专利名称：包含枯草蛋白酶变体的组合物和方法
技术领域：
本发明提供非常适于清洁应用的枯草蛋白酶变体。具体而言，本发明提供芽孢杆菌属物种(Bacillus)枯草蛋白酶变体和包含此变体的清洁组合物。
背景技术：
通常，传统的家用和工业餐具洗涤组合物依赖于高碱性洗涤剂洗涤和氯漂白的组合来清洁和消毒餐具。这类系统对于可漂白的污渍一般有很好的作用。然而，家庭、医院、 自助餐厅和餐饮行业中的餐具上经常存在的含蛋白质的污物的去除是有问题的。此外，认为碱性非常高且含氯的组合物不适合消费者和环境友好的。已进行了多种尝试来产生有效去除蛋白性污物的餐具洗涤组合物。这些组合物通常包括在碱性条件(如，PH为至少9. 5)下有活性的蛋白酶。然而，此类组合物具有明显的缺点，就是它们难以配制成对于餐具洗涤剂而言消费者通常优选的液体或凝胶形式。此外， 碱性餐具洗涤组合物还经常被视为是刺激物。还进行了一些尝试来产生低pH(如，pH低于9. 5)餐具洗涤组合物。这些组合物更安全、更环境友好并且能够配制成凝胶和液体形式。然而，已证明目前的低PH餐具洗涤组合物在去除蛋白性污物上是非常低效的，即便餐具洗涤组合物中配制了高浓度的酶(如蛋白酶)。因此，本领域存在对有效去除餐具的蛋白性污物的餐具洗涤组合物的需求。此外， 存在对更加环境友好和更加消费者友好且处于容易使用和成本划算的形式的餐具洗涤组合物的需求。相似地，存在对有效去除织物的蛋白性污物的织物清洁组合物的需求。发明概述本发明提供特别适合用于清洁组合物的芽孢杆菌属物种的枯草蛋白酶变体。此外，本发明提供包含此枯草蛋白酶变体的清洁组合物。本发明提供包含SEQ ID NO :5所列的氨基酸序列的枯草蛋白酶变体。在一些优选的实施方式中，本发明提供包含具有SEQ ID NO :5所列的氨基酸序列的枯草蛋白酶变体的组合物。在一些特别优选的实施方式中，所述组合物是清洁组合物。在一些优选的替代实施方式中，所述清洁组合物是衣物洗涤剂，而在一些其他优选的实施方式中，所述清洁组合物是餐具洗涤剂。在一些实施方式中，所述餐具洗涤剂是自动机洗餐具洗涤剂，而在其他实施方式中，它们是手洗餐具洗涤剂。在一些优选的实施方式中，所述清洁组合物是液体洗涤剂，而在一些其他实施方式中，所述清洁组合物是凝胶、片剂、粉末或粒状洗涤剂。在一些实施方式中，所述清洁组合物不包含磷酸盐，而在一些其他实施方式中，所述清洁组合物含有磷酸盐。在一些优选的实施方式中，所述清洁组合物还包含至少一种漂白剂。在一些又进一步优选的实施方式中，所述清洁组合物还包含至少一种其它的酶。在一些实施方式中，所述其它的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过氧水解酶(perhydrolases)、角质酶(cutinases)、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、 鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、和淀粉酶，或其混合物。本发明还提供清洁的方法，所述方法包括提供待清洁的物品和包含SEQ ID NO 5 所列的枯草蛋白酶变体的组合物，将所述物品与所述组合物接触。在一些进一步的实施方式中，所述方法还包括漂洗所述待清洁的物品的步骤。在一些另外的实施方式中，所述物品是餐具或织物物品。发明详述本发明提供非常适于清洁应用的枯草蛋白酶变体。具体而言，本发明提供芽孢杆菌属物种的枯草蛋白酶变体和包含此变体的清洁组合物。本发明还提供了与现在所使用的枯草蛋白酶相比具有可比性或更好洗涤性能的酶组合物。除非另外指明，本发明的实施包括全部属于本领域技术的普遍用于分子生物学、 微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质和DNA测序、重组DNA领域以及工业酶应用和开发的常规技术。此外，此处提供的标题不是本发明的各个实施方式或方面的限制，本发明的各个实施方式或方面可以通过整体参考说明书而获得。因此，通过参考整个说明书而更加完全地描述下面定义的术语。无论如何，为了便于理解本发明，下面提供了一些术语的定义。除非另外定义，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。虽然与此处描述的方法和材料相似或相同的任何方法和材料都可以用于本发明的实施，本文中还是描述了优选的方法和材料。因此，通过整体参考本说明书而更加完全地描述下面定义的术语。并且，此处使用的单数“一个”和“所述”包括其复数指代，除非上下文另外清楚指明。除非另外指明，核酸以5'至3'的方向从左向右书写，氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。应理解本发明不限于所描述的特定方法学、实验方案和试剂，因为本领域技术人员可以根据使用它们的背景而对其进行改变。贯穿此说明书给出的每个最大数值限制应包括每个较低数值限制，如同此类较低数值限制明确写入本文。贯穿此说明书给出的每个最低数值限制将包括每个较高数值限制，如同此类较高数值限制明确写入本文。贯穿此说明书给出的每个数值范围将包括落入此类较宽数值范围的每个较窄数值范围，如同此类较窄数值范围全部明确写入本文。此处使用的术语“相容的”意指清洁组合物材料降低本文提供的蛋白酶的酶活性的程度不至于使该蛋白酶的效力达不到正常使用情形下所期望的。下文详细示例了具体的清洁组合物材料。此处使用的“有效量的酶”指实现具体应用中需要的酶活性必需的酶量。此类有效量是本领域普通技术人员容易确定的，并且基于许多因素，诸如使用的特定酶变体、清洁应用、清洁组合物的具体组成和是需要液体组合物还是干燥(如粒状)组合物，以及类似因素。用于“变体蛋白酶”时，此处使用的“具有改善的性质”指蛋白酶变体相对于相应的野生型蛋白酶具有改善的性能，和/或在保留性能的同时具有改善的稳定性。在一些特别优选的实施方式中，所述改善的性质选自由以下组成的组改善的餐具洗涤性能和/或洗衣性能、和改善的稳定性、以及改善的餐具洗涤性能和/或洗衣性能和改善的稳定性的组合。此处使用的短语“洗涤剂稳定性”指洗涤剂组合物的稳定性。在一些实施方式中， 该稳定性是在使用洗涤剂过程中评估的，而在其他实施方式中，该术语指洗涤剂组合物在储存过程中的稳定性。术语“改善的稳定性”用于指组合物中的变体蛋白酶在储存过程中更好的稳定性和/或在肥皂水(sud)中更好的稳定性。在优选的实施方式中，变体蛋白酶表现出储存过程中在餐具洗涤剂和/或衣物洗涤剂中改善的稳定性和/或在肥皂水中改善的稳定性，这包括相对于相应的野生型针对氧化剂、螯合剂、自体分解、表面活性剂和高碱性的稳定性。此处使用的短语“蛋白水解稳定性”指蛋白质(如酶)耐受蛋白水解的能力。不应将该术语限于使用任何特定的蛋白酶来评估蛋白质的稳定性。此处使用的“氧化稳定性”指蛋白质在氧化条件下起作用的能力。具体而言，该术语指蛋白质在各种浓度的H2O2、过酸和其他氧化剂存在下起作用的能力。各种氧化条件下的稳定性可通过本领域技术人员已知的标准方法和/或通过本文描述的方法测量。氧化稳定性的实质性改变显示为相比于无氧化化合物时存在的酶活性，酶活性的半衰期至少约5% 或更大的增加或降低(在大多数实施方式中，优选所述改变为增加)。此处使用的“pH稳定性”指蛋白质在特定PH下起作用的能力。一般而言，大多数酶具有起作用的有限PH范围。除了在中间范围pH(pH7左右)起作用的酶之外，还存在能够在具有非常高或非常低的PH的条件下工作的酶。各种pH下的稳定性可通过本领域技术人员已知的标准方法和/或通过本文描述的方法来测量。PH稳定性的实质性改变显示为相比于最适PH下酶的酶活性，酶活性的半衰期至少约5%或更大的增加或降低(在大多数实施方式中，优选所述改变为增加)。然而，本发明不应限制于任何PH稳定性水平和pH范围。此处使用的“热稳定性”和“耐热性”指蛋白质在特定温度下起作用的能力。一般而言，大多数酶具有起作用的有限温度范围。除了在温和温度范围(如室温)下工作的酶之外，还存在能够在非常高或非常低温度下工作的酶。热稳定性可通过已知的方法或通过本文描述的方法来测量。热稳定性的实质性改变显示为在暴露于给定温度时变体催化活性的半衰期至少约5%或更大的增加或降低(在大多数实施方式中，优选所述改变为增加)。 然而，本发明不应限制于任何温度稳定性水平和温度范围。此处使用的术语“化学稳定性”指蛋白质(如酶)针对可不利地影响其活性的化学品的稳定性。在一些实施方式中，此类化学品包括但不限于过氧化氢、过酸、阴离子去污剂、阳离子去污剂、非离子去污剂、螯合剂等。然而，本发明不应限制于任何特定化学稳定性水平和化学稳定性范围。此处使用的术语“纯化的”和“分离的”指从样品中去除污染物。例如，通过去除溶液或制品内不是目的酶的污染性蛋白质和其他化合物来纯化目的酶。在一些实施方式中， 重组的目的酶表达于细菌或真菌宿主细胞，并且通过去除其他宿主细胞成分来纯化这些重组的目的酶；从而增加样品中重组的目的酶多肽的百分比。
此处使用的“目的蛋白质”指所分析、鉴别和/或修饰的蛋白质(如酶或“目的酶”)。自然存在的、以及重组的(如“突变体”或“变体”)蛋白质用于本发明。此处使用的“蛋白质”指由氨基酸构成并被本领域技术人员识别为蛋白质的任何组合物。术语“蛋白质”、“肽”和多肽在本文可互换使用。当肽是蛋白质的一部分时，本领域技术人员理解该术语在上下文中的使用。此处使用的“表达载体”指含有有效地连接至合适控制序列的DNA序列的DNA构建体，所述控制序列能够实现DNA在适宜的宿主中的表达。此类控制序列包括实现转录的启动子、任选的控制此类转录的操纵子序列、编码适宜的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或简单的潜在基因组插入序列。 转化进入适宜的宿主后，载体可独立于宿主基因组而复制和起作用，或在一些情况下，载体可整合到基因组本身。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”和“载体”经常互换使用，因为质粒是目前最常使用的载体形式。然而，本发明应包括起等同功能并且本领域已知或将知晓的那些其他形式的表达载体。在一些优选的实施方式中，将蛋白酶基因连接到适合的表达质粒。然后使用克隆的蛋白酶基因转化或转染宿主细胞以表达该蛋白酶基因。在此质粒含有质粒复制必需的公知元件情况下，其可在宿主中复制，或可将质粒设计为整合到宿主染色体。提供有效的基因表达的必需元件(如，有效地连接至目的基因的启动子)。在一些实施方式中，这些必需元件作为可被识别(即，被宿主转录)的基因自身的同源启动子，和外源的或由蛋白酶基因的内源终止子区提供的转录终止子而提供。在一些实施方式中，还包括选择基因，诸如通过在含抗微生物剂的培养基中生长而使得含质粒的宿主细胞得以连续培养维持的抗生素抗性基因。下面的盒式诱变方法可用于促进本发明的蛋白酶变体的构建，但也可使用其他方法。首先，如本文所述，获得编码蛋白酶的自然存在的基因，全部或部分测序。然后，扫描序列以获得期望对编码的蛋白酶的一个或多个氨基酸进行突变(如，通过缺失、插入或取代) 的点。评估此点侧翼的序列中限制位点的存在，以将该基因的小区段替换为在表达时将编码不同的突变体的寡核苷酸库。此类限制位点优选为该蛋白质基因内的独特位点，以促进基因区段的替换。然而，可使用在蛋白酶基因中不过度丰富的任何方便的限制位点，只要限制酶切消化产生的基因片段可重组装成适当的序列。如果所选点的方便距离(约10个至约15个核苷酸)内不存在限制位点，则通过以不改变最终构建中的阅读框和所编码的氨基酸的方式取代该基因中的核苷酸来产生此类位点。改变基因的序列以使其符合期望的序列的突变通过用众所周知的方法进行引物延伸完成。遗传密码的冗余性、基因的限制酶图谱和大量不同的限制酶使得定位适宜的侧翼区和评估得到两个方便的限制位点序列所需的改变这一任务是常规的。注意，如果可获得一个方便的侧翼限制位点，则上述方法只需用于不含位点的侧翼区。克隆自然存在的DNA和/或合成的DNA之后，用关联限制酶消化待诱变位置侧翼的限制位点，并将多个末端互补的寡核苷酸盒连接到基因中。通过此方法简化了诱变，因为可以合成所有寡核苷酸以具有相同的限制位点，而不必用合成的连接物来创建限制位点。此处使用的“对应于”指蛋白质或肽中列举的位置处的残基或类似、同源、或等同于蛋白质或肽中列举的位置处的残基的残基。此处使用的“对应区域”一般指沿相关蛋白质或参考蛋白质的类似位置。术语“编码...的核酸分子”、“编码...的核酸序列”、“编码...的DNA序列”、和
“编码...的DNA ”指沿脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定沿多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此DNA序列编码氨基酸序列。此处使用的“野生型”和“天然”蛋白质是自然界中发现的那些蛋白质。术语“野生型序列”和“野生型基因”在本文可互换使用，指天然的序列或宿主细胞中自然存在的序列。在一些实施方式中，野生型序列指作为蛋白质工程计划的起点的目的序列。编码自然存在的蛋白质的基因可根据本领域技术人员已知的一般方法获得。这些方法一般包括合成标记的探针，该探针具有编码目的蛋白质的区域的推断序列，制备表达所述蛋白质的生物体的基因组文库，和通过与探针杂交从文库中筛选目的基因。然后作图和测序阳性杂交克隆。此处使用的术语“重组的DNA分子”指由借助分子生物学技术连接在一起的DNA区段构成的DNA分子。术语“重组的寡核苷酸”指使用分子生物学操作产生的寡核苷酸，所述操作包括但不限于连接通过限制酶切消化多核苷酸序列产生的两个或更多个寡核苷酸序列、合成寡核苷酸(如，合成引物或寡核苷酸)和类似操作。此处使用的“等同的残基”指蛋白质共有特定的氨基酸残基。例如，等同的残基可通过在蛋白质(如蛋白酶)的三级结构水平确定同源性而鉴定，该蛋白质的三级结构已通过X-射线晶体学确定。等同的残基定义为具有推定等同残基的蛋白质和目的蛋白质的特定氨基酸残基的主链原子之两个或更多个原子的原子坐标在排比后在约0. 13nm并且优选约0. Inm内。在定向和定位最佳模型以产生分析蛋白质的非氢蛋白质原子的原子坐标的最大重叠后，即实现了对齐。优选的模型是针对在可获得的最高分辨率的实验衍射数据产生最低的R因子的晶体学模型，使用晶体学和蛋白质表征/分析领域技术人员已知的方法确定。此处使用的术语“调节元件”指控制核酸序列表达的某些方面的基因元件。例如， 启动子是促进有效地连接的编码区的转录起始的调节元件。其他的调节元件包括剪接信号、多聚腺苷酸化信号和终止信号。此处使用的“宿主细胞”一般是用载体转化或转染的原核宿主或真核宿主，所述载体使用本领域已知的重组DNA技术构建。转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或表达期望的蛋白质变体。在载体编码蛋白质变体的前形式或前原形式的情形中，此类变体在表达时通常从宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。术语“引入的”在将核酸序列插入到细胞上下文中意指转化、转导或转染。转化的手段包括但不限于任何本领域已知的合适方法，诸如原生质体转化、氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA和类似方法，如本领域已知的。(参见如，Chang和Cohen，Mol Gen Genet, 168 :111-115,1979 ；Smith 等人，Appl Env Microbiol, 51 :634,1986 ；禾口 Ferrari 等人，于 Harwood, Bacillus. Plenum Publishing Corporation,% 57-72 页，1989)。术语“启动子/增强子”表示含有能够提供启动子和增强子两种功能的序列的DNA 区段。启动子/增强子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。内源的启动子/增强子是与基因组中给定的基因天然相连的启动子/增强子。外源的(异源的)启动子/增强子是通过遗传操作(即分子生物学技术)将其置于与基因并列的启动子/增强子。
表达载体上“剪接信号”的存在经常造成重组转录物的更高水平的表达。剪接信号介导内含子从初级RNA转录物的去除，并由剪接供体和受体位点组成(参见如Sambrook 等人，Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆试验室手册)，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,第 16. 7-16. 8 页，1989)。术语“稳定转染”或“稳定转染的”指外来DNA引入并整合到转染细胞的基因组。 术语“稳定转染子”指已将外来或外源DNA稳定整合到转染细胞的基因组DNA的细胞。此处使用的术语“选择性标记”或“选择性基因产物”指编码酶活性的基因的使用， 该酶活性赋予表达选择性标记的细胞对抗生素或药物的抗性。此处使用的术语“扩增”和“基因扩增”是指使特定的DNA序列不成比例地复制的方法，从而该扩增的基因以比原来在基因组存在的数量更高的拷贝数存在。在一些实施方式中，在药物(例如可抑制酶的抑制剂)存在下通过生长对细胞的选择导致该药物存在时编码生长所需的基因产物的内源性基因的扩增，或者编码该基因产物的外源性(例如输入的)序列的扩增，或者两者兼备。在药物(例如可抑制酶的抑制剂)存在下通过生长对细胞的选择可导致该药物存在时编码生长所需的基因产物的内源性基因的扩增，或者通过编码该基因产物的外源性(例如输入的)序列的扩增来选择，或者两者兼备。“扩增”是指涉及模板特异性的核酸复制的特定情况。它与非特异性模板复制(即模板依赖的但是不依赖于特殊模板的复制)相反。此处的模板特异性不同于复制(即适宜的多核苷酸序列的合成)的保真度和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性。模板特异性经常以“靶”特异性来描述。靶序列是要与其他核酸区分意义上的“靶”。扩增技术已经首先设计用来这种区分。此处使用的术语“可扩增的标记”、“可扩增的基因”和“扩增载体，，指允许在适合的生长条件下扩增基因的标记、基因或编码该基因的载体。此处使用的术语“可扩增的核酸”指可通过任何扩增方法扩增的核酸。可预期的是“可扩增的核酸”将通常包括“样品模板”。此处使用的术语“样品模板”指来源于分析“靶”(在下文定义)存在的样品的核酸。相反，“背景模板”用于指样品模板之外的、可能存在或不存在于样品的核酸。背景模板最经常是无意的。它可能是携带造成的，或它可能是由于存在要从样品中纯化出去的核酸污染物。例如，待检测的核酸之外的生物体核酸可作为背景存在于测试样品中。此处使用的术语“引物”是指寡核苷酸，其或者是在纯化的限制酶切消化中天然产生的或者是合成制备的，其在诱导合成了与核酸链互补的引物延伸产物的情况下(即核苷酸和诸如DNA聚合酶等诱导剂存在下，而且在适宜的温度和PH下)能够作为合成的起始点发挥作用。为了最大扩增效率，该引物优选是单链的，但也可以是双链的。如果是双链的， 在用于制备延伸产物之前先处理引物以分离其链。优选该引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在诱导剂的存在下引导延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素， 包括温度、引物来源和方法的使用。此处使用的术语“探针”是指寡核苷酸(即核苷酸的序列)，或者是作为纯化的限制酶切消化产物天然发生的，或者是合成、重组或PCR扩增制备的，其能够与另一个目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针用于特定基因序列的检测、鉴别和分离。设想用于本发明的任何探针都用任何“报告分子”标记，从而使其可在任何检测系统中检测到，这种标记包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的组织化学检测)、荧光、放射性和发光系统。这并不意味着本发明限于任何具体的检测系统或标记。此处使用的术语“靶”当涉及扩增方法(如聚合酶链式反应)使用时，是指被用于聚合酶链式反应的引物所结合的核酸区域。所以，“靶”是要与其他核酸序列区分的。“区段”定义为在靶序列范围内的核酸的区域。此处使用的术语“聚合酶链式反应和PCR是指美国专利第4，683，195号、第 4，683，202号和第4，965，188号中的方法，其中包括不经克隆或纯化在基因组DNA的混合物中提高靶序列的区段浓度的方法。这些方法是本领域技术人员公知。此处使用的术语“扩增试剂”指除引物、核酸模板和扩增酶之外的那些扩增所需试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸、缓冲液等)。通常，扩增试剂与其他反应成分一起放入并包含于反应容器(试管、微孔等)中。此处使用的术语“限制性核酸内切酶”和“限制酶”是指细菌的酶，其在特异性核苷酸序列处或附近切割双链DNA。此处使用的术语“清洁组合物”指用于清洁应用的任何组合物。该术语意图涵盖 (除非另外指明)粒状或粉末状的通用的或强效洗涤剂(如衣物洗涤剂)，液体、凝胶、或糊状的通用洗涤剂(如“强效液体”洗涤剂)，液体和粉末状精细织物洗涤剂，手洗餐具洗涤剂，轻效型餐具洗涤剂(如高泡沫洗涤剂)，机器餐具洗涤剂(即“自动机洗餐具洗涤剂”)， 包括家用和公共机构用的片剂、粒状、液体洗涤剂、助漂洗洗涤剂，液体清洁和消毒剂(如抗细菌手洗皂)、洗衣棒、漱口剂、假牙清洁剂、汽车香波、地毯香波、浴室清洁剂、人和其他动物用洗发香波、人和其他动物用护发素、淋浴凝胶、沐浴凝胶、泡沫浴和金属清洁剂，以及清洁助剂(如漂白添加剂、洗衣添加剂、预处理组合物，包括“去污棒(stain-stick)”或其他预处理形式)。此处使用的术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配方”指要在清洁弄脏的物品的洗涤介质中使用的混合物。在优选的实施方式中，该术语指用于清洁衣物、盘碟、刀具等的洗涤剂(如“餐具洗涤剂”)。这并不意味着本发明限于任何特定类型的洗涤剂配方或组合物。实际上，除了含有至少一种本发明的蛋白酶的洗涤剂之外，该术语涵盖了包含表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活性剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、 掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂的洗涤剂。此处使用的“餐具洗涤组合物”指用于清洁餐具包括刀具的组合物的所有形式，包括但不限于粉末、片剂、凝胶、粒状和液体形式。这并不意味着本发明限于任何特定类型的餐具组合物。实际上，本发明可用于清洁任何材料的餐具(如盘碟，包括但不限于碟、杯、玻璃杯、碗等)和刀具(如用具，包括但不限于勺、刀、叉、服务用具等)，所述材料包括但不限于陶、塑料、金属、瓷、玻璃、丙烯酸酯等。术语“餐具”在本文用于指盘碟和刀具。术语“相关洗涤条件”在本文用于指在餐具或织物洗涤剂市场细分中家庭中实际使用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤手法、肥皂水浓度、洗涤剂类型和水硬度。术语“改善的洗涤性能”用于指相对于相应的野生型酶在相关洗涤条件下获得餐具、刀具或织物污渍去除的更好的最终结果，或指达到相同的最终结果需要按重量计更少的突变体蛋白酶。术语“保留的洗涤性能”用于指在相关洗涤条件下按重量计的突变体蛋白酶的洗涤性能是相对于相应的野生型蛋白酶的至少约80%。蛋白酶的洗涤性能通过在适合的测试条件测量它们去除某些代表性污渍的能力来方便地测量。在这些测试系统中，可控制其他相关因素，诸如洗涤剂组成、肥皂水浓度、水硬度、洗涤手法、时间、PH、和/或温度，以模仿在某一市场细分中(如餐具洗涤、织物清洁等)用于家庭应用的典型条件。当用于通过DNA诱变的蛋白水解酶修饰时，本文描述的实验室应用测试系统是家庭应用代表性的。因此，本文提供的方法方便测试大量不同的酶和选择那些特别适合于具体洗涤剂应用类型的酶。这样易于选择为具体应用条件“量身定制的”酶。术语“清洁活性”是指在蛋白水解、水解、清洁或本发明的其他过程中的通行条件下，用该蛋白酶达到的清洁性能。在一些实施方式中，清洁性能通过利用针对酶敏感的污渍例如草、血液、奶或卵蛋白的多种清洁检测来测定，如在将这些污渍进行标准洗涤之后用各种层析、分光光度测量或其他定量方法测定这些污渍。示例性检测包括但不限于，WO 99/34011和美国专利第6，605，458号(其通过引入本申请作为参考)，以及实施例中包括的那些方法中记载的那些检测。术语蛋白酶的“清洁有效量”是指在具体清洁组合物中达到所需酶活性水平的前述蛋白酶的量。这种有效量容易由本领域普通技术人员确定，并且基于许多因素，例如所使用的特殊蛋白酶、清洁用途、清洁组合物的具体组成、和需要液体、凝胶还是干的(例如粒状、棒状)组合物等。此处使用的术语“清洁添加剂材料”是指为具体类型的所需清洁组合物和产品形式(例如液体、粒状、粉末、棒状、糊状、喷雾、片剂、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选与组合物中使用的蛋白酶相容。在一些实施方式中，粒状组合物是“紧密的”形式，而在其他实施方式中，液体组合物是“浓缩”形式。此处使用的“低洗涤剂浓度”系统包括洗涤水中存在低于约SOOppm洗涤剂组分的洗涤剂。日本洗涤剂通常视为低洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在大约 667ppm洗涤剂组分。此处使用的“中等洗涤剂浓度”系统包括洗涤水中存在约SOOppm至约2000ppm洗涤剂组分的洗涤剂。北美洗涤剂通常视为中等洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在大约975ppm洗涤剂组分。巴西洗涤剂通常在洗涤水中存在大约1500ppm洗涤剂组分。此处使用的“高洗涤剂浓度”系统包括洗涤水中存在大于约2000ppm洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲洗涤剂通常视为高洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在大约 3000-8000ppm洗涤剂组分。此处使用的“织物清洁组合物”、“衣物清洁组合物”和“衣物洗涤剂”指用于清洁有污物的衣物和/或织物的组合物。这意味着本发明涵盖任何形式，包括粉末、片剂、凝胶、 粒状和液体形式。这并不意味着本发明限于任何特定类型的衣物和/或织物。这些术语涵盖手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适合用于浸泡和/或预处理有污渍的织物(如布、亚麻布和其他纺织材料)的组合物。此处使用的“非织物清洁组合物”包括非纺织表面清洁组合物，包括但不限于餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、牙齿清洁组合物和个人清洁组合物。此处使用的术语“消毒”指去除表面的污染物，以及抑制或杀死物品表面的微生物。这并不意味着本发明限于任何特定表面、物品或待去除的污染物或微生物。此处使用的术语“枯草蛋白酶”指在MEROPS-The Peptidase Data base (MER0PS-肽酶数据库)(Rawlings 等人，MEROPS :the peptidase database (MER0PS 肽酶数据库)，Nucl Acids Res, 34Database issue, D270-272, 2006)中描述的 S8 丝氨酸蛋白酶家族的任何成员。产生本文提供的变体蛋白酶的合适宿主菌株包括其中可实现蛋白酶的表达的可转化微生物。具体而言，从中获得蛋白酶的相同物种或属的宿主菌株是适宜的，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，优选嗜碱性芽孢杆菌属菌株，且最优选Bacillus nov. spec. PB92或其突变体，该突变体具有大致相同的性质。另外，枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)菌株是优选的菌株。其他合适和优选的宿主菌株包括在用突变体基因转化之前基本不能产生胞外蛋白水解酶的那些菌株。特别感兴趣的是蛋白酶缺陷的芽孢杆菌属宿主菌株，诸如Bacillus nov. spec. PB92的蛋白酶缺陷衍生菌株。通过使用在选择的宿主生物体中有功能的表达信号获得蛋白酶的表达。表达信号包括调节蛋白酶基因转录和翻译的DNA序列。适当的载体能够以足够高的拷贝数在选择的宿主菌株中复制，或能够通过染色体整合实现蛋白酶基因在宿主菌株中的稳定维持。本发明的变体蛋白水解酶(即变体蛋白酶)通过以下制备在适合的发酵条件下培养包含期望的突变体蛋白水解基因的转化的宿主菌株，然后回收产生的酶。优选地，表达的蛋白酶被分泌到培养基中，这有利于蛋白酶的回收，或在革兰氏阴性细菌宿主菌株的情形中，被分泌到周质中。为了分泌要采用适宜的氨基末端信号序列，优选原始基因编码的信号序列，如果该序列在选择的宿主菌株中有功能的话。在一些实施方式中，将几种取代组合以增加枯草蛋白酶在洗涤剂组合物中的稳定性和/或性能。因此本发明提供以下蛋白酶变体，这些蛋白酶变体提供改善的洗涤性能(如具有 N76D+N87R+G118R+SU8L+PU9Q+S130A+S188D+N248R 的 PB92 变体；使用 BPN，编号； “PX3”).此变体在本文成为“枯草蛋白酶蛋白酶变体”、“突变体蛋白酶”、“变体蛋白酶”、“蛋白酶变体”、“芽孢杆菌属物种蛋白酶”、“芽孢杆菌属物种枯草蛋白酶变体，，和“突变体蛋白酶变体”。此变体的氨基酸序列如SEQ IDNO 5所列。因此，本发明提供此枯草蛋白酶变体，其适合用于洗涤剂组合物和/或洗涤方法。 应理解，与PB92参考枯草蛋白酶的氨基酸位置同源(并且根据与BPN’的比对编号)的位置将落入权利要求的范围。清洁组合物除非另外注明，本文提供的所有组分或组合物水平是指该组分或组合物的活性水平，并将杂质例如可商购的来源中可能存在的残留的溶剂或副产物排除在外。酶组分重量是基于总活性蛋白质。除非另外指明，所有百分比和比值是按重量计算。除非另外指明，所有百分比和比值是基于总组合物计算。在所示例的洗涤剂组合物中，酶水平通过按总组合物重量计的纯酶表示，并且除非另外说明，洗涤剂成分按总组合物的重量计来表示。如本文所示，在一些实施方式中，本发明的清洁组合物还包含添加剂材料，包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活性剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶增溶剂、光漂剂、荧光剂、织物柔顺剂、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗缩剂、 防皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、color speckles、银护理(silvercare)、防晦暗剂和/或防腐蚀剂、碱性源、加溶剂、载体、加工助剂、色素和PH控制剂(参见如美国专利第6，610，642号、 第 6，605，458 号、第 5，705，464 号、第 5，710，115 号、第 5，698，504 号、第 5，695，679 号、第 5，686，014号和第5，646，101号，所有这些专利都通过引用并入本申请作为参考)。下面详细举例说明具体清洁组合物材料的实施方式。在清洁添加剂材料与清洁组合物中本发明的变体蛋白酶不相容的实施方式中，使用了适当方法使清洁添加剂材料和蛋白酶保持分离 (即，不互相接触)，直至这两种组分适宜组合时。这种分离方法包含本领域已知的任何适宜方法(例如胶丸、包封、片剂、物理分离等)。本发明的丝氨酸蛋白酶变体可用于配制各种洗涤剂组合物。本发明的清洁组合物可有利地用于例如洗衣应用、硬表面清洁、自动机洗餐具洗涤应用、以及美容应用诸如假牙、牙齿、头发和皮肤。本发明的变体蛋白酶可用于粒状、粉末、凝胶和液体组合物。本发明的蛋白酶变体还可用于清洁添加剂产品。包括本发明的变体蛋白酶的清洁添加剂产品理想地适合于包含在需要另外的漂白效力的洗涤过程中。此类实例包括但不限于低温溶液清洁应用。最简单形式的添加剂产品可以是本发明提供的蛋白酶变体。在一些实施方式中，添加剂包装成剂型以添加到采用过氧(peroxygen)源并且需要增加的漂白效力的清洁过程中。在一些实施方式中，单一剂型包括丸剂、片剂、胶丸或其他单一剂量单位包括预测量的粉末和/或液体。在一些实施方式中，包括填料和/或载体材料以增加此类组合物的体积。适宜的填料或载体材料包括但不限于各种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐以及滑石、粘土和类似材料。在一些实施方式中，用于液体组合物的填料和/或载体材料包括水和 /或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。此类醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方式中，组合物包含约5%至约90%的此类材料。在其他的实施方式中，使用酸性填料以降低组合物的PH。在一些替代的实施方式中，清洁添加剂包括至少一种如下所述的活化过氧源和/或下文更详细地描述的添加剂成分。本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的本发明提供的丝氨酸蛋白酶。在一些实施方式中，需要的酶水平通过添加本发明提供的丝氨酸蛋白酶变体实现。通常，本发明的清洁组合物包含至少0. OOOlwt % (重量百分比)、约0. OOOlwt %至约IOwt %、约 0. 001wt%至约、或甚至约0. 01wt%至约0. lwt%的至少一种本发明提供的丝氨酸蛋白酶。在一些优选的实施方式中，本文提供的清洁组合物通常是这样配制的在含水清洁操作的应用中，洗涤水的pH值为约5. 0至约11. 5，或在替代的实施方式中甚至约6. 0至约10. 5。在一些优选的实施方式中，液体产品制剂被通常配制成具有约3. 0至约9. 0的净 PH值，而在一些替代的实施方式中，制剂具有约3至约5的净pH值。在一些优选的实施方式中，粒状洗衣产品被通常配制成具有约8至约11的pH值。控制pH在建议的使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，这些技术为本领域所公知。在一些特别优选的实施方式中，当蛋白酶变体被应用于粒状组合物或液体中时， 蛋白酶变体是包封化的颗粒形式，以在存储时保护酶不与该粒状组合物的其它成分混合。 此外，包封化还提供在清洁过程中控制丝氨酸蛋白酶有效性的一种方法，并可增强丝氨酸蛋白酶的性能。可预期的是本发明的包封的丝氨酸蛋白酶将可用于各种环境。这还意味着使用本领域已知的任何适宜的包封材料和方法包封丝氨酸蛋白酶。在一些优选的实施方式中，包封材料通常包封至少部分丝氨酸蛋白酶催化剂。在一些实施方式中，包封材料是水溶性的和/或水分散性的。在一些另外的实施方式中，包封材料具有0°c或更高的玻璃化转变温度(关于玻璃化转变温度的更多信息，参见如WO 97/11151，尤其是第6页第25行至第7页第2行)。在一些实施方式中，包封材料选自由以下组成的组碳水化合物、天然或合成树胶、几丁质和壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡和它们的组合。在包封材料是碳水化合物的一些实施方式中，包封材料选自由以下组成的组单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些优选的实施方式中，包封材料是淀粉(关于一些示例性适宜的淀粉的描述，参见如EP 0 922 499 ；和美国专利第4，977，252号、第 5，354，559 号、第 5，935，826 号)。在其他的实施方式中，包封材料包含塑料制成的微球(如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及它们的混合物；可使用的可商购的微球包括但不限于EXPANCEL (Casco Products, Mockholm，瑞典)、PM 6545, PM 6550、PM 7220、 PM 7228、EXTENDOSPHERES ,和 Q-CEL (PQ Corp.，Valley Forge, PA)、 LUXSIL 和SPHERICEL1 (Potters Industries, Inc.，Carlstadt, NJ 和 Valley Forge,PA)。如此处所述，在一些实施方式中，本发明的蛋白酶变体可用于衣物洗涤剂中。这些应用使酶承受了各种环境压力。本发明的蛋白酶变体由于它们在各种条件下的稳定性所以比很多现在应用的酶更有优势。的确，存在涉及洗涤的蛋白酶暴露其中的多种洗涤条件，包括不同洗涤剂配方、洗涤水容量、洗涤水温度和洗涤时间长短。另外，在不同的地理区域应用的洗涤剂配方在洗涤水中的相关成分的浓度不同。例如，在洗涤水中，欧洲洗涤剂通常含有大约4500-5000ppm 洗涤剂成分，而日本洗涤剂通常含有大约667ppm洗涤剂成分。在北美尤其在美国，在洗涤水中洗涤剂通常含有约975ppm的洗涤剂成分。低洗涤剂浓度系统在洗涤水中包含的洗涤剂要少于约SOOppm洗涤剂成分。通常日本洗涤剂被认为是低洗涤剂浓度系统，因为在洗涤水中它们含有大约667ppm洗涤剂成分。中洗涤剂浓度包括在洗涤水中包含约800ppm至约2000ppm之间的洗涤剂成分的洗涤剂。通常北美洗涤剂被认为是中等洗涤剂浓度系统，因为在洗涤水中它们大约含有 975ppm洗涤剂成分。巴西通常在洗涤水中含有大约1500ppm洗涤剂成分。高洗涤剂浓度系统在洗涤水中包含的洗涤剂浓度要大于约2000ppm洗涤剂成分。 通常欧洲洗涤剂被认为是高洗涤剂浓度系统，因为在洗涤水中它们含有大约4500-5000ppm 洗涤剂成分。拉丁美洲洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗洗涤剂(high suds phosphate builder detergent)，而且由于在洗涤水中含有的洗涤剂成分浓度范围为1500ppm到6000ppm，所以在拉丁美洲用的洗涤剂的范围既落入中等洗涤剂浓度又落入高洗涤剂浓度范围内。如上所述，巴西通常在洗涤水中含有大约1500ppm洗涤剂成分。但是，其它高泡磷酸盐助洗洗涤剂地理区域不局限于其它拉丁美洲国家，在洗涤水中可含有高至大约6000ppm洗涤剂成分的高洗涤剂浓度系统。根据上文所述，很明显，世界范围内通常洗涤溶液中洗涤剂组合物浓度从低于约 800ppm的洗涤剂组合物(低洗涤剂浓度地理区域，如在日本，约667ppm)到约800ppm和约 2000ppm之间(中等洗涤剂浓度地理区域，如在美国大约975ppm，和在巴西约1500ppm)，到高于约2000ppm (高洗涤剂浓度地理区域，如在欧洲约4500ppm到约5000ppm和在高泡磷酸盐助洗洗涤剂地理区域的大约6000ppm)。通常的洗涤溶液浓度是由经验决定的。例如，在美国通常一个洗衣机容纳约 64. 4L洗涤溶液。相应地，为了在洗涤溶液中获得大约975ppm的洗涤剂浓度，必须添加大约62. 97g洗涤剂组合物到64. 4L的洗涤溶液中。这个量是消费者用与洗涤剂一起提供的量杯量取到洗涤水中的常用量。作为另外的例子，不同的地理区域应用不同的洗涤温度。在日本的洗涤水温度通常低于在欧洲用的温度。例如，在北美和日本的洗涤水温度通常在10-30°C之间(例如大约 20°C)，而在欧洲洗涤水温度通常在30-60°C (例如约40°C)。此外，在一些其他区域，通常使用冷水进行洗衣、以及餐具洗涤应用。在一些实施方式中，本发明的“冷水洗涤”利用在以下温度的洗涤约10°C至约40°C、或约20°C至约30°C、或约15°C至约25°C、以及约15°C 至约35°C范围的所有其他组合、和10°C至40°C内的所有范围。作为另外的例子，不同的地理区域通常有不同的水硬度。水硬度通常按照每加仑混合Ca2+/Mg2+微粒数(grain)描述。硬度是水中含有的钙(Ca2+)和镁(Mg2+)量的一种量度。在美国大部分水是硬水，但是硬度不同。中等硬度水(60-120ppm)到硬水(121-181ppm) 有60-181ppm的硬矿物质(百万分率ppm与每美国加仑微粒数的转换关系是ppm值除以 17. 1等于每加仑微粒数的值)。
权利要求
1.一种枯草蛋白酶变体，包含SEQ ID NO :5所列的氨基酸序列。
2.一种组合物，包含权利要求1所述的枯草蛋白酶变体。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物是清洁组合物。
4.如权利要求3所述的清洁组合物，其中所述组合物是衣物洗涤剂。
5.如权利要求3所述的清洁组合物，其中所述组合物是餐具洗涤剂。
6.如权利要求5所述的餐具洗涤剂，其中所述餐具洗涤剂是自动机洗餐具洗涤剂。
7.如权利要求3所述的清洁组合物，其中所述组合物是液体洗涤剂。
8.如权利要求3所述的清洁组合物，其中所述组合物是凝胶、片剂、粉末或粒状洗涤剂。
9.如权利要求3所述的清洁组合物，其中所述组合物不含磷酸盐。
10.如权利要求3-9中任一项所述的清洁组合物，还包含至少一种漂白剂。
11.如权利要求3-10中任一项所述的清洁组合物，还包含至少一种其它的酶。
12.如权利要求11所述的清洁组合物，其中所述至少一种其它的酶选自半纤维素酶、 纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过氧水解酶、 角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。
13.一种清洁的方法，包括提供待清洁的物品和包含SEQ ID NO :5所列的枯草蛋白酶变体的组合物，和将所述物品与所述组合物接触。
14.如权利要求13所述的方法，还包括漂洗所述待清洁的物品的步骤。
15.如权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述物品是餐具或织物物品。
全文摘要
本发明提供非常适于清洁应用的枯草蛋白酶变体。具体而言，本发明提供芽孢杆菌属物种的(Bacilus sp.)枯草蛋白酶变体和包含此变体的清洁组合物。
文档编号C12N9/54GK102209777SQ200980144951
公开日2011年10月5日 申请日期2009年11月10日 优先权日2008年11月11日
发明者A·J·保罗斯, D·A·埃斯特尔, F·齐德戈伯, J·T·小凯尔特斯, L·G·卡斯康-佩雷拉 申请人:丹尼斯科美国公司