专利名称：功能性丝状真菌检测方法、含有功能性丝状真菌制品的评价方法和引物对的制作方法
技术领域：
本发明涉及功能性丝状真菌检测方法、含有功能性丝状真菌制品的评价方法和引物对。
背景技术：
已知丝状真菌，即霉，具有各种功能，还已知例如病原性丝状真菌引起植物病害。 病原性丝状真菌是使圆白菜、黄瓜、西红柿、茄子、油菜等许多蔬菜、稻等农产品，以及花、树木、草坪等中发生枯萎病、根腐病、叶腐病、枯萎病等病害的原因。作为这些丝状真菌，熟知的有丝核菌属、镰刀菌属、腐霉属、木霉属、核盘菌属等。作为针对这种病原性丝状真菌的有效的植物病害防除方法，可以列举使用微生物、尤其是丝状真菌的植物病害防除剂(例如，国际公开第97/31521号小册子和国际公开第2006/085567号小册子)。人们已经了解，一般来说，细菌类与丝状真菌类中，增殖和活性所适宜的生长条件不同。因此，人们希望使用在适于病原性丝状真菌的生长的条件下可以发挥植物病害防除功能的功能性丝状真菌来代替细菌的植物病害防除剂比使用细菌类的植物病害防除剂有更大的效果。其中，使用属于墨汁鬼伞科的丝状真菌的植物病害防除剂， 其功能高(参照国际公开第2006/085567号小册子)。可是，为了使用这种功能性丝状真菌作为植物病害防除剂，需要使之以适度的密度存在于土壤或堆肥中，使之发挥适当的植物病害防除功能，并使这种功能得以维持。为了简便地利用功能性丝状真菌的规定功能，有时也在土壤或堆肥、固体培养基或固定化载体中接种功能性丝状真菌，制造含有功能性丝状真菌制品。在制造这种含有功能性丝状真菌制品时，在制造、保管或搬运等过程中，必须适当监控功能性丝状真菌浓度。近年来，开发了使用分子生物学的手法进行菌的鉴定、检测的技术。例如，在特开 2007-268471号公报中，通过提供一种检测存在于有机性废弃物或废水等沼气发酵处理污泥中的与沼气生成相关的沼气生成细菌和酸生成细菌，评价其活性的方法，公开了沼气发酵装置的适当运转管理指标和运行控制方法。该方法利用了综合性地定量检测属于酸生成细菌的真正细菌群或具有沼气生成能力的沼气生成菌群的方法，其包括使用PCR法定量检测DNA和RNA浓度，经时监控的步骤。此外，特开2007-174973号公报公开了能够高精确度、迅速、简便且便宜地对农产物(谷类、蔬菜)、畜产品(肉类)、水产品(鱼类和贝类)、毛发、体液、微生物等试样中所含的DNA进行DNA扩增和分析的技术。该方法包括通过PCR反应扩增试样中的DNA的工序， 该PCR扩增工序使用SSR引物对，通过多重PCR进行。然而，在土壤和堆肥中，除了作为目的物的功能性的丝状真菌以外，还存在各种丝状真菌和细菌类。为了从这种土壤或堆肥等中，只监控特定的功能性丝状真菌，就需要呈现出特异性极高的检测方法。而且，需要适当进行接种功能性丝状真菌而获得的含有功能性丝状真菌制品的评价的评价方法。
发明内容
本发明的目的是提供能够以高精确度检测功能性丝状真菌短矮鬼伞 (Coprinellus curtus)的功能性丝状真菌检测方法和含有功能性丝状真菌制品的评价方法。本发明的第一个方式是提供功能性丝状真菌检测方法，其使用选自(1)具有序列号1所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸，( 具有序列号2所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸，( 具有序列号3所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸，和(4)具有序列号4所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸中的至少1 个多核苷酸，检测试样中的功能性丝状真菌短矮鬼伞。本发明的第二个方式是含有功能性丝状真菌制品的评价方法，该方法是含有功能性丝状真菌短矮鬼伞的含有功能性丝状真菌制品的评价方法，其包括对来源于前述含有功能性丝状真菌制品的试样，使用由序列号1或序列号3所示的碱基序列或与其实质相同的碱基序列构成的多核苷酸，和由序列号2或序列号4所示的碱基序列或与其实质相同的碱基序列构成的多核苷酸所构成的引物对，进行定量PCR，基于前述定量的PCR的结果，评价前述含有功能性丝状真菌制品中的功能性丝状真菌短矮鬼伞的存在或浓度。本发明的第三个方式是提供由下述多核苷酸构成的引物对(1)具有序列号1或序列号3所示的碱基序列或与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸、(2)具有序列号2或序列号4所示的碱基序列或与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸。本发明的第四个方式是提供下述任意一个多核苷酸或选自下述多核苷酸中的至少2个构成的多核苷酸组(1)具有序列号1所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸、(2)具有序列号2所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸、( 具有序列号3所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸、(4)具有序列号4所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸。
图1是为了获得本发明引物组而使用的GM-21株的序列。图2是表示使用实施例1中这种GM-21株的实时PCR的Ct值的图。图3是表示使用实施例1中这种超纯水样品的实时PCR的Ct值的图。图4是表示实施例1中这种GM-21株浓度与引物组A的实时PCR的Ct值之间的关系的图。
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图5是表示实施例3中这种不同种类的微生物与引物组A的实时PCR的Ct值的图。图6是表示通过实时PCR测定实施例4中这种GM-21株接种悬浮液、堆肥中的 GM-21株浓度的图。图7是经时表示实施例5中的这种功能性堆肥制造工序中的堆肥内的细菌类浓度的变化的图。图8经时表示实施例5中的这种功能性堆肥制造工序中的堆肥内的GM-21株浓度变化的图。
具体实施例方式本发明的检测功能性丝状真菌短矮鬼伞的方法为，使用选自下述中的至少1个多核苷酸检测试样中的功能性丝状真菌短矮鬼伞(1)具有 GTGTTGCATGTAGCTGCCTCCTC(GM2125F 序列号1)所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸，( 具有T GACGCGAGAGTTATCCAGACCTAC (GM2152R 序列号2)所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸，( 具有 GTGTTGGTTGTAGCTGCCTCCTC(GM2127F 序列号3)所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸，和(4)具有 TGGTAATTCGAGGAGAGGCAC(GM2172R 序列号4)所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸。由于这些多核苷酸表现出对功能性丝状真菌短矮鬼伞的高特异性，因此通过使用这些多核苷酸，可以高精确度检测到试样中的功能性丝状真菌短矮鬼伞。此外，本说明书中所谓“工序”的术语，不仅是独立的工序，而且在无法与其它工序明确区别的情况下，如果可以达到本工序的预期的作用，也都包含在该术语中。此外，本说明书中所示数值范围包括其左右的数值。由于可以明确地将上述GM2125F、GM2127F、GM215^ 或GM217^ 或它们的组合与近缘种区别开，进行检测，因此非常适于高精确度且特异性地检测作为目的物的功能性丝状真菌短矮鬼伞。GM2125F、GM2127F、GM2152R 和 GM2172R 对应于图 1 所示的包含 GM-21 株的 18S ( — 部分)、几51、5.85、几52、洸5(—部分)的序列(序列号12)的663个碱基区域中，第46位到第68位(序列号1和序列号3)和第119位到第143位的序列(序列号2)，和第168位到第188位(序列号4)。该区域是保守性较低的区域，对短矮鬼伞的特异性特别高。因此， 通过使用对应于该区域的GM2125F、GM2127F、GM2152R或GM2172R或它们的组合，可以高精确度检测短矮鬼伞。而且，与这些序列分别互补的序列和与这些互补序列实质相同的序列，也可以用于高精确度检测功能性丝状真菌短矮鬼伞，与GM2125F、GM2127F、GM2152R和GM2172R—样， 可以在本发明的检测方法中使用。这里所称的实质相同的序列，是指与GM2125F、GM2127F、GM2152R和GM2172R的各序列或与它们各自互补的序列同等程度、具有可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的同源性的序列，作为这种序列，可以列举取代、缺失、添加了 1 5个碱基左右的数个碱基的序列。 这种数个碱基不同的实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列，可以列举例如，具有在4XSSC 65°C下杂交，然后在0. IXSSC 65°C下1小时清洗这种一般杂交条件下，与GM2125F、GM2127F、GM2152R、GM2172R或与它们互补的序列杂交的碱基序列的多核苷酸。与GM2125F、GM2127F、GM2152R和GM2172R的各序列或与它们各自互补的序列实质相同的序列中，作为更优选的序列，可以列举下述表1记载的PCR条件下可以扩增的序列， 它们是对上述GM2125F、GM2127F、GM2152R和GM2172R的各序列或与它们各自互补的序列， 在其3’末端侧取代或添加1 3个碱基，在5’末端侧取代或添加1 5个碱基，或在各个末端侧连续缺失1 5个碱基的序列。如果是这种实质相同的序列，它们与上述GM2125F、 GM2127F、GM2152R和GM2172R的序列一样，可以用于包括PCR技术在内的各种检测方法。[表 1]
权利要求
1.功能性丝状真菌检测方法，使用选自(1)具有序列号1所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸，(2)具有序列号2所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸，(3)具有序列号3所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸，和(4)具有序列号4所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸中的至少1个多核苷酸，检测试样中的功能性丝状真菌短矮鬼伞。
2.根据权利要求1所述的功能性丝状真菌检测方法，包括使用由序列号1或序列号3 所示的碱基序列或与其实质相同的碱基序列构成的多核苷酸，和由序列号2或序列号4所示的碱基序列或与其实质相同的碱基序列构成的多核苷酸所构成的引物对，进行PCR。
3.根据权利要求1所述的功能性丝状真菌检测方法，包括使用由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸，和由序列号2所示的碱基序列构成的多核苷酸所构成的引物对， 进行PCR。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的功能性丝状真菌检测方法，所述功能性丝状真菌短矮鬼伞是短矮鬼伞GM-21 (NITE BP-37)。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的功能性丝状真菌检测方法，所述试样是选自土壤试样、堆肥试样、培养物试样和固定化物试样中的至少1种。
6.含有功能性丝状真菌制品的评价方法，该方法是含有功能性丝状真菌短矮鬼伞的含有功能性丝状真菌制品的评价方法，包括对来源于所述含有功能性丝状真菌制品的试样，使用由序列号1或序列号3所示的碱基序列或与其实质相同的碱基序列构成的多核苷酸，和由序列号2或序列号4所示的碱基序列或与其实质相同的碱基序列构成的多核苷酸所构成的引物对，进行定量PCR，基于所述定量的PCR的结果，评价所述含有功能性丝状真菌制品中的功能性丝状真菌短矮鬼伞的存在或浓度。
7.根据权利要求6所述的含有功能性丝状真菌制品的评价方法，所述引物对是由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸，和由序列号2所示的碱基序列构成的多核苷酸所构成的引物对。
8.根据权利要求6或7所述的含有功能性丝状真菌制品的评价方法，所述含有功能性丝状真菌制品是通过包括以下步骤的方法获得的功能性堆肥对处于细菌类活动限制状态的堆肥接种所述功能性丝状真菌短矮鬼伞，在所述堆肥内培养所述丝状真菌，使之选择性增殖。
9.根据权利要求6 8中任一项所述的含有功能性丝状真菌制品的评价方法，所述功能性堆肥还含有在丝状真菌的生长发育条件下可以活动的能够与丝状真菌共存生长的细菌类。
10.根据权利要求6 8中任一项所述的含有功能性丝状真菌制品的评价方法，所述功能性堆肥还包括在丝状真菌的生长发育条件下可以活动的能够与丝状真菌共存生长的细菌嗜盐枝芽孢杆菌130-1 (FERM BP-10975)。
11.由下述多核苷酸构成的引物对(1)具有序列号1或序列号3所示的碱基序列、或与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸，(2)具有序列号2或序列号4所示的碱基序列、或与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸。
12.下述任意一个多核苷酸(1)具有序列号1所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸，(2)具有序列号2所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸，(3)具有序列号3所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸，(4)具有序列号4所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸。
13.由选自下述多核苷酸中的至少2个构成的多核苷酸组(1)具有序列号1所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸，(2)具有序列号2所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸，(3)具有序列号3所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸，(4)具有序列号4所示的碱基序列或与其互补的碱基序列的多核苷酸、或具有与它们实质相同的可以识别功能性丝状真菌短矮鬼伞的碱基序列的多核苷酸。
全文摘要
本发明提供一种功能性丝状真菌检测方法，其采用选自具有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的碱基序列的多核苷酸和具有与其互补的碱基序列的多核苷酸和具有与它们实质相同的碱基序列的多核苷酸中的至少1个多核苷酸，检测试样中的功能性丝状真菌短矮鬼伞(Coprinus curtus)，还提供了一种含有功能性丝状真菌制品的评价方法，其评价含有功能性丝状真菌制品中的功能性丝状真菌短矮鬼伞的存在或浓度。
文档编号C12Q1/68GK102203247SQ200980132700
公开日2011年9月28日 申请日期2009年8月20日 优先权日2008年8月22日
发明者中崎清彦 申请人:国立大学法人静冈大学