专利名称：用于检测hpv的核苷酸序列、方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测人乳头瘤病毒(HPV)的核苷酸序列、方法和试剂盒，特别是使用相对较少数量的核苷酸序列作为探针来检测多种HPV亚型的那些。
背景技术：
子宫颈癌为女性中最常见的癌症之一。据估计，2002年世界范围内的死亡率为 273，500，并且在2004年增加到320，000。据估计，其中83%的患者在发展中国家，在妇女中占癌症的15-24%，远远高于发达国家的3至7%。已经发现子宫颈癌与人乳头瘤病毒(HPV) 感染密切相关，其可导致在癌症发展过程中的癌前期阶段子宫颈上皮内瘤形成(CIN)。因此，检测HPV在预防和治疗子宫颈癌中起到了极为重要的作用。采用核苷酸序列检测人体中HPV的方法可分为两组。第一组在检测人类样品中的HPV的存在时对HPV亚型进行鉴别，例子包括罗氏 AMPLICOR HPV测试(AMPLIC0R HPV Test)和线性阵列 HPV 基因分型测试(LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test)； Innogentics INNO-LiPA HPV基因分型(额外)法(INN0-LiPA HPV Genotyping Extra)； 亚能生物科技(深圳)有限公司的CN200410037617. 7和深圳市隆阳生物科技有限公司的 CN200610061044. 0。该组方法一般需要针对每一种待检测HPV亚型分别提供一种核苷酸探针，并且需要这些探针必须处于不同的位置(即，如上述例子中所用的那样，在阵列形式上单独的点或线中或在ELISA形式96孔板(宝灵曼公司(Boehringer,Mannheim))的不同孔中)以及替代阵列的其他方法，因此，其开发更复杂且普遍更昂贵。最重要的是，目前已经分离了多于200种HPV亚型且预期会有更多新亚型，因此所有现存的基因分型试剂盒都不能检测除目前已制造的各HPV检测试剂盒具体说明的那些20-37种亚型以外的HPV病毒， 从而因为对于每个和每种待测亚型都需要特定探针，而不能对HPV病毒的存在与否进行明确检测。尽管可以在基因分型形式上增加更多类型，但是由于很难从临床样品中获得罕见类型，从而有关监管机构要求的审批过程(特别是对于罕见类型)使得这种方式即使可能也会是困难的。因此覆盖所有HPV亚型的用于明确分型的基因分型方法不仅难以开发且造价昂贵，而且也不太可行。第二组仅检测HPV的存在而不能鉴别HPV亚型，其中帝吉耐杂交捕获 II (Digene Hybrid Capture II) (HCII)为本发明人已知的目前唯一市售产品。HCII进一步再细分为高风险和低风险型，其中在临床样品中直接使用液相杂交来检测HPV的DNA并使用化学发光信号放大技术取代扩增靶病毒DNA。因此大体而言，目标浓度相对较低时信噪比低，从而检测灵敏度相比于基于PCR的试验低很多。另外，除了使用RNA探针可能导致试剂盒的低稳定性以及污染的可能性(HCII依赖于样品的细胞含量，使得偶尔出现假阳性和假阴性结果，即，接近其检测限浓度时报道的假阳性/阴性率更高)以外，HCII也很昂贵。进一步而言，对于HCII，采用特异的RNA探针来捕获待测的靶亚型DNA，从而与上述第一组(基因分型试验)所述的那些类似，HCII也面对开发限制，除了其是在液体混合物中完成的而不需基因分型。另外，HCII只能检测18种HPV亚型(HCII高风险型13种，HCII低风险型5种)，这远低于最常见的人类38种HPV亚型。150多种罕见HPV亚型中的一部分已被证实为癌症诱导高风险，因此对这些亚型的检测能力对于诊断和预防子宫颈癌也是非常重要的。基于上述情况，需要探索和开发一种简单并且/或者低成本的用于检测各种HPV 亚型感染的方法。发明目的因此本发明的一个目的在于解决现有技术中的至少一个或更多的难题。特别地， 本发明的一个目的在于以低成本提供用于检测样品中常见HPV亚型的核苷酸序列以及相关方法和试剂盒。最少，本发明的一个目的在于为公众提供有用的选择。
发明内容
因此，本发明提供了一种分离的核酸分子，其选自由下列序列组成的组(a)选自由SEQ ID NOs. 1-24和32组成的组中的序列；以及(b)与(a)中任一所述核酸分子完全互补的序列。本发明的另一个方面在于提供一种HPV检测试剂盒，包括a)用于检测HPV的至少一种HPV探针，每种HPV探针为选自由下列序列组成的组中的分离的核酸分子(a)选自由SEQ ID NOs. 1_24组成的组中的序列；以及(b)与(a)中任一所述核酸分子完全互补的序列；b)用于通过聚合酶链反应扩增样品DNA中的HPV的引物；以及c)用于标记扩增的并杂交于所述DNA芯片的DNA的标记物。本发明的另一个方面在于提供一种用于检测至少2种HPV亚型的DNA芯片，其包括至少一种HPV探针，每种HPV探针为选自由下列序列组成的组中的分离的核酸分子(a) 选自由SEQ ID NOs. 1-24组成的组中的序列；以及(b)与(a)中任一所述核酸分子完全互补的序列。本发明的另一个方面在于提供一种在样品中检测至少2种HPV亚型存在的方法。 首先，通过聚合酶链反应扩增存在于样品中的HPV的DNA。然后用至少一种HPV探针检测 HPV，每种HPV探针为选自由下列序列组成的组中的分离的核酸分子(a)选自由SEQ ID NOs. 1-24组成的组中的序列；以及(b)与(a)中任一所述核酸分子完全互补的序列。本发明也提供了一种HPV检测试剂盒，包括a)用于检测至少36种HPV亚型的至少两种HPV探针，所述的至少两种HPV探针中的每种分别为分离的核酸分子；b)用于通过聚合酶链反应扩增样品DNA中的HPV的引物；以及c)用于标记扩增的并杂交于所述DNA芯片的DNA的标记物。本发明的另一个方面在于提供一种用于检测至少36种HPV亚型的DNA芯片，包括至少两种HPV探针，所述的HPV探针中的每种分别为分离的核酸分子。本发明的另一个方面在于提供一种用于检测至少36种HPV亚型的存在的方法，包括以下步骤 ·通过聚合酶链反应扩增存在于样品中的HPV的DNA ； ·用至少两种HPV探针检测所述的至少36种HPV亚型，所述的4种HPV探针中的每种分别为分离的核酸分子。
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在本发明的上述任意一个方面，优选的是，所述HPV检测试剂盒和/或DNA芯片由用于检测36种HPV亚型的4种HPV探针组成。更优选地，所述4种HPV探针分别具有SEQ ID NOs. 1-4 或 SEQ IDNOs. 21-24 所示的序列。在本发明的上述任意一个方面，优选地，分离的核酸分子为DNA。
现在将通过实例并结合附图对本发明的优选实施方式进行说明，其中图1示出了通过本发明的示例性核苷酸序列检测各种HPV亚型的图示。
具体实施例方式现通过实例并结合附图在以下段落中对本发明进行描述。本发明的目的、特征和方面通过以下描述而公开或显而易见。本领域普通技术人员应该理解，本文中的讨论仅为对示例性实施方式的描述，并非为限制体现在示例性解释中的本发明更广泛的方面。本发明的发明人制备了用于多种HPV亚型的探针，其核苷酸序列与HPV的DNA互补，从而相对少量的探针可以检测大部分常见HPV亚型。在一个具体实施方式
中，可通过本发明的2至4种HPV探针的各种组合检出至少36种最常见的HPV亚型。本发明的探针含有SEQ ID NOs. 1-24所示核苷酸序列(表1)。
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其选自由下列序列组成的组(a)选自由SEQ ID NOs. 1_24和 32组成的组中的序列；以及(b)与(a)中任一所述核酸分子完全互补的序列。
2.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述序列选自由SEQIDNOs. 1_4组成的组。
3.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述序列选自由SEQIDNOs. 21-24组成的组。
4.权利要求1-3中任一项所述的分离的核酸分子，其为DNA。
5.一种HPV检测试剂盒，其包含 至少一种HPV探针，用于检测HPV，每种HPV探针为选自由下列序列组成的组中的分离的核酸分子(a)选自由SEQ ID NOs. 1_24组成的组中的序列；以及(b)与(a)中任一所述核酸分子完全互补的序列； 引物，用于通过聚合酶链反应扩增样品DNA中的HPV ；以及 标记物，用于标记扩增的并杂交于所述DNA芯片的DNA。
6.权利要求5所述的HPV检测试剂盒，其由用于检测38种HPV亚型的四种HPV探针组成。
7.权利要求6所述的HPV检测试剂盒，其中所述四种HPV探针分别具有SEQID NOs. 1-4所示的序列。
8.权利要求6所述的HPV检测试剂盒，其中所述四种HPV探针分别具有SEQID NOs. 21-24所示的序列。
9.权利要求5-8中任一项所述的HPV检测试剂盒，其中所述分离的核酸分子为DNA。
10.一种用于检测至少2种HPV亚型的DNA芯片，其包含至少一种HPV探针，每种HPV 探针为其选自由下列序列组成的组中的分离的核酸分子(a)选自由SEQ ID NOs. 1-24组成的组中的序列；以及(b)与(a)中任一所述核酸分子完全互补的序列。
11.权利要求10所述的DNA芯片，其中所述DNA芯片由用于检测38种HPV亚型的四种 HPV探针组成。
12.权利要求11所述的DNA芯片，其中所述四种HPV探针分别具有SEQID NOs. 1_4所示的序列。
13.权利要求11所述的DNA芯片，其中所述四种HPV探针分别具有SEQID NOs. 21-24 所示的序列。
14.权利要求10-13中任一项所述的DNA芯片，其中所述分离的核酸分子为DNA。
15.一种在样品中检测至少2种HPV亚型的存在的方法，包括以下步骤 通过聚合酶链反应扩增存在于所述样品中的HPV的DNA ； 用至少一种HPV探针检测HPV，每种HPV探针为选自由下列序列组成的组中的分离的核酸分子(a)选自由SEQ ID NOs. 1_24组成的组中的序列；以及(b)与(a)中任一所述核酸分子完全互补的序列。
16.权利要求15所述的方法，其中通过四种HPV探针检测38种HPV亚型。
17.权利要求16所述的方法，其中所述四种HPV探针分别具有SEQID NOs. 1_4所示的序列。
18.权利要求16所述的方法，其中所述四种HPV探针分别具有SEQID NOs. 21-24所示的序列。
19.权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述分离的核酸分子为DNA。
20.一种HPV检测试剂盒，其包含 至少两种HPV探针，用于检测至少36种HPV亚型，所述的至少两种HPV探针中的每种分别为分离的核酸分子； 引物，用于通过聚合酶链反应扩增样品DNA中的HPV ；以及 标记物，用于标记扩增的并杂交于所述DNA芯片的DNA。
21.一种用于检测至少36种HPV亚型的DNA芯片，其包含至少两种HPV探针，所述的至少两种HPV探针中的每种分别为分离的核酸分子。
22.一种用于检测至少36种HPV型的存在的方法，包括以下步骤 通过聚合酶链反应扩增存在于样品中的HPV的DNA ； 用至少两种HPV探针检测所述的至少36种HPV亚型，所述的四种HPV探针中的每种分别分离的核酸分子。
全文摘要
本发明提供了用于人类乳头瘤病毒(HPV)检测探针的各种序列，其中每种序列都能检测HPV的多种亚型。本发明也提供了含有所述探针的HPV检测芯片、检测试剂盒和使用所述探针的HPV检测方法。可通过本发明的序列检测38种常见的HPV亚型，包括可通过本发明的序列的各种组合检测高风险的HPV亚型。
文档编号C12Q1/70GK102209793SQ200980144854
公开日2011年10月5日 申请日期2009年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者周国辉, 谭荣安, 陈卓宇 申请人:达雅高生物科技有限公司