非 生物因素如极度的水供应，即洪水，和/或极度的盐度，即高盐度，和/或极度缺水，即干旱， 和/或极端温度，即温度非常高或非常低。总的来说，这些因素影响作物的潜在产量。而且， 气候条件的变化和全球变暖已被认为是对粮食自给自足的潜在威胁。由于在了解植物病原 体相互作用方面的令人瞩目的进展，如今在生物因素一昆虫攻击条件下生存更好的转基因 植物成为现实。这些品种常见的例子为Bt棉花和Bt茄子。然而，还没有可以承受非生物胁迫的作物，主要是因为生物胁迫本质上是多基因 的。因此，急切需要修饰作物，这样它们能够在极端生物胁迫环境条件下生存，且保持 高产量，从而产生抗逆作物；也就是说，急切需要提高作物的多重抗逆性，这样可以解决由 环境胁迫造成的问题。一种可能提高作物抗逆能力的途径是通过基因工程，其是设计一个或多个基因给 予所需的性能。考虑到这些目标，近年来修饰了一些植物。其中一个例子涉及能在渗透胁 迫条件下合成渗透剂以保持细胞的水势的基因。其他类型包括基因修饰，其可以选择性地 将毒性钠离子泵入液泡，从而可以保持细胞质内无毒。
然而，就与渗透胁迫相关的传感机制而言，既没有太多的了解，也没有太多可利用 的方法。在低等生物如酵母中，渗透感应了解得更好，因此，具有作物靶基因的酵母渗透感 应突变子的功能互补可能是新基因相似功能的功能验证的一种途径。有关渗透感应机制的 作物的基因改造是非常可取的，因为这可能导致对渗透胁迫的抗性增强。已对转基因植物做出了许多努力，在特定胁迫下，即盐度或干旱或其他非生物胁 迫条件下，转基因植物的性能增强了。目前，这些转基因植物是利用在单一特定胁迫下诱导 的基因。然而，目前没有转基因植物利用多重胁迫下诱导的基因，因此，这样的基因是非常 可取和有利的。因此，目前需要一个可以耐受多重胁迫的基因，从而利用这种基因的植物在 维持其潜在产量的同时能够耐受多重胁迫。

发明内容
本发明的需要
因此，急切需要一种能够渗透感应、被多重胁迫诱导，且可以改善作物的多重抗逆性的 基因，尤其是转基因植物，以使作物对多个环境的非生物胁迫条件产生因应行动，从而，在 维持其产量的同时增加其经济价值；其分离的方法；其序列表；至少利用酵母表达载体和 植物表达载体克隆这样的基因的方法；及利用酵母表达载体和植物表达载体克隆的产物。 也急切需要改善作物多重抗逆性的方法，及具有改善的多重抗逆性的植物。而且，急切需要 具有这种基因的功能性能。本发明解决的问题
因此，本发明的目的在于通过提供能够渗透感应、被多重胁迫诱导、且能够改善作物的 多重抗逆性的基因，尤其是转基因植物，以解决作物的抗逆性差的问题，以使作物对多个环 境的非生物胁迫条件产生因应行动；及从籼稻IR64中分离这种基因的方法，和改善作物多 重抗逆性的方法。发明目的
因此，本发明的主要目的在于提供一种分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因，其 能够渗透感应、被多重胁迫诱导、且能够改善作物的多重抗逆性，从而使作物对多个环境的 非生物胁迫条件产生因应行动，从而，在保持作物的潜在产量的同时增加其经济价值。本发明的另一个目的在于提供一种分离籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的方法。本发明的另一个目的在于提供分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的序列表。本发明的另一个目的在于提供至少利用酵母表达载体和植物表达载体克隆分离 自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的方法。本发明的另一个目的在于提供通过利用酵母表达载体和植物表达载体克隆分离 自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的产物。本发明的另一个目的在于提供分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的功能 特性。
本发明的另一个目的在于提供一种通过采用分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激 酶基因来改善作物多重抗逆性的方法。本发明的另一个目的在于提供具有改善的多重抗逆性的作物。本发明的另一个目的在于提供分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因以改善 作物多重抗逆性的应用。以下通过附图和相应的说明将更清楚地呈现本发明的目的和优点，这将不会限制 本发明的范围。


图IA为根据本发明的优选实施例，用于分离籼稻IR64的基因的引物序列；
图IB为根据本发明的优选实施例，用于分离籼稻IR64的基因及其克隆的PCR的不同 条件；
图IC为根据本发明的优选实施例，分离籼稻IR64的基因的PCR的琼脂糖凝胶电泳图， 显示了一个约2. 6Kb的扩增产物，更精确地，约2598bp的扩增产物；
图2A为根据本发明的优选实施例，0sHk3b的开放阅读框(ORF)的全基因序列； 图2B为根据本发明的优选实施例，由OsHkIBb的开放阅读框编码的蛋白质的完整的氨 基酸序列；
图3A证实了本发明优选实施例中，本发明的基因克隆进pYES2载体； 图3B证实了本发明优选实施例中，本发明的基因克隆进pCAMBIA1304载体； 图4阐述了本发明的优选实施例中，通过水稻0sHK3b ORF获得的酵母SLNl-温度依赖 性渗透感应突变体HS13的功能互补；
图5阐述了本发明的优选实施例中，水稻的OsHDb对各种非生物胁迫的可诱导性的柱 状图6阐述了本发明的优选实施例中，ftTza sativa cv IR64的转化和再生，步骤[a] 水稻IR64的萌芽；步骤[b]在愈伤组织诱导培养基上形成水稻愈伤组织；步骤[c]在愈 伤组织诱导培养基上保持5-7天，继代培养水稻愈伤组织；步骤[d]在包含OsHDb构造的 农杆菌菌株LBA4404共同感染水稻愈伤组织；步骤[e]协同培养共同感染的水稻愈伤组织； 步骤[f]利用抗生素头孢噻肟洗涤长满的农杆菌；步骤[g]将洗净的愈伤组织转移至筛选 平板；步骤[h]转化的愈伤组织置于再生培养基上；步骤[j]再生植株转移至新鲜的再生 培养基上；步骤[i]形成转基因植物；步骤[k]进一步转移至陶罐，置于花房中。图7A为根据本发明的优选实施例，通过叶盘法证实了图6中生长的植物叶片的多 重抗逆性，展示了在对照和盐胁迫条件下不同叶片样本的漂白速率；
图7B展示了本发明的优选实施例中，图6中生长的植物叶片的总叶绿素含量； 图8为根据本发明的优选实施例，证实了利用质粒pCAMBIA1304将本发明OsHDb基因 成功整合至IR64转基因植物的基因组中；
图9为根据本发明的优选实施例，证实了图6中在盐胁迫条件下种子发芽，由种子生长 得到的T1植株的多重抗逆性；
图10对比证实了在正常条件下生长7天，此后在盐胁迫条件下再生长10天的T1植株 的多重抗逆性；说明书的末尾提供附图的详细说明。
具体实施例方式据了解，现有技术既没有公开也没有任何启示，杂交型组氨酸激酶基因能够渗透 感应、能被多重胁迫诱导，且能改善作物的多重抗逆性，尤其是转基因植物可以从籼稻IR64 中分离得到。而且，现有技术既没有公开也没有任何启示，分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激 酶基因至少可以利用酵母表达载体和植物表达载体而克隆。而且，现有技术既没有公开也没有任何启示，作物可以通过引入这样的分离基因 而改善其多重抗逆性，从而作物可以对多个环境的非生物胁迫条件产生因应行动，来解决 作物的抗逆性低的问题。本发明的目的在于从籼稻IR64中分离杂交型组氨酸激酶基因，发明人意外发现 如果分离自顶64幼苗的cDNA利用正向引物OsHkIBbF和反向引物OsHkIBbR进行PCR扩增， 其中退火步骤在约55°C进行，会分离得到杂交型组氨酸激酶基因，且意外地发现分离的基 因、特别是转基因植物能够渗透感应，且被多重胁迫诱导，能够改善作物的多重抗逆性。本发明的目的在于至少利用酵母表达载体和植物表达载体克隆从籼稻IR64中分 离的杂交型组氨酸激酶基因，发明人意外发现，分离基因利用正向引物0sHk3hS7WF和反 向引物0sHk3hS7dR进行PCR扩增处理，本发明的基因扩增进入酵母表达载体，也克隆进入 植物表达载体中。本发明的目的在于改善作物的多重抗逆性，发明人意外发现，当来自IR64种子的 愈伤组织与包含克隆基因的培养基协同感染时，IR64转化，且生长为完整的含有本发明的 基因表达的转基因IR64植株，且意外地发现这样的转基因植株能够增强对多种环境胁迫 的多重抗逆性，从而意味着这样的植株在非生物胁迫条件下能更好地生存。也发现，利用本发明的基因克隆的转基因植物的种子在种子发芽期间也能改善 多重抗逆性，且意外的是，根和苗也没有表现出生长减缓；与正常萌发的作物种子和由此生 长的植株相比，也发现由此生长的植物能改善多重抗逆性。因此，通过本方法可以解决作物 的抗逆性低的问题。因此，本发明涉及对来自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的分离方法，包 括采用正向引物0sHk3bF和反向引物0sHk3bR对分离自IR64幼苗的cDNA进行PCR扩 增处理，其中退火步骤在约55°C进行，杂交型组氨酸激酶基因-OsHDb分离自其质粒 pT0P0-0SHK3bo根据本发明，正向引物OsHkIBbF为5，ATGACGTTCGCGAGGTACGC3，，反向引物 0sHk3bR 为 5，CTATTCAACTTGGTCATGATTTTG3，(图 1A)
根据本发明，引物是通过以下步骤合成的
a)对齐酵母的SLNl(渗透传感器)的氨基酸序列(蛋白质)和水稻(Oryza sativa japonica)组氨酸激酶[HK]家族的14个成员的氨基酸序列(蛋白质)，其中水稻(Oryza sativa japonica)HK家族14个成员中的其中一个成员-OsHkIBb与酵母SLNl (渗透传感 器)更接近；
b)由水稻(Oryzasativa japonica) OsHkIBb的氨基酸序列，获取其相应的核苷酸序列；
c)利用商用软件分析其0RF;
d)利用商用引物设计软件由OsHkIBb的ORF设计正向引物OsHkIBbF 5，ATGACGTTCGCGAGGTACGC3，和反向引物 0sHk3bR :5，CTATTCAACTTGGTCATGATTTTG3，；
e)确定正向引物和反向引物的核苷酸序列；
f)制备正向引物0sHk3bF :5，ATGACGTTCGCGAGGTACGC3，和反向引物 0sHk3bR 5， CTATTCAACTTGGTCATGATTTTG3，。根据本发明的一个优选实施例，利用商用在线软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/gorf/)来分析 ORF0根据本发明的一个优选实施例，利用商用在线引物设计软件(www. idtdna. com/ analyzer/applications/oligoanalyzer/)根据 0sHk3b 的 ORF 来设计正向引物 0sHk3bF 5，ATGACGTTCGCGAGGTACGC3，和反向引物 0sHk3bR :5，CTATTCAACTTGGTCATGATTTTG3，。根据本发明，分离水稻IR64、尤其是水稻cv IR64幼苗的cDNA，包括以下步骤
a)从IR64幼苗的盐胁迫叶片组织中分离总RNA;
b)利用链亲和素顺磁性磁粒和生物素标记的寡核苷酸d(T)2(l引物从总RNA中分离 mRNA;
c)利用常规使用的第一链cDNA合成试剂盒由mRNA合成cDNA第一链。根据本发明，PCR包括以下步骤
a)制备反应混合物cDNA、正向引物0sHk3bF 5，ATGACGTTCGCGAGGTACGC3，和反向引 物 OsMDR :5，CTATTCAACTTGGTCATGATTTTG3，；
b)步骤a)的反应混合物在约94°C预变性5分钟；
c)步骤b)的反应混合物开始进行34个循环，先于94°C变性1分钟；
d)步骤c)的反应混合物在55°C退火1分钟；
e)步骤d)的反应混合物在72°C延伸3分钟；
f)步骤e)的反应混合物最后在72°C延伸7分钟。根据本发明，从籼稻IR64中分离杂交型组氨酸激酶基因的方法，还包括以下步 骤
1)通过将基因的扩增片段克隆进入T0P0-TA2.1载体中，制备pTOPO-OsHDb重组质
粒；
2)利用标准M13正向和反向引物从pTOPO-OsHDb重组质粒中分离基因-OsHICBb; 其中分离得到的基因OsHKIBb通过DNA的大小而得以确认，大小约为2. 6Kb,更精确的是
约为 2598bp0根据本发明，利用选定的引物进行PCR反应后，可以获得目标DNA的多个拷贝，其 在溶液中是不可见的，但是当与Τ0Ρ0-ΤΑ克隆载体(其可以稳定目标DNA)连接时，可以看 到转化菌落，而通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，可以看见扩增产物。Τ0Ρ0-ΤΑ仅用于 稳定扩增产物，也使测序变得容易。形成的基因意味着推定的分离。形成后，如图IC所示， 通过测序确定分离产物，琼脂糖凝胶上的条带表明其已经被分离到。在一个实施例中，本发明涉及分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因，且发现 其分离的基因、尤其是转基因植物可以作为渗透传感器，能够渗透感应并被多重胁迫诱导，可以改善作物的多重抗逆性，从而使作物能对多种非生物胁迫条件产生因应行为，因此，在 保持其潜在产量的同时增加其经济价值。在另一个实施例中，本发明涉及分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的序 列表，其中形成pTOPO-OsHDb重组质粒后进行基因测序，基因OsHkIBb的ORF的全基因序列 为2598bp，可参见附图2A所示；本发明的基因OsHkIBb已于2008年8月7日提交国家生物 资源中心(NCBI)- http //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/198387187,其 GenBank 登录 号为Bankit 1121378 FJ004641。附上NCBI确认的副本。在一个实施例中，本发明涉及杂交型组氨酸激酶基因，如图2A所示，其开放阅读 框
的全基因序列-0sHk3b为2598 bp。根据本发明的一个实施例，杂交型组氨酸激酶基因-OsHKIBb在NCBI的GenBank 登录号为 Bankitll21378 FJ004641。在本发明的另一个实施例中，本发明涉及一种将分离自籼稻IR64的杂交型组氨 酸激酶基因克隆至酵母表达载体PYES2中的克隆方法，包括
a)利用正向引物0sHk3h§7e/F和反向引物0sHk3h§7e/R对pT0P0_0sHK3b质粒进行PCR (polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)处理，来扩增pT0P0_0sHK3b质粒的flsMJ/
基因；
其中，OsHkIBb基因的扩增片段包括该基因的完整的开放阅读框
，还有 额外的分e/位点-0sHk3b克隆进pYES2的损a/位点。根据本发明，用于克隆分离基因的引物与用于分离基因的引物是相同的，但是用 于克隆分离基因的引物包括额外的分e/位点，其有助于OsHkIBb基因克隆进入
pYES2。根据本发明的一个优选实施例，用正向引物0sHk3b5^/F和反向引物 0sHk3h§7e/R进行PCR扩增后，加入pYES2。根据本发明，PCR扩增pTOPO-OsHDb质粒的0sHk3b基因包括以下步骤
a)制备反应混合物pTOPO-OsHDb质粒、正向引物0sHk3h§7e/F和反向引物 0sHk3h§7e/R;
b)步骤a)的反应混合物在约94°C预变性5分钟；
c)步骤b)的反应混合物开始进行34个循环，先94°C变性1分钟；
d)步骤c)的反应混合物在55°C退火1分钟；
e)步骤d)的反应混合物在72°C延伸3分钟；
f)步骤e)的反应混合物最后在72°C延伸7分钟。根据本发明的一个优选实施例，用正向引物0sHk3b5^/F和反向引物 0sHk3h§7e/R 进行 0sHk3b 的 PCR 扩增后，加入 pYES2。在另一个实施例中，本发明涉及将分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因转 入酵母表达载体PYES2中的克隆子，确定为pYES2-OsHk;3b。在另一个实施例中，本发明涉及将分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因克 隆至植物表达载体，优选为水稻表达载体PCAMBIA1304中的方法，包括以下步骤
利用正向引物0sHk3h§7e/F和反向引物0sHk3h§7e/R对pT0P0_0sHK3b质粒进行PCR 处理,来扩增pT0P0-0sHK3b质粒的0sHk3b基因；其中，OsHkIBb基因的扩增片段包括该基因的完整的开放阅读框
，还有 额外的SpeI位点-0sHk3b克隆进pCAMBIA1304的分e I 位点。根据本发明，用于克隆分离基因的引物与用于分离基因的引物是相同的，但是用 于克隆分离基因的引物包括额外的分e/位点，其有助于OsHkIBb基因克隆进入
PCAMBIA1304。根据本发明的一个优选实施例，用正向引物0sHk3b5^/F和反向引物 0sHk3h§7e/R 进行 OsHkIBb 的 PCR 扩增后，加入 pCAMBIA1304。根据本发明，PCR扩增pTOPO-OsHDb质粒的0sHk3b基因包括以下步骤
a)制备反应混合物pTOPO-OsHDb质粒、正向引物0sHk3h§7e/F和反向引物 0sHk3h§7e/R;
b)步骤a)的反应混合物在约94°C预变性5分钟；
c)步骤b)的反应混合物开始进行34个循环，先94°C变性1分钟；
d)步骤c)的反应混合物在55°C退火1分钟；
e)步骤d)的反应混合物在72°C延伸3分钟；
f)步骤e)的反应混合物最后在72°C延伸7分钟。根据本发明的一个优选实施例，用正向引物0sHk3b5^/F和反向引物 0sHk3h§7e/R 进行 OsHkIBb 的 PCR 扩增后，加入 pCAMBIA1304。在另一个实施例中，本发明涉及将分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因转 入水稻表达载体PCAMBIA1304中的克隆子，确定为pCAMBIA1304_0sHk;3b。在一个实施例中，本发明涉及一种改善作物多重抗逆性的方法，包括协同感染来 自IR64种子的水稻愈伤组织和包含克隆基因的培养基，使协同感染的愈伤组织进入完整 的转基因IR64植株，其中培养基是农杆菌菌株LBA4404，克隆基因是pCAMBIA1304-0sHk;3b。根据本发明，一种改善作物多重抗逆性的方法包括以下步骤
a)共同感染来自IR64种子的水稻愈伤组织和包含克隆基因的培养基；
b)协同培养步骤a)的共同感染水稻愈伤组织；
c)用抗生素洗涤步骤b)的协同培养的水稻愈伤组织的长满的培养基；
d)将步骤c)的洗涤后的愈伤组织转移至筛选培养基中，以便转化的愈伤组织的生
长；
e)用再生培养基处理步骤d)的转化愈伤组织；
f)用新鲜的再生培养基重复步骤e)的转化愈伤组织处理步骤，直至形成完全再生植
株；
g)在培养管中强化步骤f)得到的完全再生植株；
h)将步骤g)得到的强化的植株转移至陶罐中，以生成完全转基因IR64植株； 其中所述培养基为农杆菌菌株LBA4404，所述克隆基因为pCAMBIA1304-0sHk;3b。根据本发明的一个优选实施例，步骤b)的协同培养是将步骤a)共同感染的水稻 愈伤组织置于黑暗中48h。根据本发明的一个优选实施例，步骤g)的培养管包括再生培养基中的再生水稻 植株。根据本发明，抗生素为头孢噻肟，再生培养基包括商用Moorashige和Skoog培养基(Sigma, India)。在一个实施例中，本发明涉及通过采用本发明的分离自籼稻IR64的克隆基因而 获得的具有改善的多重抗逆性的作物，发现转基因植株含有过量表达的分离自籼稻IR64 的杂交型组氨酸激酶基因，且对多种环境胁迫具有多重抗逆性，从而意味着根据本发明获 得的转基因植物可以在非生物胁迫条件下生长良好，从而解决了抗逆性低的问题。在一个实施例中，本发明涉及第二代植株，是由采用了本发明的克隆基因得到第 一代转基因植株的种子而获得的，其中次生(第二代)转基因植株也具有改善的多重抗逆 性，甚至在第一代转基因植株的种子发芽期间，也意外地发现根和苗表现出长势更好，至少 没有表现出长势减慢。相反的是，发现没有感染本发明克隆基因的幼苗生成的植株对环境 胁迫抗逆性差，在正常(对照)植株的种子发芽期间，根和苗的长势缓慢。在一个实施例中，本发明涉及分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因来改善 作物多重抗逆性的应用。以下结合附图来说明本发明。根据本发明最优选的实施例，包括以下步骤 A从籼稻IR64中分离杂交型组氨酸激酶基因
根据本发明最优选的实施例，水稻cv IR64的OsHDb的全长基因，即编码蛋白质 的一段DNA，一般通过聚合酶链式反应(PCR)而分离到，PCR采用正向引物OsHkIBbF: 5，ATGACGTTCGCGAGGTACGC3，和反向引物 0sHk3bR 5，CTATTCAACTTGGTCATGATTTTG3，(图 1A)，该引物是筛选获得的。意外地发现如果试图采用别的其他引物从IR64中分离目的基 因，是不能分离得到目的基因的。根据本发明，聚合酶链式反应(PCR)是在如图IB所示的条件下进行的，该条件也 是经过筛选的。意外地发现如果试图在非图IB所示条件下进行PCR反应，不会分离得到目 的基因。根据本发明，采用OsHkIBbF和OsHkIBbR引物[图1B]进行PCR的条件(图1B) 为-在约94°C预变性5min ；然后开始；34个循环，94°C变形lmin，55°C退火lmin，72°C延伸 3min ；最后 72°C延伸 7min。根据本发明，从盐胁迫的IR64幼苗的叶片组织中分离总RNA。接下来采用链亲 和素顺磁性磁粒和生物素标记的寡核苷酸(KT)2tl引物由总RNA分离mRNA。采用第一链 cDNA合成试剂盒由mRNA合成第一链cDNA。如上所述进行PCR反应。扩增片段克隆进 T0P0-TA2. 1载体中得到pTOPO-OsHDb重组质粒。图IC展示了采用标准M13正向和反向引 物从pTOPO-OsHDb质粒获得的PCR扩增产物。从凝胶(图1C)可以看出OsHkIBb的DNA的 大小约为2. 6Kb，更精确的是为2598bp，这也证实了该基因-OsHkIBb被分离得到。对分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因进行测序
根据本发明，在一个实施例中，形成pTOPO-OsHDb重组质粒后对分离自籼稻IR64的基 因进行测序。测序后获得的DNA序列如图2A所示，其展示了 OsHkIBb的ORF的全基因序列， 为2598bp，已经于2008年8月7日提交国家生物资源中心(NCBI)，其GenBank登录号为 Bankit 1121378 FJ004641。附上 NCBI 确认的副本。根据本发明，获得的DNA序列利用BLAST搜索进行分析，意外地发现其与已知基 因-来自其他生物的杂交型组氨酸激酶基因是同源的，仅有只属于水稻IR64的微小变化。而且，分离的cDNA被证实其ORF约2598bp长，其可以编码约865个氨基酸残基(图2B)。 预计得到的多肽的分子量约为95. 90KDao预计的蛋白质包括信号传递域和信号接收域。这 些是杂交型组氨酸激酶的特性。图2B也展示了在位置处信号传递域有一个保守组氨酸 残基，从上开始第6行用下划线表示，在772位置处信号接收域有一个保守天冬氨酸残基， 从下开始第2行用下划线表示。图2B表明由OsHkIBb的ORF编码的蛋白质的完整的氨基酸 序列约为95. 9kDa，其中291位置处信号传递域具有保守组氨酸残基(H，下划线)。771位 置处信号接收域具有保守天冬氨酸残基(D，下划线)。因此，本发明提供了 一种来自籼稻cv IR64的基因，其具有杂交型组氨酸激酶基因 的所有特点。分离的OsHkIBb基因的DNA序列于2008年8月7日提交国家生物资源中心 (NCBI)，其登录号为Bankit 1121378。附上NCBI确认的副本。C克隆分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因
Cl克隆进入酵母表达载体PYES2: 根据本发明，通过采用0sHk3b5^/F和0sHk3b5^/R引物(图IA所示)、图IB所示的 PCR条件扩增pTOPO-OsHDb的基因AsMl^，将本发明的基因0sHk3b克隆进酵母表达载体 PYES2，其中包括基因flsMJA的全部开放阅读框(ORF)的扩增片段克隆进pYES2的损a/ 位点，阅读框架克隆采用SphI [图3A]酶切得以确认，利用SphI对pYES2-OsHk;3b质粒进 行酶切以确认 0sHK3b ORF 的方向；M: Ikb 的 DNA 梯；1，2，3，4，5 为 pYES2_0sHK3b 质粒；6: PYES2 ；7:没有酶切的pYES2 -0sHk3b质粒，图的上方为pYES2-OsHk;3b的示意图。因此，本发明提供了 OsHkIBb基因，其可以被克隆进入酵母表达载体pYES2-OsHk;3b 中，在酵母表达载体pYES2-OsHk;3b中生成OsHkIBb基因的克隆子。克隆进入植物表达载体pCAMBIA1304
根据本发明，通过采用0sHk3b5^/F和0sHk3b5^/R引物(图IA所示)、图IB所示 的PCR条件扩增pTOPO-OsHDb的基因0sHk3b，将本发明的基因0sHk3b克隆进植物表达 载体PCAMBIA1304，其中包括基因AsMJA的全部开放阅读框(ORF)的扩增片段克隆进 PCAMBIA1304的位点，阅读框架克隆采用SphI [图3B]酶切得以确认，利用SphI对 pCAMBIA1304-0sHk;3b质粒进行酶切以确认OsHDb ORF的方向；Μ:11Λ的DNA梯；1,2，3，4为 pCAMBIA1304-0sHK3b 质粒；5: pCAMBIA1304 ；6:没有酶切的 pCAMBIA1304_0sHk3b 质粒， 图的上方为pCAMBIA1304-0sHk;3b的示意图。因此，本发明提供了 OsHkIBb基因，其可以被克隆进入植物表达载体 pCAMBIA1304-0sHk3b中，在植物表达载体pCAMBIA1304_0sHk3b中生成0sHk3b基因的克隆子。分离自水稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的功能特性(优点)
Dl为了证实目前提供的基因OsHkIBb可以用作渗透传感器，即其优点在于挽救酵母中 的渗透感应突变子，根据本发明的一个优选实施例，采用SLNl基因中具有温度敏感性突变 子的酵母i^eiccheiromycGs cerevisiae)菌株HS13来进行互补实验(sln_Ts)。可以观察 到HS13突变株在YPD培养基(酵母，蛋白胨和葡萄糖培养基)上生长很好(图4A)， 但37°C不能生长(图4B)，在包含盐QOOmM NaCl)的YPD培养基上也是一样的。根据本 发明，HS13突变株利用(i) PYES2-0sHk3b, (ii) pYES2载体(没有OsHkIBb的载体)和 (iii)功能基因slnl (来自酵母)进行转化，以获得修饰的HS13菌株，其进行进一步测试。然后，根据本发明，携带PYES2 (没有OsHkIBb的载体)的HS13作为阴性对照(VC)，携带功 能基因slnl的HS13作为阳性对照(SLNl)。所有的菌株在YPD培养基上划线，在或 37°C培养，意外地观察到培养7 后，用pYES2-OsHk;3b转化的HS13和携带功能基因slnl 的HS13可以在37°C生长(图4B)，而HS13自身或携带pYES2 (VC)的HS13不能在37°C生 长，从而证实了 slnl突变子与OsHkIBb的互补是可以实现的，表明基因OsHkIBb具有挽救酵 母中渗透感应突变子的优点。在证实基因OsHkIBb作为渗透传感器可用于提高对盐胁迫的耐受性的优点后，试 图通过检查OsHkIBb基因的保守组氨酸和/或天冬氨酸残基来寻找这种基因的作用模式，在
蛋白表达中发生基因的定点突变，以使信号传递域的保守组氨酸残基突变 为缬氨酸(HK3H*，携带组氨酸突变的0SHK3ffi91V的HS13)，保守天冬氨酸残基突变为谷氨 酸(HK3D*，携带天冬氨酸突变的0SHK3D772E的HS13) \pYES2~0sHk3b的定点突变是利用 快速变化的定点突变试剂盒的正向引物0SHK3bHisMUTF GGCTACTGTTTCAGTTGAGA TCAGAACTC 和反向引物 0SHK3bHisMUTR AGTTCTGA TCTCAACTGAAACAGTAGCC 使信号传递域的 保守组氨酸残基突变为缬氨酸；而利用快速变化的定点突变试剂盒的正向引物 0SHK3bAspMUTF GA TGCTTGTTTCA TGCTCA TACAGA TGCCAG 和反向引物 0SHK3bAspMUTR -CTGGCATCTGTATGAGCATGAAACAAGCATC使信号接收域的保守天冬氨酸突变为谷氨酸]。以上分析证实了酵母HS13中的突变，在37°C时，具有这些突变的OsHkIBb保守残基 的转化不能与具有宿主HS13D的slnl-Ts突变体等位基因互补(图4B)，这证实了 0sHk3b 确实是杂交型组氨酸激酶，且为了/KA 在37°C生长，保守组氨酸和天冬氨酸都参与了磷酸 化过程。而且，发现转化的酵母(0sHk3b)可以对高达200mM NaCl (包含200mM NaCl的 YPD)的盐胁迫具有耐受性，而转化的载体(VC)或转化的//SA 细胞在37°C不能存活(图 4D)。这种分析明显证明编码基因的蛋白质可以用作渗透传感器，且可以用于提高 对盐胁迫的耐受性。为了证实目前提供的基因OsHkIBb可被不同的非生物胁迫诱导，进行了实时PCR 分析(qRT-PCR)以量化其mRNA的表达。这种分析是利用不同的来自IR64幼苗的mRNA的 cDNA样本来进行的，这些幼苗受到各种非生物胁迫，即盐度(S)、干旱(D)、ABA (脱落酸)， 高温(42°C )和低温)8小时和M小时。实时PCR扩增结果用图5中的柱状图表示， 令人惊讶的是，这个基因对非生物胁迫形式的不同环境信号具有可诱导性。而且，也可以发 现在盐度、干旱、ARA、高温和低温下，^转录子的微分调控。随着时间从8小时增加至 24小时，0sHk3b转录子在所有胁迫条件下如盐度(图5B，C)、干旱(图5D，E)、ABA (图 5F, G),高温(图5H，I)和低温(图5J，K)，也发生累积，从而表明该基因在多重抗逆性 方面的作用，因此，表明其在不同胁迫，尤其是高温、低温、盐度和干旱等条件下改善作物的 抗逆性。提高作物的多重抗逆性-应用分离自水稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因来提高 作物的多重抗逆性
为了证实目前提供的基因-OsHkIBb可以改善作物(转基因水稻)对胁迫、尤其是非生 物胁迫的抗逆性，IR64植株利用pCAMBIA1304-0sHk;3b，在筛选的组成型启动子控制下，进 行基因- sM^力的转化，为了对比，IR64植株也利用对照载体(没有OsHkIBb基因的VC)进 行转化。
根据本发明，IR64的转化是通过以下步骤获得的对IR-64种子进行表面消 毒(图6a)、转移至愈伤组织诱导培养基上形成愈伤组织；生长的愈伤组织(图6b)进 一步继代培养，再置于愈伤组织诱导培养基上5-7天(图6c)；这些愈伤组织与包含 PCAMBIA1304-0sHk3b的农杆菌菌株LBA4404进行共同感染(图6d)，共同感染的水稻愈伤 组织进一步继代培养2-3天(图6e)，用抗生素头孢噻肟洗涤长满的农杆菌(在水稻愈伤组 织上)(图6f)，洗涤的愈伤组织然后转移到筛选平板上以便转化的愈伤组织的生长(图 6g)，转化的愈伤组织进一步置于再生培养基上(图他)，在新鲜的再生培养基上继代培养 (图6i)，完全再生植株转移到培养管中强化(图6 j)，然后强化的植株进一步转移至陶缸 中，置于花房以产生完全转基因IR64植株(图故)。为了证实基因OsHkIBb具有提高水稻的抗逆性作用，进行了叶盘法分析。在该分 析中，从不同植株切下叶片，在包含高盐OOOmM NaCl)的溶液中培养，另外设置了对照，用 正常的水代替盐。约培养后，比较叶片并寻找其总的生活力(图7A)，也评估了这些样 本中叶绿素的含量，结果如图7B所示。该分析表明与未转化IR64即WT (图7A1)和VC (图7A3)相比，即使在对照条件下(没有盐胁迫)，T9 (图7Α5 ) ,Τ29 (图7Α7)的转基因 IR64植株(过度表达0sHk3b)漂白相对较少。同样的，与未转化的对比例WT (图7B2)和 VC (图7B4)相比，在盐胁迫条件下，转基因IR64植株T9 (图7B6)和T23 (图7B8)中，叶 绿素保留更多，这证实了转基因水稻植株中基因OsHkIBb的过度表达使其在非生物胁迫尤 其是盐胁迫条件下生存更好。转基因水稻植株的确认
为了证实OsHkIBb基因融合进IR64过度表达系的基因组中，利用基因OsHkIBb特异性 正向引物和载体(PCAMBIA1304)特异性反向引物进行组织PCR反应。扩增显示在带4，7， 8，9，10, 11，18，19，23，32具有1. 4 1Λ大小的条带，表明OsHkIBb转基因成功融合进 IR64转基因植株的基因组中(图8)。水稻转基因系(T1)显示在种子发芽期间对盐胁迫具有抗性
将IR64野生型(WT)和过度表达OsHkIBb的种子置于包含用K ^shida (含 有200 mM NaCl (盐胁迫))浸透的棉花的平皿中。发明人意外发现在200 mM NaCl中，过 度表达OsHkIBb系的种子发芽率比野生型种子要高(图9A)。生长4天后，测定发芽幼苗的 根长和苗长，发明人意外发现过度表达系中的两者的长度要长，而在野生型中要短(图9B、 9C)。为了测定转基因植株中可用的K+和Na+离子，发明人利用火焰光度计评估了可用的 离子量，发现过度表达转基因植株比野生型植株保留更高的K+/Na+比(图9D)。该分析表 明水稻中OsHkIBb过度表达使发芽种子对盐胁迫具有耐受性。
过度表达OsHkIBb的转基因幼苗比WT更适应盐胁迫
进一步利用转基因水稻幼苗(Tl)来测试对盐胁迫的耐受性。七天后，幼苗被 转移至含一半^shida培养基的200 mM NaCl中，而在无NaCl的1/2 Yoshida培养基中生 长的幼苗作为对照。胁迫十天后进行拍照。发明人发现，与野生型植株相比，在盐胁迫条件 下，过度表达OsHkIBb的表达植株竟可以抵抗更高的盐胁迫(图10B)，且保持更多的叶绿素 (图10C)。在非胁迫条件下，发现过度表达OsHkIBb的植株比野生OsHDb系生长更快(图 10A)。该分析进一步表明水稻OsHkIBb过度表达使幼苗对盐胁迫具有耐受性。
附图的详细说明图IA 用于分离OsHkIBb基因的引物序列； 图IB 聚合酶链式反应(PCR)的条件；
图IC 聚合酶链式反应产物的琼脂糖凝胶电泳，显示OsHkIBb的扩增产物大小约为 2.6肪(更精确的是2598匕 )；
图2A 0sHk3b的ORF的完全基因序列，为2598bp (提交至NCBI，GenBank登录号为 Bankit 1121378 FJ004641)；
图2B 由OsHkIBb的ORF编码的蛋白质的完全氨基酸序列，为95. QkDa0信号传递域 在291位置处具有保守组氨酸残基(H，用红色表示)；信号接收域在771位置处具有保守 天冬氨酸残基(D，用蓝色表示)；该序列提交至NCBI，(ienBank登录号为Bankit 1121378 FJ004641)；
图3A 确认OsHkIBb克隆进入pYES2载体中用SphI对pYES2-OsHk;3b进行酶切以确认 0sHK3b ORF 的方位；M: Ikb DNA 梯；1，2，3，4，5 为 pYES2_0sHK3b 质粒；6: pYES2 ；7: 没有酶切的PYES2 -0sHk3b质粒；
图 3B 确认 0sHk3b 克隆进入 pCAMBIA1304 载体中用 SphI 对 pCAMBIA1304 -0sHk3b 进行酶切以确认 0sHK3b ORF 的方位；M: Ikb DNA 梯；1，2，3，4 为 pCAMBIA1304_0sHK3b 质粒；5: pCAMBIA1304 ；6: 没有酶切的pCAMBIA1304_0sHk;3b质粒；图的顶部为 pCAMBIA1304-0sHk3b 的示意图4 由水稻0sHK3b ORF获得的酵母SLNl-温度敏感渗透感应突变体HS13的功能互 补。通过0SHK3B ORF的表达进行突变的互补测验；酵母菌株在正常YPD培养基和含200mM NaCl的YPD培养基(盐培养基)上于，37°C培养三天进行敏感性测验； 该实验中用到的菌株 WT,野生型酵母； HS13, slnl-ts 突变体； VC,仅携带载体(pYES2)的HS13; 0SHK3a 和 0SHK3b,携带表达 pYES2_0sHK3b 的 HS13 ； SLNl,携带野生型表达等位基因的HS13; ΗΚ3Η*，携带组氨酸突变 pYES2-0sHK3b (0sHK3H291V)的 HS13 ； HK3D*，携带天冬氨酸突变 pYES2-0sHK3b (0sHK3D772E)的 HS13 ； 4A:不同酵母菌株在YPD培养基上于培养； 4B:不同酵母菌株在YPD培养基上于37°C培养；
4C:不同酵母菌株在盐胁迫(包含200mM NaCl的YPD)培养基上于培养； 4D:不同酵母菌株在盐胁迫(包含200mM NaCl的YPD)培养基上于37°C培养； 4E:不同酵母菌株在4A，4B, 4C和4D划线培养的示意图。图5 水稻OsHKIBb对各种非生物胁迫的可诱导性的柱状图；X轴为不同的样本； Y轴为相对表达的HiRNA ；利用IR64 (IR)的mRNA合成得到的cDNA进行qRT-PCR分析， IR64 (IR)处于不同胁迫条件下，S卩S (200mM NaCl), D (脱水)，ABA (IOOuM脱落酸)，高 温(42°C )，低温) 8 (hrs)和24 (24hrs)，同时还有C (对照)样本。图6 -.Oryza sativa Cv IR64的转化和再生；a.水稻IR64的萌芽；b.愈伤组织 诱导培养基上形成愈伤组织；c.置于愈伤组织诱导培养基上5-7天继代培养；d.水稻愈伤组织与包含pCAMBIA1304-0sHk;3b构造的农杆菌菌株LBA4404进行共同感染；e.协同培养 共同感染的水稻愈伤组织；f.用抗生素头孢噻肟洗涤长满的农杆菌；g.转移洗涤的愈伤 组织到筛选平板上；h.转化的愈伤组织置于再生培养基上；i.再生植株转移至新鲜的再 生培养基上；j.完全再生植株转移到培养管中强化；k.步骤j的植株转移至陶罐中，置于 花房。图7A 叶盘法，展示了在对照和盐胁迫条件下不同的叶片样本的漂白速度；
图7B:总叶绿素含量；X轴不同样本；Y轴总叶绿素含量(μ g/每g新鲜叶片重 量)；
WT, IR64 ；
VC,用不含OsHKIBb基因的载体转化的IR64;
T9,用含OsHKIBb基因的载体转化的IR64 (植株号9)；
T23,用含OsHKIBb基因的载体转化的IR64 (植株号23)。图8 利用组织PCR反应确认了 IR64-OsHk;3b再生植株；(A)利用再生苗的组织作 为模板，载体特异性正向和基因特异性反向引物作为引物进行PCR扩增；M: DNA marker; 4，7，8，9，10, 11，12，18，19，23，32为用于组织PCR的不同的0sHk3b转基因苗； IR:非转化IR64，即野生型植株和+ve: pCAMBIA_0sHk3b用作模板。图9 通过在200 mM NaCl条件下，IR64_0sHk3b转基因种子(T1)的发芽测 试证实了多重抗逆性；(A) WT种子野生型；OEl 过度表达OsHKIBb系，置于包含 ^shida培养基的200 mM NaCl中；(B)测定苗长；(C)测定根长；(D)测定K+/Na+比 ；数据是在96 h盐胁迫后测定的。图10:说明了 IR64-OsHk;3b转基因幼苗(T1)在对照(无盐)和盐胁迫条件下的 生长及其叶绿素测定；(A)正常Yoshida培养基；(B)含NaCl (200mM)的、k Yoshida培 养基；WT:野生型IR64;0E1:过度表达OsHKIBb系；(C)对照盐胁迫幼苗的叶绿素测定；在 正常对照条件下生长7天的幼苗拍摄照片后承受盐胁迫QOO mM NaCl) 10天。
权利要求
1.一种从籼稻IR64中分离杂交型组氨酸激酶基因的方法，其特征在于，包括采用正 向引物OsHkIBbF和反向引物0sHk3bR对分离自IR64幼苗的cDNA进行PCR处理，其中退火 步骤在55°C进行，且所述杂交型组氨酸激酶基因-OsHDb分离自其质粒pTOPO-OSHDb。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正向引物OsHkIBbF为 5，ATGACGTTCGCGAGGTACGC3，；所述反向引物 0sHk3bR 为5，CTATTCAACTTGGTCATGATTTTG3，。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述引物是通过以下步骤合成而得a)对齐酵母的SLNl(渗透传感器)的氨基酸序列(蛋白质)和水稻(Oryza sativa japonica)组氨酸激酶[HK]家族的14个成员的氨基酸序列(蛋白质)，其中水稻(Oryza sativa japonica)HK家族14个成员中的其中一个成员-OsHkIBb与酵母SLNl (渗透传感 器)更接近；b)由水稻(Oryzasativa japonica) OsHkIBb的氨基酸序列，获取其相应的核苷酸序列；c)利用商用软件分析其0RF;d)利用商用引物设计软件由OsHkIBb的ORF设计正向引物OsHkIBbF 5，ATGACGTTCGCGAGGTACGC3，和反向引物 0sHk3bR :5，CTATTCAACTTGGTCATGATTTTG3，；e)确定正向引物和反向引物的核苷酸序列；f)制备正向引物0sHk3bF :5，ATGACGTTCGCGAGGTACGC3，和反向引物 0sHk3bR 5， CTATTCAACTTGGTCATGATTTTG3，。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述cDNA分离自水稻cvIR64 幼苗，包括以下步骤a)从IR64幼苗的盐胁迫叶片组织中分离总RNA;b)利用链亲和素顺磁性磁粒和生物素标记的寡核苷酸d(T)2(l引物从总RNA中分离 mRNA;c)利用常规使用的第一链cDNA合成试剂盒、由mRNA合成cDNA第一链。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR包括以下步骤a)制备反应混合物cDNA、正向引物0sHk3bF 5，ATGACGTTCGCGAGGTACGC3，和反向引 物 OsMDR :5，CTATTCAACTTGGTCATGATTTTG3，；b)步骤a)的反应混合物在约94°C预变性5分钟；c)步骤b)的反应混合物开始进行34个循环，先于94°C变性1分钟；d)步骤c)的反应混合物在55°C退火1分钟；e)步骤d)的反应混合物在72°C延伸3分钟；f)步骤e)的反应混合物最后在72°C延伸7分钟。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤1)通过将基因的扩增片段克隆进入T0P0-TA2.1载体中，制备pTOPO-OsHDb重组质粒；2)利用标准M13正向和反向引物从pTOPO-OsHDb重组质粒中分离基因-OsHICBb; 其中分离得到的基因OsHKIBb通过DNA的大小而得以确认，大小约为2. 6Kb,更精确的是约为 2598bp0
7.一种分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因。
8.根据权利要求7所述的基因，其特征在于所述基因能够作为渗透传感器，能够渗透 感应并被多重胁迫诱导，能够改善作物的多重抗逆性，使作物能对多种非生物胁迫条件产 生因应行动，从而在保持其潜在产量的同时增加其经济价值。
9.一种分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的序列测定方法，其特征在于，在形 成pTOPO-OsHDb重组质粒后进行基因测序，基因OsHkIBb的ORF的全基因序列为2598bp。
10.一种杂交型组氨酸激酶基因，其特征在于，所述基因-OsHkIBb的ORF的全基因序列 为2598bp，如图2A所示。
11.根据权利要求10所述的基因，其特征在于，所述基因-OsHkIBb经国家生物资源中心 (NCBI)确认，其 GenBank 登录号为 Bankit 1121378 FJ004641。
12.—种将分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因克隆至酵母表达载体pYES2中的 方法，其特征在于，包括利用正向引物0sHk3h§7e/F和反向引物0sHk3h§7e/R对pT0P0_0sHK3b质粒进行PCR 处理,来扩增pT0P0-0sHK3b质粒的0sHk3b基因；其中，OsHkIBb基因的扩增片段包括该基因的完整的开放阅读框
，还有 额外的分e/位点-0sHk3b克隆进pYES2的损a/位点。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，利用的引物与权利要求2和3中的用于 分离基因的引物是相同的，但是用于克隆分离基因的引物包括额外的分e/位点，其有助于 0sHk3b基因克隆进入pYES2。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增pTOPO-OsHDb质 粒的0sHk3b基因包括以下步骤a)制备反应混合物pTOPO-OsHDb质粒、正向引物0sHk3h§7e/F和反向引物 0sHk3h§7e/R;b)步骤a)的反应混合物在约94°C预变性5分钟；c)步骤b)的反应混合物开始进行34个循环，先94°C变性1分钟；d)步骤c)的反应混合物在55°C退火1分钟；e)步骤d)的反应混合物在72°C延伸3分钟；f)步骤e)的反应混合物最后在72°C延伸7分钟。
15.一种将分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因转入酵母表达载体pYES2中的克 隆子，其特征在于，所述克隆子为pYES2-OsHk;3b。
16.一种将分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因克隆至植物表达载体 PCAMBIA1304中的方法，其特征在于，包括利用正向引物0sHk3h§7e/F和反向引物0sHk3h§7e/R对pT0P0_0sHK3b质粒进行PCR 处理,来扩增pT0P0-0sHK3b质粒的0sHk3b基因；其中，OsHkIBb基因的扩增片段包括该基因的完整的开放阅读框
，还有 额外的SpeI位点-0sHk3b克隆进pCAMBIA1304的分e I 位点。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，利用的引物与权利要求2和3中的用于 分离基因的引物是相同的，但是用于克隆分离基因的引物包括额外的分e/位点，其有助于 0sHk3b基因克隆进入pCAMBIA1304。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增pTOPO-OsHDb质粒的0sHk3b基因包括以下步骤a)制备反应混合物pTOPO-OsHDb质粒、正向引物0sHk3h§7e/F和反向引物 0sHk3h§7e/R;b)步骤a)的反应混合物在约94°C预变性5分钟；c)步骤b)的反应混合物开始进行34个循环，先94°C变性1分钟；d)步骤c)的反应混合物在55°C退火1分钟；e)步骤d)的反应混合物在72°C延伸3分钟；f)步骤e)的反应混合物最后在72°C延伸7分钟。
19.一种将分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因转入酵母表达载体PCAMBIA1304 中的克隆子，其特征在于，所述克隆子为pCAMBIA1304-0sHk;3b。
20.一种提高作物多重抗逆性的方法，其特征在于，包括共同感染来自IR64种子的水稻愈伤组织和包含克隆基因的培养基，使共同感染的愈 伤组织进入完整的转基因IR64植株，其中所述培养基为农杆菌菌株LBA4404，所述克隆基 因为 pCAMBIA1304-0sHk3b。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，包括以下步骤a)共同感染来自IR64种子的水稻愈伤组织和包含克隆基因的培养基；b)协同培养步骤a)的共同感染水稻愈伤组织；c)用抗生素洗涤步骤b)的协同培养的水稻愈伤组织的长满的培养基；d)将步骤c)的洗涤后的愈伤组织转移至选择培养基中，以便转化的愈伤组织的生长；e)用再生培养基处理步骤d)的转化愈伤组织；f)用新鲜的再生培养基重复步骤e)的转化愈伤组织处理步骤，直至形成完全再生植株；g)在培养管中强化步骤f)得到的完全再生植株；h)将步骤g)得到的强化的植株转移至陶罐中，以生成完全转基因IR64植株； 其中所述培养基为农杆菌菌株LBA4404，所述克隆基因为pCAMBIA1304-0sHk;3b。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述步骤b)的协同培养是将步骤a)的 共同感染的水稻愈伤组织置于黑暗中48h。
23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述步骤g)的培养管包括再生培养基 中的再生水稻植株。
24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗生素为头孢噻肟。
25.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述再生培养基包括商用Moorashige 和Skoog培养基。
26.—种通过权利要求20-25任一项所述的方法生产获得的具有改善的多重抗逆性 的作物，其特征在于，转基因植株含有过量表达的分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基 因。
27.一种由第一代转基因植株的种子生产获得的第二代植株，其特征在于，所述第一代 转基因植株通过采用分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因而生成，次生(第二代)转 基因植株具有改善的多重抗逆性。
28.分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因来改善作物的多重抗逆性的应用。
29.如前述实施例和附图所述的一种分离籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的方法。
30.如前述实施例和附图所述的一种分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因。
31.如前述实施例和附图所述的一种分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的基 因测序方法。
32.如前述实施例和附图所述的一种克隆分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因 的方法。
33.如前述实施例和附图所述的一种分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的克隆子。
34.如前述实施例和附图所述的一种改善作物多重抗逆性的方法。
35.如前述实施例和附图所述的具有改善的多重抗逆性的作物。
36.如前述实施例和附图所述的一种二代植株。
37.如前述实施例和附图所述的杂交型组氨酸激酶基因的应用。
全文摘要
本发明提供了一种分离自籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因，其能够渗透感应、被多重胁迫诱导、且能够改善作物甚至是继代产物的多重抗逆性，以使作物对多种环境的非生物胁迫条件产生因应行动，从而，在保持作物的潜在产量的同时增加其经济价值。本发明还提供了一种分离籼稻IR64的杂交型组氨酸激酶基因的方法、其功能特性、其序列表、至少利用酵母表达载体和植物表达载体的克隆方法及其克隆产物。本发明还提供了改善作物多重抗逆性的方法和具有改善的多重抗逆性的作物。
文档编号C12N15/54GK102131930SQ200980131254
公开日2011年7月20日 申请日期2009年8月10日 优先权日2008年8月11日
发明者拉特纳·卡兰, 斯内·拉塔·森格拉-巴瑞克, 阿什瓦尼·巴瑞克, 高塔姆·库玛·罗伊 申请人:阿什瓦尼·巴瑞克