在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法

专利名称：在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法
技术领域：
本发明涉及在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法。相关技术描述表达特定表型的选择性标记基因作为表达载体的一部分广泛应用于重组DNA技术以供鉴定和分离已引入基因的宿主细胞。选择性标记基因的产物可提供杀生物剂或病毒抗性，对重金属等的抗性，或可将原养性赋予营养缺陷型。阳性选择性基因用于鉴定和/或分离保留引入的基因的细胞，而阴性选择性基因提供消除保留引入基因的细胞的手段。由阳性选择性基因赋予的表型(例如，对特定抗生素的抗性)，以及因此所述选择性标记基因在细胞/宿主中的存在，取决于所述细胞/宿主的最终用途，可为不合意的， 例如，在商业生产株中的潮霉素B抗性基因。为此原因，双向选择性标记基因如构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)乙酰胺酶(amdS)基因，代表着有吸引力的替代方案。amdS基因是显性双向选择性标记，因为该基因在阳性和阴性方向都是显性的。amdS基因的优点在于其可方便地从宿主细胞利用显性阴性选择(dominant negative selection)加以缺失或消除(cure)，这可通过将细胞涂布于含氟代乙酰胺(fluoroacetamide)的生长培养基中来达成。氟代乙酰胺由携带amdS的细胞代谢为氟代乙酸，其对于细胞是有毒的。仅那些失去 amdS基因的细胞可在阴性选择条件下生长。然而，使用amdS作为选择性标记的一个主要问题在于其相当广泛地遍布在真菌界中，且野生型宿主株中该基因任何活性内源拷贝必须在使用amdS基因作为选择性标记之前失活或缺失。可获得相对少的其它双向选择性标记基因(例如pyrG、SC、niaD和oliC)，但其遭受需要在其利用之前生成营养缺陷型突变体的不利之处，其可将未知的和不合意的突变引入宿主基因组，且这些系统可能无法在所有真菌中起作用。举例而言，一些镰孢属(Fusarium)菌株可代谢5-氟代乳清酸，使得pyrG作为双向选择性标记是无效的。因此，本领域中有对在丝状真菌中使用阳性和阴性表型的新方法的需要。美国专利6，555，370号公开了双功能性选择性融合基因的用途。本领域中还有对提供用于去除引入经遗传工程改造的丝状真菌的外源DNA例如选择性标记从而使得所述真菌仅含有最小痕量至不含(minimal trace to none)用于生成重组株的DNA的不同方法的需要。任何提供此类DNA去除的技术在本领域中是有价值的。本发明提供了在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法。

发明内容
本发明涉及在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的方法，包括(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含
(i)第一多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(ii)第二多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iii)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和(iv)第一侧翼序列，其位于组分⑴、( )和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的 3', (2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或C3)所述第一和第二区域中的一个位于基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’ 或3，。其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失基因或其部分或用核酸构建体替代基因或其部分；(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞； 和(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失第一和第二多核苷酸。本发明还涉及用于将目标多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组的方法，包括(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含(i)目标第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iv)第一重复序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’ ；和(ν)第一侧翼序列，其位于组分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组，以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞； 和(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞，以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组从而
7缺失第二和第三多核苷酸。本发明还涉及此类核酸构建体和包含此类核酸构建体的载体和丝状真菌细胞。附图简述

图1显示pJaL504_[Bam HI]的限制图谱。图2显示pJaL504-[Bgl II]的限制图谱。图3显示pJaL574的限制图谱。图4显示pWTY1449-02-01的限制图谱。图5显示pEJG61的限制图谱。图6显示pEmY21的限制图谱。图7显示pDM156. 2的限制图谱。图8显示pEmY23的限制图谱。图9显示pWTY1470-19-07的限制图谱。图10显示pWTY1515-02-01的限制图谱。图11显示pJfySlM0-75-5的限制图谱。图12显示pJfyS1579-l_13的限制图谱。图13显示pJfyS1579-8_6的限制图谱。图14显示pJfyS1579-21_16的限制图谱。图15显示pAlLol492_M的限制图谱。图16显示pJfyS1579-;35-2的限制图谱。图17显示pJfyS1579-41_ll的限制图谱。图18显示pJfyS1604-55_13的限制图谱。
图19显示pJfyS1579-93_l的限制图谱。图20显示pJfyS1604-17_2的限制图谱。图21显示pEJG69的限制图谱。图22显示pEJG65的限制图谱。图23显示pMMrl9的限制图谱。图M显示pEJG49的限制图谱。图25显示pEmY15的限制图谱。图沈显示pEmYM的限制图谱。图27显示pDM257的限制图谱。图28显示pDM258的限制图谱。图四显示镶片镰孢(Fusarium venenatum) amyA缺失株的转化体的相对乳糖氧化
酶产率。图30显示镶片镰孢amyA缺失株的转化体的相对α -淀粉酶活性。图31显示pJfyS1698-65_15的限制图谱。图32显示pJfyS1698-72_10的限制图谱。图33显示镶片镰孢alpA缺失株的转化体的相对碱性蛋白酶活性。图34显示pJfyS1879-32_2的限制图谱。图35显示pJfySlll的限制图谱。
图36显示pJfyS2010-13_5的限制图谱。图37显示pJfyS120的限制图谱。定义选择性标记本文中术语“选择性标记”定义为编码能够赋予抗生素抗性表型、提供自养型需求(用于显性阳性选择)或激活毒性代谢物(用于阴性选择)的蛋白质的基因。显性阳性选择性标记本文中术语“显性阳性选择性标记”定义为当转化入丝状真菌细胞之后表达允许阳性选择转化体的显性表型的基因。显性阳性选择性表型本文中术语“显性阳性选择性表型”定义为允许阳性选择转化体的表型。阴性选择性标记本文中术语“阴性选择性标记”定义为当转化入丝状真菌细胞之后表达允许阴性选择(即，消除)转化体的表型的基因。阴性选择性表型本文中术语“阴性选择性表型”定义为允许阴性选择(即，消除) 转化体的表型。基因本文中术语“基因”定义为细胞基因组DNA的区，其控制分立的遗传特征，通常对应于单一蛋白质或RNA。术语“基因”涵盖了整个功能性单元，包括编码序列、非编码序列、内含子、启动子和编码改变表达的蛋白质的其它调节序列。其部分本文中术语“其部分”定义为基因整个功能性单元的组分，如开读框 (ORF)、启动子、内含子序列和其它调节序列；或其部分。位于第一和第二多核苷酸的5’或3’ 本文中术语“位于第一和第二多核苷酸的 5”’和位于第一和第二多核苷酸的3”’定义为优选距第一和第二多核苷酸1000至5000bp 之内，更优选100至IOOObp之内，甚至更优选10至IOObp之内，最优选1至IObp之内，甚至最优选紧邻第一和第二多核苷酸。然而，其位置甚至可相距大于5000bp。位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’或3’:本文中术语“位于组分(i)、(ii)和(iii) 的5”’和位于组分(i)、(ii)和(iii)的3”’定义为优选距组分(i)、(ii)和(iii) 1000至 5000bp之内，更优选100至IOOObp之内，甚至更优选10至IOObp之内，最优选1至IObp之内，甚至最优选紧邻组分(i)、(ii)和(iii)。然而，其位置甚至可相距大于5000bp。位于基因或其部分的5’或3’ 本文中术语“位于基因或其部分的5”’和位于组分 (i)、(ii)和(iii)的3”’定义为优选距基因或其部分1000至5000bp之内，更优选100至 IOOObp之内，甚至更优选10至IOObp之内，最优选1至IObp之内，甚至最优选紧邻基因或其部分。然而，其位置甚至可相距大于5000bp。分离的多核苷酸本文中术语“分离的多核苷酸”指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少纯，优选至少5%纯，更优选至少10 %纯，更优选至少20 %纯，更优选至少40 %纯，更优选至少60 %纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯。基本上纯的多核苷酸本文中术语“基本上纯的多核苷酸”指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%， 更优选至多5 %，更优选至多4 %，更优选至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选至多1 %，并且甚至最优选至多0. 5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多
9核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，甚至更优选至少98%纯，最优选至少99%，并且甚至最优选至少99. 5%纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。编码序列当用于本文中，术语“编码序列，，意指直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。 编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列，或它们的任意组合。cDNA:术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。 起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自 mRNA的cDNA缺乏任何内含子序列。核酸构建体术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。调控序列(control sequence)术语“调控序列”在本文定义为包括表达编码多肽的多核苷酸必需的所有组分。每个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或每个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。此类调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和目的为引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。表达术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。引入本文中术语“引入”及其变型定义为将DNA转移入丝状真菌细胞。将DNA引入丝状真菌细胞可通过本领域任何已知方法(如转化)来达成。转化本文中术语“转化”定义为将分离的DNA引入丝状真菌细胞从而使得DNA作为染色体整合体或自主复制的染色体外载体而维持。分离的多肽术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，如通过SDS-PAGE测定的，所述多肽为至少纯，优选至少5%纯，更优选至少10% 纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯， 并且最优选至少90%纯。
基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10 %，优选至多8 %，更优选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多 4%,更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1 %，并且甚至最优选至多0. 5%的与其天然或重组结合的(associated)其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计是至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95% 纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%纯， 最优选至少99. 5%纯，并且甚至最优选100%纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如， 这能够通过如下实现通过公知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽。发明详述本发明涉及在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的方法，包括(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含(i)第一多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(ii)第二多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iii)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和(iv)第一侧翼序列， 其位于组分⑴、( )和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分⑴、( )和(iii)的 3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞的基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞的基因或其部分的3’，( 所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因之内，或C3)所述第一和第二区域中的一个位于基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞的基因的5’或3’，其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失基因或其部分或用核酸构建体替代基因或其部分；(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失第一和第二多核苷酸。在一个方面，使整个基因完全缺失，不留下外源DNA。本发明还涉及用于将目标多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组的方法，包括(a) 将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含(i)目标第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iv)第一重复序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’ ；和(ν)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)、(iii)和 (iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和(C)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失第二和第三多核苷酸。本发明描述了双功能性阳性和阴性选择系统，其赋予任何丝状真菌能够干净地 (clean)、最不显著地(minimally marked)进行基因缺失或插入的能力。这是作为将转化 DNA片段整合入基因组并由所述DNA片段上携带的侧翼DNA序列和对应的宿主基因组序列之间的双交换(double crossover)事件而导致基因缺失或基因插入的结果而达成的。内部重组发生在所述直接重复之间，导致间插序列的切出，其结果为缺失了宿主基因组中的靶基因，或插入了编码目标多肽的多核苷酸，或多核苷酸插入了基因而没有留下残余的DNA 或仅留下单独的重复。在一个方面，所述双重标记系统对于任何对潮霉素B敏感而对5-氟代脱氧尿苷有抗性的丝状真菌提供了通用系统(universal system)。本发明允许对潮霉素B敏感而对 5-氟代脱氧尿苷有抗性的任何丝状真菌菌株充当为了下述目的而用携带双重阳性和阴性选择性盒的载体转化的候选物(1)生成携带一个或多个(几个)干净的或最不显著的基因缺失的株或( 将一个或多个(几个)基因引入丝状真菌细胞，而不在所述丝状真菌细胞中留下转化DNA或仅留下最少的转化DNA。显性阳性和阴性选择性标记在本发明的方法中，可使用任何显性阳性选择性标记。在一个方面，所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素 (phleomycin)抗性基因(ble/bleO)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)、D_丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶 3' (I) (aph(3' ) I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3' (II) (aph(3' )II)基因。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由草胺膦乙酰转移酶基因(pat) 的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰胺酶基因(amdS)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由吡啶硫胺抗性基因(PtrA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)的编码序列编码的。 在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由D-丝氨酸脱水酶(dsdA)基因的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由ATP硫酰酶基因(sC)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3' (II) (aph(3' ) II)基因的编码序列编码的。
所述阳性选择性标记可从任何可用的来源获得。例如，编码潮霉素B磷酸转移酶(EC 2. 7. 1. 119 ；UniProtKB/Swiss-Prot P09979)的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt) 可从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) (Zalacain 等，1986, Nucleic Acids Research 14:1565-1581)和大肠杆菌(Ε. coli) (Lino 等，2007，Acta CrystalIogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 63 :685-688)获得。编码草胺膦 N-乙酰转移酶(EC
2.3. 1. 183 ； UniProtKB/Swi ss-Prot P16426)的草胺膦乙酰转移酶基因(pat)可从吸水链霉菌(White 等，1990，Nucleic Acids Research 18 1062 ；and Thompson 等，1987，EMBO J. 6 :2519-2523)和绿色产色链霉菌(Str印tomyces viridochromogenes) (Lutz 等，2001， Plant Physiol. 125 :1585-1590 ；和 Strauch 等，1988，Gene 63 :65-74)获得。由例如 ble (UniProtKB/Swiss-Prot P13081)和 bleO(UniProtKB/Swiss-Prot P67925)编码的博来霉素抗性蛋白质(BRP)可分别从肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia) (Mazodier 等，1985，Nucleic Acids Research 13 :195-205)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus) (Oskam等，l"l，Plasmid 26 :30-39)获得。乙酰胺酶基因(amdS) (EC
3.5. 1. 4 ；UniProtKB/Swiss-ProtP08158)可从构巢翘孢霉(Emericella nidulans)(构巢曲霉(Aspergillus nidulans)) (Corrick 等，1987，Gene 53 :63-71)、黑曲霉(Aspergillus niger)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum) (EP 758, 020)获得。编码线粒体噻唑生物合成酶(UniProtKB/Swiss-Prot Q9UUZ9)的吡啶硫胺抗性基因(ptrA或thiA)可从米曲霉 (Aspergillus oryzae) (Kubodera 等，2000, Biosci.Biotechnol. Biochem. 64 :1416-1421) 获得。编码嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶(NCBI登录号CAB42570)的pac基因可从大肠杆菌 (W0 1998/11241)获得。乙酰 CoA 合酶基因(acuA/facA ；EC6. 2. 1. 1)可从黑曲霉(UniftOt A2QK81)、构巢翘孢霉(构巢曲霉)(Uniprot P16928) (Papadopoulou 和 Sealy-Lewis, 1999，FEMS Microbiology Letters 178 :35-37 ；以及 Sandeman 禾口 Hynes，1989，Mol. Gen. Genet. 218 :87-92)禾口布拉克胡须霉(Phycomyces blakesleeanus) (UniProtKB/Swiss-Prot Q01576) (Garre 等，1994，Mol. Gen. Gen. 244 :278-286)获得。编码 D-丝氨酸脱水酶(EC
4.3. 1. 18 ；UniProtKB/Swi ss-Prot A1ADP3)的 dsdA 基因可从大肠杆菌(Johnson 等，2007， J. Bacteriol. 189 =3228-3236)获得。编码 ATP 硫解酶(NCBI 登录号:AAN04497)的 sC 基因可从黑曲霉获得(Varadarajalu 和 Punekar，2005，Microbiol. Methods. 61 :219-224)。线粒体ATP合酶亚基9(oliC)基因(UniProtKB/Swiss-Prot P16000)可从构巢翘孢霉(构巢曲霉)(Ward 和 Turner，1986，Mol. Gen. Genet. 205 :331-338)。氨基糖苷磷酸转移酶 3' (I 和 II)(aph(3' )1 和 II)基因(EC 2. 7. 1. 95 ;hterproIPR002575)可从环状芽孢杆菌 (Bacillus circulans)禾口灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(分别见Sarwar禾口Akhtar， 1991，Biochem. J. 273 :807 ；以及 Trower 禾口 Clark, 1990, N. A. R. 18 :4615)获得。在本发明的方法中，可使用任何阴性选择性标记。在一个方面，所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。在另一个方面，所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。在另一个方面，所述阴性选择性标记是由乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列所编码的。在另一个方面，所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列所编码的。
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所述阴性选择性标记可为来自任何可用的来源。例如，胸苷激酶基因(tk)(EC 2. 7. 1. 21 ；UniProtKB/Swiss-Prot P03176)可从人单纯疱疹(Herpes simplex)病毒 1 获得 (McKnight，1980，Nucleic Acids Research 8:5949-5964)。乳清苷 _5，-磷酸脱羧酶基因 (pyrG) (EC 4. 1. 1. 23 ； UniProtKB/Swi ss-Prot P07817)可从黑曲霉获得(Wilson 等，1988， N. A. R. 16 2339)。胞嘧啶脱氨酶基因(codA) (EC3. 5. 4. 1 ； UniProtKB/Swi ss-Prot C0DA_ EC0LI)可从大肠杆菌(K12 株)获得(Danielsen 等，1992，Molecular Microbiology 6 1335-1344)。在核酸构建体中，编码阳性和阴性选择性标记的多核苷酸可为相对于彼此的任何顺序，无论例如其是否命名为第一和第二多核苷酸或者第二或第三多核苷酸。此外，编码所述阳性和阴性选择性标记的多核苷酸可为相同的取向或为相反的取向。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由草胺膦乙酰转移酶基因(pat)的编码序列编码的， 而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO) 的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰胺酶基因(amdS)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由吡啶硫胺抗性基因(PtrA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰 CoA合酶基因(acuA/facA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因 (tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由ATP硫酰酶基因(sC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面， 所述显性阳性选择性标记是由线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' )1)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3' (II) (aph(3' )II)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由草胺膦乙酰转移酶基因(pat)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰胺酶基因(amdS)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由吡啶硫胺抗性基因(PtrA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由ATP硫酰酶基因(sC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' )1)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。 在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3' (II) (aph(3' )II) 基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG) 的编码序列编码的。 在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。 在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由草胺膦乙酰转移酶基因(Pat)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因 (ble/bleO)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰胺酶基因(amcK)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。 在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由吡啶硫胺抗性基因(PtrA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由ATP硫酰酶基因(sC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3' (II) (aph(3' ) II)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。本发明还涉及选自下组的分离的乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶(a)乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶，其包含与SEQ ID NO :52的成熟多肽具有优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，甚至更优选至少95 %相同，且最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%相同的氨基酸序列；(b)乳清苷_5，-磷酸脱羧酶，其由在优选至少中等严格条件下，更优选至少中-高严格条件下，甚至更优选至少高严格条件下且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO 51的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交的多核苷酸编码；和(c)乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO :51的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90 %，甚至更优选至少95 %同一性，且最优选至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99%同一性的核苷酸序列。在一个优选的方面，所述乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶包含SEQ ID NO 52或其具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段，或由SEQ ID NO :52或其具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段组成。在另一个方面，所述乳清苷_5，-磷酸脱羧酶包含SEQ ID N0:52或由SEQ ID NO 52 组成。本发明还涉及选自下组的包含编码乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶的核苷酸序列的分离的多核苷酸(a)多核苷酸，其包含编码乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶的核苷酸序列，所述乳清苷-5，-磷酸脱羧酶包含与SEQ ID NO :52的成熟多肽具有优选至少70%，更优选至少 75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，甚至更优选至少95 %同一性，且最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的氨基酸序列；(b)多核苷酸，其编码乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶，所述多核苷酸包含在优选至少中等严格条件下，更优选至少中高严格条件下，甚至更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与 SEQ ID NO :51或其全长互补链杂交的核苷酸序列；和(c)多核苷酸，其编码乳清苷_5’_磷酸脱羧酶，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO :51的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，甚至更优选至少95 %同一性，且最优选至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %同一性的核苷酸序列。在一个优选的方面，编码乳清苷_5，-磷酸脱羧酶的多核苷酸包含SEQ IDNO 51 或其编码具有乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶活性的片段的亚序列，或由SEQID NO 51或其编码具有乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶活性的片段的亚序列组成。在另一个优选的方面，编码乳清苷-5，-磷酸脱羧酶的多核苷酸包含SEQ ID NO :51或由SEQ ID NO 51组成。用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸在本领域是已知的，且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备或其组合。从此类基因组DNA克隆本发明的多核苷酸可例如通过使用公知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共同结构特征的克隆的DNA 片段来实施。参见，例如 hnis 等，1990，PCR :A Guide to Methods and Application, Academic Press,New York。可使用其它核酸扩增方法如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。SEQ ID N0:51的核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ ID NO 52的氨基酸序列，或其片段；可用于根据本领域公知的方法设计核酸探针以从不同属或种的株鉴定并克隆编码乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶的DNA。具体而言，此类探针可用于遵循标准的Southern印迹方法与目标属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定并分离其中的对应基因。此类探针可明显短于完整序列，但其长度应为至少14，优选至少25，更优选至少35，且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度为至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度可为至少 200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可使用更长的探针，例如长度优选为至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针两者均可使用。通常标记探针以供检测相应的基因(例如，用32p、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标记)。本发明涵盖此类探针。因此，可就与上述探针杂交并编码乳清苷-5，-磷酸脱羧酶的DNA对从一个株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其它株的基因组或其它DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移至并固化于硝酸纤维素或其它适当的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO :1或其亚序列同源的克隆或DNA，载体材料优选用于Southern印迹。就本发明而言，杂交表明核苷酸序列与对应于SEQ ID NO :51或其亚序列的标记的核酸探针在非常低至非常高严格条件下杂交。在这些条件下与核酸探针杂交的分子可使用例如X射线片来检测。在一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID N0:51。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO :52或其亚序列的多核苷酸序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO 52的多核苷酸序列。对于长度至少为100个核苷酸的探针，非常低至非常高严格条件定义为在42°C在 5X SSPE，0. 3% SDS，200 μ g/ml经剪切和变性的鲑精DNA中进行预杂交和杂交，且对于非常低和低严格条件，使用25%甲酰胺，对于中等和中等-高严格条件，使用35%甲酰胺，或者对于高或非常高严格条件，使用50%甲酰胺，根据标准Southern印迹方法进行最佳12至 24小时。对于长度至少为100个核苷酸的探针，使用2X SSC, 0.2% SDS，优选在45°C (非常低严格度)，更优选在50°C (低严格度)，更优选在55°C (中等严格度)，更优选在 60 0C (中-高严格度)，甚至更优选在65°C (高严格度)，且最优选在70°C (非常高严格度)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。本发明还涉及包含此种乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶的核酸构建体、重组表达载体和重组丝状真菌细胞。本发明还涉及产生乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶的方法，包括在有助于产生乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶的条件下，培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，所述宿主细胞是丝状真菌细胞。重复序列在本发明的在丝状真菌基因组中缺失基因的方法中，包含编码显性阳性选择性标记的第一多核苷酸和编码阴性选择性标记的第二多核苷酸的核酸构建体还包含位于第一和第二多核苷酸5’的第一重复序列和位于第一和第二多核苷酸3’的第二重复序列。在本发明将目标多核苷酸引入丝状真菌基因组的方法中，包含目标第一多核苷酸、编码显性阳性选择性标记的第二多核苷酸和编码阴性选择性标记的第三多核苷酸的核酸构建体还包含位于第二和第三多核苷酸5’的第一重复序列和位于第二和第三多核苷酸 3’的第二重复序列，其中所述目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’。两种方法的重复序列均优选包含相同序列从而使得第一和第二重复序列可发生分子内同源重组以缺失编码所述阳性和阴性选择性标记的多核苷酸。所述重复序列可为任何多核苷酸序列。在一个方面，所述重复序列为丝状真菌细胞天然的序列。在另一个方面，所述重复序列为对于所述丝状真菌细胞为外源(异源)的序列。所述重复序列可为非编码或编码的多核苷酸序列。在另一个方面，所述重复序列为丝状真菌细胞天然的多核苷酸序列。在另一个方面，所述重复序列与3’侧翼序列或5’侧翼序列相同以确保规则的(clean)基因缺失、破坏或插入。为了增加发生分子内同源重组以缺失所述阳性和阴性选择性标记的多核苷酸的可能性，重复序列应含有足够数量的核酸，如优选20至10，000个碱基对，50至10，000个碱基对，100至10，000个碱基对，200至10，000个碱基对，更优选400至10，000个碱基对， and最优选800至10，000个碱基对。侧翼序列在本发明的在丝状真菌基因组中缺失目标基因的方法中，包含编码显性阳性选择性标记的第一多核苷酸、编码阴性选择性标记的第二多核苷酸、第一重复序列和第二重复序列的核酸构建体还包含位于上述多核苷酸5’的第一侧翼序列和位于上述多核苷酸3’的第二侧翼序列。为了缺失目标基因，第一侧翼序列与位于丝状真菌细胞基因5’端的第一区域相同，而第二侧翼序列与位于该基因3’端的第二区域相同。所述第一和第二侧翼序列分别与丝状真菌细胞基因组的所述第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失所述基因，并用所述核酸构建体替代所述基因。在本发明的将目标多核苷酸引入丝状真菌基因组的方法中，包含目标多核苷酸， 编码显性阳性选择性标记的第二多核苷酸，编码阴性选择性标记的第三多核苷酸，第一重复序列和第二重复序列的核酸构建体还包含位于上述多核苷酸5’的第一侧翼序列和位于上述多核苷酸3’的第二侧翼序列。为了引入目标多核苷酸，第一侧翼序列与丝状真菌细胞基因组的第一区域相同， 而第二侧翼序列与丝状真菌细胞基因组的第二区域相同。所述第一和第二侧翼序列分别与丝状真菌细胞基因组的所述第一和第二区域发生分子间同源重组以将包含目标多核苷酸的核酸构建体引入丝状真菌细胞的基因组。在一个方面，第一区域位于丝状真菌细胞基因的5’，而第二区域位于丝状真菌细胞基因的3’。在另一个方面，第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的一个基因之内。 在另一个方面，第一和第二区域之一位于丝状真菌细胞的一个基因之内而另一个位于该基因的5’或3’。在另一个方面，所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
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为了增加在准确位置整合的可能性，侧翼序列应优选含有足够数目的核酸，如100 至10，000个碱基对，优选400至10，000个碱基对，且最优选800至10，000个碱基对，足以确保同源重组。侧翼序列可为任何与丝状真菌细胞基因组中的靶序列相同的序列。此外， 侧翼序列可为非编码或编码核苷酸序列。多核苷酸在本发明的方法中，目标多核苷酸可为任何DNA。所述DNA对于目标丝状真菌细胞可为天然的或异源的(外源的)。所述多核苷酸可编码任何具有目标生物活性的多肽。所述多肽对于目标丝状真菌细胞可以是天然的或异源的(外源的)。术语“异源多肽”在本申请中定义为对于丝状真菌细胞不是天然的多肽；其中进行了结构性修饰例如缺失、取代和/或插入以改变天然多肽的天然多肽；或其表达作为通过重组DNA技术操纵编码多肽的DNA的结果而发生定量改变的天然多肽。多肽可为下述多肽和杂合多肽的天然存在的等位基因变体和工程变体。术语“多肽”在本文并非指特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。 术语“多肽”还包括杂合多肽和融合多肽。多肽还可为多肽的天然存在的等位基因变体和工程变体。在一个方面，所述多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫调节剂 (immunodilator)、神经递质、受体、报道蛋白、结构蛋白和转录因子。在另一个方面，多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在另一个方面，所述多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、 肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。在另一个方面，所述多肽是白蛋白、胶原、原弹性蛋白、弹性蛋白或明胶。在另一个方面，所述多肽是杂合多肽，其包含从至少两个不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中一种或多种对于所述丝状真菌细胞可为异源的。在另一个方面，所述多肽是融合多肽，其中另一个多肽融合于所述多肽或其片段的N-端或C-端。融合多肽是通过将编码一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)而产生的。用于产生融合多肽的技术在本领域中是已知的，且包括将编码多肽的编码序列连接从而使得其在框内(in frame)，且融合多肽的表达是在相同的启动子和终止子的控制之下。编码目标多肽的多核苷酸可以获得自任何原核、真核或其它来源。就本发明而言， 用于本申请与给定的来源有关的术语“获得自”，应表示所述多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的基因的细胞产生。用于分离或克隆编码目标多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用公知的聚合酶链式反应(PCR)实现从这种基因组DNA克隆目标多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR Protocols =A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。所述克隆方法可涉及切出禾口分离包含编码所述多肽的核酸序列的所需核酸片段，将所述片段插入载体分子，和将重组载体并入突变体真菌细胞，其中所述核酸序列的多个拷贝或克隆会被复制。所述多核苷酸可为基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任何组合。编码目标多肽的多核苷酸可以多种方式操纵以提供所述多核苷酸在合适的丝状真菌细胞中的表达。构建编码目标多肽的DNA的重组表达载体和核酸构建体可如本文中所述加以实施。多核苷酸还可为用于操纵目标基因表达的调控序列，例如启动子。调控序列的非限定性实例如本文所述。所述多核苷酸还可为任何可用于破坏丝状真菌基因组中基因的核酸分子。所述多核苷酸可为编码或非编码的多核苷酸。所述多核苷酸可编码除了之前公开的那些之外的另一种选择性标记。所述多核苷酸可编码多肽如上述那些。所述多核苷酸可简单地为其长度足够破坏基因的任何核酸分子。多核苷酸的范围并不受上面公开的具体实例的限制，因为这些实例意欲作为本发明的几个方面的说明。核酸构建体本发明还涉及用于在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的核酸构建体，包含(i)第一多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(ii)第二多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iii)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’，( 所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因之内，或C3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’，其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失基因或其部分或用核酸构建体替代基因或其部分。本发明还涉及用于将多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组的核酸构建体，包含(i) 目标第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时， 赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iv)第一重复序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而且目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’ ；和(ν)第一侧翼序列，其位于组分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；且第一和第二重复序列可发生分子内同源重组以缺失所述第二和第三多核苷酸。编码目标多肽、显性阳性选择性标记或阴性选择性标记的分离的多核苷酸可以以多种方式操纵以供其表达。在将其插入载体之前操纵此种多核苷酸序列取决于表达载体可为合意的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域中是公知的。所述调控序列可为任何适当的启动子序列，其为由丝状真菌细胞识别用于表达编码目标多肽的多核苷酸的核苷酸序列。所述启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的丝状真菌细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、 截短的和杂合的启动子，并且可以从编码对于该丝状真菌细胞是同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。用于在丝状真菌细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从下列的基因获得的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、镶片镰孢amyA、镶片镰孢Daria (W0 00/56900)、镶片镰孢 Quinn(ff0 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W0 96/00787)、里氏木霉β -葡糖苷酶、 里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及 NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其为由丝状真菌细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码多肽的核酸序列的3’末端可操作地连接。在所选的丝状真菌细胞中有功能的任何终止子可用于本发明。对于丝状真菌细胞优选的终止子从以下各项的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于丝状真菌细胞的翻译重要的mRNA 非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’末端。可以将在所选丝状真菌细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。对于丝状真菌细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其为与核苷酸序列的3，末端可操作地连接的序列，并且当其转录时，丝状真菌细胞将其识别为信号以将聚腺苷残基添加至转录的mRNA。 在所选丝状真菌宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列可用于本发明。对于丝状真菌细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉 α-葡糖苷酶。调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的信号肽序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者， 编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选丝状真菌细胞的分泌途径(即分泌入培养基)的任何信号肽编码序列可用于本发明。对于丝状真菌细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。 前肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。前肽编码序列可从如下酶的基因获得枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉 (Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)的基因获得。当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着 (next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。同样理想的是添加调节序列，其使得能够相对于丝状真菌细胞的生长来调节多肽表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列可与调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及包含本发明核酸构建体的重组表达载体。所述重组表达载体可为任何可方便地对其进行重组DNA方法并可导致多核苷酸序列表达的质粒。载体的选择通常取决于载体与待引入的丝状真菌细胞之间的相容性。载体优选为直链的，从而使得第一和第二侧翼序列与丝状真菌细胞的第一和第二区域发生有效的分子间同源重组。用于构建本发明的重组表达载体的方法对于本领域技术人员是公知的(参见，例如 Sambrook 等，1989，见上)。丝状真菌细胞本发明还涉及包含本发明核酸构建体的重组丝状真菌细胞。在本发明的方法中，所述丝状真菌细胞可为任何丝状真菌细胞。术语“丝状真菌细胞”涵盖任何由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的后代。“丝状真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门(如由Hawksworth等， 于Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi,第8版，1995,CAB International, University Press，Cambridge，UK所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。在一个方面，所述丝状真菌细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属 (Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属 (Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、,廉抱属(Fusarium)、腐质霉属 (Humicola)(Magnaporthe) λ β M (Mucor) Λ^ jg (Myceliophthora) Λ fr 考玛月旨霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、 青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phmerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属 (Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属 Gchizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、 嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属 (Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。在一个更优选的方面，所述丝状真菌细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、曰本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、漂曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个更优选的方面，所述丝状真菌细胞是杆孢状 ,廉抱(Fusarium bactridioides)、禾谷德抱(Fusarium cerealis)、库威德抱(Fusarium crookwellense)、大刀德抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗德抱(Fusarium graminearum)、 禾赤德抱(Fusarium graminum)、异抱德抱(Fusarium heterosporum)、合欢木德抱 (Fusarium negundi)、尖,廉抱(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、 粉红德抱(Fusarium roseum)、接骨木德抱(Fusarium sambucinum)、肤色德抱(Fusarium sarcochroum)、拟分枝抱,廉抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、圆德抱(Fusarium torulosum)、拟丝抱德抱(Fusarium trichothecioides) 或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一个更优选的方面，所述丝状真菌细胞是黑剌烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟錯菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟錯菌、 Ceriporiopsis caregiea、 Ceriporiopsis gilvescens、 Ceriporiopsis pannocinta、 Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、 虫拟錯 菌(Ceriporiopsis subvermispora)、嗜角质金抱子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、 Chrysosporium inops、 金抱子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米漂毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)、福身寸身寸脉菌(Phlebia radiata)、朿Ij序侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningji)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei) 或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
在一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是镶片镰孢NRRL 30747。在另一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是镶片镰孢ATCC 20334。在另一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是黑曲霉细胞。在另一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是米曲霉细胞。在另一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是里氏木霉细胞。丝状真菌可通过本身已知的方式以涉及原生质体形成、原生质体转化和再生细胞壁的方法来进行转化。转化曲霉属和木霉属细胞的合适方法描述于EP 238 023和如1切11 φ, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81 :1470—1474。 镰孢属菌种的合适方法如Malardier等，1989，Gene78 :147-156和WO 96/00787所述。产生方法本发明还涉及产生目标多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽形成的条件下培养如本文中所述获得的丝状真菌细胞；和(b)回收多肽。在本发明的产生方法中，将细胞在适于产生多肽的营养培养基中使用本领域公知方法来培养。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公布的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌至营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌至培养基中，其能够从细胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzyme assay) 可用于确定所述多肽的活性。所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(pr印arative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS_PAGE或提取 (参见，例如，Protein Purification，J.-C. Janson 禾口 Lars Ryden 编，VCH Publishers,New York,1989)。本发明进一步由下述实施例来描述，其不应视为限制本发明的保护范围。 实施例材料用作缓冲剂和底物的化学物为至少试剂级的商业产品。所有的引物和寡核苷酸由 MWG Biotech, Inc.，High Point, NC, USA 提供。真菌菌株镶片镰孢株WTY842-1-11描述于美国专利7368271号。镶片镰孢株EmYllM-46-4. 3是镶片镰孢株WTY842-1-11的Atri5、amdS+、ApyrG衍生物。镶片镰孢株 WTY1449-03-03 是镶片镰孢株 WTY842-1-11 的 Atri5、amdS+、bar+、tk+转化体。镶片镰孢株 WTY1449-09-01 是镶片镰孢株 WTY1449-03-03 的 Atri5、amdS+、bar+、tk-消除的衍生物。镰孢属株A3/5，现在重新分类为镶片镰孢(Yoder和Christianson，1998，Fungal Genetics and Biology 23 :62-80 ；0' Donnell 等，1998, Fungal Genetics and Biology 23 :57-67)从 Dr. Anthony Trinci, University of Manchester, Manchester, England 获得。该株的保藏可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) I^flifeMtt ATCC20334 Agricultural Research Service Patent Culture Collection(农业研究机构专利培养物保藏中心)(NRRL)，Northern Regional Research Center (北区研究中心)，Peoria，IL，USA作为镰孢属株NRRL 30747获得。里氏木霄 RutC30 如 Montenecourt 禾口 Eveleigh，1979，Adv. Chem. Ser. 181 :289-301 所述。培养基和溶液LB板由每升IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl和15g的细菌用琼脂组成。NZY顶层琼脂由每升5g的NaCl、5g的酵母提取物、IOg的NZ胺、2g的MgSO4和7g 的琼脂糖组成。M400培养基由每升50g的麦芽糊精、2g的MgSO4-7H20,2g的KH2P04、4g的柠檬酸、 8g的酵母提取物、2g的尿素、0. 5g的CaCl2和0. 5ml的AMG痕量金属溶液，pH 6. O组成。AMG 痕量金属溶液由每升 14. 3g 的 ZnSO4 ·7Η20、2· 5g 的 CuSO4 ·5Η20、0· 5g 的 NiCl2, 13. 8g的FeS04、8. 5g的MnSO4和3. Og的柠檬酸组成。2XYT培养基由每升16g的胰蛋白胨、IOg的酵母提取物、5g的NaCl和5g的细菌用琼脂组成。YP培养基由每升IOg的酵母提取物和20g的细菌用蛋白胨组成。YP(}2%培养基由每升IOg的酵母提取物、20g的细菌用蛋白胨和20g的葡萄糖组成。YP(i5%培养基由每升IOg的酵母提取物、20g的细菌用蛋白胨和50g的葡萄糖组成。RA培养基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaN03、Ig的葡萄糖和20ml的50X Vogels 盐溶液(无C、无NaNO3)组成。RA+尿苷培养基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaNO3Ug的葡萄糖和20ml的50X Vogels盐溶液(无C、无NaNO3)组成。在RA培养基的过滤灭菌之后，将过滤灭菌的尿苷添加至终浓度为10mM。RA+BASTA 培养基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaN03、Ig的葡萄糖和20ml的50X Vogels盐溶液(无C、无NaNO3)组成。在RA培养基的过滤灭菌之后，使用250mg/ml的工作储液将过滤灭菌的 BASTA (草铵膦(glufosinate)，Hoechst Schering AgrEvo, Frankfurt, Germany)添加至终浓度为6mg/ml。50X Vogels 盐溶液(无 C、无 NaNO3)由每升 250g 的 KH2PO4UOg 的 MgSO4 .7H20、5g 的CaCl22H20、2. 5ml的生物素溶液和5ml的Vogels痕量元素溶液组成。生物素储液由IOOml 50%乙醇中的5mg生物素组成。Vogels痕量元素溶液由每IOOml 5g的柠檬酸、5g的ZnSO4 · 7H20、lg的 Fe (NH4) 2 (SO4) 2 · 6Η20、0· 25g 的 CuSO4 · 5Η20、0· 05g 的 MnSO4 · H20,0. 05g 的 H3BO3 和 0. 05g
25的 Na2MoO4 · 2H20 组成。PDA板由每升39g的Potato Dextrose Agar(马铃薯右旋糖琼脂) (BDBiosciences、San Jose、CA、USA)组成。PDA+1M蔗糖板由每升39g的马铃薯右旋糖琼脂(BD Biosciences、San Jose, CA, USA)和342g的蔗糖组成。VNO3RLMT 板由每升 20ml 的 50X Vogels 盐溶液(25mM NaNO3) >273. 33g 的蔗糖和 15g 的 LMT 琼脂糖(Sigma，St. Louis, MO, USA)组成。50X Vogels 盐溶液 Q5mM NaNO3)由每升 125g 的柠檬酸钠、250g 的ΚΗ2Ρ04、106. 25g 的 NaNO3UOg 的 MgSO4 ·7Η20、5β 的 CaCl22H20、2. 5ml 的生物素储液和 5ml 的 Vogels 痕量元素溶液组成。VN03RLMT-BASTA 板由每升 20ml 的 50X Vogels 盐溶液(25mMNaN03) ,273. 33g 的蔗糖和15g的LMT琼脂糖组成。在高压灭菌和冷却之后，添加BASTA 至终浓度为6mg/ml。COVE 盐溶液由每升 ^g KCl、26g MgS047H20、76g KH2P04、50mlC0VE 痕量元素组成。COVE 痕量元素溶液由每升 0. 004g 的 Na2B4O7IOH2O^O. 4g 的 CuS045H20、1. 2g 的 FeS047H20、0. 7g 的 MnSO4H2O^O. 8g Na2Mo022H20、IOg 的 ZnS047H20 组成。Tr匪培养基由20ml的COVE盐溶液、0. 6g的CaCl2、6g的(NH4) 2S04、30g的蔗糖和 25gAgar Noble 组成。TrMM-G 由 20ml 的 COVE 盐溶液、0. 6g 的 CaCl2、6g 的(NH4) 2S04、25g 的 Agar Noble 组成，高压灭菌、冷却并添加40ml的50%葡萄糖。STC 由 0. 8M 山梨醇、2. 5mM Tris pH 8 和 5mM CaCl2 组成。TrSTC 由 IM 山梨醇、IOmM Tris pH 8 禾口 IOmM CaCl2 组成。PEG 由 50% PEG 4000、IOmM Tris pH7. 5 禾口 IOmM CaCl2 组成。STC 由 0. 8M 山梨醇、25 或 50mM Tris pH 8 和 50mM CaCl2 组成。SPTC 由 40%聚乙二醇 4000、0. 8M 山梨醇、25 或 50mM Tris pH 8 和 50mM CaCl2 组成。SY50 培养基(pH 6. 0)由每升 50g 的蔗糖、2. Og 的 MgSO4 WH2OUOg 的 KH2PO4,2. Og 的K2S04、2. Og的柠檬酸、IOg的酵母提取物、2. Og的尿素、0. 5g的CaCl2 ·2Η20和5ml的200X
AMG痕量金属溶液(不含镍)组成。200X AMG痕量金属溶液(不含镍)由每升3. Og的柠檬酸、14. 3g的SiSO4 · 7H20、 2. 5g 的 CuSO4 · 5H20、13. 8g 的 FeSO4 · 7H20 和 8. 5g 的 MnSO4 · H2O 组成。20X SSC由0. 3M柠檬酸钠pH 7和3M氯化钠组成。DNA 测序DNA 测序是用 ABI PRIZM 3700DNA Analyzer (Applied Biosystems, Inc.， Foster City, CA, USA)进行的。实施例1 镶片镰孢WTY842-1-11对5_氟代脱氧尿苷(FdU)的敏感性测试为了使胸苷激酶(tk)能够用作阴性选择性标记，真菌必需对相当高浓度的核苷类似物5-氟代脱氧尿苷(FdU)不敏感。为了确定镶片镰孢WTY842-1-11对FdU的敏感程度， 通过将取自在-140°C储藏的10%甘油储备的菌株的集落琼脂糖栓(colonized agar plug) 铺于 VNO3RLMT板并在 ChexAll Instant Seal Sterilization Pouch (Fisher Scientific,Pittsburgh, PA, USA)中在沈-28°C培育7日来制备镶片镰孢WTY842-1-11的一周龄培养物。在7日之后，从一周龄培养物将栓靠近边缘切出(cut sub-marginally)，并朝下置于 6 孔板中补充了不同浓度的 FdU(0 至 500 μ M) (Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO, USA) 的 VNO3RLMT 培养基上。将板在打开的ZIPLOC 袋(S. C. JohnsonHome Storage, Inc., Racine，WI，USA)中在沈-28°C温育14日，之后记录在每个FdU浓度的生长程度。发现镶片镰孢WTY842-1-11对所有测试的FdU浓度均不敏感，尽管当浓度超过 100 μ M时，与50 μ M以下的浓度相比生长略微减少。实施例2 构建质粒pJaL574质粒pDV8 (美国专利6，806，062号)携带单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK ； tk)基因(DNA序列为SEQ ID NO 37而推导的氨基酸序列为SEQ IDNO :38)，其为插入构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpdA)启动子的1.01Λ Xho Ι/BglII片段和携带三功能性构巢曲霉吲哚甘油磷酸酯合酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶和谷氨酰胺氨基转移酶(trpC) 转录终止子的1.8kb Bam Hi/Hind III片段之间的1. 2kb Bgl II/Bam HI片段。将质粒 PDV8用Bam HI消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用Klenow聚合酶(Stratagene， La Jolla, CA, USA)填充(fill in)。将消化的质粒使用 QUICK LIGATION Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生产商的实验方案重新连接，用 MINELUTE GelExtraction Kit(QIAGEN Inc. , Valencia, CA, USA)处理，并将所得的连接产物使用TOPO Blunt Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)依照生产商的指示克隆入pCR 4Blunt-TOPO (Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)。将克隆反应物根据生产商的指示转化入ONE SHOT 化学感受态T0P10细胞(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)。 使用BIOROBOT 960(KQIAGEN Inc, Valencia, CA, USA)从八个所得的转化体提取质粒 DNA，并通过使用Bio I/BamHI和Bio I/Hind III限制消化来筛选。来自两个具有正确限制性消化样式的转化体的质粒DNA的DNA测序确证了两者均携带所需序列。一个命名为 pJaL504-[Bam HI](图 1)。将质粒pJaL 504-[Bam HI]用Bgl II消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用Klenow聚合酶填充。将消化的质粒依照生产商的实验方案使用QUICK LIGATION Kit重新连接，用MINELUTE Reaction Cleanup Kit处理，然后将所得的连接物使用 TOPO Blunt Cloning Kit依照生产商的指示克隆入pCR 4Blunt-TOPO 。将克隆反应物依照生产商的指示转化入ONE SHOT 化学感受态T0P10细胞。使用BIOROBOT 9600从八个所得的转化体提取质粒DNA，并通过使用Bio I/Bgl II和Bio I/Hind III的限制消化筛选。来自两个具有正确地限制性消化样式的转化体的质粒DNA的DNA测序确证两者均携带所需序列。一个命名为pJaL504-[Bgl II](图2)。Punt等(1990，Gene 3 101-109)之前显示可缺失构巢曲霉gpdA启动子的364bp而不影响该启动子的强度。基于这些作者的观察，设计如下所示的引物#172450以截短构巢曲霉gpdA启动子并减少载体的大小。引物 172450 5’-GACGAATTCTCTAGAAGATCTCTCGAGGAGCTCAAGCTTCTGTACAGTGACCGGTGACTC-3’ (SE Q ID NO 1)下划线序列对应于gpdA启动子序列。剩余序列是携带下述限制性位点的手柄(handle) :Eco RI、Xba I、Bgl II、Xho I 禾口 Hind III。为了截短构巢曲霉trpC终止子(同样为了减少载体大小)，设计了携带Eco RI手柄的如下所示的引物#172499。引物 172499 5，-GACGAATTCCGATGAATGTGTGTCCTG-3 ’ (SEQ ID NO 2)下划线序列对应于trpC终止子序列。使用引物17M99和17M50的扩增将启动子截短了 364bp而将trpC终止子序列截短了 239bp。PCR用上述两个引物使用pJaL504-[Bgl II]作为模板实施以生成由构巢曲霉 gpdA启动子的截短形式、HSVl-TK基因的编码序列和构巢曲霉trpC终止子的截短形式组成的2. 522kb片段。 Γ ±| β. IS ^ 5 μ 1 IOX Buffer (Promega Corporation, Madison, WI, USA)、 0. 4μ 1 25mM dNTPsU. 25 μ 1 引物 172450 (lOOng/μ 1)、1. 25 μ 1 引物 172499 (lOOng/ μ1)、0·5μ1 PJaL 504_[Bgl II] (lOOng/μ 1)、2 μ 1 Pfu DNA 聚合酶(Promega Corporation，Madison，WI，USA) (2. 5U/μ 1)和39. 6 μ 1灭菌蒸馏水组成。将扩增反应物在 ROBOCYCLER (Stratagene，La Jolla, CA, USA)中温育，其程序为在 95°C进行 1 个循环45秒，然后进行28个循环，每个在95°C进行45秒，57°C进行45秒和72°C进行5分钟。 在72°C进行10分钟的最终延伸。对扩增反应物使用低熔点琼脂糖凝胶在50mM Tri s-50mM硼酸-ImMEDTA 二钠 (TBE)缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶切出2522bp片段，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)提取。然后将凝胶纯化的 DNA 使用TOPO Blunt Cloning Kit依照生产商的指示插入pCR 4Blunt-TOPO 。将克隆反应物根据生产商的指示转化入ONE SHOT 化学感受态T0P10细胞。使用BIOROBOT 9600从八个所得的转化体提取质粒DNA，并通过使用Eco RI和Bgl II的限制消化筛选。来自两个具有正确限制消化样式的质粒DNA的DNA测序确证两者均携带所需序列。一个命名为 pJaL574(图 3)。实施例3 构建质粒 pWTY1449-02-01将质粒PJaL574依照生产商推荐的试验方案转化入感受态大肠杆菌SCSllO细胞 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)。使用BIOROBOT 9600 从二十四个所得的转化体提取质粒DNA，然后使用Eco RI和Bgl II对其进行分析性消化。之后的DNA序列分析导致了具有正确序列的克隆的鉴定，其命名为PWTY1449-02-01 (图4)。实施例4 构建质粒pEJG61将质粒pEJG61 (图5)如美国专利7368271所述进行构建，只是倒转了 bar盒的取向(即，核苷酸5901-5210编码amdS启动子，核苷酸5209-4661编码bar编码序列，而核苷酸4660-4110编码黑曲霉葡糖淀粉酶(AMG)终止子)。实施例5 镶片镰孢WTY842-01-11的孢子和原生质体的生成为了生成镶片镰孢WTY842-01-11的孢子，将如实施例1中所述的16个来自新鲜琼脂糖培养(大约一周龄)的琼脂栓(大约lcmxlem)接种入2. 8LFernbach瓶中的500ml RA培养基，并在沈.5°C以150rpm振荡温育对小时，然后在观.5°C再温育12小时。然后将培养物经过灭菌塑料漏斗中的灭菌MIRACL0TH (CalBiochem，San Diego, CA, USA)经过0. 45 μ M过滤器过滤入1升过滤单元的基部(base)。将在过滤器上收集的孢子用500ml灭菌蒸馏水洗涤，然后重悬于IOml灭菌蒸馏水中，并使用血细胞计数器计数。将浓度调整至 2xl08/mL·将新鲜生成的孢子用于接种500ml带挡板的摇瓶，每个含有IOOmlYPG5^If养基， 以Iml新鲜孢子OxlO8Ail)接种。将摇瓶在23. 5°C以150rpm振荡温育15小时，此时种系物 (germline)大约长为3-5个孢子长度。将在IMMgSO4中过滤灭菌的二十ml的每ml 5mg的 N0V0ZYME 234(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)等分入八个灭菌的 50ml 管。然后将种系物经过灭菌漏斗中的灭菌MIRACL0TH 过滤，并用IOOml灭菌蒸馏水继以IOOml灭菌IM MgSOJi]洗。使用灭菌刮铲将经润洗的种系物轻柔地刮入含有在IM MgSO4中的N0V0ZYME 234的管中，并轻柔地混合。将管横置楔入夹子中在以90rpm振荡温育多至1小时。将三十ml的IM山梨醇添加至每个管，并将管在室温(大约M-28°C)以377xg在Sorvall RT 6000B 浮筒式离心机(Thermo-Fischer Scientific,ffaltham,MA,USA)中离心 10 分钟。在倾去上清之后，将沉淀轻柔地重悬于Iml IM山梨醇中。然后添加三十ml的IM山梨醇，并将试管轻柔地颠倒若干次。将其在室温以377xg离心5分钟，并将沉淀轻柔地重悬于Iml IM 山梨醇。在轻柔地颠倒试管若干次之后，添加30ml IM山梨醇，并将试管轻柔地混合。在此时点从每个试管移出100 μ 1的等分试样，并添加至含有900 μ 1 STC的EPPENDORF 管以供计算原生质体浓度。将剩余的悬液在室温(大约M_28°C)以377xg离心5分钟。去除上清，并将沉淀重悬于STC SPTC DMSO(9 1 0. 1)从而使得原生质体的终浓度为每ml 5xl07。立即将原生质体用于共转化。实施例6 将 pEJG61 和 pWTY1449-01_02 共转化入镶片镰孢 WTY842-01-11将两ml新鲜生成的镶片镰孢WTY842-01-11原生质体(5x107ml)与体积80 μ 1 中的环状PEJG61和pWTY1449-02-01各50μ g(每种40 μ 1) 一同添加至50ml灭菌的离心管。将原生质体和DNA轻柔地混合，然后在冰上温育30分钟。缓慢添加一百μ SPTC 并轻柔地混合。将试管在室温)温育10分钟。缓慢添加八ml的SPTC并通过轻柔地涡旋混合。然后将试管在室温(^rc )温育10分钟。然后将反应物分至十个灭菌的 50ml管(lml/管)。然后将三十五ml的VNO3RLMT培养基(顶层琼脂糖)逐次添加至一个管，并通过轻柔地颠倒三次来混合。然后将每个试管的内容物倾至含有35ml补充以每 ml iang的BASTA 的VNO3RLMT培养基的预倾板之上。将板储藏于ChexAll Instant Seal Sterilization Pouches 3_4日，然后转移至塑料袋中再储藏7_8日。将板上产生的菌落亚培养于VN03RLMT-BASTA 板。推定的转化体命名为镶片镰孢WTY1449-03-01至四。实施例7 =BASTAtm抗性转化体的表型分析将镶片镰孢转化体WTY1449-03-01至四在另外三个培养基上筛选(1)补充以不同浓度的 FdU (0-500 μ Μ)的 VNO3RLMT 培养基；(2) VN03RLMT-BASTA 和(3) VN03RLMT-BASTA -FdU (后者补充以0至500 μ M的FdU)。将板在开放的塑料袋中在环境温度(^TC )温育多至15日。推定的转化体的百分之四十是共转化体(表型上)，即能够在 VN03RLMT-BASTA 上生长，但不能在补充了不同浓度的FdU的VNO3RLMT培养基或补充了不同浓度的FdU的VN03RLMT_BASTA 培养基上生长。实施例8 推定的bar+，tk+共转化体的基因型分析对于五个表型为bar+，tk+的共转化体(实施例7)，将四个小栓从生长于VN03RLMT+BASTA 培养基上的7日龄培养物(描述于实施例1)切出，并接种入含有25ml M400培养基的带挡板的125ml摇瓶中以生成用于DNA提取的生物质。将摇瓶在以 150rpm振荡温育4日。然后通过灭菌的MIRACL0TH 收获生物质。将生物质用200ml灭菌蒸馏水彻底润洗，使用戴手套的手挤压，并使用干净的长镊子浸于液氮中。将冰冻的生物质立即加工或在_80°C在灭菌的50ml塑料管中暂时储存。在杵和研钵中磨碎生物质之后，使用DNEASY Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)依照生产商的指示只是将起始裂解温育(由生产商建议的10分钟)延长至90分钟来提取基因组DNA。 DNA 使用NANODROP ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)定量。然后将含有8yg DNA的来自每个储备的等分试样使用SPEEDVAC Concentrator (Thermo-Electron Corp.，Waltham，MA，USA)浓缩至干燥，其后将 60 μ 1 IOmM Tris ρΗ 8.0添加至每个样品并混合。将来自每个菌株的八微克DNA用Eco RI消化，对选定菌株还用Bam HI消化。Eco RI反应物由IX Eco RI缓冲液，8 μ g DNA, 65单位Eco RI，并用灭菌水调至终体积100 μ 1 组成。在37°C温育10小时之后，添加上样缓冲液(40%蔗糖，5mM EDTA，0. 025%溴酚蓝， 0. 025%二甲苯蓝)，并将样品上样至四个琼脂糖凝胶上，将其在TBE缓冲液中在60伏运行5小时。BamHI 限制性消化物由 IX NEB缓冲液3(New England Biolabs Inc. ,Ipswich, MA, USA),8y g DNA，65单位Bam HI，每ml 100 μ g牛血清白蛋白并用灭菌水调至终体积 100 μ 1组成。在37°C温育10小时之后，添加上样缓冲液，并将样品上样至琼脂糖凝胶上，然后在60伏在TBE缓冲液中运行5小时。在溴化乙锭染色并脱色之后，从凝胶使用HYB0ND N尼龙膜(Amer sham Biosciences, Buckinghamshire, UK)如下制备 Southern 印迹。脱嘌呤是在 0. 25N HCl 中在
轻柔振荡10分钟继以在在灭菌蒸馏水中进行5分钟洗涤来进行的。在洗涤之后， 进行两个变性反应使用0. 5N NaOH/1. 5MNaCl轻柔振荡反应15分钟(第一反应)和20分钟(第二反应)。之后进行另一次洗涤在灭菌水中在M_26°C轻柔振荡洗涤2分钟。最终洗涤之后进行两次中和反应，分别在对_261使用1. 5M NaCl, 0. 5M Tris ρΗ 7. 5和0. 001M EDTA轻柔振荡反应30分钟。然后将膜使用TURBO BLOTTER Kit (Schleicher &khuell， Keene，NH, USA)在M_26°C在10X SSC中印迹过夜。将膜在M_26°C在2X SSC中振荡洗涤5分钟。然后将膜在M_26°C空气干燥10分钟，使用STRATALINKER (Stratagene，La Jolla，CA，USA)(用自动设定，其生成120mJ/cm2的总剂量)的UV交联，并最终在真空烤箱中在80°C烘烤1小时。如下所示的用于产生bar-和tk基因特异性探针的引物是使用Vector NTI 软件(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)设计的。bar基因正向引物#996023 5，-CGAGTGTAAACTGGGAGTTG-3，(SEQ ID NO 3)bar基因反向引物#996024 5，-GAGCAAGCCCAGATGAGAAC-3，(SEQ ID NO 4)tk基因正向引物#998744 5，-GGCGATTGGTCGTAATCCAG-3，(SEQ ID NO 5)tk基因反向引物#998745
5，-TCTTCGACCGCCATCCCATC-3” (SEQ ID NO 6)将bar和tk基因的DIG标记的探针使用PCR DIG Probe Synthesis Kit依照生 /^ ' (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA) 。 环之后，将反应物置于冰上，在微离心机中短暂离心，然后上样于琼脂糖凝胶。在TBE缓冲液中电泳之后，将预计大小的条带切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit凝胶纯化。将滤纸在 35ml DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)中在玻璃管中在42°C预杂交3小时，之后去除DIG Easy Hyb，并用7. 5ml新鲜DIG Easy Hyb加上10 μ 1标记的探针替代，将其煮沸5分钟然后置于冰上(S卩，使用了得自PCR 反应的凝胶纯化的DNA的大约30% )。在杂交炉中在42°C实施12小时杂交。在室温在 2XSSC，0. SDS中实施两次5分钟的杂交后洗涤，然后在65°C在0. 2X SSC, 0. SDS中两次15分钟洗涤。后续的洗涤和检测是使用DIG Wash和Block Set.Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments CDP-Star Chemi-Iuminescent 底物(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN,USA)依照生产商的推荐进行的。通过表型(实施例7)和Southern(此实施例)分析确证为真正的bar+，tk+共转化体的一个镶片镰孢菌株命名为镶片镰孢 WTY1449-03-03。实施例9 从镶片镰孢bar+，tk+共转化体消除tk基因如实施例5中所述，在RA+BASTA 培养基中诱导镶片镰孢菌株WTY1449-03-03的孢子形成。然后对所述孢子就其在补充FdU的培养基上的生长(其应诱导tk基因的丧失) 进行筛选。通过用四个切自该株的新鲜培养物的栓接种25ml RA培养基，获得了 1.06x10s 个孢子。使用该孢子储备以制备一系列稀释物以供铺板于15mm直径补充FdU的VNO3RLMT 板和未补充的VNO3RLMT板(后者用于存活率估计)。将孢子(100至IxlO7个)铺于重复的板上，并在大约在 ChexAll Instant Seal Sterilization Pouch 中温育 5 日。对五个选定的菌落进行了 Southern分析(使用实施例8中所述的bar和tk探针)，当使用实施例7中所述的方法将所述菌落亚培养于25 μ M FdU中时其能够生长。 其结果解释了所有五个单一孢子分离物均消除了 tk基因。一个菌株命名为镶片镰孢 WTY1449-09-0I0实施例10 确证尿苷的补充抵消了 tk携带转化体的FdU敏感表型为了优化用于pyrG-缺失菌株(其需要尿苷补充以供存活)的基因缺失系统，确定对生长培养基补充尿苷是否干扰tk+株的FdU敏感性的机理是重要的。为此，使bar+，tk+ 株镶片镰孢 WTY1449-03-03 在 VN03RLMT_BASTA 板(如实施例1中所述)上再生，并如实施例5中所述诱导产生孢子。在收获和洗涤之后，将孢子铺板 (每14cm直径板50，000个孢子)于含有50 μ M FdU和不同浓度的尿苷(0. I-ImM)的补充了 FdU 的 VNO3RLMT 板。将这些板在 28°C在 ChexAll Instant Seal Sterilization Pouch 中温育6日，之后就生长对其进行评价。尽管未在无尿苷的补充了 FdU的VNO3RLMT板上观察到生长，但在补充了所有浓度 (0. I-ImM)的尿苷和FdU的VNO3RLMT上均发生了 tk+株的大量生长。该情况使得在含有 FdU的培养基上分辨tk-株与tk+株变得困难或不可能。其结果，必需优化尿苷和FdU浓度以确定是否存在会使得tk+和tk-株在补充了 FdU和尿苷的培养基上能够分辨的任何组合
31(实施例15和16)。实施例11 :pEmY21的生成从质粒pPHTI (Cummings 等，1999，Current Genetics 36 :371-382)使用下述引物扩增大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因G)NA序列为SEQ ID NO :7而推导的氨基酸序列为 SEQ ID NO :8)。正向引物5，-GGGttcgaaTTCATTTAAACGGCT-3，(SEQ ID NO 9)反向引物5' -GGGagcgctCAATATTCATCTCTC-3 (SEQ ID NO 10)将由下划线序列表示的限制性位点Bst BI (正向引物)和Eco 47111(反向引物) 工程引入所述引物以供克隆。(用于扩增 hpt 基因)的 PCR 反应物由 IX ThermoPol Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)，200 μ M dNTPs，50pmol 正向和反向引物，IOOpg ρΡΗΤ1，1 单位 Vent DNA 聚合酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich, MAUSA)并用灭菌蒸馏水调至总体积100 μ 1组成。该扩增反应使用ROBOCYCLER 实施，其程序为在95°C进行1个循环2分钟，25个循环，每个在95°C进行1分钟，51°C进行1分钟和72°C进行2分钟，并在 72 °C进行1个循环7分钟。将PCR产物在40mM Tris碱_20mM乙酸钠-ImM EDTA 二钠(TAE)缓冲液中通过
琼脂糖凝胶电泳分离。将1.81Λ片段从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit提取琼脂糖。然后将凝胶纯化的片段使用TOPO Blunt Cloning Kit克隆入 pCR -BluntII-TOPO (Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)。所得的质粒命名为 pEmYlO。使用QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla,CA,USA)依照生产商的指示使用如下所示的引物将Eco RI位点从pEmYlO中hpt基因的编码序列去除，所述引物中小写字母代表靶Eco RI位点的未突变的核苷酸而下划线字母代表突变的核苷酸。所得的质粒命名为PBK3。正向引物5' -GGGTACCCCAAGGGCgTattcTGCAGATGGG-3' (SEQ ID NO 11)反向引物5' -CCCATCTGCAgaatAcGCCCTTGGGGTACCC-3 ‘ (SEQ ID NO :12)将所得不含所述Eco RI位点的hpt基因从pBK3使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。正向引物5，-GGRRtaccTTCATTTAAACGGCTTCAC-3，(SEQ ID NO 13)反向引物5' -GGRRtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3 (SEQ ID NO 14)下划线部分代表引入用于克隆的Kpn I位点。将米曲霉pyrG基因的部分用于生成直接重复，并使用下述引物从pS02 (W0 98/12300)进行 PCR 扩增重复1
正向引物5，-TCCcccgggTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO 15)反向引物5' -GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3 (SEQ ID NO 16)重复2 正向引物5，-GGggtaccTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO 17)反向引物5 ’ -TCCcccgggCGACCAGCAGACGGCCC-3’ (SEQ ID NO 18)下划线部分代表引入用于克隆的限制性位点Sma I (cccggg)或Kpn I (ggtacc)。将三个片段(hpt，重复#1和重复#2)在不同的反应(各50μ1)中扩增，所述反应物由 IX ThermoPol Buffer, 200 μ M dNTPs，0. 25 μ M 每种引物，50ng 模板 DNA 和 1 单位 Vent DNA聚合酶组成。所述扩增反应使用ROBOCYCLER 进行，其程序为在95°C进行一个循环2分钟，30个循环，每个在95°C进行1分钟，61°C的进行1分钟和72°C进行2分钟，并在72°C进行1个循环7分钟。将PCR产物在TAE缓冲液中通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。将大约21Λ 的扩增的hpt片段和大约0. 2kb的重复片段从凝胶切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将两个pyrG重复片段用Kpn I消化，用小牛小肠磷酸酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA, USA)脱磷酸，并用 MINELUTE Reaction Cleanup Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)依照生产商的指示处理。然后将携带重复#1和hpt的片段使用QUICK LIGATION Kit依照生产商的指示连接在一起，用 MINELUTE Reaction Cleanup Kit 处理，并使用TOPO Blunt Cloning Kit 克隆入 pCR -BluntII-TOPO 。序列分析确证了一个其中重复#1和hpt片段连接在一起的克隆。 该质粒命名为pEmY18。为了将第二个重复克隆入pEmY18，用Eco RV消化pEmy 18，并将消化物在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将5. 6kb片段从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将0. 2kb重复2片段(如上所述)和消化的pEmY18 使用QUICK LIGATION Kit连接在一起。将连接混合物用于转化SOLOPACK Gold Supercompetent Cells (Stratagene, La Jolla, CA, USA)。序列分析鉴定了其中三个组分 (重复#1、hpt和重复#2)为所需的顺序和取向且无PCR错误的质粒。所得的质粒命名为 pEmY20o为了确保后续用Eco RI对pEmY20的消化会释放单一片段，使用 QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit依照生产商的指示和如下所示的正向和反向引物去除Eco RI位点。在序列验证之后，所得的质粒命名为pEmY21(图6)。正向引物5' -GGGTACCCCAAGGGCQTATTCTGCAGATGGG-3' (SEQ ID NO 19)反向引物5' -CCCATCTGCAGAATACGCCCTTGGGGTACCC-3' (SEQ ID NO 20)实施例12 构建质粒PDM156. 2，其携带并入镶片镰孢乳清苷-5’ -单磷酸脱羧酶(pyrG)基因的基因组DNA片段粗糙脉孢菌乳清苷-5’ -单磷酸脱羧酶(pyr-4)基因的探针(DNA序列为SEQ ID NO :21而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 22)通过掺入异羟基洋地黄毒甙元标记的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)的PCR使用下述引物来制备。引物(有义)5，-GTCAGGAAACGCAGCCACAC-3，(SEQ ID NO 23)引物(反义)5，-AGGCAGCCCTTGGACGACAT-3，(SEQ ID NO 24)将质粒 pFB6 (Buxton 等，1983，Molecular and General Genetics 190:403-405) 用Hind III消化，并将消化物通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳纯化。将1. 11Λ pyr-4片段切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商建议的实验方案进行琼脂糖提取。扩增反应物由 IX Taq DNA Polymerase Buffer (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA),5 μ 1 PCR DIG Labeling Mix(Boehringer Mannheim, Manheim, Germany)，IOng 的 1. Ikb Hind III pyr_4 片段，IOpmol 的有义引物，IOpmol 反义引物，以及 1 单位 Taq DNA 聚合酶(New England Biolabs Inc. , Ipswich,MA,USA)组成。将反应物在 ROBOCYCLER 中温育，其程序为在95°C进行1个循环3分钟，然后35个循环，每个在 95°C进行30秒，55 °C进行1分钟，和72°C进行1分钟。在72°C实施5分钟的最终延伸。将扩增翻译产物通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳纯化。将大约 0. 78kb的异羟基洋地黄毒甙元(DIG)标记的探针从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。如WO 99/60137所述，生成镶片镰孢株A3/5的基因组DNA文库，并克隆入lambda 载体EMBL4。使用DIG标记的探针筛选克隆入lambda载体EMBL4的镶片镰孢A3/5DNA的基因组文库。将lambda噬菌体与大肠杆菌K802细胞(New England Biolabs, Ipswich, ΜΑ, USA) —同铺板于具有附Z顶层琼脂糖的LB板。使用Sambrook等(Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版；J. Sambrook, Ε. F. Fritsch 禾口 Τ· Maniatis ；Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)的技术进行噬菌斑上移(plaque lift)至 HYB0ND 尼龙膜。DNA通过UV交联使用UVSTRATALINKER 结合于膜。然后将滤纸与0. 78kb DIG标记的粗糙脉孢菌pyr-4探针杂交。pyrG克隆的杂交和检测依照GENIUS System User' s Guide (Boehringer Hammhe im, Manheim, Germany)在 42°C 用由 5X SSC，35% 甲酰胺，0. 1% L-月桂酰肌氨酸(Iauroylsarcosine)，0· 02% SDS 和封闭试剂(BoehringerHammheim， Manheim, Germany)组成的杂交溶液来实施。使用的DIG标记的探针的浓度是2. 5ng每 ml杂交溶液。杂交DNA用碱性磷酸酶偶联的抗异羟基洋地黄毒甙元抗体(Boehringer Hammheim, Manheim, Germany)免疫检测，并用化学发光底物(Boehringer Hammheim, Manheim, Germany)Lumiphos 530来显现。DNA制备物是从推定的阳性lambda克隆使用 Lambda Midi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)来制备的。将来自上述鉴定的克隆的lambda DNA用Eco RI消化，并将其在TAE缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳。将3. 91Λ片段切出，并使用QIAEX Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.,Valencia, CA)进行琼脂糖提取。然后将该片段克隆入pUC118 (Viera和Messing，1987， Methods in Enzymology 153 :3_11)的EcoRI 位点。并用 2 μ 1 克隆反应物转化0NESHOT TOPlO感受态细胞。通过DNA测序分析来自八个所得的转化体的质粒DNA。选取一个具有所需序列的克隆并命名为PDM156. 2(图7)。pyrG片段携带整个编码区加上1. 3kb的启动子和1. 5kb的终止子。 实施例13 构建镶片镰孢pyrG缺失载体pEmY23将镶片镰孢pyrG编码序列Q678bp，DNA序列为SEQ ID NO 51，而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 52)通过用Eco RV和Mu I的消化从pDM156. 2切出(实施例 12)，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示进行凝胶纯化。分离pEm Y21的Sma I片段并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行凝胶纯化，并使用QUICK LIGATION Kit依照生产商的指示将两个凝胶纯化的片段连接在一起，并用 MINELUTE ReactionCleanup Kit处理，并将2 μ 1所得的连接物用于依照生产商的指示转化ONE SHOT 化学感受态T0P10细胞。使用BIOROBOT 9600从八个所得的转化体提取质粒DNA。对这些DNA筛选插入物的取向，就错误不存在进行测序，并选取一个具有正确插入序列的克隆，并命名为 pEmY23 (图 8)。实施例14 构建pyrG缺失的株EmYllM-46_4. 3将质粒pEmY23用Eco RI和Xmn I消化，并对其在TAE缓冲液中进行1 %琼脂糖凝胶电泳以分离3. 6kb的DNA片段。使用QIAQUICK GelExtraction Kit依照生产商的指示凝胶纯化该3. 61Λ片段，并将其用于转化镶片镰孢WTY842-1-11的原生质体，如实施例6中所述，有两点不同第一，仅使用一种类型的转化DNA(3. 61Λ的经Eco RI-Xmn I消化的pEmY23片段)，以及第二，转化体是在补充了 ImM尿苷和每ml 0. 125mg潮霉素B (Roche， Indianapolis, IN,USA)的VNO3RLMT上选择的。选取十个转化体以供在25ml未补充的M400 液体培养基中进行筛选，并还在VN03RLMT+lmM尿苷(用于生长的阳性对照)，VNO3RLMT+ImM 尿苷+每ml 0. 125mg的潮霉素B (用于转化的阳性对照)和未补充的VNO3RLMT (筛选pyrG 缺失)上的表型筛选中进行筛选。尿苷原养型的候选物可在三日内在液体培养基上鉴定， 而在七日内通过基于板的表型筛选中鉴定。一个选用于进一步筛选和孢子纯化的候选物命名为EmYlK4-46-4。对来源于该菌株的孢子纯化的分离物(如实施例21中所述获得，只是琼脂培养基是补充了 IOmM尿苷的VNO3RLMT)进行如上所述相同的筛选实验方案，并选取两个单独的孢子分离物用于Southern杂交分析以供与亲本株比较。这些孢子纯化的株命名为镶片镰孢 EmYl 154-46-4. 3 和 EmYllM-46_4. 5。如实施例8中所述从存在pyrG和缺乏hpt的镶片镰孢WTY842-1-11 (对照株)、 主要转化体镶片镰孢EmYl 154-46-4和单一孢子分离物镶片镰孢EmYl 1M-46-4. 3和 EmYllM-46-4. 5制备基因组DNA。将来自每个株的八微克DNA用Mu I和Mfe I消化。Stu I 反应物由 IX NEB 缓冲液 2 (New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA), 8 μ g DNA, 65 单位Mu I，并用灭菌水调至总体积100 μ 1组成。在37°C温育10小时之后，添加上样缓冲液(40%蔗糖，5mM EDTA，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯蓝)，并将样品上样于两个1%琼脂糖凝胶上，将其在TBE缓冲液中以60伏运行5小时。Mfe I限制性消化物由IX NEB缓冲液 4 (New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA), 8 μ g DNA，65 单位 MFe I 并用灭菌水
35调至总体积100 μ 1组成。在37°C温育10小时之后，添加上样缓冲液，并将样品上样于琼脂糖凝胶上，将其在TBE缓冲液中以60伏运行5小时。在溴乙锭染色和脱色之后，从凝胶使用HYB0ND N尼龙膜如下所述制备Southern 印迹。脱嘌呤是在0. 25N HCl中在轻柔振荡10分钟继以在在灭菌蒸馏水中进行 5分钟洗涤来进行的。在洗涤之后，进行两个变性反应使用0. 5N NaOH/1. 5M NaCl轻柔振荡反应15分钟(第一反应)和20分钟(第二反应)。之后进行另一次洗涤在灭菌水中在 ^TC轻柔振荡洗涤2分钟。最终洗涤之后进行两次中和反应，分别在^TC使用1.5M NaCl, 0. 5MTris pH 7. 5和0. OOlM EDTA轻柔振荡反应30分钟。然后将膜使用TURB0BL0TTER Kit在在IOX SSC中印迹过夜。将膜在在2X SSC中振荡洗涤5分钟。然后将在
膜空气干燥10分钟，使用STRATALINKER (用自动设定，其生成120mJ/cm2的总剂量) UV交联，并最终在真空炉中在80°C烘烤1小时。如下所示的用于产生pyrG和hpt基因特异性探针的引物是使用Vector NTI 软件(Invitrogen，Carl sbad, CA, USA)设计的。镶片镰孢pyrG正向引物5，-GCCATGCGATCCAGCGTTTGAATCC-3，(SEQ. ID NO 25)
镶片镰孢pyrG反向引物5，-GCGTCCGCAACTGACGATGGTCCTC-3，(SEQ.ID NO 26)大肠杆菌hpt正向引物5，-CAGATACCACAGACGGCAAGC-3，(SEQ. ID NO 27)大肠杆菌hpt反向引物5，-GGGCAGTTCGGTTTCAGG-3，(SEQ. ID NO 28)将pyrG和hpt基因的DIG标记的探针使用PCR DIG Probe Synthesis Kit依照生产商的实验方案生成。在循环之后，将反应物置于冰上，在微离心机中短暂离心，然后上样于琼脂糖凝胶。在TBE缓冲液中电泳之后，将预计大小的条带切出，并使用 MINELUTE Gel Extraction Kit 凝胶纯化。将滤纸在:35ml DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)中在玻璃管中在 42°C预杂交 3 小时，之后去除DIG Easy Hyb，并用7. 5ml新鲜DIG Easy Hyb加上10 μ 1标记的探针替代(由PCR 反应扩增的凝胶纯化的DNA的大约30% )，将其煮沸5分钟然后置于冰上。在杂交炉中在 42°C实施12小时杂交。在室温在2X SSC,0. 1% SDS中实施两次5分钟的杂交后洗涤，然后是在65°C在0. 2X SSC,0. 1% SDS中的两次15分钟洗涤。后续的洗涤和检测是使用DIG Wash禾口 Block Set>Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments 禾口 CDP-Star Chemi-Iuminescent 底物(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生产商的推荐进行的。Southern杂交结果揭示镶片镰孢EmYl 154_46_4及其两个单孢子分离物 EmYl 154-46-4. 3 和 EmYl 154-46-4. 5 保持了 pyrG 缺失事件，并携带 hpt 基因。实施例15 :pyrG缺失的镶片镰孢株EmYllM-46_4. 3的孢子在补充尿苷和FdU的培养基上的萌发效率测试了来自pyrG缺失的镶片镰孢株EmYllM-46-4. 3的孢子在补充尿苷和FdU的培养基上的萌发效率。镶片镰孢EmYllM-46-4. 3的孢子如实施例5中所述使用补充了 IOmM尿苷的RA培养基生成。将200 μ 1体积的五十个孢子等分至45个补充了 0、25或50 μ M FdU 和0,0. 01,0. 05,0. 1或0. 25mM尿苷的VNO3RLMT板(Hcm直径)上。设置每种FdU和尿苷组合的三次重复的板并将其在26°C在ChexAll Instant Seal Sterilization Pouch中温
育10日。当尿苷浓度为0. OlmM时，镶片镰孢EmYllM-46_4. 3的孢子并不在25或50 μ M FdU的存在下萌发，但其在FdU不存在时在相同的培养基上容易地萌发。然而，当尿苷浓度为0. ImM时，pyrG缺失株的孢子在25和50 μ MFdU存在下可以以大约25%的频率萌发(与 FdU不存在时的75%的频率相比较)。实施例16 在低尿苷浓度在FdU补充基本培养基上分辨tk+和tk-株为了确定非常低的尿苷浓度是否在tk+株中赋予对FdU的抗性，实施了重构实验。 使用了 tk+株镶片镰孢WTY1449-3-3和tk-株镶片镰孢WTY1449-9-1。诱导每株的孢子并将其以每板50个孢子(镶片镰孢WTY1449-9-1)或每14em直径板50，000个孢子(镶片镰孢 WTY1449-3-3)铺板。此外，将 WTY1449-3-3 和 WTY1449-9-1 孢子(分别为 50 个和 50，000) 的组合混合并铺板。所有板含有补充了 50 μ M FdU的VNO3RLMT。板中尿苷浓度为1、0. 5、 0. 25或0. ImM。每种处理以三次重复实施。tk+株在所有板上以均一的雾状(haze)生长，唯独在缺乏尿苷的培养基上不生长。tk-株在所有浓度的尿苷，以及缺乏尿苷的培养基上生长良好。在混合板上，结果为纯的tk+和tk-株的板的结果的组合。在每个含有尿苷的板上，明显的tk-菌落重叠在tk+ 株雾状的背景生长之上。将出现在tk+和tk-孢子的混合物铺板的板上的菌落亚培养至补充了 50μΜ FdU (不含尿苷)的新鲜VNO3RLMT培养基板。还从背景生长(每个混合板3个菌落)将相同数量的样品亚培养至VN03RLMT+50yM FdU(不含尿苷)。此外，将菌落和背景生长从纯 tk-板和纯tk+板亚培养至VN03RLMT+50 μ M FdU(不含尿苷)板。这是为了评价(1)混合板上的背景生长(假定的FdU敏感、tk+株)之后是否会在缺乏尿苷情况下表现出预计的表型(对FdU敏感)；和( 假定的FdU抗性、tk-菌株是否会在这些情况下正常生长。在温育之后，显然tk+株绝对无法在50 μ M FdU存在下在缺乏尿苷的培养基上生长，而tk-株在50 μ M FdU存在下在缺乏尿苷的培养基上正常生长。尽管tk+在含有尿苷的混合板上有背景雾状生长，但tk-株是容易分辨的，并可容易地将其从补充了 0. ImM尿苷的含FdU培养基亚培养至不含尿苷的培养基，而没有被tk+株污染的危险，这正是要求保护的双重选择技术所需的。结果阐明了可成功地将tk基因在补充了尿苷的生长条件下用作阴性选择性标记 (与尿苷的补充消除了对FdU抑制作用的发表论断，例如Sachs等，1997，Nucleic Acids Research 25 :2389-2395 相反)。实施例17 构建质粒 pWTY1470-19-07将携带镶片镰孢trichodiene合酶(tri5)基因的5，和3，侧翼序列(DNA序列为 SEQ ID NO: 29，推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 30)的质粒pJRoy40 (美国专利7，332，341 号)用作模板以供扩增5’ tri5基因侧翼序列的部分。PCR反应物在终体积50 μ 1中含有 200 μ M dNTPs, IX Taq DNA 聚合酶缓冲液，125pg pJRoy40DNA，50pmol 每种下示引物和 1 单位Taq DNA聚合酶。
正向引物5，-GGGAGATCTTCGTTATCTGTGCC-3’ (SEQ ID NO 31)反向引物5，-GGGAGATCTTAGTAGTCGGCATTTGAAAC-3‘ (SEQ ID NO 32)(下划线的核苷酸显示引入的BglII位点)。将扩增反应物在ROBOCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环3分钟； 10个循环，每个在95°C进行30秒，在52°C进行45秒和在72°C进行2分钟；20个循环，每个在95°C进行30秒，在52°C进行45秒和在72°C进行5分钟；以及在72°C进行1个循环7 分钟。PCR产物通过使用TBE缓冲液的1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离。将大约600bp的片段从凝胶切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将片段使用 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)插入pCR 2. 1 (Invitrogen, 0^1让￡1(1丄4，旧4)，并用2111克隆反应物转化ONE SHOT T0P10感受态细胞。将来自八个所得的转化体的质粒DNA用Eco RI和Bgl II在不同的反应中消化，且三个具有正确的限制消化样式的转化体的插入通过DNA测序得到确证。选取一个具有所需序列的克隆并命名为 pWTY1470-09-05。通过用Bgl II消化从pWTY1470-09-05释放出携带tri5基因5，重复的608bp Bgl II片段，通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用 MINELUTE Gel Extraction Kit 进行琼脂糖提取。质粒ρJRoy40通过Bgl II消化线性化，之后将其使用虾碱性磷酸酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生产商的指示脱磷酸，并使用 QIAQUICK PCR Purification Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)纯化。将线性化的pJRoy40和凝胶纯化的Bgl II片段使用T4DNA连接酶(New England Biolabs Inc.， Ipswich, MA, USA)依照生产商的指示连接在一起。大肠杆菌SURE 化学感受态细胞 (Stratagene，LA Jolla,CA,USA)的转化依照生产商的指示加以实施。一个转化体通过DNA 测序确证含有所需的载体，即携带tri55’和3’侧翼序列并另外含有5’侧翼序列一部分的重复。所得的质粒命名为pWTY1470-19-07(图9)。实施例18 构建质粒 pWTY1515-02-01对质粒pWTY1470-19-07使用QUDCCHANGE Site-DirectedMutagenesisKit 依照生产商的指示以及如下所示的正向和反向引物进行体外诱变。正向引物5，-CAAGTAACAGACGCGACAGCTTGCAAAATCTTCGTTATCTGTG-3，(SEQ ID NO 33)反向引物5，-CACAGATAACGAAGATTTTGCAAGCTGTCGCGTCTGTTACTTG-3，(SEQ ID NO 34)该诱变去除了 1779bp处的Bgl II位点，并使得2386bp处的Bgl II位点变成唯一，并可用于后续的操作中以插入携带胸苷激酶(tk)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因盒的片段。将该诱变反应用于依照生产商推荐的实验方案转化试剂盒提供的大肠杆菌 XLlO-GOLD Ultra-感受态细胞(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。一个根据序列分析验证的携带如上所示的突变的转化体，命名为pffTY1515-02-01( 10)，并用作实施例19中的骨架。实施例19 :tri5缺失载体pJfyS1579-21_16的生成使用ADVANTAGE GC Genomic PCR Kit (Clonetech, Palo Alto, CA, USA)和如下所示的基因特异性正向和反向引物从质粒pEmY23 PCR扩增大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因盒。反向引物中的下划线部分是用于克隆的Bgl II位点。正向引物5，-TTGAACTCTCAGATCCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3，(SEQ ID NO 35)反向引物5，-CAGATAACGAAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3> (SEQ TD NO :36)PCR反应物在50 μ 1的终体积中含有362ng pEmY23作为DNA模板，200 μ m dNTPs, 1. ImM 乙酸镁，0·4μΜ 引物，IX GC Reaction Buffer (Clonetech, Palo Alto, CA, USA), 0. 5M GC Melt(Clonetech, Palo Alto,CA, USA)禾口 IX GC Genomic Polymerase Mix(Clonetech, Palo Alto, CA, USA)。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER (Eppendorf, Munich, Germany)中温育，其程序为在95°C进行1个循环2分钟；25个循环，每个在94°C进行30秒和66°C进行3分钟；和在66°C进行1个循环3分钟；以及在4°C维持。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1. 9kb的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit (QIAGENInc.，Valencia, CA, USA)进行琼脂糖提取。将所述片段使用TOPO TACloning Kit依照生产商的指示克隆入pCR 2. 1。将 ONE SHOT T0P10 感受态细胞 Qnvitrogen, Carlsbad, CA, USA)用 2 μ 1 TOPO TA反应物转化。来自8个转化体的质粒DNA的序列分析确证了与预计序列并无偏差，且该质粒命名为PJfySlM0-75-5(图11)。将hpt插入物通过用Bam HI和Bgl II的消化而从pJfySlM0-75_05释放，并在 TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳分离。将1. 9kb的片段切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。使用Rapid DNALigation Kit将该片段连接至经 Bgl II线性化的空tri5缺失载体pWTY1515-02-01 (实施例18)，其已经使用小牛小肠磷酸酶脱磷酸。将大肠杆菌SURE 化学感受态细胞用所述连接反应物转化，并将来自M个所得的转化体的质粒DNA通过用Eco RI的限制性消化分析确证插入的取向。选取了一个携带所需取向的插入的转化体并命名为pJfyS1579-l-13(图12)。将单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因(DNA序列为SEQ ID NO :37，而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 38)使用pWTY1449-2_l作为模板和如下所示的基因特异性正向和反向引物进行PCR扩增。粗体序列代表引入的Bgl II位点。正向引物5，-GCCGACTACTAGATCGACCGGTGACTCTTTCTGGCATGCG-3，(SEQ ID NO 39)反向引物5，-CAGATAACGAAGATCTGAGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGC-3，(SEQ ID NO 40)PCR反应物在50 μ 1的终体积中含有IX HERCULASE 反应缓冲液 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)，200 μ M dNTPs, 55ng pWTY1449-2_l，0. 2 μ M 引物，2 % DMSO 和 2· 5 单位HERCULASE DNA 聚合酶(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。
将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C 进行ι个循环ι分钟；25个循环，每个在94°C进行30秒，在60°C进行30秒，和在68°C进行 2分45秒；和在68°C进行1个循环2分45秒；并在4°C维持。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约2. Skb的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将所述片段使用TOPO TA Cloning Kit 克隆入pCR 2. 1。将 ONE SHOT T0P10 感受态细胞 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)用2 μ 1 TOPO TA反应物转化。来自一个转化体的质粒 DNA的序列分析在tk编码序列鉴定了一个突变(C1621G)，其导致甘氨酸至丙氨酸的氨基酸变化。使用QUIKCHANGE II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla,CA,USA)依照生产商的指示和如下所示的正向和反向引物校正了该突变。小写字母表示所需变化。16个克隆的序列分析导致选取其中一个，命名为pJfyS1579-8-6(图13)。正向引物5，-CCCTGTTTCGGGGCCCCGAGTTGCTGG-3，(SEQ ID NO 41)反向引物5，-CCAGCAACTCGGGGCCCCGAAACAGGG-3，(SEQ ID NO 42)将质粒pJfyS1579-08-06用Bam HI和Bgl II消化以释放所述2. 8kb tk片段，并如上所述纯化片段。将该片段使用QUICK LIGATION Kit连接于经Bgl II线性化并经小牛小肠磷酸酶处理的pJfyS1579-l-13，并用于依照生产商的实验方案转化大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。将所得的质粒命名为pJfyS1579-21-16(图14)并用作tri5缺失盒。实施例20 镶片镰孢转化方法将一百微克每种下述实施例中所述的缺失盒用Bst Z171/Bam HI (实施例21)或 Not I (实施例M、26、37和39)消化。将每个消化反应物在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit提取DNA条带。将所得的纯化DNA 在1. 5ml微离心管中通过乙醇沉淀来浓缩，即添加10%反应物体积的3M乙酸钠pH 5，然后添加2. 5体积的冰冷的乙醇(94% )并在冰上温育20分钟。然后将管在EPPENDORF 5424桌上离心机(Eppendorf,Hamburg,Germany)中以15，OOOxg离心10分钟。弃去上清， 并用Iml冰冷的70%乙醇洗涤沉淀，并将其以15，OOOxg离心5分钟。弃去上清并使沉淀风干。然后将沉淀重悬于70 μ 1 IOmM Tris pH 8缓冲液。所得的含DNA溶液的浓度使用 NANODROP 1000 分光光度计(ThermoFischer Scientific, ffaltham, MA, USA)确定。适当受体株的原生质体是通过下述方法生成。首先通过用含有VNO3RLMT培养基的 7日龄培养物的Ihlcm2琼脂栓接种2. 8L Fernbach烧瓶中的500ml的RA培养基(实施例 21)或补充了 IOmM尿苷的RA培养基(实施例M、26、37和39)并将烧瓶在以150rpm 振荡温育36小时来获得孢子。将孢子培养物经过灭菌MIRACL0TH 过滤，并将孢子捕获于 MILLIPORE STERICUP 0. 2 μ m 过滤单元(Millipore，Bellerica, MA, USA)之上。 用200ml灭菌玻璃蒸馏水洗涤孢子，并将其重悬于IOml灭菌玻璃蒸馏水。将一 ml的孢子溶液用于接种100ml补充了 5%葡萄糖的YP培养基(实施例21)或补充了 5%葡萄糖和IOmM尿苷的YP培养基(实施例M、26、37和39)。将接种的培养基在 17°C以150rpm振荡温育16小时。将培养物经过MIRACL0TH 过滤以收集菌丝体，然后使用灭菌的刮铲将其转移至50ml聚丙烯管。将菌丝体重悬于20ml在每ml IM的MgSO4中含有每ml 5mg 的 N0V0ZYME 234 和 5mg 的 GLUCANEX (两者均来自 Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)的原生质体化溶液，并转移至50ml聚丙烯管。将管在29. 5°C以90rpm振荡温育一小时，之后添加30ml IM山梨醇。然后将管以800xg在Sorvall RT 6000B浮筒式离心机 (ThermoFischer Scientific,ffaltham,MA,USA)中离心10分钟。弃去上清并将原生质体沉淀用30ml IM山梨醇洗涤两次。将管在SOOxg离心5分钟并弃去上清。将原生质体以切107 每ml的浓度重悬于过滤灭菌的9 1 0. 1 (v/v) STC SPTC DMSO的溶液中，并以受控冷冻速率使用 NALGENE Cryo 1°C Freezing Container(ThermoFischer Scientific, ffaltham, MA, USA)在 _80°C冷冻过夜。转化通过将原生质体在冰上融化并将200 μ 1原生质体添加至四个Hml管中的每一个来达成。将五μ g DNA (以少于10 μ 1)添加至前三个管中，而不将DNA添加至第四个管。然后将750 μ 1 SPTC添加至每个管，并将管轻柔倒转6次。将管在室温温育30分钟， 并将6ml STC添加至每个管。将每个转化物分为三部分，并添加至150mm直径板，其含有补充了每ml 125 μ g潮霉素的VNO3RLMT培养基(实施例21)或补充了每ml 125yg潮霉素和IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基(实施例M、26、37和39)，并在室温温育7日。实施例21 构建Δ tri5镶片镰孢株JfyS1604-47_02将镶片镰孢A3/5原生质体用经Bst Z171/Bam HI线性化的pJfyS1579-21_16使用实施例20所述方法转化。将转化体在含有每ml 125 μ g潮霉素B的VNO3RLMT板上选择。在第7日之后，将123个转化体中的48个亚培养至含有相同培养基的新板上。然后通过Southern分析来分析八个转化体如下。通过用来自如上所述获得的7日龄转化体的四个Icm琼脂栓接种25ml的M400培养基来生成这些株的真菌生物质。将培养物在28V以 150rpm振荡温育3日。去除琼脂栓，并将培养物经过MIRACL0TH 过滤。将收获的生物质用液氮冷冻，并使用研钵和杵磨碎菌丝体。使用DNEASY Plant Maxi Kit依照生产商的指示分离基因组DNA，只是65°C 的裂解温育期从10分钟延长至1. 5小时。将二 μ g基因组DNA用16单位的SphI和22单位的DraI在50 μ 1反应体积中在 37°C消化22小时。对消化物进行TAE缓冲液中的1. 0%琼脂糖凝胶电泳。将DNA在凝胶中通过用 0. 25M HCl 处理片段化，用 1. 5MNaCl-0. 5M NaOH 变性，用 1. 5M NaCl-IM Tris pH 8 中和，然后在 20X SSC 中使用 TURBOBLOTTER Kit 转移至NYTRAN Supercharge 尼龙膜(均来自 Whatman，Kent，UK)。将 DNA 使用 UV STRATALINKER UV 交联至膜上，并在 20ml DIG Easy Hyb中在42°C预杂交1小时。针对tri5基因的3’侧翼序列的PCR探针是使用下述正向和反向引物生成的。正向引物5' -GTGGGAGGATCTGATGGATCACCATGGGC-3' (SEQ ID NO 43)反向引物5' -CCGGGTTTCGTTCCGAACGATCTTTACAAGG-3' (SEQ ID NO 44)探针是使用PCR Dig Probe Synthesis Kit依照生产商的指示生成的。将探针在TAE缓冲液中通过1. 2%琼脂糖凝胶电泳纯化，并将对应于探针的条带切出，并使用 MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将探针煮沸5分钟，并添加至IOml DIG Easy Hyb以产生杂交溶液。杂交在42°C实施15_17小时。然后将膜在高严格条件下在室温在2X SSC加0. 1 % SDS中洗涤，然后在65 °C进行两次洗涤，每次在0. IX SSC加 0.1% SDS中进行15分钟。探针-靶杂交体通过化学发光测定法(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)依照生产商的指示检测。将一个如Southern分析确定的在tri5位点携带单一拷贝的缺失盒的转化体镶片镰孢JfyS1579-43-23通过从含有VNO3RLMT培养基的7日龄板使用灭菌牙签切下四个 Icm2栓并将其转移至含有25ml RA培养基的125ml带挡板的摇瓶来进行孢子形成。将烧瓶在以150rpm振荡温育48小时。将孢子培养物经过灭菌的MIRACL0TH 过滤，并收集于50ml聚丙烯管。使用血细胞计数器确定孢子浓度，并将IO5个孢子(Iml中)转移至含有补充了 50 μ M FdU的VNO3RLMT培养基的150mm板，并在温育4日。使用灭菌牙签挑取孢子分离物，并将其转移至含有补充了 10 μ M FdU的VNO3RLMT培养基的新板，并使其在 24- °C生长7日。将基因组DNA从7个孢子分离物提取，并如上所述实施Southern分析以确保盒从基因组正确切出。如预计，所有通过Southern印迹分析的孢子分离物切出了盒，留下一个重复序列。将一个孢子分离物通过如前述段落中所述在株中诱导孢子形成来纯化孢子一次，并使用血细胞计数器确定孢子浓度，并稀释至每ml 40个孢子。将一 ml的稀释孢子溶液铺板于含有VNO3RLMT培养基的150mm板，并将板在温育4日。将孢子分离物亚培养至含有VNO3RLMT培养基的新板，并将一个命名为镶片镰孢JfyS1604-17-02 ( Δ tri5)的孢子分离物用作缺失PyrG基因的起始株。实施例22 构建携带胸苷激酶(tk)阴性选择性标记和潮霉素磷酸转移酶(hpt) 阳性选择性标记的通用缺失载体。构建了携带胸苷激酶(tk)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)标记两者的通用缺失载体以便于装配后续的缺失质粒。靶向缺失的基因的5’和3’区域的侧翼序列在用Riie I或 Asc I (对于5’侧翼序列)以及Sbf I或Swa I (对于3’侧翼序列)消化载体之后可容易地连接于后者。为了 PCR扩增来源于镶片镰孢pyrG基因5’侧翼区域的直接重复，在两个PCR反应物中使用50皮摩尔如下所示的引物，所述反应物在50 μ 1的总体积中含有50ng pDM156. 2， IX Pfx Amplification Buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA,USA), 6 μ 1 IOmM dNTPs混合物， 2. 5 单位PLATINUM Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)和 1 μ 1 50mM MgSO4。引物重复 #1有义引物5，-GTTTAAACGGCGCGCC CGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCAGG-3，(SEQ ID NO 45)反义引物5，-TTGTCGCCCGGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3，(SEQ ID NO 46)重复#2有义引物5，-AGTATTCCCGGG CGACAAAACAAGGCTACTGCA-3，(SEQ ID NO 47)反义引物
5，-ATTTAAATCCTGCAGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3，(SEQ ID NO 48)将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，其程序如下。
对于重复#1 在98°c进行1个循环2分钟，然后5个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行30秒和68°C进行1分钟。接着进行35个循环，每个在94°C进行30秒，在59°C进行30 秒和68°C进行1分钟。对于重复#2，循环参数为在98°C进行1个循环2分钟；然后5个循环，每个在94°C进行30秒，在55°C进行30秒，和68°C进行1分钟。然后是35个循环，每个在94°C进行30秒，在56°C进行30秒，和68°C进行1分钟。在35个循环之后，将两个反应物(即重复#1和#2)在68°C温育10分钟，然后在10°C冷却直至进一步加工。将来自两个反应的PCR产物使用TAE缓冲液通过0. 8 % GTG-琼脂糖(Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, USA)分离。对于重复#1和重复#2，从凝胶切出大约 0. 26kb 的片段，并使用 Ultrafree -DA旋转杯(spin cup) (Millipore, Billerica, MA, USA)依照生产商的指示纯化。然后将十微升每种纯化的重复用于单一的重叠 PCR (overlapping PCR)反应，其反应物在50 μ 1的总体积中含有IX Pfx扩增缓冲液，6 μ 1 IOmM dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 混合物，2. 5 单位PLATINUM Pfx DNA 聚合物和 1 μ 1 50mM MgSO4。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，其程序为在
98°C进行1个循环2分钟，然后5个循环，每个在94°C进行30秒，在50°C进行30秒和68°C 进行1分钟。然后将反应物与预温的溶液混合，所述溶液在50 μ 1的终体积中含有50皮摩尔用于重复#1的有义引物和50皮摩尔用于重复#2的反义引物，IX Pfx扩增缓冲液，6 μ 1 IOmM dNTPs, 2. 5 单位PLATINUM Pfx DNA 聚合酶和 1 μ 1 50mM MgSO4。将新的100 μ 1的扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育， 程序为35个循环，每个在94°C进行30秒，在58°C进行30秒和68°C进行1分钟。在35个循环之后，将反应物在68°C温育10分钟，然后在10°C冷却直至进一步加工。将0. 5kb PCR 产物(携带所述重复装配体)如上所述通过0. 8% GTG-琼脂糖凝胶电泳分离。将质粒pCR4(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)用作用于构建通用缺失载体的载体骨架的来源。为了去除PCR4DNA的非必需部分，将2. 5μ g质粒pTter61C(W0 2005/074647) 顺序用 Bsp LUll I 和Bst XI 消化。然后用 Antarctic磷酸酶(New England Biolabs Inc., Ipswich,MA, USA)处理消化的载体。将3. Ikb经消化的骨架如上所述通过0. 8% GTG-琼脂糖凝胶电泳来分离。然后将纯化的重复装配体用Rapid Ligation Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN,USA)连接于纯化的载体骨架。连接反应物由75ng纯化的载体骨架和3μ 1纯化的重复装配体组成。将一微升该连接反应物用于使用生产商推荐的实验方案来转化化学感受态SOLOPACK Supercompetent 细胞 Gtratagene，Carlsl^ad， CA, USA) 0将二十四个转化体通过Nco I/Pme I限制性消化分析。二十四个转化体中的二十三个具有预计的限制消化样式。随机选择克隆PFvRs #10用于测序以确证无PCR诱导的错误。序列分析显示克隆PFvRs #10中的重复装配体具有预计的序列，并因此将其选作镶片镰孢通用载体的骨架，并命名为pAlLol492-M(图15)。将携带潮霉素磷酸转移酶(htp)基因的盒从pEmY23使用如下所示的基因特异性正向和反向引物进行PCR扩增。下划线序列代表Xma I位点，而粗体字母代表Bgl II位点。 在每个5’端的四个“a”使得PCR产物的末端能够进行后续的消化。
正向引物5，-aaaacccKggCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3' (SEQ ID NO :49)反向引物5，-aaaacccgggAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3，(SEQ ID NO :50)扩增反应物在50 μ 1的终体积中含有60ng pEmY23, 200 μ m dNTPs, ImM乙酸镁， 0. 4μΜ引物，IX Pfx Amplification Buffer,0. 5M GC Melt和2. 5单位PLATINUM Pfx 聚合酶。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，其程序为在95°C进行1个循环2分钟；10个循环，每个在94°C进行30秒，在60°C进行30秒和68°C进行1分 50秒；和在68°C进行一个循环7分钟，接着在4°C维持。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1. Skb的片段从凝胶切出，并使用MIMELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。随后将经凝胶纯化的PCR产物用Xma I消化，并在1 %琼脂糖凝胶上运行并如上所述再次凝胶纯化。将 QUICK LIGATION Kit用于将hpt PCR产物连接于经小牛小肠磷酸酶处理、经Xma I-线性化的pAlLol492-24。将所得的质粒命名为pJfyS1579-35_2 (图16)并用作受体以供插入胸苷激酶基因。单纯疱疹病毒tk盒的来源是质粒pJfyS 1579-08-06 (实施例19)，通过用Bam HI 和Bgl II的消化将该插入物释放。将消化产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离，并将对应于2. 81ibtk基因插入物的片段切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将QUICKLIGATION Kit用于将tk基因和连接于经小牛小肠磷酸酶处理的、经Bgl II-线性化的pJfyS1579-;35-02。所得的质粒命名为pJfyS1579-41_ll (图 17)并将其用作起始点以供构建pyrG、amyA、alpA和dpsl缺失载体。实施例23 :pyrG缺失载体pJfyS1604-55_13的生成将镶片镰孢A3/5pyrG基因(DNA序列为SEQ ID NO 51而推导的氨基酸序列碱 SEQ ID NO 52)的 3，侧翼序列使用 EXPAND High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和如下所示基因特异性正向和反向引物进行扩增。下划线部分是引入用于克隆的Sbf I位点，而斜体部分是引入用于之后的消化以在转化前去除质粒的pCR 2. 1部分的Not I位点。正向引物5，-aaaaaacctgcaggatcctgcgcggactcttgattattt-3' (SEQ ID NO :53)反向引物5' -aaaaaacctgcagggcggccgcaattccattcctgtagctgagtata-3' (SEQ ID NO :54)扩增反应物以50 μ 1的终体积含有125ng镶片镰孢A3/5基因组DNA，200 μ m dNTPs，0. 4μΜ 弓 I 物，含 5mM MgCl2 的 IX EXPAND Buffer (RocheDiagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和 2. 5 单位 EXPAND DNA 聚合酶 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN， USA) 。
Γ ±| Jx jS ^ EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环2分钟，10 个循环，每个在94°C进行30秒，进行30秒，和72°C进行1分钟；和20个循环，每个在 94°C进行30秒，54°C进行30秒，和72°C进行1分10秒。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳分离，并将0. 71Λ片段切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。 将0. 7kb PCR产物用SbfI消化，并通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳消化。将大约0. 7kb的片段从凝胶切出，并进一步使用Ultrafree -DA旋转杯(spin cup)纯化。将 0. 7kb 片段使用 QUICK LIGATI0N Kit 连接于 pJfyS1579-41-ll (其经 SbfI 消化并使用小牛小肠磷酸酶脱磷酸)，并将连接混合物用于依照生产商的实验方案转化大肠杆菌 SURE 化学感受态细胞。所得的质粒命名为pJfyS1604-35-13。将5，pyrG 侧翼序列使用EXPAND High Fidelity PCR System 和如下所示的基因特异性正向和反向引物来从pEmY23(实施例13)扩增。下划线部分是引入用于克隆的Pme I位点而斜体部分是引入用于之后的消化以在真菌转化前去除内酰胺酶基因的 Not I位点。正向引物5，-aaaaaagtttaaacgcggccgcctgttgcctttgggccaatcaatg-3' (SEQ ID NO :55)反向引物5，-aaaaaagtttaaacctagttggagtattgtttgttctt~3' (SEQ ID NO :56)扩增反应物含有20ng pEmY23,200ym dNTPs，0. 4 μ M 引物，含有 15mM MgCl2W IX EXPAND Buffer 和 2. 5 单位EXPAND DNA 聚合酶。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C 进行ι个循环2分钟；10个循环，每个在94°C进行30秒，53°C进行30秒，和72°C进行40 秒；和20个循环，每个在94°C进行30秒，53°C进行30秒，和72°C进行40秒，并在每个后续循环中另外加上10秒。将PCR产物使用MINELUTE PCRPurification Kit(QIAGEN Inc. ,Valencia, CA, USA)纯化。将纯化的PCR产物用Riie I消化并通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳分离。将大约0. 51Λ的片段从凝胶切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit 进行琼脂糖提取。将0. 51Λ片段使用QUICKLIGATION Kit连接于经Riie I消化和小牛小肠磷酸酶处理的pJfyS1604-35-13。连接反应物在20 μ 1反应体积中含有50ng载体，20ng 插入物，IX QUICK LIGATION Reaction Buffer (New England Biolabs Inc. ,Ipswich,MA, USA)，和10单位Quick T4DNALigase0将反应物在室温温育5分钟并将2 μ 1连接物用于依照生产商的指示转化大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。使用序列分析鉴定以所需取向含有插入的转化体，并确证无PCR错误。所得的质粒命名为pJfyS1604-55-13(图18)并用作 pyrG基因缺失盒。实施例M Δ tri5 Δ pyrG镶片镰孢株JfyS1643-18_2的生成将依照实施例20中所述的方法用经Not I消化和经凝胶纯化的pJfyS1604-55_13 转化的镶片镰孢JfyS1604-17-2(Atri5)的五十一个推定转化体用灭菌牙签从转化板转移至含有补充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在 M-28°C生长7日。然后对转化体通过将栓转移至两个VNO3RLMT(—个含有或且一个不含尿苷(IOmM))中的每一个进行表型分析。将九个在不含尿苷的板上呈现无生长或不良生长的转化体通过Southern分析进行分析。将来自9个转化体中的每一个的基因组DNA如实施例21所述进行提取，并将每个的2 μ g用观单位Mfe I和14单位Dra I消化。依照实施例21中所述的方法使用下述正向和反向引物生成了针对pyrG基因3’侧翼序列的PCR探针正向引物5’ -GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3，(SEQ ID NO 57)反向引物5' -GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3，(SEQ ID NO 58)Southern分析表明9个尿苷自养型中的2个以单一拷贝携带所述缺失盒，而其余维持该盒的异位整合(ectopic integration)。将一个转化体，镶片镰孢JfyS1604_85_5， 如实施例5中所述在含有IOmM尿苷的RA培养基中进行孢子形成，并将IO5个孢子铺板于含有补充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm板。将所得的孢子分离物亚培养至含有补充了 10 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板上，并随后通过 Southern分析进行分析以确保从基因组的正确切出。经分析的株均正确地切出了所述盒，并将一个株，镶片镰孢JfyS1643-10_3，如前述段落中所述进行孢子形成。使用血细胞计数器确定孢子浓度，并将储液稀释至40个孢子 /ml的浓度。将一 ml铺板于含有补充了 IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm板。将所得的孢子集落亚培养至含有补充了 IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板上，并将一个孢子分离物，镶片镰孢JfyS1643-18-2(Atri5ApyrG)用作供缺失镶片镰孢α-淀粉酶A基因 (amyA)的株。实施例25 :amyA缺失载体pJfyS1604-17_2的生成为了获得上游和下游侧翼序列的信息以供完全去除镶片镰孢amyA基因(DNA 序列为SEQ ID NO :59而推导的氨基酸序列间SEQ ID NO 60)，使用了 GENOME WALKER Universal Kit (Clonetech, Palo Alto, CA, USA) 对每个用该试剂盒生成的镶片镰孢A3/5 基因组DNA文库使用如下所示的5’基因特异性引物和5’嵌套引物进行两轮针对5’侧翼序列的PCR。3’侧翼序列使用如下所示的3’基因特异性引物和3’嵌套引物获得。5’基因特异性引物5，-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3，(SEQ ID NO 61)5’嵌套引物5，-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3，(SEQ ID NO 62)3’基因特异性引物5，-CTACACTAACGGTGAACCCGAGGTTCT-3，(SEQ ID NO 63)3，嵌套引物5' -GCGGCAAACTAATGGGTGGTCGAGTTT-3‘ (SEQ ID NO 64)初级PCR反应物在50 μ 1的反应体积中含有IX HERCULASE ReactionBuffer, 2 μ 1每种基因组DNA文库(如试剂盒中所述生成)，200ηΜ试剂盒提供的APl(接头引物1)，200ηΜ基因特异性引物(见上)，200μΜ dNIPs和2.5单位 HERCULASE DNA 聚合酶。初级扩增在EPPENDORF MASTERCYCLER 中实施，程序为7个循环，
每个在94°C进行25秒，72°C进行3分钟，和32个循环，每个在94°C进行25秒，和67°C进行 3分钟以及在67°C进行1个循环7分钟。次级PCR反应物在50 μ 1的反应体积中含有IX HERCULASE ReactionBuffer, 1 μ 1各初级PCR反应物，200ηΜ试剂盒提供的ΑΡ2 (接头引物2、，200ηΜ基因特异性嵌套引物(见上)，200 μ M dNTPs和2. 5单位HERCULASE DNA聚合酶。次级扩增在EPPENDORF MASTERCYCLER 中实施，程序为5个循环，
每个在94°C进行25秒，和72°C进行3分钟，以及20个循环，每个在94°C进行25秒和67V 进行3分钟，以及在67°C进行1个循环7分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约0. 7kb的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit依照生产商的指示纯化。将 PCR产物使用如上所述相应的嵌套引物和试剂盒提供的引物2直接进行测序。将获得的序列用于设计引物以扩增amyA基因5’侧翼序列的11Λ区和3’侧翼序列的0. 7kb区以供插入空的缺失载体pJfyS1579-41-ll。将amyA3’侧翼序列从镶片镰孢A3/5基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。正向引物5，-AAAAAAcctgcaggTAATGGGTGGTCGAGTTTAAAAGTA-3，(SEQ ID NO :65)反向引物5，-AAAAAAcctgcagggcggccgcTTTAAGCATCATTTTTGACTACGCAC-3，(SEQ ID NO :66)下划线字母代表用于之后去除β -内酰胺酶的Not I位点，而斜体字母代表用于载体克隆的SbfI位点。扩增反应物含有IX HERCULASE Reaction Buffer, 120ng 基因组 DNA 模板， 400nm引物，200 μ M dNTPs和2. 5单位HERCULASE DNA聚合酶。将扩增反应物在 EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环2分钟；10 个循环，每个在94°c进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行1分钟；和20个循环，每个在 94°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行1分10秒。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约0. 7kb的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。用SbfI消化PCR片段以产生粘性末端。将该片段插入经SbfI-线性化、小牛小肠磷酸酶处理的通用缺失载体pJfyS1579-41-ll。连接反应物在20 μ 1的反应体积中含有80ng载体，80ng插入物，IX QUICK LIGATI0N Reaction Buffer 和 10 单位 Quick T4DNALigase。将 1· 5 μ 1 体积的连接反应物用于依照生产商的指示转化100 μ 1大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。使用用Eco RI的限制性分析和序列分析就插入物取向筛选克隆，鉴定出不含PCR错误的克隆。 该质粒命名为pJfyS1579-93-l (图19)并用作5’ amyA侧翼序列插入物的受体。使用下示的正向和反向引物PCR扩增5’ amyA侧翼序列。下划线的碱基代表用于bla基因去除的Not I位点，而其它小写字母代表Riie I位点以确保所述片段是平端的 (blunt)以克隆入平端的载体位点。正向引物5 ‘ -AAAAAAgtttaaacGCGGCCGCTTGATTATGGGATGACCCCAGACAAGTGGT-3‘ (SEQ IDNO 67)反向引物5，-AAAAAAgtttaaacCCGCACGAGCGTGTTTCCTTTTCATCTCG-3，(SEQ ID NO :68)
PCR扩增与上述相似，只是循环参数不同。将扩增反应物在 EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环2分钟；10 个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行1分15秒；和20个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行1分15秒，并在每个后续的循环额外进行 10秒。PCR产物通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳分离。将大约11Λ的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit从凝胶纯化。用Rne I消化该11Λ片段以产生平端，并将该插入物克隆入经Riie I-消化、经小牛小肠磷酸酶脱磷酸的 pJfyS1579-93-l。连接反应物在20 μ 1反应体积中含有75ng载体，IOOng插入物，1XQUICK LIGATION Reaction Buffer 和 10 单位 Quick T4DNA Ligase0 在 5 分钟的温育之后， 将2μ 1连接反应物用于依照生产商的指示转化100 μ 1大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。使用序列分析确证插入物为正确的取向并不含PCR错误。鉴定所得的载体命名为 pJfyS1604-17-2(图 20)。实施例洸Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA镶片镰孢株JfyS1643-95_04的生成将依照实施例20中所述方法用经Not I消化和凝胶纯化的pJfyS1604-17_02转化的镶片镰孢JfyS1643-18-02(Atri5ApyrG)的五个推定的转化体用灭菌牙签从转化板转移至含有补充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在 2448°C温育7日。对于Southern分析，将2 μ g基因组DNA用25单位kp I消化。依照实施例21中所述方法使用如下所示的正向和反向引物生成针对amyA基因5’侧翼序列的 DIG探针。正向引物5，-GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3，(SEQ ID NO 69)反向引物5' -GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3，(SEQ ID NO 70)Southern分析如实施例21中所述加以实施，其结果表明五个转化体中的两个用缺失盒的单独整合物替代了编码序列。将命名为镶片镰孢JfyS1643-73-02的初级转化体如实施例5中所述进行孢子形成，并将IO5个孢子铺板于含有补充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm直径板。将获得的孢子分离物亚培养至补充了 10 μ M FdU和 0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板。对两个镶片镰孢孢子分离物(JfyS1643-83_02和JfyS1643-83_04)进行一次孢子纯化，得到株 JfyS1643-95-l 和 JfyS1643_95_2 (来自 JfyS1643-83_02)和 Jfys 1643-95-04(来自JfyS1643-83_04)。将从FdU板挑取的起始孢子分离物，以及其相应的一次孢子纯化分离物通过Southern分析进行分析以确保从基因组的正确切出。所有分析的株正确地切出了该盒。将镶片镰孢JfyS1643-95-04(Atri5ApyrG Δ amyA)用作用于缺失镶片镰孢碱性蛋白酶A基因(alpA)的株。实施例27 构建质粒pEJG69将Microdochium nivale 乳糖氧化酶(LOx)基因(DNA 序列为 SEQ ID NO 71 而推导的氨基酸序列为 SEQ ID NO 72)从 pEJG33 (Xu 等，2001，European Journal ofBiochemistry 268 :1136-1142)使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。正向引物5' -CCCGCATGCGTTCTGCATTTATCTTG-3‘ (SEQ ID NO 73)反向引物5' -GGGTTAATTAATTATTTGACAGGGCG-3‘ (SEQ ID NO 74)下划线部分代表引入用于克隆的sphl (正向)或I^c 1(反向)位点。PCR 在 50μ 1 的终体积中含有 200μΜ dNTPs，1 μ M 每种引物，50ngpEJG33，IX Pwo 缓冲液(Promega, Madison, WI, USA)禾口 1 μ 1 的 Pwo Hot StartPolymerase (Promega, Madison, WI, USA)。将扩增反应物在ROBOCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环2分钟； 10个循环，每个在95°C进行30秒，55°C进行45秒，和72°C进行1分钟；20个循环，每个在 95°C进行30秒，55°C进行45秒，和72°C进行1分钟，在每个后续循环中另外进行20秒延伸；和在50°C进行1个循环10分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1. 5kb的片段从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。使用相同的条件重新扩增乳糖氧化酶基因，并如上所述进行纯化，只是将聚合酶和缓冲液分别用iTaq DNA聚合酶和I1aq DNA Polymerase Buffer替代，并用经凝胶纯化的上述PCR产物作为模板。将PCR产物使用TOPO TACloning Kit克隆入pCR 2. 1以确保无PCR错误。将所得的无错误质粒用SphI消化，用T4DNA聚合酶(New England Biolabs Inc. ,Ipswich，MA，USA)处理，使用QIAQUICK Nucleotide Removal Kit(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)纯化，并用I^c I消化。将该片段在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并将大约1. 5kb的片段从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel ExtractionKit 进行琼脂糖提取。将质粒pEJG61用Bsp LUllI消化，依照生产商的指示用Klenow DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA, USA)处理，然后用Pac I消化。将消化的质粒在 TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，并将81Λ片段切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit将其进行琼脂糖提取。将Lox编码序列使用T4DNA Ligase依照生产商的指示连接于Bsp LUllI-和Pac I-消化的PEJG61。通过序列分析筛选质粒以确保不含PCR错误，并鉴定了一个所得的质粒， 将其命名为pEJG69(图21)。实施例28 构建质粒pEJG65将质粒pEJG61 (实施例4)用Bsp LUllI消化，用Klenow DNA聚合酶处理并用Pac I消化。将消化的质粒在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳分离，并将8. Ikb片段切出， 并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit从琼脂糖纯化。将南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶编码序列(DNA序列为SEQID NO 75而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 76)从pMT12^(W0 94/01541)使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。正向引物5' -GCATGCGAGTGTCCTTGCGC-3，(SEQ ID NO 77)
反向引物5，-TTAATTAACTAAGGTGGTGTGATG-3，(SEQ ID NO 78)PCR 反应物含有 200 μ M dNTPs, 1 μ M 每种弓| 物，20ng pMT1229, IXPwo 缓冲液 (Promega, Madison, WI, USA),禾口 1 μ 1 Pwo Hot Start Polymerase (Promega, Madison, WI, USA)。将扩增反应物在ROBOCYCLER 中温育，其程序为在94°C进行1个循环2分钟；10个循环，每个在94°c进行30秒，55°C进行45秒，和72°C进行1分钟；17个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行45秒，和72°C进行1分钟，在每个后续循环中另行进行20秒的延伸；以及在72°C进行1个循环10分钟。将PCR产物在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳分离，并将1. 4kb片段接触， 并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将PCR片段使用TOPO TA Cloning Kit克隆入pCR 2. 1以验证不含PCR错误。由于该基因编码序列中内部Sph I位点的存在，将南极假丝酵母脂肪酶A编码序列从pCR 2. 1作为两个不同的片段通过分别消化来释放。为了释放第一片段(11Λ)，将质粒用Sph I消化并用T4DNA聚合酶处理。将该聚合酶在75°C热失活10分钟，并用Nhe I消化质粒。将第二片段(0. 4kb)用Nhel/Pac I消化从质粒释放。对两个消化物进行TAE缓冲液中的琼脂糖凝胶电泳并将来自Sph I/Nhe I消化的11Λ片段和来自Nhe I/Pac I消化的0.41Λ片段切出，并使用QIAQUICK (}el Extraction Kit进行琼脂糖纯化。将两个片段使用jM DNA连接酶连接于消化的pEJG61。连接反应物含有IX LigationBuffer (New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA，USA)，IOOng 上述 Ikb 片段，50ng 0. 4kb 片段，50ng 消化的PEJG61和10单位T4DNA连接酶。将反应物在室温温育16小时，并用其依照生产商的指示转化大肠杆菌XLIO-GOLD Ultra-感受态细胞。通过序列分析筛选转化体，并鉴定了一个含有具有所需无错误编码序列的质粒的克隆，并命名为PEJG65(图22)。实施例29 构建质粒pMStrl9通过将来自pA2W!lO(WO 1998Λ6057)的尖镰孢磷脂酶基因克隆入镶片镰孢表达载体pDM181(W0 2000/56900)来构建质粒pMStrl9。使用PCR扩增来分离方便DNA片段上
的磷脂酶基因。尖镰孢磷脂酶基因具体是使用标准扩增条件用Pwo DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals,Basel, Switzerland)和45°C的退火温度用如下所示的引物从pA2PhlO扩增的。PLMStrlO 5，-TCAGATTTAAATATGCTTCTTCTACCACTCC-3‘ (SEQ ID NO 79)SwaIPLMStrll 5，-AGTCTTAATTAAAGCTAGTGAATGAAAT-3，(SEQ ID NO 80)将所得的DNA片段凝胶纯化，并用Swa I消化。还用Swa I消化质粒pDM181，并将其脱磷酸。然后将DNA片段连接在一起以产生质粒pMMrlS。将在两个使用连接混合物生成的单独的大肠杆菌pMStrlS转化体，#4和#17中的磷脂酶基因使用标准引物步移方法测序。两者都在基因中的不同位置获得了单一的点突变。突变由Nar I位点分隔，所述Nar I切割pMMrlS两次。因此通过如下将不含错误的磷脂酶基因装配在镰孢属表达载体PDM181中用Nar I消化pMMrl8#4和pMMrl8#17，分离不含错误的片段，并将其连接在一起以产生PMMr 19 (图23)。使用标准方法确证了 pMStrl9 中的磷脂酶序列。 实施例30 构建质粒pEJG49镶片镰孢表达载体pEJG49是通过修饰pSheBl (W0 2000/56900)生成的。所述修饰包括(a)通过定点诱变去除一个pSheBl序列内的Bsp LUllI位点；(b)去除850bp的尖镰孢胰蛋白酶启动子；(c)通过接头连接引入Bsp LUllI位点以助于插入21Λ镶片镰孢葡糖淀粉酶启动子；和(d)引入尖镰孢磷脂酶基因。pSheBl 序列之内 Bsp LUllI 位点的去除是使用 QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit依照生产商的指示用下述诱变引物对完成的。5' -GCAGGAAAGAACAAGTGAGCAAAAGGC-3‘ (SEQ ID NO 81)5' -GCCTTTTGCTCACTTGTTCTTTCCTGC-3‘ (SEQ ID NO 82)这产生了 pSheBl中间物1。930bp的尖镰孢胰蛋白酶启动子的去除是通过如下完成的用Mu I和I^cI消化pSheBl中间物1 (6，971bp)，对消化物进行使用TBE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳，切出 6，040bp的载体片段，并用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化切出的片段。为了引入新的Bsp LUllI位点，使用下述引物产生了接头5' -dCCTACATGTTTAAT-3’ (SEQ ID NO :83)Bsp LullI5' -dTAAACATGTAGG-3' (SEQ ID NO :84)将每个引物(每个2 μ g)在70°C加热10分钟，然后经过1小时冷却至室温。将该接头连接入经Mu I-Pac I-消化的pSheBl中间物1载体片段，产生pSheBl中间物2。然后将载体PSheBI中间物2用Bsp LullI和I^c I消化。将消化的载体在TBE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。尖镰孢磷脂酶基因片段还通过PCR使用pMSTR19作为模板来生成。使用下述PCR 引物在该基因的5’端引入Sph I位点而在3’端引入I^c I位点5' -GGGGGCATGCTTCTTCTACCACTCC-3‘ (SEQ ID NO 85)Sph I5' -GGGGTTAATTAAGAGCGGGCCTGGTTA-3‘ (SEQ ID NO 86)Pac I实施PCR和纯化的条件如上所述。将磷脂酶基因片段依照生产商的指示克隆入 pCR -TOPO 。然后将pCR -TOPO ·磷脂酶克隆用Sph I消化并用T4DNA聚合酶处理以去除突出的3'端。使用QIAQUICK NuCle0tideRem0Val Kit纯化片段，并用I3ac I 消化。将消化物在TBE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，并将11Λ条带从凝胶切出并使用QIAQUICK GelExtraction Kit 纯化。将质粒pShebl中间物2 (见上)用Mu I和Bsp LullI消化，并使用QIAQUICK Nucleotide Removal Kit纯化。然后将片段连接于2kb Stu I-BspLullI镶片镰孢葡糖淀粉酶启动子片段(W0 2000/056900)。该载体，称作pShebl中间物3，用Bsp LullI消化，用Klenow片段处理以填充5 ‘悬突(overhang)，用I^ac I消化，并使用QIAQUICK Nucleotide Removal Kit纯化。然后将该片段连接于Sph I，平端I^ac I尖镰孢磷脂酶片段(如上所述)。所得的质粒，命名为PEJG49(图，携带在镶片镰孢葡糖淀粉酶启动子的转录调控之下的磷脂酶报道基因。实施例31 构建质粒pEmY15使用定点诱变从表达质粒pEJG49去除Eco RI和Not I限制位点各一个，并使得这些在双丙氨膦(bialaphos)抗性标记(bar基因)侧翼的限制位点唯一。诱变是使用如下所示的正向和反向引物和QUIKCHANGE Site-DirectedMutagenesis Kit来完成的。正向引物5' -cctgcatggccgcCgccgcCaattcttacaaaccttcaacagtgg-3‘ (SEQ ID NO 87)反向引物5' -ccactgttgaaggtttgtaagaattGgcggcGgcggccatgcagg-3‘ (SEQ ID NO 88)大写字母表示所需的变化，而所得的质粒命名为pEmY15(图25)。实施例32 构建质粒pEmYM为了用镶片镰孢pyrG基因替代表达质粒pEmY15中的bar基因，进行了下述实验方案。将质粒pEmY15用Eco RI和Not I消化，并在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化。将7. 11Λ片段切出，并使用QIAQUICK GelEXtracti0n Kit进行琼脂糖提取。将pyrG基因的2. 3kb片段从pDM156. 2使用如下所示的正向和反向引物进行PCR 扩增。正向引物5，-ATAAGAATgcggccgcTCCAAGGAATAGAATCACT-3，(SEQ ID NO :89)反向引物5，-CGgaattcTGTCGTCGAATACTAAC-3，(SEQ ID NO :90)粗体序列对应于引入分别用于正向和反向引物的Not I位点和Eco RI位点。扩增反应物由在50 μ 1 的终体积中的 IX ThermoPol Buffer, 200 μ M dNTPs, 31ng PDM156. 2，1 μ M每种引物和1单位VENT DNA聚合酶组成。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，其程序为在95°C进行ι个循环3分钟；30个循环，每个在95°C进行30秒，55 °C进行1分钟；和72°C进行3分钟；并在72°C进行1个循环7分钟。将PCR产物在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳分离，并将2. 3kb片段切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。然后将该片段用Eco RI和 Not I消化，并将消化反应物使用MINELUTE Reacti0nCleanup Kit纯化。将片段使用 T4DNA连接酶依照生产商的指示连接于经Not I/Eco RI消化的pEmY15。将连接混合物依照生产商的指示转化入大肠杆菌XLl-Blue亚克隆级感受态细胞(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。对转化体进行测序以确保不含PCR错误，并鉴定了含有无错误pyrG片段的质粒。 所得的质粒命名为PEmYM (图26)。实施例33 构建质粒pDM257将质粒pEmYM (实施例32)用Af 1 II和Sna BI消化。将6. 5kb片段在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将质粒PEJG65用Afl II和Sna BI消化。将3. 3kb片段在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将两个片段使用T4DNA连接酶依照生产商的指示连接在一起。将连接混合物依照生产商的指示转化入大肠杆菌XLl-Blue亚克隆级感受态细胞。通过序列分析筛选转化体， 并鉴定了含有具有所需片段的质粒的克隆。将所得的质粒命名为pDM257(图27)。实施例34 构建质粒pDM258将质粒pDM257用ka I and Afl II消化并在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并将4. Ikb片段从凝胶切出，并使用QIAQUICK GelExtraction Kit进行琼脂糖提取。还将质粒pEJG69用 a I和Afl II消化，并在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并将5. Skb片段从凝胶切出，并如上所述进行琼脂糖提取。将两个片段使用T4DNA连接酶依照生产商的指示连接在一起。将连接混合物依照生产商的指示转化入大肠杆菌XLl-Blue亚克隆级感受态细胞。通过序列分析筛选转化体， 并鉴定了所需的质粒，并命名为pDM258(图28)。实施例35 在镶片镰孢株JfyS1643-95_04中表达乳糖氧化酶。镶片镰孢JfyS1643-95_04 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)的原生质体如实施例5中所述生成。然后将该原生质体依照实施例20中所述的方法用携带Microdochium nivale乳糖氧化酶表达载体的PDM258转化，以评价镶片镰孢JfyS1643-95-04株的表达潜力。将转化体如实施例21中所述在摇瓶中生长，只是所述烧瓶在以200rpm振荡温育5日。使用与BIOMEK 3000 (Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, USA) 一同的活性测定法对摇瓶培养液测定乳糖氧化酶活性。该乳糖氧化酶测定法是Glucose Oxidase Assay Procedure (K-Glox) (Megazyme，Wicklow，Ireland)的修饰版本。将培养上清适当地在0. IM MOPS缓冲液pH 7.0(样品缓冲液)中稀释，然后对稀释样品进行从0倍至1/3倍至1/9倍的系列稀释。将乳糖氧化酶标样(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)使用两倍逐步稀释，在样品缓冲液中的浓度以0. 056mg/ml开始以0. 007mg/ml结束。将包括标样的总共20 μ 1的每个稀释物转移至96孔平底板。将一百微升POD溶液(Peroxidase，4ΑΑ，在磷酸钾缓冲液PH 7加对羟基苯甲酸和叠氮化钠中的稳定剂)添加至每孔然后添加100 μ 1 葡萄糖底物(样品缓冲液中0. 5Μ葡萄糖)。反应速率在环境温度(大约)在510nm 测量总共10分钟。样品浓度通过从使用乳糖氧化酶作为标样生成的标准曲线外推来确定。 选择产量最高的乳糖氧化酶转化体在2升发酵罐中进行生长和分析。发酵培养基(pH 6)由每升20g大豆粉，20g蔗糖，2. Og MgSO4 · 7H20, 2. Og无水 KH2PO4, 2. Og K2SO4, 5. Og (NH4) 2S04，1. Og 柠檬酸，0. 5ml 的 200X AMG 痕量金属溶液(不含镍) 和0. 5ml ^pluronic acid及20%麦芽糖补料(feed)组成。发酵在四.0+/-1. 0°C,1200rpm 和l.Ovvm通气下进行，其中％ DO维持在30%以上。对发酵液使用 Alpha-Amylase Assay Kit (Megazyme International Ireland Ltd. ,fficklow, Ireland)连同BIOMEK 3000 和BIOMEK NX (Beckman Coulter, Inc, Fullerton CA,USA)进行α -淀粉酶活性的测定。如上所述对发酵液测定乳糖氧化酶活性。所得的转化体镶片镰孢JfyS1643-95_04，在2升发酵罐中具有与无缺失的其它镶片镰孢转化体等同的乳糖氧化酶产生水平(图四)，表明amyA基因的缺失并不对异源蛋白质产生具有不利作用。然而该缺失确实消除了该株和该种系所有后续株在培养液中的 α-淀粉酶活性(图30)。由于该转化体与现有的生产株具有等同的外源蛋白质产生能力， 并在发酵过程中减少了 α -淀粉酶水平，选取镶片镰孢JfyS1643-95-04宿主株用于缺失碱性蛋白酶A基因(alpA)。实施例36 镶片镰孢碱性蛋白酶A(alpA)缺失载体pJfyS1698-72_10的生成用于完全去除镶片镰孢A3/5碱性蛋白酶A(alpA)基因的上游侧翼序列(DNA序列为 SEQ ID NO :91 而推导的氨基酸序列为 SEQ ID NO 92)使用 GENOME WALKER Universal Kit获得。将每个用该试剂盒生成的文库使用如下所示的5’基因特异性引物和5’嵌套引物进行针对5’侧翼序列的两轮PCR。5’基因特异性引物5，-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3，(SEQ ID NO 93)5’嵌套引物5，-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3，(SEQ ID NO 94)序列信息是从从PCR产物使用BD GENOME WALKER Universal Kit中提供的 Nested Adaptor I^rimer和上述5’嵌套引物获得的。将获得的序列用于设计引物以扩增 5’ alpA侧翼序列的11Λ区域以供插入空的缺失载体pJfyS1579-41_ll。将alpA 5’侧翼序列从镶片镰孢A3/5基因组DNA使用如下所示的区域特异性正向和反向引物进行PCR扩增。下划线字母代表用于之后去除载体的pCR 2. 1部分的Not I位点，而斜体字母代表用于载体克隆的Asc I位点。正向引物5，-aaaaaaggcgcgccKCKgccKcGTTACGGTGTTCAAGTACATCTTACA-S' (SEQ ID NO :95)反向引物5' -aaaaaaggcgcgccATTGCTATCATCAACTGCCTTTCTT-3，(SEQ ID NO :96)扩增反应物含有IX HERCULASE Reaction Buffer, 120ng 基因组 DNA，400nm 引物，200 μ M dNTPs 和 2. 5 单位HERCULASE DNA 聚合酶。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C 进行ι个循环2分钟；20个循环，每个在94°C进行30秒，56°C进行30秒，和72°C进行1分 10秒；和在72°C进行1个循环7分钟。将扩增反应物的5μ 1部分通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳显影以确保该反应产生了所需的11Λ条带。然后将该插入物从所述扩增反应物依照生产商的指示使用TOPO TA Cloning Kit直接克隆入pCR 2.1 TOPO 。通过用Eco RI的限制性分析筛选转化体以确保插入物的存在，并合并了 5个正确的制备物。通过用Asc I消化将该插入物从pCR 2.1释放，并如上所述通过琼脂糖凝胶电泳纯化片段。将该插入物使用QUICK LIGATION Kit克隆入经Asc I-线性化的pJfyS1579-41_ll，并使用连接混合物依照生产商的实验方案转化大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。通过序列分析筛选转化体以确保不含PCR错误。一个含有侧翼序列而无错误的质粒命名为pJfyS1698-65-15(图31)并用于插入3’侧翼序列。将alpA基因的3’侧翼序列从镶片镰孢A3/5基因组DNA使用如下所示的区域特异性正向和反向引物进行扩增。下划线字母代表供之后去除β内酰胺酶的Not I位点，而斜体字母代表用于载体克隆的Sbf I位点。正向引物5，-aaaaacctgcaggGGATGTGTGTGGAATAGGATATG-3，(SEQ ID NO :97)反向引物5，-aaaaacctgcagggcggccgcCCTCAAGGTGGAGAAATAATCTGT-3，(SEQ ID NO :98)PCR 反应物含有 IX HERCULASE Reaction Buffer, 120ng 基因组 DNA 模板， 400nm 引物，200 μ M dNTPs 和 2. 5 单位HERCULASE DNA 聚合酶。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C 进行ι个循环2分钟；20个循环，每个在94°C进行30秒，56°C进行30秒，和72°C进行1分 10秒；和在72°C进行1个循环7分钟。将扩增反应物的5 μ 1部分通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳显影以确保该反应产生了所需的11Λ条带。然后将该直接来自PCR反应的插入从所述扩增反应物使用 TOPO TA Cloning Kit克隆入pCR 2.1 TOPO 。对所得的质粒进行测序以鉴定含有正确序列的菌落。然后通过Sbf I消化将该片段从该质粒释放，并在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将11Λ条带切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。然后将该片段使用QUICK LIGATION Kit连接于经Sbf I线性化的 pJfyS1698-65-15(经小牛小肠磷酸酶处理)，并使用该连接混合物依照生产商的指示转化大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。通过用Not I的限制性分析筛选转化体以确保片段以正确的取向插入，并进行测序以确保没有偏离预计的序列。将所得的质粒 pJfyS1698-72-10(图 32)用于缺失 alpA 基因。实施例37 Atri5ApyrG Δ amyA Δ alpA 镶片镰孢株 JfyS1763-ll_01 的生成将依照实施例20中所述方法用经Not I-消化和凝胶纯化的pJfyS1698-72_10转化的镶片镰孢JfyS1643-95_04 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)(实施例26)的三个转化体用灭菌牙签从转化板转移至含有补充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在室温温育7日。对于Southern分析，将来自3个转化体每一个的2 μ g镶片镰孢基因组DNA用34单位Sph I消化。根据实施例21中所述方法使用如下所示的正向和反向引物生成针对apl4基因5’侧翼序列的DIG探针。正向引物5' -GCACGTTAGGCTCAAGCCAGCAAGG-3‘ (SEQ ID NO 99)反向引物5' -GAGGCTCATGGATGTGGCGTTAATG-3‘ (SEQIDN0:100)如实施例21中所述实施的Southern分析表明三个转化体之一含有缺失盒在alpA 基因位点的单一拷贝，并将该转化体命名为JfyS1698-83-2。将镶片镰孢JfyS1698-83_2如实施例5所述进行孢子形成，并将IO5个孢子铺板于含有补充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm直径板。将所得的孢子分离物亚培养至含有补充了 10 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板。将所得的孢子分离物如实施例21中所述通过Southern分析进行分析，并鉴定了一个正确地切出盒
55的孢子分离物。该分离物命名为镶片镰孢JfyS1698-94-04。将镶片镰孢JfyS1698-94_04 如实施例21中所述进行一次孢子纯化，并挑取一个孢子分离物，并命名为镶片镰孢 JfyS1763-ll-01 ( Δ tri5 Δ pyrG AamyAAalpA)。如实施例5和20中所述生成并用pDM258转化镶片镰孢JfyS1763-ll_01的原生质体。将转化体如实施例35中所述进行分析，并测定发酵液的碱性蛋白酶活性。将 PROTAZYME AK 片(Megazyme，Wicklow，Ireland)通过轻柔地搅拌悬于 2. Oml 0. 01% TRITON X-100中。将五百微升该悬液和500 μ 1补充了PROTAZYME AK片的测定缓冲液在EPPENDORF 管中混合并置于冰上。添加了二十微克的蛋白酶样品(稀释于0. 01%TRITON X-100)。该测定通过将该EPPENDORF 管转移至设定为测定温度 EPPENDORF 热混合器而起始。将管在EPPENDORF 热混合器上以1300rpm温育 15分钟。该温育通过将管转移回冰浴而停止。然后将管在冰冷的离心机中以16，OOOxg离心几分钟，并将200 μ 1上清转移至微滴定板。读取在650nm的吸光度作为蛋白酶活性的量度。如amyA缺失，alpA基因的缺失不对乳糖氧化酶表达具有有利影响。然而，在发酵上清中碱性蛋白酶的副活性减少了 10倍(图33)。实施例38 :dpsl缺失载体pJfySlll的生成将镶片镰孢缩酚酸肽(cbpsip印tide)合酶(dpsl)基因的3’侧翼序列(DNA序列为SEQ ID NO :101而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO :102)从镶片镰孢JfyS1763-ll_01基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。引物中的下划线部分代表引入用于克隆的Sbf I位点，而斜体部分对应于引入用于之后去除β-内酰胺酶的Not I位点。使用DNEASY Plant Maxi Kit 提取基因组 DNA。正向引物5' -GACTAAGCCCTGCAGGTTGGTCTCAATCGTCGCGACAG-3' (SEQ ID NO :103)反向引物5' -AGTCTACCCCTGCAGGCGGCCGCTGGCATCGGTGGACGTAACACGC-3' (SEQ ID NO 104)扩增反应物以50 μ 1 的终体积含有 IX HERCULASE Reaction Buffer, 400nM 每种引物，200μΜ dNTP，IOOng基因组DNA和1. 5单位HERCULASE DNA聚合酶。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环2分钟；25个循环，每个在95°C进行30秒，57°C进行30秒，和72°C进行1分20秒；和在 72 °C进行1个循环7分钟。扩增反应物使用MINELUTE PCR Purification Kit纯化。然后用^f I消化纯化的反应物并对其进行使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳。将11Λ条带从凝胶切出， 并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。然后将消化的载体依照生产商建议的实验方案使用QUICK LIGATION Kit连接于经SbfI-消化的pJfyS1579-41_ll (实施例2 (其经小牛小肠磷酸酶脱磷酸)。通过用Eco RI的限制分析(以检查插入的存在和取向)和序列分析(以确保不含PCR错误)分析所得的克隆，并将所得质粒命名为 pJfyS1879-32-2(图 34)。为了获得dpsl基因5’端的侧翼序列，如实施例36中所述使用GEN0MEWALKER Universal Kit及如下所示的基因特异性引物和基因特异性嵌套引物。
基因特异性引物5' -GCTATTGAGGGGACTATCTCCATGACTACA-3，(SEQ ID NO :105)基因特异性嵌套引物5' -GCCTACCATCGACAGCAGTAAGATATTCC-3，(SEQ ID NO :106)将5’ dpsl侧翼序列从镶片镰孢JfyS1763-ll_l基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行扩增。正向引物中的下划线部分代表引入用于克隆的Asc I位点而斜体部分对应于引入用于之后β-内酰胺酶去除的Not I位点。扩增反应和循环参数与上述的那些相同，只是使用的引物是下述那些，所用的退火温度是53°C，而延伸时间为1分15秒。正向引物5，-ATGTGCTACAGGCGCGCC GCGGCCGCGAGTTCCAACATGTCTTATTATCC-3，(SEQ ID NO 107)反向引物5，-TACTGTACCGGCGCGCCATCTGAGCCAAGAGACTCATTCAT-3，(SEQ ID NO :108)PCR 反应物使用MINELUTE PCR Purification Kit 纯化。用 Asc I 消化纯化的反应物，并对其进行使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳。将0. 7kb条带从凝胶切出，并如上所述进行琼脂糖提取。将0.71Λ条带使用QUICKLIGATION Kit连接于 pJfyS1879-32-2(经Asc I消化而经小牛小肠磷酸酶脱磷酸)。对所得的克隆通过序列分析加以分析以确保不含PCR错误，并将所得的质粒命名为pJfySlll (图35)并用于缺失镶片镰孢dpsl基因。实施例39 Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA Δ alpA Δ dpsl 镶片镰孢株 JfyS1879-57-01 的生成当依照实施例20中所述的方法用经Not I消化的和凝胶纯化的pJfySl 11转化镶片镰孢JfyS1763-ll-01原生质体时，获得了 77个转化体。将其中48个用灭菌牙签从转化板转移至含有补充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在
室温温育7日。真菌生物质是通过用如实施例21中所述获得的来自7日转化体的四个琼脂栓接种25ml补充了 IOmM尿苷的M400培养基来产生的。将培养物在以150rpm振荡温育3 日。去除琼脂栓，并将培养物经过MIRACL0TH 过滤。将收获的生物质用液氮冻结，并使用研钵和杵磨碎菌丝体。使用DNEASY Plant Maxi Kit依照生产商的指示分离基因组DNA，只是在 65°C的裂解温育期从10分钟延伸至1. 5小时。将两μ g基因组DNA用Nco I和Spe I各28单位在50 μ 1反应体积中在37°C消化22小时。在TAE缓冲液中对消化物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。在凝胶中将DNA通过用 0. 25M HCl 处理进行片段化，用 1. 5M NaCl-O. 5MNa0H 变性，用 1. 5M NaCl-IM Tris pH 8 中和，然后在 20X SSC 中使用 TURBOBLOTTER Kit 转移至NYTRAN Supercharge 尼龙膜。 将DNA使用UV STRATALINKER UV交联至膜，并在42°C在20mlDIG Easy Hyb中预杂交1小时。依照实施例21中所述的方法使用如下所示的正向和反向引物生成针对dpsl基因 3’侧翼序列的DIG探针。
正向引物5' -CTTGACTATTATCTCACGTTGTCAG-3‘ (SEQ ID NO :109)反向引物5' -TCAAGTGTTGTGTAATGTTGGAACA-3‘ (SEQ ID NO 110)如实施例21中所述实施的Southern分析表明获得的8个转化体中的三个在dpsl 位点含有单一拷贝的缺失片段。将一个命名为镶片镰孢JfyS1879-43-05。将镶片镰孢JfyS1879-43_05如实施例5所述进行孢子形成，并将IO5个孢子铺板于含有补充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm直径板。将所得的孢子分离物亚培养至含有补充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板。将所得的孢子分离物如实施例21中所述通过Southern分析进行分析，并鉴定了一个正确地切出盒的孢子分离物。该分离物命名为镶片镰孢JfyS1879-52-3。将镶片镰孢JfyS1879-52_03 如实施例21中所述进行一次孢子纯化，并挑取一个孢子分离物，并命名为镶片镰孢JfySlS 79-57-01(Δtri5ΔpyrGΔamyAΔalpAΔdpsl)。实施例40 构建里氏木霉hemA缺失载体pJfyS120为了缺失里氏木霉氨基-Y -酮戊酸合酶基因，将3’ hemA侧翼序列从里氏木霉 RutC30基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。引物中的下划线部分代表引入用于克隆的Sbf I位点而粗体部分对应于引入用于之后去除β-内酰胺酶的Not I 位点。正向引物(#064877)5' -TATAGCGTACCTGCAGGTGTCATGCCCGCGGCTTTGCCTTGA-3' (SEQIDN0:111)反向引物(#064878)5 ‘ -ATGCTGTACCTGCAGGCGGCCGCCGCTCCCGATCATCATCCCTCCGAG-3 ‘ (SEQ ID NO 112)扩增反应物由IX HERCULASE Reaction Buffer，400nM 每种引物，200 μ M dNTP，125ng基因组DNA和1. 5单位HERCULASE DNA聚合酶组成。将反应物在 EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环2分钟；25个循环，每个在95°C进行30秒，57°C进行30秒，和72°C进行1分45秒；和在72°C进行1个循环7分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1. 5kb的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将1. 5kb片段使用TOPO -TA Cloning Kit依照生产商的指示克隆入 pCR 2.1，并测序以确保不含PCR错误。将片段从pCR2. 1通过SbfI消化来释放，并在TAE 缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳来纯化。将1. 5kb条带切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将消化的片段使用QUICK LIGATION Kit依照生产商的指示连接于通用缺失载体pJfyS1579-41-l 1 (实施例22)，其之前经SbfI消化和小牛小肠磷酸酶脱磷酸。将所得的克隆通过序列分析来进行分析以检查插入物的存在和取向以确保不含PCR错误。将所得的质粒命名为pJfyS2010-13-5(图36)。将5，hemA侧翼序列从里氏木霉RutC30基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。引物中的下划线部分代表引入用于克隆的AscI位点而粗体部分对应于引入用于之后去除β-内酰胺酶的Not I位点。
正向引物(#065245)5， -CATGGTTTAAACGGCGGCGCGCCGCGGCCGCAATTCAGAGCATCACGGTTGAGGGA-3’ (SEQID NO 113)反向引物(#065246)5 ’ -CTTGTTTTGTCGGGCGCGCCACATGGCCTTGGATTGACGCAGGAC-3’ (SEQ ID NO :114)对扩增反应物实施与上述3’侧翼序列进行的相同方法。将反应物在 EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，其程序为在95°C进行1个循环2分钟； 25个循环，每个在95°C进行30秒，53°C进行30秒，和72°C进行1分15秒；和在72°C进行 1个循环7分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约11Λ的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。随后将11Λ片段用Asc I消化，并如上所述凝胶纯化。将消化的片段使用QUICK LIGATION Kit依照生产商连接于pJfyS2010-13-5，其之前经SbfI消化，并经小牛小肠磷酸酶脱磷酸。将所得的克隆通过序列分析加以分析以确保不含PCR错误，并将所得的质粒命名为pJfyS120(图37)。将质粒pJfyS120用于缺失里氏木霉hemA基因。实施例41 里氏木霉株RutC30的原生质体的生成为了生成里氏木霉株RutC30的新鲜培养物，将栓从含有浸于10%甘油的菌株栓的储备物转移至新鲜的PDA板，并在温育7日。将孢子在細10.01 % Tween 20中使用灭菌的涂布器收集，并将350μ 1孢子用于接种带挡板的摇瓶中的 25ml YPG2并在以90rpm振荡温育16小时。通过如下收集菌丝体将培养物经过 MILLIPORE STERICUP 250ml 0. 2ym过滤器单元过滤并收集在过滤器上的种系 (gremlin)。将菌丝体用大约IOOml 1. 2M山梨醇洗涤。将菌丝体重悬于20ml由IM MgSO4中的 5mg/mlGLUCANEX (Novozymes，Bagsvaerd，DK)和 0· 36 单位/ml 甲壳酶(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)组成的原生质体化溶液。将原生质体化溶液在125ml摇瓶中在34°C以 90rpm振荡温育25分钟。通过在冰上温育烧瓶来停止反应。将原生质体转移至50ml锥底管 (conical bottomed tube)，并添加30ml冰冷的1. 2M山梨醇。将管在室温(大约24-28°C ) 以 377xg 在 Sorvall RT6000B 浮筒式离心机(Thermo-Fischer Scientific, ffaltham, ΜΑ, USA)中离心10分钟。弃去上清并用30ml 1. 2M山梨醇洗涤原生质体。重复管离心，并弃去上清。将沉淀重悬于1.2M山梨醇并移出10 μ 1样品以使用血细胞计数器(VWR，ffest Chester, PA)确定原生质体的浓度。将含有原生质体的管以377xg离心，并将原生质体重悬于TrSTC至终浓度为hlO8个原生质体/ml。实施例42 里氏木霉氨基-Y -酮戊酸合酶(hemA)基因的缺失将里氏木霉RutC30原生质体如实施例20中所述用经Not I消化和凝胶纯化的缺失载体pjfysi20转化，但具有下述指出的不同之处。将一百y 1原生质体转移至添加了 2 μ g凝胶纯化的pJfyS120的Hml聚丙烯管。添加两百五十微升聚乙二醇4000并将管通过颠倒6次轻柔地混合。将管在34°C温育30分钟，之后添加:3ml TrSTC0将管内含物铺板于两个含有IM蔗糖和5mM氨基-γ -酮戊酸(ALA)的150mm PDA板，将其在温育16小时。将冷却至50°C，含有PDA、100 μ g/ml潮霉素B和5mM ALA的覆层(overlay)倾至板顶部，并使其在室温冷却30分钟。然后将板在温育5日。
该转化产生134个转化体。将每个转化体转移至含有5ml具有5mMALA和25 μ g/ ml潮霉素B的6孔细胞培养板的一个孔，并在温育5日。通过将少量来自转化体的孢子刮至含有未补充ALA的TrMM培养基的不同的6孔板来测试转化体的ALA营养缺陷型。然后将三个呈现营养缺陷型的转化体亚培养至含有5mM ALA的PDA板，并在温育5日。 为了生成用于Southern分析的基因组DNA，将5日转化体的四个Icm2栓接种至125ml烧瓶中25ml含有5mMALA的丫 62%培养基，并在28°C以150rpm生长48小时。使用实施例8中所述的相同方法从培养物分离基因组DNA。对于Southern分析，将2 μ g基因组DNA用33单位Nco I在50 μ 1反应体积中进行消化，并对其在TAE缓冲液中进行琼脂糖电泳。将凝胶中的DNA脱嘌呤、变性并中和，然后如实施例8中所述转移至NYTRAN Supercharge膜。将DNA使用UV STRATALINKER UV交联至膜，并在42°C在20ml DIG Easy Hyb中预杂交1小时。使用PCR Dig Probe Synthesis Kit依照生产商的指示用如下所示正向和反向引物生成针对hemA基因3’侧翼的探针。正向(#065764)5' -GACGCATACAATACAAGCATATGCTGTTGGTGTCT-3' (SEQ ID NO :115)反向(#065765)5' -AAGGCGTCTGGAAACAGAAGCTGCT-3‘ (SEQ ID NO :116)扩增反应物由组成 IX HERCULASE Reaction Buffer, 400nM 每种引物， 200 μ M DIG-标记的含dUTP-的dNTPs，125ng里氏木霉RutC30基因组DNA和1. 5单位 HERCULASE DNA 聚合酶。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温
育，其程序为在95°C进行1个循环2分钟；25个循环，每个在95°C进行30秒，58°C进行30 秒，和72°C进行45秒；和在72°C进行1个循环7分钟。将探针通过TAE缓冲液中的1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，并将对应于探针的条带切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将探针煮沸5分钟，并添加至10ml DIG Easy Hyb以产生杂交溶液。杂交在42°C实施15-17小时。然后将膜在高严格条件下在室温在2X SSC加0. SDS中洗涤5分钟，然后在0. IX SSC加0. 1 % SDS中洗涤两次，每次在65V洗洚15分钟。通过化学发光测定法(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)依照生产商的指示检测探针-靶杂交体。三个转化体的Southern分析表明所有三个ALA营养缺陷型转化体在hemA位点含有单一拷贝的缺失盒。将一个转化体JfyS2010-52-65用于消除hpt和tk标记。一个新鲜板的孢子通过将7日培养物的栓转移至含有5mMALA板的PDA板并在温育7日来生成。 将孢子在IOml 0. 01%TWEEN 20中使用灭菌的涂布器来收集。孢子浓度使用血细胞计数器确定，并将106个孢子铺板至含有TrMM-G培养基的150mm板，所述培养基含有ImMALA 禾口 1 μ M FdU0获得了十六个FdU抗性孢子分离物，并如上所述从10个这样的孢子分离物提取 DNA。将分离物如上所述通过Southern分析进行分析，而结果显示所有10个孢子分离物在缺失盒的重复之间切出了 htp/tk区。挑取一个镶片镰孢菌株JfyS2010-52-65-02(AhemA， hpt-, tk-)并将其归档(archived)。本发明进一步由下述编号的段落描述
[1] 一种用于在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的方法，包括(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含(i)第一多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(ii)第二多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iii)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和(iv)第一侧翼序列，其位于组分⑴、( )和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、( )和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’，( 所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或C3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’ ；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组，以缺失基因或其部分并用核酸构建体替代基因或其部分；(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞； 和(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失第一和第二多核苷酸。[2]段落1的方法，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、 嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA 合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶 3' (II) (aph(3' )II)基因。[3]段落1的方法，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。[4]段落1的方法，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因 (hpt)的编码序列所编码的。[5]段落4的方法，其中所述hpt编码序列是从大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因获得的。[6]段落1的方法，其中所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。[7]段落6的方法，其中所述tk编码序列是从单纯疱疹病毒1型基因获得的。[8]段落1的方法，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因
61(hpt)的编码序列所编码的而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。[9]段落1-8任一项的方法，其中所述丝状真菌细胞选自下组枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属 (Bjerkandera)、拟赌菌属(Ceriporiopsis)、金抱子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属 (Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、键抱属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、身寸脉菌属 (Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)Jf 节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属 (Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。[10]段落1-8任一项的方法，其中所述丝状真菌细胞是pyrG营养缺陷型。[11]段落1-10任一项的方法，还包括(d)将编码目标多肽的多核苷酸引入步骤 (c)的分离细胞。[12]段落1-11任一项的方法，其中所述核酸构建体包含于线性化的重组载体中。[13]段落1-12任一项的方法，其中所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’。[14]段落1-12任一项的方法，其中第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因内。[15]段落1-12任一项的方法，所述第一和第二区域的一个位于丝状真菌细胞基因之内，而所述第一和第二区域的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’。[16]段落1-15任一项的方法，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。[17]段落1的方法，其中整个基因完全缺失，不留下外源DNA。[18] 一种用于缺失丝状真菌细胞基因组中一个基因或其部分的核酸构建体，包含(i)第一多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(ii)第二多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iii)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和(iv)第一侧翼序列，其位于组分⑴、( )和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、( )和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’，( 所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或C3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’ ；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失基因或其部分并用核酸构建体替代基因或其部分；且所述第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失所述第一和第二多核苷酸。[19]段落18的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、 zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(PtrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因 (neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' )1)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3' (II) (aph(3' )II)基因。[20]段落18的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。[21]段落18的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的。[22]段落21的核酸构建体，其中所述hpt编码序列是从大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因获得的。[23]段落18的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。[24]段落23的核酸构建体，其中所述tk编码序列是从单纯疱疹病毒1型基因获得的。[25]段落18的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。[26]段落18-25任一项的核酸构建体，其中所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’。[27]段落18-25任一项的核酸构建体，其中第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因内。[28]段落18-25任一项的核酸构建体，所述第一和第二区域的一个位于丝状真菌细胞基因之内，而所述第一和第二区域的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’。[29]段落18- 任一项的核酸构建体，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。[30] 一种重组载体，包含段落18- 任一项的核酸构建体。[31] 一种重组丝状真菌细胞，包含段落18- 任一项的核酸构建体。[32] 一种用于将多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组的方法，包括(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含(i)目标第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iv)第一重复序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’ ；和(ν)第一侧翼序列，其位于组分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组，以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞； 和(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失第二和第三多核苷酸。[33]段落32的方法，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin 和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因 (PtrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、 乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP 合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶 3' (II) (aph(3' ) II)基因。[34]段落32的方法，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因 (codA)ο[35]段落32的方法，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因 (hpt)的编码序列所编码的。[36]段落35的方法，其中所述hpt编码序列是从大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因获得的。[37]段落32的方法，其中所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。[38]段落37的方法，其中所述tk编码序列是从单纯疱疹病毒1型基因获得的。[39]段落32的方法，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因 (hpt)的编码序列所编码的而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。[40]段落32-39任一项的方法，其中所述丝状真菌细胞选自下组枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、 Filikisidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。[41]段落32-39任一项的方法，其中所述丝状真菌细胞是pyrG营养缺陷型。[42]段落32-41任一项的方法，其中所述核酸构建体包含于线性化的重组载体中。[43]段落32-42任一项的方法，其中所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’。[44]段落32-42任一项的方法，其中第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因内。[45]段落32-42任一项的方法，所述第一和第二区域的一个位于丝状真菌细胞基因之内，而所述第一和第二区域的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’。[46]段落32-45任一项的方法，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。[47] 一种用于将多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组中的核酸构建体，其包含(i)目标第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iv)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而编码目标多肽的第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’ ；和(ν)第一侧翼序列，其位于组分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；且所述第一和第二重复序列可发生分子内同源重组以缺失所述第二和第三多核苷酸。[48]段落47的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、 zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(PtrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因 (neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' )1)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3' (II) (aph(3' )II)基因。[49]段落47的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。[50]段落47的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的。[51]段落47的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。[52]段落47的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。[53]段落47的核酸构建体，其中所述hpt编码序列是从大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因获得的。[54]段落47的核酸构建体，其中所述tk编码序列是从单纯疱疹病毒1型基因获得的。[55]段落47巧4任一项的核酸构建体，其中所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’。[56]段落47巧4任一项的核酸构建体，其中第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因内。[57]段落47巧4任一项的核酸构建体，所述第一和第二区域的一个位于丝状真菌细胞基因之内，而所述第一和第二区域的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’。[58]段落47-57任一项的核酸构建体，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。[59] 一种重组载体，包含段落47-58任一项的核酸构建体。[60] 一种重组丝状真菌细胞，包含段落47-58任一项的核酸构建体。[61] 一种产生多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下，培养依照段落 1-17任一项获得的丝状真菌细胞；和(b)回收所述多肽。[62]段落61的方法，其中所述多肽对于丝状真菌细胞是内源的。[63]段落61的方法，其中所述多肽是由引入所述丝状真菌细胞的多核苷酸编码的外源(异源)多肽。[64] 一种产生多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下，培养依照段落 32-46任一项获得的丝状真菌细胞；和(b)回所述收多肽。[65]段落65的方法，其中所述多肽对于所述丝状真菌细胞是内源的。[66]段落65的方法，其中所述多肽是由引入所述丝状真菌细胞的多核苷酸编码的外源(异源)多肽。[67] 一种分离的乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶，选自下组(a)乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶，其包含与SEQ ID NO :52的成熟多肽具有优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少 80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，甚至更优选至少95 %同一性，且最优选至少 96 %，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的氨基酸序列；(b)乳清苷_5，-磷酸脱羧酶，其由在优选至少中等严格条件下，更优选至少中高严格条件下，甚至更优选至少高严格条件下且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO 51的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交的多核苷酸编码；和(c)乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸具有与SEQ ID NO :51的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90 %，甚至更优选至少95 %同一性，且最优选地，至少96 %，至少97 %，至少98 %，或
66至少99%同一性的核苷酸序列。[68]段落67的分离的乳清苷_5，-磷酸脱羧酶，其包含SEQ ID NO 52或其具有乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶活性的片段，或由SEQ ID NO 52或其具有乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶活性的片段组成。[69] 一种分离的多核苷酸，其编码段落67或68的乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶。[70]段落69的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO :51或其编码具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段的亚序列，或由SEQ ID NO :51或其编码具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段的亚序列组成。[71] 一种核酸构建体，其包含段落69或70的多核苷酸。[72] 一种重组表达载体，其包含段落69或70的多核苷酸。[73] 一种重组丝状真菌细胞，其包含段落69或70的多核苷酸。[74] 一种产生段落67或68的乳清苷_5’_磷酸脱羧酶的方法，包括在有助于产生乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述构建体包含编码乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶的核苷酸序列。本文中描述和要求保护的本发明并不受限于本文中公开的具体方面的范围，因为这些方面意欲说明本发明的几个方面。任何等同的方面意欲在本发明的保护范围之内。事实上，除了本文中显示和描述的之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员从前述描述而言是显而易见的。此类修饰也意欲落入所附权利要求的范围之内。在冲突的情况下，应以包括定义的本公开为准。
权利要求
1.一种用于在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的方法，包括(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含(i)第一多核苷酸，其包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；( )第二多核苷酸，其包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iii)第一重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，其位于组分(i)、( )和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的 3', (2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或C3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’ ；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失所述基因或其部分并用核酸构建体替代所述基因或其部分；(b)通过施以阳性选择来选择并分离具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组从而缺失第一和第二多核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA 合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶 3' (II) (aph(3' )II)基因。
3.权利要求1的方法，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
4.权利要求1-3任一项的方法，还包括(d)将编码目标多肽的多核苷酸引入步骤(c) 的分离的细胞。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
6.权利要求1的方法，其中整个基因完全缺失，不留下外源DNA。
7.一种用于缺失丝状真菌细胞基因组中的基因或其部分的核酸构建体，包含(i)第一多核苷酸，其包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(ii)第二多核苷酸，其包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iii)第一重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、( )和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’， (2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或C3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’ ；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失基因或其部分并用核酸构建体替代基因或其部分；且所述第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失所述第一和第二多核苷酸。
8.权利要求7的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、 zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(PtrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因 (neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' )1)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3' (II) (aph(3' )II)基因。
9.权利要求7的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因 (codA)ο
10.权利要求7-9任一项所述的核酸构建体，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
11.一种重组丝状真菌细胞，包含权利要求7-10任一项所述的核酸构建体。
12.一种用于将多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组的方法，包括(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含(i)目标第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iv)第一重复序列，其位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重复序列，其位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’ ；和(ν)第一侧翼序列，其位于组分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组从而缺失第二和第三多核苷酸。
13.权利要求12的方法，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、 嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA 合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶 3' (II) (aph(3' )II)基因。
14.权利要求12的方法，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
15.权利要求12-14中任一项的方法，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
16.一种用于将多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组中的核酸构建体，其包含(i)目标第一多核苷酸；( )第二多核苷酸，其包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(iii)第三多核苷酸，其包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iv)第一重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而编码目标多肽的第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’ ；和(ν)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；而且所述第一和第二重复序列可发生分子内同源重组以缺失第二和第三多核苷酸。
17.权利要求16的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、 zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(PtrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因 (neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3' (I) (aph(3' )1)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3' (II) (aph(3' )II)基因。
18.权利要求16的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因 (codA)。
19.权利要求16-18任一项所述的核酸构建体，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
20.一种重组丝状真菌细胞，包含权利要求16-19任一项所述的核酸构建体。
21.—种产生多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下，培养依照权利要求 1-6任一项获得的丝状真菌细胞；和(b)回收所述多肽。
22.—种产生多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下，培养依照权利要求 12-15任一项获得的丝状真菌细胞；和(b)回收所述多肽。
23.一种分离的乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶，选自下组(a)乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶，其包含与SEQ ID NO 52的成熟多肽具有优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%， 更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，甚至更优选至少95 %同一性，且最优选至少95 %， 至少97%，至少98%，或至少99%同一性的氨基酸序列；(b)乳清苷_5，-磷酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中等严格条件下，更优选至少中等严格条件下， 甚至更优选至少高严格条件下且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO 51的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO :51的成熟多肽编码序列具有优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%同一性，且最优选地，至少96%，至少97%，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。
24.权利要求23的分离的乳清苷-5，-磷酸脱羧酶，其包含SEQID NO :52或其具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段，或由SEQ ID NO :52或其具有乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶活性的片段组成。
25.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求23或M的乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶。
26.—种产生权利要求23或M的乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶的方法，包括在有助于产生乳清苷-5’ -磷酸脱羧酶的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述构建体包含编码乳清苷_5’ -磷酸脱羧酶的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因缺失、破坏或插入丝状真菌细胞基因的方法。
文档编号C12N15/80GK102224245SQ200980146945
公开日2011年10月19日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年9月30日
发明者杰弗里.沙斯基, 温迪.约德 申请人:诺维信股份有限公司