用于计数抗生素抗性微生物的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于计数抗生素抗性微生物的方法和组合物的制作方法
用于计数抗生素抗性微生物的方法和组合物相关专利申请的交叉引用本申请要求2008年8月21日提交的美国专利申请No. 61/090，761的优先权，该 专利申请以引用方式全文并入本文。
背景技术：
有大量文献证明凝固酶阳性菌种金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)是人 类机会性病原体(Murray 等人编辑，1999，Manual of Clinical Microbiology，第 7 版，ASM Press, Washington, D. C.)。由金黄色葡萄球菌引起的医院感染是发病和死亡的主要原因。 由金黄色葡萄球菌引起的一些最普通的感染涉及皮肤，这些感染包括发生在各个部位的疖 子或疔疮、蜂窝织炎、脓疱病以及手术后和慢性伤口感染。由金黄色葡萄球菌导致的一些更 严重的感染是菌血症、肺炎、骨髓炎、急性心内膜炎、心肌炎、心包炎、大脑炎、脑膜炎、烫伤 样皮肤综合征和各种脓肿。由葡萄球菌肠毒素介导的食物中毒是另一种与金黄色葡萄球菌相关的重要综合 征。中毒性休克综合征是一种社区获得性疾病，它也已被归因于产毒素的金黄色葡萄球菌 的感染或定植。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)出现在二十世纪80年代，成为医院中 的重大临床和流行病学问题(Oliveira 等人，2002，Lancet Infect Dis. 2 :180-189)。MRSA 能耐受所有的内酰胺，包括青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和单环内酰胺类，它们是治 疗金黄色葡萄球菌感染的最常用抗生素。MRSA感染只能用毒性更高且更昂贵的抗生素治 疗，这些抗生素通常作为最后一道防线来使用。由于MRSA能容易地通过医护人员在患者间 传播，全世界的医院都面临控制MRSA的问题。因此，需要开发出用于检测和/或鉴定MRSA 的快速简便的筛选或诊断试验法，以减少它的扩散和改善对受感染患者的诊断和治疗。金黄色葡萄球菌中的甲氧西林耐受性之所以独特，是因为从其他凝固酶阴性葡萄 球菌(CNS)获得了编码耐β-内酰胺的青霉素结合蛋白(PBP)的DNA，该蛋白在细胞暴露于 β -内酰胺抗生素时会接管正常PBP的生物合成功能。金黄色葡萄球菌通常含有四种ΡΒΡ， 其中PBP 1、2和3是必需的。MRSA中的低亲和力PBP被称为PBP 2a(或ΡΒΡ2')，是由染 色体mecA基因编码，起到耐β -内酰胺的转肽酶的作用。mecA基因在甲氧西林敏感性金黄 色葡萄球菌中不存在，但广泛分布于其他的葡萄球菌种类中，且高度保守⑴bukata等人， 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34 :170-172)。基于检测mecA基因和金黄色葡萄球菌特异性染色体序列来检测和鉴定MRSA的 方法已有描述。(Saito 等人，1995，J. Clin. Microbiol. 33 :2498-2500 ；Ubukata 等人， 1992，J. Clin. Microbiol. 30 :1728-1733 ；Murakami 等人，1991，J. Clin. Microbiol. 29 2240-2244 ；Hiramatsu等人，1992,Microbiol. Immunol. 36 :445-453)。但是，由于mecA基因 在金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌中都广泛存在，这些方法并不总是能够区别MRSA 与耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)(参见Suzuki等人，1992，Antimicrob. Agents. Chemother. 36 :429-434)。为解决这个问题，Hiramatsu等人开发了对MRSA具有特异性的 基于PCR的测定法，该测定法利用能与3种类型的葡萄球菌染色体盒mec DNA(SCCmec DNA)的右末端杂交的引物，以及对金黄色葡萄球菌的对应于SCCmec整合位点的右侧上的核苷 酸序列具有特异性的引物。(美国专利No. 6，156，507)。其他葡萄球菌种类(例如表皮葡 萄球菌(S^pidermidis)和溶血葡萄球菌(S. haemolyticus))中的SCCmec整合位点周围 的核苷酸序列与金黄色葡萄球菌中存在的那些核苷酸序列不同，因此，这个PCR测定法能 特异性检测MRSA。用于检测MRSA和区分MRSA与MRCNS的遗传测定法相对较昂贵。另外，这类试验 法需要复杂的仪器和熟练的实验人员才能进行。

发明内容
鉴于当前的试验法要求复杂的仪器、不稳定的培养基和/或高度熟练的实验人 员，因此需要更简单的基于培养的试验法来检测和区分样本中的MRSA和/或MRCNS微生 物。此外，目前的MRSA和MRCNS微生物的试验法是定性的或者半定量的。本发明涉及用于 检测和区分样本中的抗生素抗性微生物的简单物品和方法。有利地，本发明的某些实施例 提供抗生素抗性微生物的定量计数。本发明方法还提供对含有MRSA和MRCNS的样本中的 这两种微生物的差分计数。在一个方面，本发明提供用于检测或计数抗生素抗性微生物的物品。该物品可包 括有效量的用于选择抗生素抗性葡萄球菌微生物的生长的内酰胺抗生素，前提条件是 该内酰胺抗生素不是氨曲南。该物品还可包括营养培养基、用于指示微生物的存在的 指示剂系统和包含胶凝剂的干燥、可再水化的薄膜培养装置。在另一个方面，本发明提供用于对抗生素抗性微生物进行差分计数的物品。该物 品可包括有效量的用于选择抗生素抗性葡萄球菌微生物的生长的β-内酰胺抗生素，前提 条件是该β-内酰胺抗生素不是氨曲南。该物品还可包括营养培养基、用于指示微生物的 存在的第一指示剂系统、用于指示金黄色葡萄球菌的存在的第二指示剂系统和包含胶凝剂 的干燥、可再水化的薄膜培养装置。在另一个方面，本发明提供用于检测抗生素抗性微生物的方法。该方法可包括提 供怀疑含有抗生素抗性微生物的液体样本；提供干燥的薄膜培养装置；用该液体样本接种 该培养装置；将该接种的培养装置温育一段时间；和分析该培养装置存在抗生素抗性微生 物。该培养装置可包括营养培养基、有效量的用于选择抗生素抗性微生物的生长的β-内 酰胺抗生素(前提条件是该β -内酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示微生物的存在的指示 剂系统和胶凝剂。在另一个方面，本发明提供用于检测和区分抗生素抗性微生物的方法。该方法可 包括提供怀疑含有抗生素抗性微生物的液体样本；提供干燥的薄膜培养装置；用该液体样 本接种该培养装置；将该接种的培养装置温育一段时间；和分析该培养装置存在抗生素抗 性微生物。该培养装置可包括营养培养基、有效量的用于选择抗生素抗性微生物的生长的 β-内酰胺抗生素(前提条件是该β-内酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示微生物的存在 的指示剂系统、用于指示金黄色葡萄球菌的存在的第二指示剂系统和胶凝剂。在另一个方面，本发明提供用于检测和区分抗生素抗性微生物的方法。该方法可 包括提供怀疑含有抗生素抗性微生物的液体样本和包含胶凝剂的干燥的薄膜培养装置以 及以下成分中的任何一种或多种营养培养基、有效量的用于选择抗生素抗性微生物的生长的内酰胺抗生素(前提条件是该内酰胺抗生素不是氨曲南)和用于指示微生 物的存在的指示剂系统。该方法还可包括向该培养装置加入如果不是已经存在的营养培 养基、有效量的用于选择抗生素抗性微生物的生长的内酰胺抗生素(前提条件是该 内酰胺抗生素不是氨曲南)和用于指示微生物的存在的指示剂系统。该方法还可包括 用该液体样本接种该培养装置，将该接种的培养装置温育一段时间，和分析该培养装置存 在抗生素抗性微生物。在另一个方面，本发明提供用于检测和区分抗生素抗性微生物的方法。该方法可 包括提供怀疑含有抗生素抗性微生物的液体样本和包含胶凝剂的干燥的薄膜培养装置以 及以下成分中的任何一种或多种营养培养基、有效量的用于选择抗生素抗性微生物的生 长的β -内酰胺抗生素(前提条件是该β -内酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示微生物的 存在的第一指示剂系统和用于检测金黄色葡萄球菌的存在的第二指示剂系统。该方法还可 包括向该培养装置加入如果不是已经存在的营养培养基、有效量的用于选择抗生素抗性微 生物的生长的β-内酰胺抗生素(前提条件是该β-内酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示 微生物的存在的第一指示剂系统和用于检测金黄色葡萄球菌的存在的第二指示剂系统。该 方法还可包括用该液体样本接种该培养装置，将该接种的培养装置温育一段时间，和分析 该培养装置存在抗生素抗性微生物。定义出于本发明的目的，“液体样本”指其中可能含有各种微生物的含水混合物，包括食物样本和临床样本 在内，包括那些均化、稀释和/或悬浮在含水混合物中的样本在内；“ β -内酰胺抗生素”指任何在其分子结构中包含β -内酰胺核心的抗生素。β -内 酰胺抗生素的非限制性例子包括青霉素、头孢菌素、单菌胺环、卡巴培南和前述任一者的含 β-内酰胺的衍生物；“粉末”指具有适用于本发明薄膜培养板装置的平均直径的一种或多种胶凝剂的 颗粒状材料，优选地直径为约10-400微米，更优选地直径为约30-90微米；“冷水可溶性粉末”指当与含水试验样本进行组合时在室温水(例如约18°C至 24°C )中形成凝胶的粉末； “非抑制性乳化剂，，指适用于将水不溶性粘合剂分散在含水环境中，但不会实质上 抑制想要培养的微生物的生长的乳化剂，优选地为非离子型乳化剂；“复水的培养基”指用水或含水试验样本对冷水可溶性粉末进行复水所形成的溶 液和/或凝胶；“透气的”指这样的材料，它当在它的边缘实质上暴露于空气时，可在水平方向上 (即平行于它的上表面和下表面)充分地可透过空气，以给上方的复水培养基提供充足的 空气供应，从而支持复水培养基中的好氧微生物的生长；“水基粘合剂组合物”指水不溶性粘合剂分散于含水环境中所得的粘合剂组合物； 和“选择剂”指任何起到抑制生长于本发明培养基装置上的微生物的生长和/或促进 所述微生物的鉴定的作用的元素、化合物或组合物。词语“优选的”和“优选地”指在某些情况下，可提供某些有益效果的本发明实施例。然而，在相同的情况或其它情况下，也可优选其它实施例。此外，对一个或多个优选实 施例的叙及并不暗示其它实施例是不可用的，且并无意于将其它实施例排除在本发明范围 之外。当术语“包含”及其变型出现在具体实施方式
和权利要求中时不具有限制的意思。本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种或多种(一 个或多个)”可互换使用。因此，例如，怀疑含有“一种”微生物的样本可被解释为意指该液 体可包含“一种或多种”微生物。术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或更多个的组合。本文以端点值叙及的数字范围包括该范围内的所有数字(比如，1到5包含1、 1. 5、2、2· 75,3,3. 80、4、5 等)。本发明的上述发明内容并非意图描述本发明每一个公开的实施例或每种实施方 式。以下“具体实施方式
”更具体地举例说明了示例性实施例。在本专利申请全文的几处， 通过实例列表提供指导，可以不同组合使用这些实例。在每一种情况下，被引用的列表均仅 用作一个代表性的组，不应被理解为是排他性列表。


本发明将结合下面所列的附图进行进一步的阐述，其中在几个视图中相同的结构 由相同的数字指代。图1是包括隔片的薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。图2是包括网格图案的自支撑基材的一个实施例的顶视图。图3是薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。图4是包括隔片和捕获元件的表面菌落计数薄膜培养装置的一个实施例的顶部 透视图(局部剖视)。
具体实施例方式本发明涉及用于检测样本中的耐抗生素(例如耐β -内酰胺抗生素)微生物的物 品和方法。本发明还提供用于区分样本中的抗生素抗性微生物的物品和方法。具体地讲， 本发明涉及抗生素抗性葡萄球菌的检测。在一些实施例中，可将耐抗生素金黄色葡萄球菌 与耐抗生素凝固酶阴性葡萄球菌区分开来。与常规的测试抗生素抗性微生物存在与否的试 验法形成对照的是，本发明方法提供对样本中活的抗生素抗性微生物的定量。本发明方法 还提供对样本中不同种类和/或类群的抗生素抗性微生物的定量。常规的基于琼脂的抗生素抗性微生物检测试验法需要费力地制备琼脂平板，且通 常平板必须在相对较短的时间内使用，以避免脱水和/或抗生素功效的损失。相比之下，本 发明的干的薄膜培养装置现成可用于样本，能保藏相对较长时间，且任选地可在使用过程 中加入抗生素，从而确保抗生素选择的完全功效。常规的检测抗生素抗性微生物的方法通常涉及纯化微生物菌落并将菌落转移到 含抗生素的琼脂平板，以确定它们是否能在抗生素存在下生长。在这些方法中，首先对抗生 素抗性微生物的存在进行定性检测(即在划线平板上的菌落或者在用于对存在与否进行定性的肉汤培养中的生长)，随后对检测到的微生物的耐抗生素纯菌落进行表征(即通过 产生抗菌谱或者通过进行最小抑菌浓度(MIC)或最小杀菌浓度(MBC)测定来表征)。常规 方法可包括区分性试验(例如凝集测定)，以使得能够对抗生素抗性微生物进行推测性鉴 定。但是，常规的方法不能提供对原始样本中的抗生素抗性微生物的直接、定量的计数。此 外，常规的方法不能提供对原始样本中存在的微生物混合群体的区分性定量。本发明方法 可提供对原始样本中或原始样本的稀释部分中的抗生素抗性微生物的计数。本发明方法还 可提供对样本中的抗生素抗性微生物的混合群体的差分计数。
薄膜培养装置 本发明的物品包括薄膜培养装置，如美国专利No. 4，476，226、5，089，413和 5，232，838中公开的那些薄膜培养装置，这些专利以引用方式全文并入本文。图1示出根据 本发明的薄膜培养装置的一个实施例。培养装置110包括主体构件，该主体构件包括具有 上下表面(分别为11 和112b)的自支撑防水基材112。基材112可为相对坚硬的膜(例 如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯)，该膜不会吸水或者以别的方式被水影响。基材112可为透明 的或不透明的，这取决于是否想要通过该基材观察细菌菌落。为促进细菌菌落的计数，基材 212可在其上印刷有网格图案(例如方格)，如图2中所示。再参见图1，基材112可在其上表面11 上涂覆有一层粘合剂114，该层粘合剂起 到将干燥的胶凝剂和/或营养物保持在均勻的单层中以便水化的作用。粘合剂114应以优 选地小于粉末化胶凝剂和/或营养物的颗粒直径的厚度涂覆到基材112上。目的是施加足 够的粘合剂以将颗粒粘附到基材，但又不太多而造成颗粒完全嵌在粘合剂中。冷水可溶性 粉末的均勻单层116是所期望的，其表面积充分暴露以便水化。图1中还示出在覆盖片122 上的任选的粘合剂层114’和冷水可溶性粉末层116’。在一些实施例中，粘合剂114可包含水基粘合剂组合物。优选地，水基粘合剂层 114当被含水试验样本湿润时充分透明，以使得能够观察微生物菌落。水基粘合剂组合物可 掺入一种或多种亲水剂，包括营养物，选择剂、指示剂(例如酶底物、染料)或它们的组合。 本领域技术人员参考本说明书，根据所要生长和/或选择性检测(例如染色)或抑制的具 体微生物，将显而易见地知道水基粘合剂组合物中使用的具体营养物和/或选择剂。示例性的一类有用的亲水性选择剂包括这样的染料，其被生长中的微生物代谢或 者以别的方式与生长中的微生物反应，由此造成微生物菌落被染色或者发荧光，以便技术 人员或自动读数器进行检测和/或定量。这种染料的非限制性例子包括氯化三苯基四唑、 对甲苯基四唑红、四唑紫、藜芦基四唑蓝、中性红、酚红、氯酚红和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷 酸二钠盐。本发明的特别优选的染料包括中性红和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸二钠盐。但 是应认识到，取决于所要鉴定的具体微生物，也可使用其他合适的染料。在本发明的另一个实施例中，粉末116可包含营养物但无胶凝剂。如果想要显现 和/或分离分立的细菌菌落，则胶凝剂可以是合乎需要的。在许多微生物学试验中，如用于 细菌鉴定或抗生素易感性的试验中，使用到肉汤培养基，可不需要粘稠的凝胶。在进行这种 试验的装置中，可省去胶凝剂。可采用缓冲试剂如碳酸钠来提供显示中性pH的培养基，并可采用“Cab-0-Sil M-5”作为加工助剂，如美国专利No. 4，565，783中所描述，该专利以引用方式全文并入本 文。当然，可根据所要生长的微生物的类型，对用于粉末116的具体的包覆混合物(例如营养物、指示剂和/或胶凝剂)加以调整。用于支持各种葡萄球菌的生长的非限制性示例性粉末混合物如下15克胶(M150瓜尔豆胶和黄原胶(Rhodia，Cranbury, NJ)的1 1混合物)5克蛋白胨2. 5克酵母膏1克右旋糖0. 06克碳酸钠0. 12 克“Cab-0-Sil M-5”(热解法二氧化硅，可从 Cabot Corporation 市售获得)设想到，本发明的物品可包括区分性指示剂。本文所用的“区分性指示剂”指添加 到培养基中的、会指示某些微生物的存在而不会指示其他微生物的存在的试剂。区分性指 示剂的非限制性例子包括染料(例如着色剂、PH指示剂、氧化还原指示剂)、酶底物(例如 磷酸酶、糖苷酶、肽酶、核酸酶、脂肪酶等的发色底物或荧光底物)以及当被某些微生物代 谢时会产生可检测的反应(例如与菌落相关的PH变化)的特定营养物(例如可发酵碳水 化合物、氨基酸)。在一些实施例中，可将一种或多种区分性指示剂加在涂覆到基材上的水基组合物 中以加到薄膜培养装置。在一些实施例中，可将一种或多种区分性指示剂加到液体样本，然 后液体样本加到培养装置。在一些实施例中，可在培养装置进行水化后，将一种或多种区分 性指示剂加到培养装置。涉及到使用加到水化后的培养装置的区分性指示剂的方法的一 个例子，是其中将用于检测耐热核酸酶的物品加到温育后的培养装置的方法，如美国专利 No. 6，022，682中所述，该专利以引用方式全文并入本文。在本发明范围内还设想到，粉末116可任选包括为执行某些用于微生物鉴定的生 化试验所必需的试剂。这种在特定类型的微生物存在下发生颜色变化的试剂(例如酶底 物)可包括在粉末116或粘合剂114中。在本发明的另一个实施例中，粉末116可包含这样的涂层，其包括胶凝剂和营养 物的混合物、选择剂和/或指示剂，且已被溶解或悬浮于溶液中涂覆并干燥到基材112上。 在这个实施例中，涂层实质上是无水的(即涂层一旦被允许与周围环境平衡，其水分含量 不超过大约脱水涂层的水分含量)。如图1所示，主体构件可包括施加到基材112的上表面的隔片118，该隔片118包 括在中部切穿以暴露基材112上的粉末116的圆形孔120。孔120的壁提供预定大小和形 状的槽以限定水化后的培养基。隔片118应足够厚以形成所需体积的槽，例如1、2或3毫 升。聚乙烯闭孔泡沫塑料是隔片118的优选材料，但也可使用任何疏水性(非湿润性)、对 微生物惰性且能够承受灭菌的材料。在一些实施例中(未显示)，隔片118可包括多个孔 20(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个孔)，每个孔可接种上不同的液体样本。隔片118可包括相对较厚的设计，如美国专利No. 5，681，712中所述的那些设计， 该专利以引用方式全文并入本文。较厚的带孔隔片118的一个目的是对放置在隔片118的 孔120中的膜进行定位和保护(例如微孔过滤膜)(未显示)。较厚的隔片118的另一个目 的是减少或防止覆盖片122与生长中的微生物菌落的接触(即提供生长表面和覆盖片122 之间的“顶部空间”，这还可使得对生长中的微生物菌落的通气增加)。隔片118的厚度应足以围住当对培养装置接种时加到装置的液体体积。取决于膜(当使用时)的厚度，隔片可为至少约0.5mm厚、约Imm厚、约1. 5mm厚和约2mm厚。图3显示薄膜培养装置310的另一个实施例。这个实施例包括基材312、粘合剂 314、冷水可溶性粉末316和覆盖片322，如图1所示。与图1的培养装置110相反，图3的 装置310不包括用于在接种过程中限定样本的隔片。可将模板例如加重环(未显示)临时 施加到覆盖片322的外面，该模板在闭合后用以在冷水可溶性粉末316形成凝胶的时候将 样本限定到特定区域。在一些实施例中，装置310可接种上多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、12、15或20个)不同的液体样本，采用适当的隔片和模板来将各个样本限定于培养装置 310的粉末316的不同部分。图4示出根据本发明的薄膜培养装置的另一个实施例410。培养装置410包括主 体构件411，该主体构件包括具有上下表面41 和412b的自支撑基材412。基材412在其 上表面41 上包覆有一层粘合剂414。包含一种或多种胶凝剂的冷水可溶性粉末416以薄 的、相对均勻的层粘附到粘合剂414。一旦接种上含水试验样本(未显示)，冷水可溶性粉 末层416立即水化而形成复水的培养基(未显示)，该培养基进而能够培育存在于液体接种 物中或存在于膜(如试验样本微生物过滤膜)(未显示)的表面上的微生物。隔片418部 分地覆盖基材412和覆盖粉末416的表面，具有孔420。另外，薄膜培养装置410任选包括 覆盖片422，以覆盖在加入含水试验样本后形成的复水培养基。图4还显示捕获元件似6和 在其上生长的微生物菌落428。在该图示的实施例中，捕获元件似6是微孔滤膜，已将液体 样本过滤通过该膜，以在其上截留样本中可能存在的任何细菌。虽然图1-4所示的实施例具有连接到装置的覆盖片，但在本发明范围内还设想 到，含粉末的实施例可以在保藏和温育过程中不进行覆盖，而是仅仅放在无菌环境中。还可以在本发明的装置中使用透气的膜层，如美国专利No. 5，232，838中所描述。 可将透气的层“夹”在基材和冷水可溶性粉末之间，在该透气的膜层的两侧上具有粘合剂涂 层(未显示)。抗生素本发明包括利用抗生素来选择抗生素抗性微生物的生长的物品和方法。对某些 从临床感染分离到的微生物(例如金黄色葡萄球菌)日常筛选它们对某些抗生素(例如
内酰胺抗生素)的耐药性。用于筛选过程的抗生素的选择可取决于操作者想要进行抗 生素耐药性测试的微生物。在一些实施例中，可在薄膜培养装置的制造过程中将抗生素掺入到该装置 中。在一些实施例中，可将抗生素掺入到薄膜培养装置的粘合剂涂层中，如美国专利 No. 5，089，413的实例1中所描述。除此之外，或者作为另外一种选择，可在薄膜培养装置的 制备过程中将抗生素掺入到涂覆在基材上的混合物中(如美国专利No. 7，087，401的实例 1和2中所描述)。美国专利No. 7，087，401 (其以引用方式全文并入本文)描述了将抗生 素掺入到含水混合物中，随后将混合物涂覆并干燥到基材上。在一些实施例中，可将抗生素 加到粉末(例如粉末化营养物和/或胶凝剂)的混合物，然后可用粉末涂覆方法将该混合 物涂覆到基材上的粘合剂层上。在一些实施例中，可在薄膜培养装置的使用过程中将抗生素加到该装置。例如，可 在将样本接种到培养装置中之前将抗生素加到样本。或者，可在将样本接种到培养装置中 之前将含抗生素的溶液加到培养装置。例如，在一个实施例中，用含抗生素的溶液水化该装置的胶凝剂，并通过例如将含有样本的过滤器放在水化凝胶的表面上来将样本接种到水化 凝胶上。在一些实施例中，在就要将样本加到薄膜培养装置之前将先抗生素的浓缩溶液加 到该装置，然后在接种过程中将两种溶液混合。设想到，可使用任何与薄膜培养装置材料相容的抗生素来检测和/或计数根据本 发明的抗生素抗性微生物。本文所用的“相容的”意指该抗生素与薄膜培养装置中的其他 材料发生相互作用，不至于实质上改变抗生素的功效或者会不利地影响培育和检测耐该抗 生素的微生物的能力。优选的一组用于检测抗生素抗性微生物的抗生素是内酰胺抗生 素组别，它们常常是用于治疗临床感染的主要类型的抗生素。在一些实施例中，可将内 酰胺抗生素用于培养装置中以检测抗生素抗性微生物。在某些实施例中，内酰胺抗生 素属于内酰胺抗生素中的头孢菌素组别。抗生素的头孢菌素组别包括“第一代头孢菌 素”(例如头孢唑林)。抗生素的头孢菌素组别还包括“第二代头孢菌素”(例如头孢西丁 和头孢呋辛)。在一些实施例中，头孢唑林可用于根据本发明的薄膜培养装置中。可将头孢唑林 以会在水化的培养基中产生约1 μ g/mL至约5 μ g/mL浓度的量加到上述的装置。在一些实 施例中，头孢唑林在接种的样本中的最终浓度可为约1 μ g/mL、约3 μ g/mL、约4 μ g/mL或约 5 μ g/mL。在一些实施例中，头孢呋辛可用于根据本发明的薄膜培养装置中。可将头孢呋辛 以会在水化的培养基中产生约3 μ g/mL至约5 μ g/mL浓度的量加到上述的装置。在一些实 施例中，头孢呋辛在接种的样本中的最终浓度可为约3 μ g/mL、约4 μ g/mL或约5 μ g/mL。在一些实施例中，头孢西丁可用于根据本发明的薄膜培养装置中。可将头孢西丁 以会在水化的培养基中产生约3 μ g/mL至约5 μ g/mL浓度的量加到上述的装置。在一些实 施例中，头孢西丁在接种的样本中的最终浓度可为约3 μ g/mL、约4 μ g/mL或约5 μ g/mL。在本发明范围内设想到，物品或方法可包括使用两种或更多种抗生素以检测和/ 或计数抗生素抗性微生物。捕获元件本发明的培养装置可与捕获元件一起使用以检测液体悬浮液中或者表面上的抗 生素抗性微生物。本文所用的“捕获元件”指用于捕集和保持样本中存在的微生物的物品。 优选地，将捕获元件的尺寸确定成能让它们放入本发明的薄膜培养装置中并在温育期间保 持在薄膜培养装置中，保持的时间足以让靶标微生物进行至少一次细胞分裂。将捕获元件 放入培养装置中可使捕获元件与培养装置中的胶凝剂和/或营养培养基(如果存在的话)， 从而让微生物生长和/或增殖。在一些实施例中，在将捕获元件放入培养装置中之前将培 养装置水化(例如用无菌液体或未知的液体样本接种)。在一些实施例中，在将捕获元件放 入培养装置中之后将培养装置水化。可对捕集装置加以选择非，确定它们与某些类型的样本的适合性。例如，可将微 孔过滤器用作捕获元件以截留液体样本中存在的微生物。可使液体样本通过过滤器，从而 微生物可被截留在其上。微生物可通过例如物理俘获或者特异性(例如抗原-抗体或受 体-配体相互作用)或非特异性(疏水吸附)化学相互作用进行截留。参考图4所示的实施例，试验样本可包含液体接种物和/或捕获元件4 如微孔 过滤器(例如过滤膜)或擦拭装置。捕获元件4 可从各种膜(membrane)和薄膜(film)构造而成，且可用于捕集微生物。在一些实施例中，捕获元件似6可提供表面，微生物菌落 可在该表面上通过本发明的方法和装置进行培育、检测和/或计数。特别合适的是已通常 用于从大的流体样本分离小的微生物群体(如细菌)的已知微孔过滤器。已知这种过滤 器被放在琼脂培养基的表面上并进行温育，以便对被过滤的微生物进行计数和评估。合适 的过滤器包括可获自Millipore公司(Marlborough，ΜΑ)的HAWG系列过滤器，例如HAWG 04750型的HA过滤器，和可获自Gelman公司(Ann Arbor, MI)的Metricel型的膜，例如 GN-6 Metricel膜。其他合适的膜包括通过在各种由乙烯醇的均聚物或共聚物构成的聚合 物上提供涂层而制备的亲水性膜，如PCT国际公开文本WO 92/07899中所描述。由该国际 公开文本的实例5中所述的方法制备的乙烯醇涂层微孔聚丙烯，是本发明中优选的微生物 过滤器ο上述的微生物过滤器的薄膜通常相对较薄，厚度约为0.01_2mm，优选 0.05-1. 0mm，且可以任何所需的二维形状提供，例如以矩形、盘形(包括部分的盘形)等提{共。取决于膜中的孔隙的大小，这种过滤器以不同的效率分离微生物。细菌容易分离， 而酵母和霉菌也会被这种过滤器分离。过滤是用合适大小的漏斗和隔膜(disc)按常规方 法进行。隔膜优选用镊子在无菌条件下操作。隔膜可由使用者从可市售获得的材料制作， 或者在无菌包装中作为单独的实体或作为本发明的套件的部件提供。擦拭装置可作为捕获元件用于本发明的培养装置。本文所用的“擦拭装置”是被 构造成用于接触表面以获取分布在该表面上的微生物样本的物品。擦拭装置可包括多孔无 纺材料。擦拭材料的非限制性例子包括纸(例如滤纸、纤维素膜过滤器)、合成的无纺材料 (例如尼龙或聚酯无纺材料)、聚合物膜或陶瓷膜(例如聚碳酸酯膜、氧化锆膜)、微结构化 薄膜(例如含微通道的薄膜，如美国专利No. 7，223，364中描述的那些，该专利以引用方式 全文并入本文)。在一些实施例中，含微通道的薄膜具有让流体(和溶质或小颗粒)从薄膜 的一个主表面通向另一个主表面的通孔。擦拭装置可包括用于改善湿润性的化学物质(例 如表面活性剂)或者试剂(例如区分性着色剂)。擦拭装置所包含的化学物质的数量一般 而言不会实质上抑制抗生素抗性微生物在本文所述的接种和温育条件下的生长。在一些实 施例中，捕获元件实质上是透明的，或者当湿润时变得实质上是透明度，从而使得区分性反 应(如溶血)可以透过捕获元件显现出来。 合适的捕获元件包括一个颗粒或多个颗粒。捕获元件包括用于将捕获元件结合到 微生物的手段。颗粒的非限制性例子包括微球体、微珠等。这种颗粒可为树脂颗粒，例如琼 脂糖、乳胶、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、纤维素、多糖或它们的组合，或者为无机颗粒，例 如二氧化硅、氧化铝或它们的组合。这种颗粒可以是磁性的、顺磁性的、超顺磁性或非磁性 的。这种颗粒可为胶体大小，例如约IOOnm至约10微米(μ m)。这种颗粒的非限制性例子 包括以商品名 DYNABEADS(Invitrogen，Inc.，Carlsbad, CA)和 BIO-ADEMBEADS(Ademtech， Pessac，法国)出售的超顺磁性聚合物颗粒。可将颗粒捕获元件掺入到其他结构如微孔膜 中。 有多种手段用于将捕获元件(例如颗粒)结合到微生物。在一些实施例中，用于 将捕获元件结合到微生物的手段可包括表面分子或者能促进非特异性吸附的性质。例如， 捕获元件的至少一部分在其表面上可具有这样的分子，它们在适当的条件(例如高PH或低PH)下变得带正电荷或带负电荷，且非特异性地吸附到与微生物表面缔合的带互补电荷的 分子。除此之外，或者作为另外一种选择，捕获元件(例如聚苯乙烯颗粒)的至少一部分 可具有非特异性吸附到与微生物表面缔合的疏水分子的疏水表面。在一些实施例中，用于 将捕获元件结合到微生物的手段可包括能通过受体-配体相互作用特异性结合微生物的 分子。这种特异性的受体-配体相互作用是本领域公知的，包括例如抗体和它们的相应抗 原之间的相互作用、凝集素和它们的相应碳水化合物结合伴侣之间的相互作用、噬菌体蛋 白和它们的相应噬菌体受体之间的相互作用，等等。应理解，用于将颗粒结合到微生物的手 段也可与薄膜或非织造物(例如过滤器)以及颗粒状捕获元件捕获元件联用。样本可在可衍自任何来源的试验样本中分析所关注的耐抗生素种类，所述来源例如生 理流体，如血液、唾液、眼晶状体液、滑液、脑脊髓液、脓液、汗液、渗出液、尿液、黏液、粪便、 乳液等。此外，试验样本可衍自身体部位，例如伤口、皮肤、鼻孔、头皮、指甲等。特别值得关注的样本包括含黏液的样本，如鼻样本(来自例如前鼻孔、鼻咽腔、鼻 腔、鼻前庭等)以及来自外耳、中耳、口、直肠、阴道或其他类似组织的样本。具体的粘膜组 织的例子包括口腔、齿龈、鼻、眼、气管、支气管、胃肠、直肠、尿道、输尿管、阴道、子宫颈和子 宫的粘膜。除了生理流体外，其他试验样品可包括其他液体以及溶于液体介质的固体。所关 注的样本可包括工艺流、水、土壤、庄稼或其他植物、空气、表面(例如受污染的表面、地面、 墙壁、仪器、被褥)等。样本还可包括经培养的细胞。各种用于检测表面上的微生物如金黄色葡萄球菌的患者采样技术是已知的。这些 取样技术也适用于本发明方法。例如，常常擦拭患者的鼻孔以获取样本。特别优选的采样 技术包括用无菌拭子或采样装置拭抹受试者(例如患者)的前鼻孔。例如，一个拭子用于 对一名受试者取样，即一个拭子用于两个鼻孔。例如可这样进行采样将干燥的或用适当的 溶液预湿润的拭子插入到受试者鼻孔的前末端，并将拭子沿着鼻孔的粘膜表面完整地旋转 一圈或多圈。有多种拭子或其他样本收集装置可市售获得，例如以商品名PURE-WRAPS获自 Puritan Medical Products Co. LLC (Guilford, ME)，或者以商品名 ESWAB 获自 Copan Diagnostics, Inc. (Corona, CA)，或者以商品名 FL0CKEDSWAB 获自 microRheologics， S. r. 1.(意大利布雷西亚)。如果需要也可使用例如美国专利No. 5，879，635 (Nason)中公 开的样品采集装置。拭子可为包括棉花、人造丝、藻酸钙、涤纶、聚酯、尼龙、聚氨酯等在内的 各种材料。然后可将样品采集装置(例如拭子)直接培养、直接分析或用适当的溶液提取 (例如，通过洗涤，经涡旋洗脱)。这些提取(即洗脱)溶液通常包括水并可任选包括缓冲 液和至少一种表面活性剂。洗脱缓冲液的例子包括例如磷酸缓冲盐水(PBS)，其可例如与 TffEEN 20或PLUR0NIC L64组合使用。试验样本(例如液体)可先进行处理再作进一步的 分析。这可包括浓缩、沉淀、过滤、离心、透析、稀释、天然成分的灭活、试剂的加入、化学处理寸。其他的样本收集装置(也称“捕获元件”)可用来从表面或者从液体流收集样本。在一些实施例中，捕获元件可用于擦拭表面以从表面收集微生物的代表性样本。随后，可将 捕获元件转移到培养装置中，并在微生物的温育和生长过程中保留在该装置中。在一些实 施例中，捕获元件可用于将微生物过滤出液体样本。在过滤步骤后，可将捕获元件转移到培 养装置中，并在微生物的温育和生长过程中保留在该装置中。检测和区分耐甲氧西林微牛物的方法薄膜装置可用于检测和区分耐抗生素(例如耐甲氧西林)微生物的方法中。装置 可进行接种，干燥的营养物和/或胶凝剂可通过几种不同的程序进行水化。在一些实施例 中，可将液体样本接种到薄膜装置中，从而基本上形成“倾注板”。在一些实施例中，可将不 含目标菌群和可为无菌的含水液体(例如水、缓冲液、营养培养基)加到薄膜装置，并让凝 胶固化。凝胶固化后，可打开覆盖片，并可使凝胶接触表面(例如墙壁、地面、仪器、皮肤、粘 膜)以使装置接种。随后可将覆盖片关闭以进行温育。在一些实施例中，如上所述将含水 溶液加到装置，随后可将捕集装置(例如膜过滤器或擦拭物)放到薄膜装置中，从而使装置 接种。或者，可用捕获元件所具有的水分溶解薄膜中的营养物和胶凝剂。在一些实施例中， 可在捕获元件已放在装置中之后，将含水溶液加到装置以溶解营养物和胶凝剂。在一些实 施例中，可将样本溶液分布(例如沉积、涂布或划线)到装置中，然后再加入含水溶液以溶 解营养物和胶凝剂。可将加重的板或者专门设计的涂布器放在覆盖片的顶部上，以完全涂 布样本。薄膜装置还可用于计数抗生素抗性微生物的方法中。在接种后，接着将培养装置 温育预定的一段时间。可透过覆盖片计数在培养基或捕获元件中或者在培养基或捕获元件 上生长的细菌菌落。可将至少一种亲水剂如营养物、指示剂或选择剂(例如抗生素)在接种时随样本 一起加到培养装置。可将该至少一种亲水剂(优选为无菌的)溶解、悬浮或稀释到液体样本 中，然后再将样本加到培养装置。在一些实施例中，可将该至少一种亲水剂紧接在液体样本 之前或之后单独加到培养装置(例如作为粉末、干燥薄膜、基材上的涂层或者溶液加入)， 并任选可在关闭和/或温育培养装置之前在培养装置中与样本一起混合(例如用移液管头 混合)。可通过在培养装置已接种后使液体、半固体溶液或脱水物品(例如经涂覆的干燥 的基材)与培养装置中的水化营养培养基接触，来将亲水剂(例如营养物、抗生素和指示 剂)加到接种的/水化的培养装置。该脱水物品可为部分脱水的物品。基材可包括塑料薄 膜、微孔膜、纤维素材料或无纺材料。区分性指示剂(如果存在的话)可用于区分不同类群或种类的微生物并提供差分 计数。例如，酶底物可用于区分含葡萄球菌的菌落和含芽孢杆菌属种类或其他微生物的菌 落。美国专利No. 5，837，482(其以引用方式全文并入本文)描述了使用“吲哚基_吡喃葡 萄糖苷”酶底物以检测非葡萄球菌微生物和Baird-Parker区分性试剂(例如蛋黄_亚碲酸 盐悬浮液)以检测葡萄球菌微生物的指示剂系统。美国专利No. 5，635，367(其以引用方式 全文并入本文)描述了使用“吲哚基-吡喃葡萄糖苷”酶底物以检测非葡萄球菌微生物和 “吲哚基-磷酸盐”酶底物以检测葡萄球菌微生物的指示剂系统。可从培养装置挑取菌落以进行区分性试验。可将各个菌落分别进行试验，或者可 将它们进行集合或“汇集”以进行区分性试验。可例如通过从装置挑取两个或多个菌落来“汇集”菌落，将它们混合在一起，然后对来自该两个或多个菌落的微生物同时进行区分性 试验。区分性试验可包括例如染色试验(例如革兰氏染色、孢子染色、免疫化学染色)、酶 促试验(例如DNA酶试验、TNA酶试验)、表面受体识别试验(例如凝固酶试验或聚集因子 试验)、遗传试验(例如扩增试验，如PCR和rtPCR ；核酸测序；或杂交测定(例如FISH测 定))、免疫测定试验(例如ELISA、免疫扩散、免疫层析)或生化试验(例如凝固酶试验、过 氧化氢酶试验、碳水化合物发酵(例如甘露糖醇发酵)、脂质分析)。本发明的套件本发明提供的套件包括两个或多个部件。一个部件包括本文所述的薄膜培养板装 置。每个套件的第二个部件可选自如下附件膜过滤器、移液管、涂布器、手套、样本获取装 置、捕获元件、样品悬浮介质、试剂和前述附件中的任何两者或多者。膜过滤器的形状和大小应适合于装配到套件的培养板装置的隔片的孔中。不同种 类的过滤器可与套件一起提供，或者多个套件可包含各种过滤器。过滤器是任选的，且优选 地在无菌条件中提供，如已通过Y辐射、环氧乙烷或其他灭菌方式灭菌的涂聚乙烯的纸包 装。或者，过滤器可为将由使用者进行灭菌的非无菌组件。合适的移液管和涂布器可由例如塑料或玻璃制作。移液管和涂布器可在预灭菌条 件中提供，或者可在非无菌条件中提供。移液管和涂布器可在单次使用后丢弃，或者可再灭 菌以供多次使用。本文所用的“移液管”包括具有至少一个对应于已知体积的刻度标志和 具有移液管头的容量移液管，其可用于容量移液装置。套件可包含亲水剂的包装。亲水剂 优选地包含在无菌包装中，例如箔包装，如制药行业常规使用的那些包装。这种包装的一个 例子是用于 NITR0-BID 软膏剂(Marlon Laboratories, Inc.，Kansas City, Mo.)。套件中所包括的营养物和/或选择剂可如上所述掺入到粘合剂和/或粉末组合物 中。套件中有用和必需的亲水剂的选择取决于所要评估的微生物。选择套件组分的另一个 标准将是亲水剂的短期和长期化学相容性。现将参考以下非限制性实例对本发明作进一步说明。所有的份数和百分数均以 重量份表示，除非另有指明。除非另有说明，否则所有的试剂均获自Sigma Chemical公司 (St. Louis) ο^M实例1.在含有头孢西丁或苯哔西林的薄膜培养装置中检测和计数葡萄球菌试剂和培养基的制备PETRIFILM好氧微生物计数板获自3M公司(St. Paul, MN)。DIFCO脱水胰酶大豆 琼月旨(TSA)获自 BD Diagnostics (Sparks，MD)。除纤维蛋白羊血获自 RemelJnc. (Lenexa, KS)。磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 7. 5)从10X浓缩液(OmniPur 6505缓冲盐水；EMD Chemicals, Inc. ；Gibbstown,NJ)制备，并进行高压灭菌。抗生素储备溶液在去离子水中制 备，并通过使其经过0. 22 μ m过滤器进行除菌。制备含有头孢西丁(SBA-Cf)的羊血琼脂，以将抗生素抗性微生物在琼脂培养基 上的回收率与抗生素抗性微生物在薄膜培养装置中的回收率进行比较。将20克的脱水TSA 与475mL的去离子水混合并进行高压灭菌。将熔融的琼脂在50°C下回火(temper)。将25 毫升的除纤维蛋白羊血加到琼脂(以产生5%羊血终浓度)并漩涡搅拌以混合。将头孢西丁储备溶液(0. 5mL,4mg/mL)加到琼脂并漩涡搅拌以混合。将琼脂倒入无菌培养皿中，让琼 脂在室温下固化。将板倒置并在4°C下保藏。制备PBS稀释溶液以稀释细菌培养物。这些稀释溶液分别含有3 μ g/mL、4 μ g/mL 和5 μ g/mL的头孢西丁，或者4 μ g/mL,5 μ g/mL和6 μ g/mL的苯唑西林。稀释溶液在制备 后八小时内使用。不含抗生素的PBS用作PETRIFILM和SBA对照板的稀释液。细菌悬浮液的制备试验了八个葡萄球菌微生物菌株。甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌(96号菌株)、耐 甲氧西林表皮葡萄球菌G71号和472号菌株)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(560号和907 号菌株)获自人临床分离物。甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(ATCC25923和ATCC27664 菌株)和甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌ATCC122^获自美国模式培养物保藏所(Manassas， VA)。接种、温育和菌落计数将各个细菌菌株接种到胰酶大豆肉汤并在37°C下温育过夜。将细菌悬浮液在上述 的每个PBS稀释液中稀释。取1毫升样本按照厂商说明书接种到PETRIFILM板上。通过用 无菌涂布器将0. 1毫升的细菌悬浮液涂布在含有头孢西丁的血液琼脂板的表面上，对板进 行接种。所有的板都在35°C下温育，并在对士2小时和48士4小时计数每个板上的菌落。 菌落计数(CFU)在表1和2中显示。数据表明，在温育后M小时和48小时，在两种类型的 平板培养基(琼脂和PETRIFILM板)中都可检测到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和表皮葡萄 球菌。数据显示，第560号菌株对头孢西丁敏感却耐苯唑西林。表1.在M小时时在含有头孢西丁或苯唑西林的PETRIFILM板和血液琼脂板上观 察到的菌落形成单位(CFU)。表中所示的稀释系数是最终稀释系数，其计入了接种到各个 板类型中的样本的体积的差异。PF-C = PETRIFILM板对照，PF-Cf(n)=具有指定微克数/ mL的头孢西丁的Petrifilm板，PF-Ox (n)=具有指定微克数/mL的苯唑西林的Petrif ilm， SBA-Cf =含有头孢西丁的羊血琼脂，SBA-C =羊血琼脂对照
权利要求
1.一种用于检测或计数抗生素抗性微生物的物品，所述物品包括有效量的用于选择抗生素抗性葡萄球菌微生物的生长的内酰胺抗生素，前提条件 是β-内酰胺抗生素不是氨曲南；营养培养基；用于指示微生物的存在的指示剂系统；和 包含胶凝剂的干燥、可再水化的薄膜培养装置。
2.一种用于对抗生素抗性微生物进行差分计数的物品，所述物品包括有效量的用于选择抗生素抗性葡萄球菌微生物的生长的内酰胺抗生素，前提条件 是β-内酰胺抗生素不是氨曲南； 营养培养基；用于指示微生物的存在的第一指示剂系统； 用于指示金黄色葡萄球菌的存在的第二指示剂系统；和 包含胶凝剂的干燥、可再水化的薄膜培养装置。
3.权利要求1或权利要求2的物品，其中所述抗生素包含甲氧西林。
4.权利要求1或权利要求2的物品，其中所述抗生素包含苯唑西林。
5.权利要求1或权利要求2的物品，其中所述β-内酰胺抗生素包含头孢菌素抗生素。
6.权利要求5的物品，其中所述头孢菌素抗生素包含头孢西丁。
7.权利要求6的物品，其中头孢西丁在所述培养装置的再水化营养培养基中的浓度为 约 0. 5 μ g/mL 至约 4 μ g/mL0
8.权利要求7的物品，其中头孢西丁在所述培养装置的再水化营养培养基中的浓度为 约 1 μ g/mL 至约 4 μ g/mL ο
9.权利要求8的物品，其中头孢西丁在所述培养装置的再水化营养培养基中的浓度为 约 2 μ g/mL 至约 4 μ g/mL ο
10.权利要求9的物品，其中头孢西丁在所述培养装置的再水化营养培养基中的浓度 为约 3 μ g/mL 至约 4 μ g/mL ο
11.前述权利要求中任一项的物品，其还包含亚碲酸钾。
12.权利要求1-10中任一项的物品，其还包含氯化锂。
13.前述权利要求中任一项的物品，其还包含第二抗生素。
14.权利要求13的物品，其中所述第二抗生素不是内酰胺抗生素。
15.前述权利要求中任一项的物品，其中所述薄膜培养装置包括表面菌落计数薄膜培 养装置。
16.一种检测抗生素抗性微生物的方法，其包括提供怀疑含有抗生素抗性微生物的液体样本；和干燥的薄膜培养装置，所述干燥的薄 膜培养装置包含营养培养基、有效量的用于选择抗生素抗性微生物的生长的内酰胺抗 生素、用于指示微生物的存在的指示剂系统和胶凝剂，前提条件是所述内酰胺抗生素 不是氨曲南；用所述液体样本接种所述培养装置； 将所述接种的培养装置温育一段时间；和 分析所述培养装置存在抗生素抗性微生物。
17.一种检测和区分抗生素抗性微生物的方法，其包括提供怀疑含有抗生素抗性微生物的液体样本；和干燥的薄膜培养装置，所述干燥的薄 膜培养装置包含营养培养基、有效量的用于选择抗生素抗性微生物的生长的内酰胺抗 生素、用于指示微生物的存在的第一指示剂系统、用于指示金黄色葡萄球菌的存在的第二 指示剂系统和胶凝剂，前提条件是所述内酰胺抗生素不是氨曲南； 用所述液体样本接种所述培养装置； 将所述接种的培养装置温育一段时间；和 分析所述培养装置存在抗生素抗性微生物。
18.一种检测和区分抗生素抗性微生物的方法，其包括提供怀疑含有抗生素抗性微生物的液体样本；和干燥的薄膜培养装置，所述干燥的薄 膜培养装置包含胶凝剂和以下成分中的任一种或多种营养培养基、有效量的用于选择抗 生素抗性微生物的生长的内酰胺抗生素、或者用于指示微生物的存在的指示剂系统， 前提条件是所述β-内酰胺抗生素不是氨曲南；向所述培养装置加入如果不是已经存在的营养培养基、有效量的用于选择抗生素抗性 微生物的生长的内酰胺抗生素和用于指示微生物的存在的指示剂系统，前提条件是所 述β-内酰胺抗生素不是氨曲南；用所述液体样本接种所述培养装置； 将所述接种的培养装置温育一段时间；和 分析所述培养装置存在抗生素抗性微生物。
19.一种检测和区分抗生素抗性微生物的方法，其包括提供怀疑含有抗生素抗性微生物的液体样本；和干燥的薄膜培养装置，所述干燥的薄 膜培养装置包含胶凝剂和以下成分中的任一种或多种营养培养基、有效量的用于选择抗 生素抗性微生物的生长的内酰胺抗生素、用于指示微生物的存在的第一指示剂系统、 或者用于指示金黄色葡萄球菌的存在的第二指示剂系统，前提条件是所述内酰胺抗生 素不是氨曲南；向所述培养装置加入如果不是已经存在的营养培养基、有效量的用于选择抗生素抗性 微生物的生长的内酰胺抗生素、用于指示微生物的存在的第一指示剂系统和用于指示 金黄色葡萄球菌的存在的第二指示剂系统，前提条件是所述-内酰胺抗生素不是氨曲南； 用所述液体样本接种所述培养装置； 将所述接种的培养装置温育一段时间；和 分析所述培养装置存在抗生素抗性微生物。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述液体样本进行稀释且所述培养装置接 种上所述稀释的液体样本。
21.权利要求16-19中任一项的方法，其还包括以下步骤i)稀释所述液体样本以产生 两个或更多个不同浓度的液体样本，和ii)将两个或更多个不同浓度的样本接种到分别的培养装置中。
22.权利要求16-21中任一项的方法，其还包括以下步骤i)提供捕获元件，和ii)使 所述胶凝剂与所述捕获元件接触。
23.权利要求22的方法，其中在将所述捕获元件与所述胶凝剂接触之前使所述胶凝剂水化。
24.权利要求16-23中任一项的方法，其中所述β-内酰胺抗生素包含头孢西丁。
25.权利要求16-24中任一项的方法，其中分析培养基存在抗生素抗性微生物包括对 菌落进行计数。
26.权利要求16-25中任一项的方法，其还包括对来自一个或多个菌落的微生物进行 差分试验的步骤。
27.权利要求沈的方法，其中从所述培养装置移取来自一个或多个菌落的微生物以进 行差分试验。
28.权利要求27的方法，其中从所述培养装置移取来自两个或更多个菌落的微生物并 混合一起以进行差分试验。
29.权利要求沈-28中任一项的方法，其中所述差分试验包括生化试验。
30.权利要求四的方法，其中所述生化试验包括对过氧化氢酶活性的试验。
31.权利要求四的方法，其中所述生化试验包括对凝固酶活性的试验。
32.权利要求四的方法，其中所述生化试验包括革兰氏染色。
33.权利要求四的方法，其中所述差分试验包括免疫测定。
34.权利要求四的方法，其中所述菌落差分试验包括遗传试验。
35.权利要求16-34中任一项的方法，其中在所述培养装置接种之后使亲水剂与所述 培养装置中的水化营养培养基接触。
36.权利要求35的方法，其中所述亲水剂包含基材。
37.权利要求36的方法，其中所述亲水剂涂覆在基材上。
38.权利要求37的方法，其中所述基材包括塑料膜、微孔膜、纤维素材料或无纺材料。
全文摘要
本发明提供一种用于检测抗生素抗性微生物的薄膜培养装置。该装置可包括用于区分葡萄球菌微生物与非葡萄球菌微生物的指示剂。使用方法包括检测或计数抗生素抗性微生物。所述方法还包括获得葡萄球菌微生物与非葡萄球菌微生物的差分计数。
文档编号C12N1/00GK102131915SQ200980132608
公开日2011年7月20日 申请日期2009年8月19日 优先权日2008年8月21日
发明者帕特里克·A·马赫, 米歇尔·L·罗索尔 申请人:3M创新有限公司