在镶片镰孢的酶缺陷突变体中产生多肽的方法

专利名称：在镶片镰孢的酶缺陷突变体中产生多肽的方法
技术领域：
本发明涉及在酶缺陷镶片镰孢突变体菌株中产生多肽的方法，酶缺陷镶片镰孢突变体菌株和获得酶缺陷镶片镰孢突变体菌株的方法。
背景技术：
已显示镶片镰孢可用作宿主细胞以供重组产生具有生物活性的多肽(W0 96/00787，WO 97Λ6330)。具有所需性状即增加的蛋白质表达和分泌的镶片镰孢宿主并不一定具有成功发酵最需要的特性。发酵可能并非最优的，因为生物物质例如酶的产生有害于特定的目标多肽的产生、回收或应用。WO 99/60137公开了镶片镰孢的单端孢霉烯缺陷突变体。WO 00/42203公开了镶片镰孢的环己缩肽缺陷突变体。本发明涉及改进的镶片镰孢宿主，其组合了用于表达商业量的目标多肽的能力， 同时在使所述多肽的回收和下游加工复杂化的酶的产生中有缺陷。

发明内容
本发明涉及产生多肽的方法，包括(a)在用于产生所述多肽的培养基中培养亲本镶片镰孢(Fusarium venenatum) 菌株的突变体，其中所述突变体菌株包含编码所述多肽的多核苷酸以及选自下组的一个或多个(几个)基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个 (几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α -淀粉酶和碱性蛋白酶；和(b)从培养基回收所述多肽。在产生多肽的方法的一个方面，所述突变体菌株还包含基因tri5和dpsl之一或两者，其中所述基因之一或两者经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素(trichodiene)合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。本发明还涉及亲本镶片镰孢菌株的突变体，包含编码多肽的多核苷酸以及选自下组的一个或多个(几个)基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α -淀粉酶和碱性蛋白酶。在一个方面，所述亲本镶片镰孢菌株的突变体还包含基因tri5和dpsl之一或两者，其中所述基因之一或两者经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。本发明还涉及获得亲本镶片镰孢菌株突变体的方法，包括(a)修饰选自下组的一个或多个(几个)基因pyrG、amyA和alpA ；和(b)鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中所述一个或多个(几个)选自下组的基因pyrG、amyA和alpA经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α-淀粉酶和碱性蛋白酶。在一个方面，所述获得亲本镶片镰孢菌株的突变体的方法还包括修饰基因tri5 和dpsl之一或两者使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。附图简述

图1显示pDM156. 2的限制图谱。图2显示pEmY21的限制图谱。图3显示pEmY23的限制图谱。图4显示pWTY1470-19-07的限制图谱。图5显示pWTY1515-2-01的限制图谱。图6显示pJaL504_[BamHI]的限制图谱。图7显示pJaL504-[BglII]的限制图谱。图8显示pJaL574的限制图谱。图9显示pWTY1449-02-01的限制图谱。图10显示pJfySlM0-75-5的限制图谱。图11显示pJfyS1579-l_13的限制图谱。图12显示pJfyS1579-8_6的限制图谱。图13显示pJfyS1579-21_16的限制图谱。图14显示pAlLo 1492- 的限制图谱。图15显示pJfyS1579-;35-2的限制图谱。图16显示pJfyS1579-41_ll的限制图谱。图17显示pJfyS1604-55_13的限制图谱。图18显示pJfyS1579-93_l的限制图谱。图19显示pJfyS1604-17_2的限制图谱。图20显示pEJG61的限制图谱。图21显示pEJG69的限制图谱。图22显示pEJG65的限制图谱。图23显示pMMrl9的限制图谱。图24显示pEJG49的限制图谱。图25显示pEmY15的限制图谱。图26显示pEmYM的限制图谱。图27显示pDM257的限制图谱。
图观显示pDM258的限制图谱。图四显示镶片镰孢JfyS1643-95_04 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)的转化体的相对乳糖
氧化酶产率。图30显示镶片镰孢JfyS1643-95_04 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)的转化体的相对 α-淀粉酶活性。图31显示pJfyS1698-65_15的限制图谱。图32显示pJfyS1698-72_10的限制图谱。图 33 显示镶片镰孢 JfyS1763_l 1-01 (Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA Δ alpA)的转化体的相对碱性蛋白酶活性。图34显示pJfyS1879-32_2的限制图谱。图35显示pJfySlll的限制图谱。定义乳清苷-5’ -单磷酸脱羧酶术语“乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶”在本文中定义为一种UTP 氨连接酶(形成ADP) (EC 6. 3. 4. 2)，其催化ATP+UTP+NH3至ADP+磷酸+CTP的转化。就本发明而言，乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶活性是依照Liberman，1956，Journal of Biological Chemistry 222:765-775)所述的方法确定的。α -淀粉酶术语“ α -淀粉酶”在本文中定义为一种1，4_α _D_葡聚糖葡聚糖水解酶(EC 3. 2. 1. 1)，其催化含有三个或更多1，4- α -连接D-葡萄糖单元的多糖中1， 4-α-D-糖苷连接的内水解。就本发明而言，α-淀粉酶活性是使用4，6-乙叉(G7)-对硝基苯基(Gl) - α -D-麦芽庚糖苷(4，6-ethylidene (G7) -p-nitrophenyl (Gl) -alpha-D-malt oheptaside)作为底物使用 Sigma Chemical Co. Kit 577 (St. Louis,M0, USA)在 pH 7. 0 确定的。碱性蛋白酶术语“碱性蛋白酶”在本文中定义为一种丝氨酸蛋白酶，其催化蛋白质中肽键的水解。就本发明而言，碱性蛋白酶活性是依照实施例观所述的方法确定的。单端孢霉烯类术语“单端孢霉烯类”在本文中定义为倍半萜环氧化物的家族，其从trichodiene由一系列氧化、异构化、环化和酯化得到更加复杂的单端抱霉烯类(Desjardins, Hohn 禾口 McCormick,1993, Microbiological Reviews 57 595-604)。单端孢霉烯类包括但不限于2-羟基trichodiene、12，13-环氧_9， 10-trichoene-2-酉享、isotrichodiol、isotrichotriol、trichotriol、isotrichodermol、 isotrichodermin、15_decalonectrin、3,15-didecalonectrin、脱氧雪腐键刀菌烯醇(deoxynivalenol)、3_乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、calonectrin、3，15- 二乙酰氧薦镰刀菌烯醇(3，15-diacet0XyScirpen0l)、3，4，15-三乙酰氧薦镰刀菌烯醇(3，4， 15-triacetoxyscirpenol)、4,15- 二乙酉先氧薦镰刀菌烯酉享(4,15-diacetoxyscirpenol)、 3-乙酰新茄病镰刀菌烯醇(3-acetylneosolaniol)、乙酰T_2毒素和Τ_2毒素；及其衍生物。单族毒素合酶术语“单族毒素合酶”在本文中定义为一种糊精-6-α-D-葡聚糖水解酶，其催化法尼基焦磷酸的异构化-环化以生成二环链烯烃trichodiene。就本发明而言，单族毒素合酶活性是依照Hohn和Beremand，1989，Applied and Environmental Microbiology 55 :1500-1503 所述的方法确定的。
由本发明的镶片镰孢突变体菌株产生的单端孢霉烯类水平可使用本领域公知的方法确定(参见，例如 Rood 等，1988，Journal of Agricultural and Food Chemistry 36: 74-79 ；Romer,1986, Journal of the Association of Official Analytical Chemists 69 :699-703 ；McCormick 等，1990, Applied and Environmental Microbiology 56 702-706)。环己缩肽术语“环己缩肽”在本文中定义为由羟基和氨基酸通过酰胺和酯键连接组成的肽相关化合物的家族。术语环己缩肽包括但不限于恩镰孢菌素(ermiatins)。恩镰孢菌素术语“恩镰孢菌素”在本文中定义为一类环己缩肽，其由三个D-2羟基异戊酸残基交替地与L-氨基酸或N-甲基-L-氨基酸连接组成以产生18员环结构。恩镰孢菌素是具有离子载体特性的环己缩肽植物毒素(phytoxin)，由多种放线菌和丝状真菌菌种，特别是镰孢属的菌株产生。恩镰孢菌素包括但不限于恩镰孢菌素AjpBjphjyBpC、 D、E禾PF ；及其哲 生物(Visconte 等，1992，Journal of Agricultural and Food Chemistry 40 :1076-1082 ；Tomodo 等，1992，Journal of Antibiotics 45 :1207-1215)，以及含有多于一种氨基酸的混合类型恩镰孢菌素(hcher等1982，Biochemistry 21 :43-48)。恩镰孢菌素的生物合成是由恩镰孢菌素合成酶催化的，其为大的多功能性酶，具有从其初级前体，即D-2羟基异戊酸，一种支链L-氨基酸(例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)，S-腺苷甲硫氨酸和ATP装配恩镰孢菌素的所有必需功能(R印er等，1995，European Journal of Biochemistry 230:119-126)。前体(D_2_羟基异戊酸和支链L-氨基酸)作为硫酯激活。共价结合的底物氨基酸残基在S-腺苷甲硫氨酸的消耗下甲基化。然后发生肽键形成和环化反应。环己缩肽合成酶术语“环己缩肽合成酶”在本文中定义为一种合成酶，其催化环己缩肽从D-2-羟基异戊酸，一种支链L-氨基酸(例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)，S-腺苷甲硫氨酸和ATP的产生。就本发明而言，环己缩肽合成酶活性是通过依照hcher等，1982， Biochemistry 21 :43-48的方法测量环己缩肽的产生来确定的。具体而言，将环己缩肽合成酶与ImM缬氨酸，0. 2mM S-腺苷甲硫氨酸，0. 2mM D_2_羟基异戊酸，4mM ATP和4mM乙酸镁以总体积100 μ 1在37°C在50mM MOPS pH 7. 0中温育10分钟。环己缩肽的量如WO 2000/92203 中所述基于 Visconti 等，1992，Journal of Agriculture and Food Chemistry 40 :1076-1082的方法来确定。一单位的环己缩肽合成酶活性定义为在37°C，pH 7. 0每分钟产生LOymol环己缩肽。环己缩肽的水平可依照Visconti 等，1992，Journal of Agriculture and Food Chemistry 40 :1076-1082的方法来确定。具体而言，将一ml镶片镰孢不含细胞的培养液用 2. Oml乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机萃取物在氮气流下蒸干，并重新溶解于0.5ml己烷。将一微升样品使用以电子冲击(EI)模式操作的Hewlett-Packard 6890GC/Series MSD 系统进行分析。将样品在柱上进样，并利用DB-5毛细管柱(30mX0.25mm，0.25ym薄膜)采用下述温度程序来分离以15°C /分钟的速率从120°C加热至300°C。例如，恩镰孢菌素A、 A1、B、B1、B2和B3通过m/z比例分别鉴定为682、668、640、654、6洸和612的(M++H)离子。缺陷术语“缺陷”在本文中定义为一种镶片镰孢突变体菌株，其与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比，不产生可检测的一个或多个(几个)选自下组的酶的活性 乳清苷-5’ -单磷酸脱羧酶、α-淀粉酶和碱性蛋白酶，或者还包括酶单族毒素合酶和环己缩肽合成酶的之一或两者的活性，或者，与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比， 优选产生至少25%更少，更优选至少50%更少，甚至更优选至少75%更少，且最优选至少 95%更少的一个或多个(几个)选自下组的酶乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α-淀粉酶和碱性蛋白酶，或者还包括酶单族毒素合酶和环己缩肽合成酶的之一或两者。由本发明的镶片镰孢突变体菌株产生的酶水平可使用本文中所述或本领域中已知的方法确定。镶片镰孢突变体菌株与在相同条件下培养的相应亲本丝状真菌细胞相比，优选产生至少25 %更少，更优选至少50 %更少，甚至更优选至少75 %更少，最优选至少95 %更少， 且甚至最优选无单端孢霉烯。所述亲本和突变体细胞可在有助于产生目标多肽的条件下或在有助于产生单端孢霉烯的条件下比较单端孢霉烯的产生。镶片镰孢突变体菌株与在相同条件下培养的相应的亲本丝状真菌细胞相比，优选产生至少25%更少，更优选至少50%更少，甚至更优选至少75%更少，最优选至少95%更少，且甚至最优选无环己缩肽。所述亲本和突变体细胞可在有助于产生目标多肽的条件下或在有助于产生环己缩肽的条件下比较环己缩肽的产生。分离的多肽术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过SDS-PAGE测定，所述多肽为至少1 %纯，优选至少5%纯，更优选至少10% 纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯， 且最优选至少90%纯。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10 %，优选至多8 %，更优选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多 4%,更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1 %，并且甚至最优选至多0. 5%的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少 95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99% 纯，最优选至少99. 5%纯，并且甚至最优选100%纯。本发明的多肽优选为基本上纯的形式，即，多肽制备物基本上不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。这可以通过如下实现例如，通过公知的重组方法或经典的纯化方法制备多肽。成熟多肽术语“成熟多肽”在本文中定义为具有酶活性的多肽，所述多肽以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在，所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基
化、磷酸化等。成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。同一性参数“同一性”描述两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用在EMBOSS包(EMBOSS =The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,Trends in Genetics 16 :276-277)的Needle程序中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970， J. Mol.Biol.48 :443-453)来确定，优选3. 0. 0版本或更高版本。使用的可选参数为缺口罚分(gap penalty) 10，缺口延伸罚分(gap extension penalty) 0· 5 和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity) ”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下
(同样的残基X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度通过在EMBOSS包 (EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice 等，2000，见上文)的 Needle 程序中实施的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，见上文) 来确定，优选3. 0.0版本或更高版本。使用的可选为参数缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和 EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下(同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)多肽片段术语“多肽片段”在本文中定义为从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有酶活性，例如乳清苷-5’ -单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶，碱性蛋白酶，单族毒素合酶或环己缩肽合成酶活性。亚序列术语“亚序列(subsequence) ”在本文中定义为从成熟多肽编码序列的5’ 和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列；其中所述亚序列编码具有酶活性例如乳清苷-5’-单磷酸脱羧酶，α -淀粉酶，碱性蛋白酶，单族毒素合酶或环己缩肽合成酶活性的多肽片段。等位变体(allelic variant)术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。分离的多核苷酸本文中术语“分离的多核苷酸”指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少纯，优选至少5%纯，更优选至少10 %纯，更优选至少20 %纯，更优选至少40 %纯，更优选至少60 %纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯。基本上纯的多核苷酸本文中术语“基本上纯的多核苷酸”指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%， 更优选至多5 %，更优选至多4 %，更优选至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选至多1 %，并且甚至最优选至多0. 5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，甚至更优选至少98%纯，最优选至少99%纯，并且甚至最优选至少99. 5%纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。编码序列当用于本文中，术语“编码序列，，意指直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。cDNA:术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。 起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自 mRNA的cDNA缺乏任何内含子序列。核酸构建体术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有本发明编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。调控序列(control sequence)术语“调控序列”在本文定义为包括表达本发明编码多肽的多核苷酸必需的所有组分。每个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或每个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。此类调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和目的为引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。表达术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。宿主细胞术语“宿主细胞”如用于本文中，包括任何易受包含本发明多肽的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的细胞类型。修饰术语“修饰”在本文中定义为对311^4、31 4、(1 81、？7冗和/或丨1^5在基因或其转录或翻译所需的调控序列中引入、取代或去除一个或多个核苷酸，或基因破坏、基因转化、基因缺失或随机或特异性诱变，或其组合。amyA、alpA、dpsUpyrG和tri5基因的一个或多个(几个)的缺失可为部分的或完全的。修饰导致pyrG、amyA、alpA、tri5、dpSl或其组合的表达的减少或消除(失活)。在一个优选的方面，一个或多个(几个)失活。发明详述本发明涉及产生多肽的方法，包括(a)在用于产生所述多肽的培养基中培养亲本镶片镰孢菌株的突变体，其中所述突变体菌株包含编码所述多肽的多核苷酸以及一个或多个(几个)选自下组的基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α -淀粉酶和碱性蛋白酶；和(b)从培养基回收所述多肽。在一个方面，所述突变体菌株还包含基因tri5和dpsl之一或两者，其中所述基因之一或两者经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。
本发明的一个优点是一个或多个(几个)可能有害于特定目标多肽的产生、下游加工例如回收、和/或应用的酶活性的消除或减少。在本发明的方法中，亲本镶片镰孢菌株可为野生型镶片镰孢菌株或其突变体。 应理解的是，术语“镶片镰孢”还包括镶片镰孢的变体(参见，例如Robert A. Samsom和 John I. Pitt 编，Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus Classification, Harwood Academic Publishers, The Netherlands)。在一个方面，所述亲本镶片镰孢菌株是镶片镰孢A3/5。在另一个方面，所述亲本镶片镰孢菌株是镶片镰孢NRRL 30747。在另一个方面，所述亲本镶片镰孢菌株是镶片镰孢ATCC 20334。在另一个方面，所述亲本镶片镰孢菌株是形态突变体(W0 97/26330)。酶缺陷镶片镰孢突变体菌株可通过使用本领域公知的方法如插入、破坏、替代或缺失来减少或消除一个或多个(几个)选自下组的基因pyrG、amyA和alpA或者还包括基因tri5和dpsl之一或两者来构建。可修饰基因的一部分如编码区或表达编码区所需的调控序列。此种基因调控序列可为启动子序列或其功能性部分，即足以影响基因表达的部分。例如，可失活启动子序列导致无表达，或可用较弱启动子替换天然启动子序列以减少编码序列的表达。其它用于可能的修饰的调控序列包括但不限于前导序列、前肽序列、信号序列、转录终止子和转录激活子。所述镶片镰孢突变体菌株可通过基因缺失技术消除或减少基因表达来构建。基因缺失技术使得基因能够部分或完全去除，由此消除其表达。在此类方法中，基因缺失是通过使用构建以连续含有基因5’和3’侧翼区的质粒进行的同源重组来达成的。所述镶片镰孢突变体菌株还可通过在基因或其转录或表达所需的调控序列中引入、取代和/或去除一个或多个(几个)核苷酸来构建。例如，可插入或去除核苷酸以导致终止密码子的引入、起始密码子的去除或开读框的移码。此种修饰可通过定点诱变或PCR 生成的诱变依照本领域已知方法来达成。参见，例如Botstein和Siortle，1985，Science 229 :4719 ；Lo 等，1985, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81 2285 ；Higuchi φ,1988, Nucleic Acids Research 16 :7351 ；Shimada, 1996, Meth. Mol. Biol. 57 157 ；Ho 等，1989，Gene 77 :61 ；Horton 等，1989，Gene 77 :61 ；以及 Sarkar 和 Sommer,1990, BioTechniques 8 :404。所述镶片镰孢突变体菌株还可通过基因破坏技术来构建，即将破坏性核酸构建体插入基因，所述破坏性核酸构建体包含与所述基因同源的核酸片段，该片段会产生同源区域的复制并将构建体DNA并入复制区域之间。如果插入的构建体将基因的启动子与编码区分开或中断编码序列从而导致非功能性基因产物，则此种基因破坏可消除基因表达。破坏性构建体可简单地为伴以与所述基因5’和3’区同源的区域的选择性标记基因。所述选择性标记使得能够鉴定含有受破坏基因的转化体。所述镶片镰孢突变体菌株还可通过基因转化的方法来构建(参见，例如Iglesias 禾口 Trautner，1983，Molecular General Genetics 189:73-76)。例如,在基因转化方法中， 将对应于所述基因的核苷酸序列在体外诱变以产生缺陷型核苷酸序列，然后将其转化入亲本镶片镰孢菌株以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷型核苷酸序列替代内源基因。可能需要所述缺陷型核苷酸序列也包含用于选择含有所述缺陷型基因的转化体的标记。所述镶片镰孢突变体菌株还可通过已确立的使用互补于基因核苷酸序列的核苷酸序列的反义技术来构建(Parish 和 Stoker，1997，FEMS Microbiology Letters 154 151-157)。更具体而言，镶片镰孢菌株的基因表达可通过引入互补于基因核苷酸序列的核苷酸序列来减少或失活，所述核苷酸序列可在株中转录，并能够杂交于株中产生的mRNA。在使得所述互补反义核苷酸序列能够杂交于所述mRNA的条件下，翻译的蛋白质的量由此减少或消除。所述镶片镰孢突变体菌株还可通过已确立的RNA干扰(RNAi)技术来构建(参见， 例如 WO 2005/056772)。所述镶片镰孢突变体菌株还可通过随机或特异性诱变使用本领域公知方法来构建，所述方法包括但不限于化学诱变(参见，例如Hopwood，The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J. R. Norris 禾口 D. W. Ribbons 编)pp 363-433, Academic Press, New York, 1970)。基因修饰可通过对亲本菌株进行诱变并筛选其中基因表达减少或失活的突变体菌株来实施。诱变可为特异性的或随机的，可通过例如使用合适的物理或化学诱变剂，使用合适的寡核苷酸，或对DNA序列进行PCR生成的诱变来实施。此外，诱变可通过使用这些诱变方法的任何组合来实施。适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N’ -亚硝基胍(NTG) 0-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMQ、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，诱变通常是通过将待诱变的亲本菌株在所选诱变剂的存在下在合适的条件下温育，并选择呈现基因表达减少或无基因表达的突变体来实施的。在一个方面，所述修饰导致一个或多个(几个)选自下组的基因pyrG、amyA和 alpA，或者还包括基因tri5和dpsl之一或两者的失活。在另一个方面，所述修饰导致一个或多个(几个)选自下组的基因pyrG、amyA和alpA，或者还包括基因tri5和dpsl之一或两者的表达的减少。在另一个方面，修饰导致一个或多个(几个)选自下组的基因pyrG、 amyA和alpA，或者还包括基因tri5和dpsl之一或两者的表达的减少、失活或其组合。在另一个方面，所述突变体包含pyrG和amyA的修饰。在另一个方面，所述突变体包含PyrG和alpA的修饰。在另一个方面，所述突变体包含amyA和alpA的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5和pyrG的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5和amyA 的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5和alpA的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含amyA和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含alpA和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含pyrG和dpsl 的修饰。在另一个方面，所述突变体包含pyrG、amyA和alpA的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5、pyrG和amyA的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5、pyrG和alpA 的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5、pyrG和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5、amyA和alpA的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5、amyA和dpsl 的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5、alpA和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含amyA、alpA和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含pyrG、alpA和dpsl 的修饰。在另一个方面，所述突变体包含pyrG、amyA和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5、pyrG、amyA和alpA的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5、pyrG、amyA和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5、 amyA、alpA和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含pyrG、amyA、alpA和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含tri5、pyrG、alpA和dpsl的修饰。在另一个方面，所述突变体包含pyrG、amyA、alpA、tri5和dpsl的修饰。在一个方面，所述pyrG基因包含编码具有乳清苷-5’ -单磷酸脱羧酶活性包含与 SEQ ID NO 44的氨基酸序列优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %同一性的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述PyrG基因包含编码具有乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶活性包含SEQ ID NO 44的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述pyrG基因包含编码具有乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶活性由SEQ ID NO 44的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述pyrG基因优选包含与SEQ ID NO :43的核苷酸序列优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。在另一个方面，所述pyrG基因包含SEQ ID NO 43 的核苷酸序列。在另一个方面，所述PyrG基因由SEQ ID NO :43的核苷酸序列组成。在另一个方面，所述pyrG基因包含在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中等严格条件下，更优选中等-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO :43的核苷酸序列或其全长互补链杂交的核苷酸序列。在另一个方面，所述乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶包含与SEQ ID N0:44的氨基酸序列优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %， 更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少 97%，至少98%，或至少99%相同的氨基酸序列。在另一个方面，所述乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶包含SEQ ID NO :44的氨基酸序列。在另一个方面，所述乳清苷_5‘-单磷酸脱羧酶由SEQ ID NO 44的氨基酸序列组成。在另一个方面，所述乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶由包含与SEQ ID N0:43的核苷酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少 80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %， 至少97%，至少98%，或至少99%同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面， 所述乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶由包含SEQ ID NO :43的核苷酸序列的多核苷酸所编码。 在另一个方面，所述乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶由由SEQ ID NO :43的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶由包含在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中等严格条件下，更优选中等-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO :43的核苷酸序列或其全长互补链杂交的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述amyA基因包含编码具有α -淀粉酶活性包含与SEQ ID NO 52 的氨基酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述amyA基因包含编码具有α -淀粉酶活性包含SEQ ID NO :52的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述amyA基因包含编码具有α _淀粉酶活性由SEQ ID NO 52的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述amyA基因包含与SEQ ID NO :51的核苷酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。在另一个方面，所述amyA基因包含SEQ ID NO 51 的核苷酸序列。在另一个方面，所述amyA基因由SEQ ID NO :51的核苷酸序列组成。在另一个方面，所述amyA基因包含在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中等严格条件下，更优选中等-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO :51的核苷酸序列或其全长互补链杂交的核苷酸序列。在另一个方面，所述α-淀粉酶包含与SEQ ID NO :52的氨基酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的氨基酸序列。在另一个方面，所述α-淀粉酶包含SEQ ID NO 52的氨基酸序列。在另一个方面，所述α-淀粉酶由SEQ ID NO :52的氨基酸序列组成。在另一个方面，所述α -淀粉酶由包含与SEQ ID NO 51的核苷酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少 98%,或至少99%同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述α -淀粉酶由包含SEQ ID NO :51的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述α-淀粉酶由由SEQ ID NO 51的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述α-淀粉酶由包含在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中等严格条件下，更优选中等-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下， 且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO 51的核苷酸序列或其全长互补链杂交的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述alpA基因包含编码具有碱性蛋白酶活性包含与SEQ ID NO 84的氨基酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %， 更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的多肽的核苷酸序列。在另一个方面， 所述alpA基因包含编码具有碱性蛋白酶活性包含SEQ ID NO :84的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述alpA基因包含编码具有碱性蛋白酶活性由SEQ ID NO 84 的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述alpA基因包含与SEQ ID NO :83的核苷酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。在另一个方面，所述alpA基因包含SEQ ID NO 83 的核苷酸序列。在另一个方面，所述alpA基因由SEQ ID NO :83的核苷酸序列组成。
在另一个方面，所述alpA基因包含在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中等严格条件下，更优选中等-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO :83的核苷酸序列或其全长互补链杂交的核苷酸序列。在另一个方面，所述碱性蛋白酶包含与SEQ ID NO :84的氨基酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的氨基酸序列。在另一个方面，所述碱性蛋白酶包含SEQ ID NO: 84的氨基酸序列。在另一个方面，所述碱性蛋白酶由SEQ ID NO :84的氨基酸序列组成。在另一个方面，所述碱性蛋白酶由包含与SEQ ID NO :83的核苷酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述碱性蛋白酶由包含SEQ ID NO :83的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述碱性蛋白酶由由SEQ ID NO 83的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述碱性蛋白酶由包含在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中等严格条件下，更优选中等-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下， 且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO 83的核苷酸序列或其全长互补链杂交的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述tri5基因包含编码具有单族毒素合酶活性包含与SEQ ID NO 20的氨基酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %， 更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的多肽的核苷酸序列。在另一个方面， 所述tri5基因包含编码具有单族毒素合酶活性包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述tri5基因包含编码具有单族毒素合酶活性由SEQ ID NO 20的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述tri5基因包含与SEQ ID NO :19的核苷酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。在另一个方面，所述tri5基因包含SEQ ID NO 19 的核苷酸序列。在另一个方面，所述tri5基因由SEQ ID NO 19的核苷酸序列组成。在另一个方面，所述tri5基因包含在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中等严格条件下，更优选中等-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO: 19的核苷酸序列或其全长互补链杂交的核苷酸序列。在另一个方面，所述单族毒素合酶包含与SEQ ID NO :20的氨基酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少98%，或至少99%同一性的氨基酸序列。在另一个方面，所述单族毒素合酶包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列。在另一个方面，所述单族毒素合酶由SEQ ID NO 20的氨基酸序列组成。
在另一个方面，所述单族毒素合酶由包含与SEQ ID NO :19的核苷酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少98%，或至少99%同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述单族毒素合酶由包含SEQ ID NO :19的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述单族毒素合酶由由SEQ ID NO 19的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述单族毒素合酶由包含在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中等严格条件下，更优选中等-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO: 19的核苷酸序列或其全长互补链杂交的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述dpsl基因包含编码具有环己缩肽合成酶活性包含与SEQ ID NO 94的氨基酸序列具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少 75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述dpsl基因包含编码具有环己缩肽合成酶活性包含SEQ ID N0:94的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述dpsl基因包含编码具有环己缩肽合成酶活性由SEQ ID NO 94的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述dpsl基因包含与SEQ ID NO :93的核苷酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。在另一个方面，所述dpsl基因包含SEQ ID NO 93 的核苷酸序列。在另一个方面，所述dpsl基因由SEQ ID NO :93的核苷酸序列组成。在另一个方面，所述dpsl基因包含在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中等严格条件下，更优选中等-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO :93的核苷酸序列或其全长互补链杂交的核苷酸序列。在另一个方面，所述环己缩肽合成酶包含与SEQ ID NO :94的氨基酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %同一性的氨基酸序列。在另一个方面，所述环己缩肽合成酶包含SEQ ID NO :94的氨基酸序列。在另一个方面，所述环己缩肽合成酶由SEQ ID NO :94的氨基酸序列组成。在另一个方面，所述环己缩肽合成酶由包含与SEQ ID NO :93的核苷酸序列具有优选至少60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少96 %，至少97 %， 至少98%，或至少99%同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述环己缩肽合成酶由包含SEQ ID NO :93的核苷酸序列的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述环己缩肽合成酶由由SEQ ID NO 93的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码。在另一个方面，所述环己缩肽合成酶由包含在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中等严格条件下，更优选中等-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQ ID NO :93的核苷酸序列或其全长互补链杂交的核苷酸序列的多核苷酸所编码。本文中公开的核苷酸序列或其亚序列，以及其氨基酸序列或其片段，可依照本领域公知的方法用于设计核酸探针以从不同属或种的株鉴定并克隆上述的基因的同源DNA。 具体而言，此类探针可用于遵循标准Southern以及方法与目标属或种的基因组或cDNA杂交以鉴定并分离其中相应的基因。此类探针可明显地短于全序列，但应为至少15，优选至少 25，且更优选至少35个核苷酸长度。也可使用更长的探针。可使用DNA和RNA探针两者。 探针通常经标记以供检测相应基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或亲和素标记)。因此，可就与上述探针杂交的DNA筛选从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA 文库。来自此类其它生物的基因组或其它DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移至并固化于硝酸纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定与本文中公开的核苷酸序列同源的克隆或DNA，将载体物质用于 Southern印迹。就本发明而言，杂交表明核酸序列在非常低至非常高严格条件下杂交于对应于本文中公开的核苷酸序列的标记的核酸探针，其互补链，或其亚序列。在这些条件下与所述核酸探针杂交的分子使用χ-射线片来检测。对于长度至少为100个核苷酸的探针，非常低至非常高严格条件定义为在42°C在 5X SSPE，0. 3% SDS，200 μ g/ml经剪切和变性的鲑精DNA中进行杂交和预杂交，且对于非常低和低严格度，使用25%甲酰胺，对于中等和中等-高严格度，使用35%甲酰胺，或者对于高或非常高严格度，使用50%甲酰胺，遵循标准Southern印迹方法任选地进行12至M小时。对于长度至少为100个核苷酸的探针，最终使用2X SSC，0.2% SDS，优选在 450C (非常低严格度)，更优选在50°C (低严格度)，更优选在55°C (中等严格度)，更优选在60°C (中等-高严格度)，甚至更优选在65°C (高严格度)，且最优选在70°C (非常高严格度)洗涤三次，每次15分钟。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用*艮据 Bolton 禾P McCarthy 计算法(1962, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48 :1390)计算的 Tm 低大约 5°C至大约 10°C，在 0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7. 6,6mM EDTA,0. 5% NP-40, IXDenhardt 溶液，ImM 焦磷酸钠，ImM 磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0. ImMATP 和 0. 2mg 每 ml 的酵母 RNA 中，根据标准的 Southern 印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至M小时。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0. 1% SDS中洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算的Tm低5°C至10°C的温度洗涤两次，每次15分钟。可使用来自其它微生物来源的，与本文中所述的基因同源或互补的核苷酸序列以修饰所选镶片镰孢菌株中的相应基因。在另一个方面，在镶片镰孢突变体菌株中基因的修饰是去除选择性标记。选择性标记的去除可通过将突变体在反选择培养基上培养突变体来达成。当所述选择性标记基因含有其5’和3’端侧翼的重复时，在对突变体菌株进行反选择时该重复将通过同源重组促使所述选择性标记基因的环出(loop out)。所述选择性标记基因还可通过同源重组来去除，即将包含缺陷型基因5’和3’区，但缺乏选择性标记的核酸片段引入突变体菌株，然后在反选择培养基上进行选择。通过同源重组，含有所述选择性标记基因的缺陷型基因由缺乏所述选择性标记的核酸片段替代。也可使用其它本领域中已知的方法。应理解的是，本发明的方法并不限于特定顺序以供获得镶片镰孢突变体菌株。基因的修饰可在用于产生目标多肽的株构建中的任意步骤引入亲本菌株。优选在此种构建之前所述镶片镰孢突变体菌株已经变为酶缺陷的。在本发明的另一个方面，镶片镰孢的突变体菌株可含有其它修饰，例如其它基因的缺失或破坏，所述基因可编码对目标多肽产生、回收或应用有害的物质。在一个方面，所述镶片镰孢菌株还包含一个或多个(几个)编码蛋白水解活性的基因的修饰例如破坏或缺失。在另一个方面，所述蛋白水解活性选自下组氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉蛋白酶(aspergillop印sin)、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和液泡蛋白酶(vacuolar protease)。在另一个方面，所述镶片镰孢菌株还包含一个或多个(几个)编码选自下组的酶的其它基因的修饰例如破坏或缺失糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶 (chitinase)、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移酶、α-1，6_转糖基酶、α-1，6-转糖苷酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。在本发明的方法中，所述镶片镰孢突变体菌株与在相同产生条件下培养的相应亲本镶片镰孢菌株相比优选产生至少相同量的目标多肽。在另一个方面，所述突变体菌株与在相同产生条件下培养的相应亲本镶片镰孢菌株相比多产生至少25%，优选至少50%，更优选至少75%，且最优选至少100%多肽。将所述镶片镰孢突变体菌株在用于产生目标多肽的营养培养基中使用本领域已知方法培养。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养所述株。使用本领域已知的方法在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公布的组成制备 (例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。分泌的多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其可从细胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、高效液相色谱、毛细管色谱、酶产物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如，酶测定(enzyme assay)可用于确定如本文所述的多肽的活性。对于许多酶，用于确定酶活性的方法在本领域是已知的(参见，例如D. khomburg和 M. Salzmann(编),Enzyme Handbook, Springer-Verlag, New York,1990)。所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。然后分离的多肽可以通过多种本领域已知的方法进一步纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦(IEF))、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)或提取(参见，例如，Protein Purification，J. -C. Janson 禾口 Lars Ryden 编，VCH Publishers，New York，1989)。所述目标多肽可为任何对于镶片镰孢菌株为天然或外源(异源)的多肽。所述多肽可由单一基因或两种或更多种基因编码。术语“编码多肽的多核苷酸”应理解为涵盖一个或多个(几个)涉及所述多肽产生的基因。术语“异源多肽”在本文中定义为对于宿主株并非天然的多肽；其中进行了结构修饰以改变天然多肽(例如，天然多肽的蛋白质序列) 的天然多肽；或其表达作为通过重组DNA技术操纵多核苷酸或宿主株(更强的启动子)的结果发生定量改变的天然多肽。因此，本发明术语“异源多肽”的范围还涵盖了天然多肽的重组产生，其程度使得此种表达涉及使用对于镶片镰孢株并非天然的遗传元件，或使用经操纵以并非天然存在于宿主株中的方式起作用的天然元件。在一个方面，所述多肽对于所述镶片镰孢菌株为天然多肽。在另一个方面，所述多肽对于所述镶片镰孢菌株为异源多肽。所述多肽可为任何具有目标生物活性的多肽。术语“多肽”在本文中并不意指特定长度的编码产物，因此，其涵盖肽、寡肽和蛋白质。术语“多肽”还涵盖两种或更多种多肽组合以形成编码产物。多肽还包括融合多肽，其包含从至少两种不同的多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中一个或多个(几个)多肽对于所述镶片镰孢菌株可为异源的。多肽还包括上述多肽和杂合体多肽的天然存在的等位变体和工程改造的变体。优选地，所述多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫调节剂 (immunodilator)、神经递质、受体、报道蛋白、结构蛋白和转录因子。在一个方面，所述多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。 在另一个方面，所述多肽是氨肽酶、α-淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。在另一个方面，所述多肽是白蛋白、胶原、原弹性蛋白、弹性蛋白或明胶。在本发明的方法中，所述镶片镰孢突变体菌株是重组株，包含编码异源多肽的多核苷酸，其可有利地用于重组产生多肽。所述株优选用包含编码异源多肽的多核苷酸的载体转化，然后将该载体整合入染色体。“转化”意指将包含多核苷酸的载体引入宿主株，从而使得所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体维持。通常认为整合是有利的，因为多肽更有可能在所述株中稳定地保持。将载体整合入染色体可通过同源重组、非同源重组或转座来进行。编码异源多肽的多核苷酸可从任何原核、真核或其它来源例如古细菌获得。就本发明而言，术语“从...获得”在本文中与给定来源相连应意指所述多肽由所述来源产生或由其中插入了来自所述来源的基因的株产生。在本发明的方法中，本发明的镶片镰孢突变体菌株还可用于重组产生对于镶片镰孢菌株为天然的多肽。该天然多肽可由重组手段来产生，即通过例如将编码多肽的基因置于不同的启动子调控下以增强该物质的表达，通过使用例如信号肽加速其输出至该株之外，或增加通常由所述镶片镰孢菌株产生的编码所述多肽的基因的拷贝数。
用于分离或克隆编码目标多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用聚合酶链式反应(PCR)实现从这种基因组DNA克隆所述核酸序列。参见，例如，Innis等，1990，PCR Protocols =A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York。所述克隆方法可涉及切出禾口分离包含编码所述多肽的多核苷酸的所需核酸片段，将所述片段插入载体分子，和将重组载体并入本发明的镶片镰孢突变体菌株，其中所述多核苷酸的多个拷贝或克隆会被复制。所述核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任何组合。在本发明的方法中，所述多肽还可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中一个多肽融合于另一个多肽或其片段的N-端或C-端。融合多肽是通过将编码一个多肽的核苷酸序列(或其一部分)与编码另一个多肽的核苷酸序列(或其一部分)融合来产生的。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列从而使得其在框内(in frame)，且融合多肽的表达是在相同的启动子和终止子调控之下。编码异源多肽的分离的多核苷酸可以以多种方式操纵以提供所述多肽在本发明的镶片镰孢突变体菌株中的表达。取决于表达载体，在其插入载体之前对多肽序列的操纵可为理想的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域是公知的。包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体可在与调控序列相容的条件下与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列能够在本发明的镶片镰孢突变体菌株中指导编码序列的表达。所述调控序列可为适当的启动子序列，其为由本发明的镶片镰孢突变体菌株识别用于表达编码多肽的多核苷酸的核苷酸序列。所述启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所述镶片镰孢突变体菌株中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码对于该镶片镰孢突变体菌株为同源或异源(外源)的胞外或胞内多肽的基因获得。用于在本发明方法中指导核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从下列的基因获得的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(W0 00/56900)、镶片镰孢 Daria (W0 00/56900)、镶片镰孢 Quinn (W0 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W0 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。所述调控序列也可为合适的转录终止子序列，其为由本发明的镶片镰孢突变体菌株识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码异源多肽的核苷酸序列的3’端可操作地连接。在镶片镰孢菌株中有功能的任何终止子可用于本发明。优选的终止子从下述基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
所述调控序列还可为合适的前导序列，其为对于本发明的镶片镰孢突变体菌株的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码异源多肽的核苷酸序列的5’末端。可以将在镶片镰孢突变体菌株中有功能的任何前导序列用于本发明。对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。所述调控序列还可为聚腺苷酸化序列，其为与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且当其转录时，镶片镰孢突变体菌株将其识别为信号以将聚腺苷残基添加至转录的mRNA。在镶片镰孢突变体菌株中有功能的任何聚腺苷酸化序列可用于本发明。对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得米曲霉 TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者， 编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入镶片镰孢突变体菌株的分泌途径(即分泌入培养基)的任何信号肽编码序列可用于本发明。对于镶片镰孢突变体菌株有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码区米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。所述调控序列还可为前肽编码区，其编码位于多肽氨基端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情况下称为酶原 (zymogen))0前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。前肽编码区可从如下酶的基因获得酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(W0 95/33836)。当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着 (next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。所述核酸构建体还可包含一个或多个(几个)多核苷酸，其编码一个或多个(几个)有利于指导异源多肽表达的因子，例如转录因子(例如，反式作用因子)、分子伴侣和加工蛋白酶。任何在镶片镰孢突变体菌株中有功能的因子可用于本发明。所述编码一个或多个(几个)这些因子的核酸不一定与编码所述异源多肽的核苷酸序列串联(in tandem)。可能还需要是添加调节或调控序列，其使得能够相对于镶片镰孢突变体菌株的生长来调节多肽表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。可以使用丝状真菌中的调节系统如TAKAa-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤 (methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。
在本发明的方法中，可将包含核苷酸序列、启动子和转录和翻译停止信号的重组表达载体用于目标多肽的重组产生。本文中所述的多种核酸和调控序列可连接在一起以产生重组表达载体，其包含一个或多个(几个)方便的限制位点以使得编码多肽的核苷酸序列能够在此类位点插入或取代。或者，所述核苷酸序列可通过将所述核苷酸序列或包含所述序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体来表达。当构建表达载体时，编码序列位于载体上，从而使得编码序列与用于表达的适当调控序列可操作地连接。所述重组表达载体可为任何可对其方便地进行重组DNA方法并实现核苷酸序列表达的载体(例如，质粒或病毒)。对载体的选择通常取决于其与其待引入的镶片镰孢突变体菌株的相容性。载体可为直链或闭合环状质粒。所述载体可为自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。所述载体可含有任何用于确保自主复制的手段。或者，所述载体可为当引入镶片镰孢突变体菌株时，整合入基因组并与其整合入的染色体一同复制的载体。此外，可使用单一载体或质粒，或一同含有待引入镶片镰孢突变体菌株基因组的总DNA的两种或更多种载体或质粒，或转座子。载体优选含有一个或多个(几个)选择性标记，其使得能够方便地选择转化的镶片镰孢突变体菌株。选择性标记为其产物提供对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属抗性、使营养缺陷型变为原养型等的基因。用于镶片镰孢突变体菌株的选择性标记的实例包括但不限于，amdS(乙酰胺酶、 argB (鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar (phosphinothricin乙酰转移酶)、hpt (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸还原酶)、pyrG (乳清苷-5 ’ -单磷酸脱羧酶)、sC (硫酸腺苷转移酶)和 trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及其等同物。优选用于镶片镰孢突变体菌株的是构巢曲霉的 amdS 基因禾口吸水链霄菌(Streptomyces hygroscopicus)的 bar 基因。所述载体优选含有使得所述载体能够整合入宿主细胞的基因组或使得所述载体能够独立于基因组在细胞中自主复制的元件。对于整合入镶片镰孢突变体菌株的基因组，所述载体可依赖于编码多肽的多核苷酸序列，或其它任何用于通过同源重组或非同源重组整合入基因组的载体元件。或者，所述载体可含有其它的核苷酸序列以供指导通过同源重组在染色体中精确位置整合入镶片镰孢突变体菌株的基因组。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10，000碱基对，优选400至10，000碱基对，且最优选800至10，000碱基对，其对于相应的靶序列具有高度的同一性以增强同源重组的可能性。整合元件可为任何与镶片镰孢突变体菌株基因组中靶序列同源的序列。此外，所述整合元件可为非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，所述载体可通过非同源重组整合入所述亲本镶片镰孢菌株。
对于自主复制，所述载体还可包含使得载体能够在镶片镰孢突变体菌株中自主复制的复制起点。所述复制起点可为任何介导在细胞中有功能的自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文中定义为使得质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。 可用于镶片镰孢突变体菌株的复制起点的实例是AMAl和ANSI (Gems等， 1991，Gene 98 :61-67 ；Cullen 等，1987，Nucleic Acids Research 15 :9163-9175；WO 00/24883)。AMAl基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可依照WO 00/24883中公开的方法达成。用于连接本文中所述元件以构建重组表达载体的方法对于本领域技术人员是公知的(参见，例如 J. Sambrook, E. F. Fritsch 禾口 T. Maniatus，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, New York)。包含核苷酸序列的载体可通过例如转化引入镶片镰孢突变体菌株从而使得载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持。整合通常被视为有利的，因为核苷酸序列更有可能在株中稳定维持。载体整合入染色体通过同源重组、非同源重组或转座发生。将表达载体引入镶片镰孢突变体菌株可涉及由以本身已知的方式的原生质体形成、原生质体转化和株细胞壁的再生组成的方法。合适的用于转化镶片镰孢菌株的方法描述于 Malardier 等，1989，Gene 78 :147-156 和 W096/00787。本发明还涉及获得亲本镶片镰孢菌株的突变体的方法，包括a)修饰选自下组的一个或多个(几个)基因pyrG、amyA和alpA;和(b)鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷-5’-单磷酸脱羧酶、α-淀粉酶和碱性蛋白酶。在一个方面，所述获得亲本镶片镰孢菌株的突变体的方法还包括修饰基因tri5 和dpsl之一或两者使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者酶的产生中有缺陷。本发明还涉及亲本镶片镰孢菌株的突变体，包含编码多肽的多核苷酸以及选自下组的一个或多个(几个)基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α -淀粉酶和碱性蛋白酶。在一个方面，所述亲本镶片镰孢菌株的突变体还包含基因tri5和dpsl之一或两者，其中所述基因之一或两者经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。本发明进一步通过下述实施例描述，其不应视为限制本发明的保护范围。
实施例材料用作缓冲剂和底物的化学物为至少试剂级的商业产品。所有的引物和寡核苷酸由 MWG Biotech, Inc.，High Point, NC, USA 提供。真菌菌株镰孢属株A3/5，现在重新分类为镶片镰孢(Yoder和Christianson，1998，Fungal Genetics and Biology 23:62-80 ；0' Donnell 等，1998, Fungal Genetics and Biology 23 :57-67)从 Dr. Anthony Trinci, University of Manchester, Manchester, England 获得。该株的保藏可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)以镰孢属株ATCC 20334或农业研究机构专利培养物保藏中心北区研
23究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL),Northern Regional Research Center), 1815 University Street, Peoria, IL, USA 作为键抱属株 NRRL 30747 获得。培养基和溶液LB板由每升IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl和15g的细菌琼脂组成。NZY顶层琼脂由每升5g的NaCl、5g的酵母提取物、IOg的NZ胺、2g的MgSO4和7g 的琼脂糖组成。M400培养基由每升50g的麦芽糊精、2g的MgSO4-7H20,2g的KH2P04、4g的柠檬酸、 8g的酵母提取物、2g的尿素、0. 5g的CaCl2和0. 5ml的AMG痕量金属溶液，pH 6. 0组成。AMG 痕量金属溶液由每升 14. 3g 的 ZnSO4 ·7Η20、2· 5g 的 CuSO4 ·5Η20、0· 5g 的 NiCl2, 13. 8g的FeS04、8. 5g的MnSO4和3. Og的柠檬酸组成。2XYT培养基由每升16g的胰蛋白胨、IOg的酵母提取物、5g的NaCl和5g的细菌琼脂组成。YP培养基由每升IOg的酵母提取物和20g的细菌蛋白胨组成。YP(i5%培养基由每升IOg的酵母提取物、20g的细菌蛋白胨和50g的葡萄糖组成。RA培养基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaNO3Ug的葡萄糖和20ml的50X Vogels 盐溶液(不含C、不含NaNO3)组成。RA+尿苷培养基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaNO3Ug的葡萄糖和20ml of 50X Vogels盐溶液(不含C、不含NaNO3)组成。在RA培养基的过滤灭菌之后，将过滤灭菌的尿苷添加至终浓度10mM。RA+BASTA 培养基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaNO3Ug的葡萄糖和20ml的 50X Vogels盐溶液(不含C、不含NaNO3)组成。在RA培养基的过滤灭菌之后，使用250mg/ ml 的工作储液将过滤灭菌的 BASTA (草铵膦(glufosinate)，Hoechst Schering AgrEvo, Frankfurt, Germany)添力口至终浓度为 6mg/ml。50X Vogels 盐溶液(No C、No NaNO3)由每升 250g 的 KH2PO4UOg 的 MgSO4 · 7H20、 5g的CaCl2 · 2H20、2. 5ml的生物素溶液和5ml的Vogels痕量元素溶液组成。生物素储液由IOOml 50%乙醇中的5mg生物素组成。Vogels痕量元素溶液由每IOOml 5g的柠檬酸、5g的ZnSO4 · 7H20、lg的 Fe (NH4) 2 (SO4) 2 · 6Η20、0· 25g 的 CuSO4 · 5Η20、0· 05g 的 MnSO4 · H20,0. 05g 的 H3BO3 和 0. 05g 的 Na2MoO4 · 2H20 组成。VNO3RLMT 板由每升 20ml 的 50X Vogels 盐溶液(25mM NaNO3) >273. 33g 的蔗糖和 15g 的 LMT 琼脂糖(Sigma，St. Louis, MO, USA)组成。50X Vogels 盐溶液 Q5mM NaNO3)由每升 125g 的柠檬酸钠、250g 的ΚΗ2Ρ04、106. 25g 的 NaNO3UOg 的 MgSO4 · 7H20、5g 的 CaCl2 · 2Η20、2· 5ml 的生物素储液和 5ml 的 Vogels 痕量元素溶液组成。VN03RLMT-BASTA 板由每升 20ml 的 50X Vogels 盐溶液(25mMNaN03) ,273. 33g 的蔗糖和15g的LMT琼脂糖组成。在高压灭菌和冷却之后，添加BASTA 至终浓度为6mg/ml。STC 由 0. 8M 山梨醇、25 或 50mMTrispH8 和 50mMCaCl2 组成。
SPTC 由 40% PEG 4000,0. 8M 山梨醇、25 或 50mM Tris pH 8 和 50mMCaCl2 组成。SY50 培养基(pH 6. 0)由每升 50g 的蔗糖、2. Og 的 MgSO4 WH2OUOg 的 KH2PO4,2. Og 的K2S04、2. Og的柠檬酸、IOg的酵母提取物、2. Og的尿素、0. 5g的CaCl2 ·2Η20和5ml的200X
AMG痕量金属溶液(不含镍)组成。200X AMG痕量金属溶液(不含镍)由每升3. Og的柠檬酸、14. 3g的SiSO4 · 7H20、 2. 5g 的 CuSO4 · 5H20、13. 8g 的 FeSO4 · 7H20 和 8. 5g 的 MnSO4 · H2O 组成。20X SSC由0. 3M柠檬酸钠pH 7 and 3M氯化钠组成。DNA 测序DNA 测序是用 ABI PRIZM 3700DNA Analyzer (Applied Biosystems, Inc.， Foster City, CA, USA)进行的。实施例1 镶片镰孢转化方法。将一百微克每种下述实施例中所述的缺失盒用Bst Z171/Bam HI (实施例11)或 Not I (实施例14、16,28和30)消化。将每个消化反应物在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit提取DNA条带。将所得的纯化DNA 在1. 5ml微离心管中通过乙醇沉淀来浓缩，即添加10%反应物体积的3M乙酸钠，pH 5，然后添加2. 5体积的冰冷的乙醇(94% )并在冰上温育20分钟。然后将试管在EPPENDORF 5424桌上离心机(Eppendorf,Hamburg,Germany)中以15，OOOxg离心10分钟。弃去上清， 并用Iml冰冷的70%乙醇洗涤沉淀，并将其以15，OOOxg离心5分钟。弃去上清并使沉淀风干。然后将沉淀重悬于70 μ 1 IOmM Tris pH 8缓冲液。所得的含DNA溶液的浓度使用 NANODROP 1000 分光光度计(ThermoFischer Scientific, ffaltham, MA, USA)确定。适当受体株的原生质体是通过下述方法生成。首先通过用含有VNO3RLMT培养基的7日培养物的Ihlcm2琼脂栓接种2. 8L Fernbach烧瓶中的500ml的RA培养基(实施例 11)或补充了 IOmM尿苷的RA培养基(实施例14、16、观和30)并将烧瓶在以150rpm 振荡温育36小时来获得孢子。将孢子培养物经过无菌MIRACL0TH 过滤，并将孢子捕获于 MILLIPORE STERICUP ο. 2 μ m 过滤单元(Millipore，Bellerica，MA，USA)之上。用 200ml灭菌玻璃蒸馏水洗涤孢子，并将其重悬于IOml灭菌玻璃蒸馏水。将一 ml的孢子溶液用于接种IOOml补充了 5%葡萄糖的YP培养基(实施例11) 或补充了 5%葡萄糖和IOmM尿苷的YP培养基(实施例14、16、观和30)。将接种的培养基在17°C以150rpm振荡温育16小时。将培养物经过MIRACL0TH 过滤以收集菌丝体，然后使用灭菌的刮铲将其转移至50ml聚丙烯管。将菌丝体重悬于20ml在每ml IM的MgSO4中含有每ml 5mg 的 N0V0ZYME 234 禾口 5mg GLUCANEX (两者均来自 Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)的原生质体化溶液，并转移至50ml聚丙烯管。将管在29. 5°C以90rpm振荡温育一小时，之后添加30ml IM山梨醇。然后将管以800xg在Sorvall RT 6000B浮筒式离心机(ThermoFischer Scientific, ffaltham, MA, USA)中离心10分钟。弃去上清并将原生质体沉淀用30ml IM山梨醇洗涤两次。将管在SOOxg离心5分钟并弃去上清。将原生质体以切107每ml的浓度重悬于过滤灭菌的9 1 0. 1 (v/v) STC SPTC DMSO溶液中，并以受控冷冻速率使用 NALGENE Cryo 1°C Freezing Container(ThermoFischer Scientific, ffaltham, MA, USA)在 _80°C冷冻过夜。转化通过将原生质体在冰上融化并将200 μ 1原生质体添加至四个Hml管中的每一个来达成。将五yg DNA(少于ΙΟμΙ)添加至前三个管中，而不将DNA添加至第四个管。 然后将750 μ 1 SPTC添加至每个管，并轻柔地将管颠倒6次。将管在室温温育30分钟，并将6ml STC添加至每个管。将每个转化物分为三份，并添加至150mm直径板上，其含有补充了每ml 125 yg潮霉素的VNO3RLMT培养基的150mm直径板上(实施例11)或补充了每ml 125 μ g潮霉素和IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基(实施例14、16,28和30)，并在室温温育7 曰。实施例2 Southern 分析真菌生物质是通过将25ml的M400培养基(实施例11)或补充了 IOmM尿苷的M400 培养基(实施例14、16、观和30)用来自如实施例1和11中所述生成的7日龄转化体的四个Icm琼脂栓接种而产生的。将培养物在以150rpm振荡温育3日。去除琼脂栓，并将培养物经过MIRACL0TH 过滤。将收获的生物质用液氮冷冻，并使用研钵和杵磨碎菌丝体。基因组DNA是使用DNEASY Plant Maxi Kit依照生产商的指示分离的，只是将65°C的裂解温育期间从10分钟延长至1. 5小时。将二 μ g基因组DNA用所示的限制性核酸内切酶50 μ 1反应体积中在37°C消化 22小时。对消化物进行TAE缓冲液中的1.0%琼脂糖凝胶电泳。将DNA在凝胶中通过用 0. 25M HCl 处理片段化，用 1. 5M NaCl-O. 5M NaOH变性，用 1. 5M NaCl-IM Tris pH 8 中和，然后在 20X SSC 中使用 TURBOBLOTTER Kit 转移至NYTRAN Supercharge 尼龙膜(均来自 Whatman，Kent，UK)。将 DNA 使用 UV STRATALINKER (Stratagene, La Jolla, CA, USA) UV 交联至膜上，并在 20ml DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)中在42°C预杂交1小时。探针使用 PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生产商的实验方案生成。探针通过TAE缓冲液中的1. 2%琼脂糖凝胶电泳纯化，并将对应于探针的条带切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc. , Valencia, CA,USA)进行琼脂糖提取。将探针煮沸5分钟，并将每一个添加至10ml DIG Easy Hyb以产生杂交溶液。杂交在42°C实施15-17小时。然后将膜在高严格条件下在2X SSC加0. 1 % SDS中在室温洗涤5分钟，然后在0. IX SSC加0. 1 % SDS中在 65°C洗涤两次，各15分钟。将探针-靶杂交体通过化学发光测定法(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)依照生产商的指示进行检测。实施例3 构建质粒pDM156. 2，其携带并入镶片镰孢乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶 (pyrG)基因的基因组DNA片段粗糙脉孢菌乳清苷-5’ -单磷酸脱羧酶(pyr-4)基因的探针(DNA序列为SEQ ID NO :1而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 2)通过并入异羟基洋地黄毒甙元标记的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)和下述引物的PCR来制备。引物(有义)5，-GTCAGGAAACGCAGCCACAC-3，(SEQ ID NO 3)引物(反义)5，-AGGCAGCCCTTGGACGACAT-3，(SEQ ID NO 4)将质粒 pFB6 (Buxton 等，1983，Molecular and General Genetics 190:403-405) 用Hind III消化，并将消化物通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳纯化。将1. 11Λpyr-4片段切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商建议的实验方案进行琼脂糖提取。扩增反应物由 IX Taq DNA Polymerase Buffer (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA),5 μ 1 PCR DIG Labeling Mix(Boehringer Mannheim, Manheim, Germany)，IOng 的 1. Ikb Hind III pyr_4 片段，IOpmol 的有义引物，IOpmol 反义引物，以及 1 单位 Taq DNA 聚合酶(New England Biolabs Inc. , Ipswich,MA,USA)组成。将反应物在 ROBOCYCLER (Stratagene，La Jolla, CA, USA)中温育，其程序为在 95°C进行 1 个循环3分钟，然后35个循环，每个在95°C进行30秒，55°C进行1分钟，和72°C进行1分钟。 在72°C实施5分钟的最终延伸。将扩增翻译产物通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳纯化。将大约 0. 78kb的异羟基洋地黄毒甙元(DIG)标记的探针从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。如TO 99/60137所述，生成镶片镰孢菌株A3/5的基因组DNA文库，并克隆入λ载体EMBL4。使用DIG标记的探针筛选克隆入λ载体EMBL4的镶片镰孢A3/5DNA的基因组文库。将λ噬菌体与大肠杆菌Κ802细胞(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 一同铺板于具有 NYZ 顶层琼脂糖的 LB 板。使用 Sambrook 等(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition ；J.Sambrook, E. F. Fritsch,禾口 Τ·Maniatis ；Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)的技术进行噬菌斑上移(plaque lift)至HYB0ND 尼龙膜 (Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)。DNA 通过 UV 交联使用 UV STRATALINKER 结合于膜。然后将滤纸与0.781Λ DIG标记的粗糙脉孢菌pyr-4探针杂交。pyrG克隆的杂交和检测依照 GENIUS System User' s Guide (Boehringer Hammheim, Manheim, Germany) 在 42°C用由 5X SSC，;35% 甲酰胺，0. L-月桂酰肌氨酸(Iauroylsarcosine), 0. 02% SDS 和封闭试剂(Boehringer Hammheim,Manheim,Germany)组成的杂交溶液来实施。使用的DIG标记的探针的浓度是2. 5ng每ml杂交溶液。杂交DNA用碱性磷酸酶偶联的抗异羟基洋地黄毒试元抗体(Boehringer Hammheim,Manheim, Germany)免疫检测，并用Lumiphos 530，一种化学发光底物(Boehringer Hammheim,Manheim, Germany)来显现。DNA 制备物是从推定的阳性λ克隆使用AMidi Ki靡AGEN Inc. , Valencia, CA, USA)来制备的。将来自上述鉴定的克隆的λ DNA用Eco RI消化，并将其在TAE缓冲液中进行 1 %琼脂糖凝胶电泳。将3. 9kb片段切出，并使用QIAEX Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA)进行琼脂糖提取。然后将该片段克隆入pUC18 (Viera和Messing， 1987，Methods in Enzymology 153 :3-11)的 Eco RI 位点。并用 2μ1 克隆反应物转化 ONE SHOT TOPlO 感受态细胞 anvitrogen，Carlsl3ad，CA，USA)。通过 DNA 测序分析来自八个所得的转化体的质粒DNA。选择一个具有所需序列的克隆并命名为pDM156. 2(图1)。 PyrG片段携带整个编码区加1. 3kb的启动子和1. 5kb的终止子。实施例4 :pEmY21的生成从质粒pPHTI (Cummings 等，1999，Current Genetics 36 :371-382)使用下述引物扩增大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因G)NA序列为SEQ ID NO :5而推导的氨基酸序列为 SEQ ID NO :6)。
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正向引物5，-GGGttcgaaTTCATTTAAACGGCT-3，(SEQ ID NO 7)反向引物5，-GGGagcgctCAATATTCATCTCTC-3’ (SEQ ID NO 8)将由下划线序列表示的限制位点Bst BI (正向引物)和Eco 47111(反向引物) 工程引入所述引物以供克隆。(用于扩增hpt基因)的PCR反应物由IX ThermoPol反应缓冲液，200 μ MdNTPs, 50pmol 正向和反向引物，IOOpg pPHTl，1 单位Vent DNA 聚合酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA USA)并用灭菌蒸馏水调至总体积100 μ 1组成。该扩增反应使用 ROBOCYCLER 实施，其程序为在95°C进行1个循环2分钟，25个循环，每个在95°C进行1分钟，51°C进行1分钟和72°C进行2分钟，并在72°C进行1个循环7分钟。将PCR产物在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶分离。将1. Skb片段从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。然后将凝胶纯化的片段使用TOPO Blunt Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)克隆入pCR -BluntII-TOPO (Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)。所得的质粒命名为 pEmYlO。使用QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla,CA,USA)依照生产商的指示使用如下所示的引物将Eco RI位点从pEmYlO中hpt基因的编码序列去除，所述引物中小写字母代表靶Eco RI位点的未突变的核苷酸而下划线字母代表突变的核苷酸。所得的质粒命名为PBK3。正向引物5' -GGGTACCCCAAGGGCgTattcTGCAGATGGG-3' (SEQ ID NO 9)反向引物5' -CCCATCTGCAgaatAcGCCCTTGGGGTACCC-3 ‘ (SEQ ID NO :10)将所得不含所述Eco RI位点的hpt基因从pBK3使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。正向引物5，-GGRRtaccTTCATTTAAACGGCTTCAC-3，(SEQ ID NO 11)反向引物5' -GGRRtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3 (SEQ ID NO 12)下划线部分代表引入用于克隆的Kpn I位点。将米曲霉pyrG基因的部分用于生成直接重复，并使用下述引物从pS02 (W0 98/12300)进行 PCR 扩增重复1 正向引物5，-TCCcccrrrTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO 13)反向引物5' -GGRRtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3 (SEQ ID NO 14)重复2 正向引物
5，-GGggtaccTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO 15)反向引物5 ’ -TCCcccgggCGACCAGCAGACGGCCC-3’ (SEQ ID NO 16)下划线部分代表引入用于克隆的限制位点Sma I (cccggg)或Kpn I (ggtacc)。将三个片段(hpt，重复#1和重复把)在不同的反应物(每个50 μ 1)中扩增，所述反应物由IX ThermoPol反应缓冲液，200 μ M dNTPs，0. 25 μ M每种引物，50ng模板DNA和1 单位Vent DNA聚合酶组成。所述扩增反应使用ROBOCYCLER 进行，其程序为在95°C 进行一个循环2分钟，30个循环，每个在95°C进行1分钟，61°C的进行1分钟和72°C进行2 分钟，并在72°C进行1个循环7分钟。将PCR产物在TAE缓冲液中通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。将大约21Λ的扩增的hpt片段和大约0. 2kb的重复片段从凝胶切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将两个pyrG重复片段用Kpn I消化，用小牛小肠磷酸酶(New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA)脱磷酸，并用MINELUTE Reaction Cleanup Kit (QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)依照生产商的指示处理。然后将携带重复#1和hpt 的片段使用 QUICK LIGATION Kit (New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA)依照生产商的指示连接在一起，用MINELUTE Reaction Cleanup Kit处理，并将所得的连接物使用TOPO Blunt Cloning Kit克隆入pCR II Blunt。序列分析确证了其中重复#1 和hpt片段在pCR II Blunt中连接在一起的一个克隆。该质粒命名为pEmY18。为了将第二个重复克隆入pEmY18，用Eco RV消化pEmy 18，并将消化物在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将5. 6kb片段从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将0. 2kb重复2片段(如上所述)和消化的pEmY18 使用QUICK LIGATION Kit连接在一起。将连接混合物用于转化SOLOPACK Gold Supercompetent Cells (Stratagene, La Jolla, CA, USA)。序列分析鉴定了其中三个组分 (重复#1、hpt和重复#2)为所需的顺序和取向且无PCR错误的质粒。所得的质粒命名为 pEmY20o为了确保后续用Eco RI对pEmY20的消化会释放单一片段，使用 QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit依照生产商的指示和如下所示的正向和反向引物去除Eco RI位点。在序列验证之后，所得的质粒命名为pEmY21(图2)。正向引物5' -GGGTACCCCAAGGGCQTATTCTGCAGATGGG-3' (SEQ ID NO 17)反向引物5' -CCCATCTGCAGAATACGCCCTTGGGGTACCC-3' (SEQ ID NO 18)
实施例5 构建镶片镰孢pyrG缺失载体pEmY23将镶片镰孢pyrG编码序列Q678bp)通过用Eco RV和MuI限制性核酸内切酶的消化从PDM156. 2切出(实施例3)，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示进行凝胶纯化。分离pEmY21的Sma I片段并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit凝胶纯化，并将两个凝胶纯化的片段连接在一起。对其筛选插入物的取向，就错误不存在进行测序，并选择一个具有正确插入序列的克隆，并命名为pEmY23(图3)。实施例6 构建质粒 pWTY1470-19-07
将携带镶片镰孢单族毒素合酶(tri5)基因的5’和3’侧翼序列(DNA序列为SEQ ID NO 19，推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 20)的质粒pJRoy40 (美国专利7，332，341号) 用作模板以供扩增5’ tri5基因侧翼序列的一部分。PCR反应物在终体积50 μ 1中含有 200 μ M dNTPs, IX Taq DNA 聚合酶缓冲液，125pg pJRoy40DNA，50pmol 每种下示引物和 1 单位Taq DNA聚合酶。正向引物5，-GGGAGATCTTCGTTATCTGTGCC-3’ (SEQ ID NO 21)反向引物5，-GGGAGATCTTAGTAGTCGGCATTTGAAAC-3‘ (SEQ ID NO 22)(下划线的核苷酸显示引入的BglII位点)。将扩增反应物在ROBOCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环3分钟； 10个循环，每个在95°C进行30秒，在52°C进行45秒和在72°C进行2分钟；20个循环，每个在95°C进行30秒，在52°C进行45秒和在72°C进行5分钟；以及在72°C进行1个循环7 分钟。PCR产物通过使用TBE缓冲液的1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离。将大约600bp的片段从凝胶切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将片段使用 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)插入pCR 2. 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，并将 ONE SHOT T0P10 感受态细胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 用2 μ 1 TOPO TA克隆反应物转化。将来自八个所得的转化体的质粒DNA用Eco RI和 BglII在不同的反应中消化，且三个具有正确的限制性酶切样式的转化体的插入物通过 DNA测序得到确证。选择一个具有所需序列的克隆并命名为PWTY1470-09-05。通过用BglII消化从pWTY1470-09-05释放出携带tri5基因5，重复的 608bpBglII片段，通过使用TBE缓冲液的1. 0%琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用 MINELUTE Gel Extraction Kit 进行琼脂糖提取。质粒ρJRoy40通过BglII消化线性化，之后将其使用虾碱性磷酸酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生产商的指示脱磷酸，并使用 QIAQUICK PCR Purification Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)纯化。将线性化的pJRoy40和凝胶纯化的BglII片段使用T4DNA连接酶(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA)依照生产商的指示连接在一起。大肠杆菌SURE 化学感受态细胞 (Stratagene，La Jolla,CA,USA)的转化依照生产商的指示加以实施。一个转化体通过DNA 测序确证含有所需的载体，即携带tri55’和3’侧翼序列并含有5’侧翼序列一部分的重复。 所得的质粒命名为pWTY1470-19-07(图4)。实施例7 构建质粒 pWTY1515-02-01对质粒pWTY1470-19-07 使用 QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit依照生产商的指示以及如下所示的正向和反向引物进行体外诱变。正向引物5，-CAAGTAACAGACGCGACAGCTTGCAAAATCTTCGTTATCTGTG-3，(SEQ ID NO 23)反向引物5，-CACAGATAACGAAGATTTTGCAAGCTGTCGCGTCTGTTACTTG-3，(SEQ ID NO 24)
该诱变去除了 1779bp处的BglII位点，并使得2386bp处的BglII位点变得唯一，并可用于后续的操作中以插入携带胸苷激酶(tk)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因盒的片段。将该诱变反应用于依照生产商推荐的实验方案转化试剂盒提供的大肠杆菌 XLlO-GOLD Ultra-感受态细胞(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。如通过序列分析验证的，一个携带如上所示的突变的转化体，命名为 pffTY1515-02-01(图5)，并用作实施例10中的骨架。实施例8 构建质粒pJaL574质粒pDV8 (美国专利6，806，062号)携带单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK ； tk)基因(DNA序列为SEQ ID NO 29而推导的氨基酸序列为SEQ IDNO :30)，其为插入构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpdA)启动子的1.01Λ Xhol/Bgl II片段和携带三功能性构巢曲霉吲哚甘油磷酸酯合酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶和谷氨酰胺氨基转移酶(trpC) 转录终止子的1.8kb Bam Hi/Hind III片段之间的1. 2kb Bgl II/Bam HI片段。将质粒 PDV8用Bam HI消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用Klenow聚合酶(Stratagene， La Jolla, CA, USA)填充(fill in)。将消化的质粒使用QUICK LIGATION Kit依照生产商的实验方案重新连接，用MINELUTE Gel Extraction Kit处理，并将所得的连接产物使用TOPO Blunt Cloning Kit依照生产商的指示克隆入pCR 4Blunt_ TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。将克隆反应物根据生产商的指示转化入ONE SHOT 化学感受态 T0P10 细胞(Invitrogen，Carlskid，CA，USA)。使用BIOROBOT 9600 (QIAGEN Inc, Valencia, CA, USA)从八个所得的转化体提取质粒DNA，并通过使用)(ho I/Bam HI和 Xho Ι/HindIII限制性酶切来筛选。来自两个具有正确限制性消化样式的转化体的质粒DNA 的DNA测序确证了两者均携带所需序列。一个命名为pJaL504-[BamHI](图6)。将质粒pJaL504-[BamHI]用BglII消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用 Klenow聚合酶填充。将消化的质粒依照生产商的实验方案使用QUICK LIGATION Kit重新连接，用MINELUTE Reaction Cleanup Kit处理，然后将所得的连接物使用TOPO Blunt Cloning Kit依照生产商的指示克隆入pCR 4Blunt-TOPO 。将克隆反应物依照生产商的指示转化入ONE SHOT 化学感受态大肠杆菌T0P10细胞。使用BIOROBOT 9600从八个所得的转化体提取质粒DNA，并通过使用)(ho Ι/BglII和Bio Ι/HindIII的限制性酶切筛选。来自两个具有正确地限制性消化样式的转化体的质粒DNA的DNA测序确证两者均携带所需序列。一个命名为pJaL504-[BglII](图7)。Punt等(1990，Gene 3 101-109)之前显示可缺失构巢曲霉gpdA启动子的364bp而不影响该启动子的强度。基于这些作者的观察，设计如下所示的引物#172450以截短构巢曲霉gpdA启动子并减少载体的大小。引物 17M50 5’-GACGAATTCTCTAGAAGATCTCTCGAGGAGCTCAAGCTTCTGTACAGTGACCGGTGACTC-3’ (SE Q ID NO 25)下划线序列对应于gpdA启动子序列。剩余序列是携带下述限制位点的手柄 (handle) :Eco RI、XbaI、BglII、Xho I和 HindIII。为了截短构巢曲霉trpC终止子(同样为了减少载体大小)，设计了携带Eco RI手柄的如下所示的引物#172499。
引物 17M99 5，-GACGAATTCCGATGAATGTGTGTCCTG-3’ (SEQ ID NO 26)下划线序列对应于trpC终止子序列。使用引物17M99和17M50的扩增将启动子截短了 364bp而将trpC终止子序列截短了 239bp。PCR用上述两个引物使用pJaL504-[BglII]作为模板实施以生成由构巢曲霉gpdA 启动子的截短形式、HSVl-TK基因的编码序列和构巢曲霉trpC终止子的截短形式组成的 2. 522kb 片段。扩 ±曾反应物由 5 μ 1 IOX 缓 7中液(Promega Corporation, Madison, WI, USA)、 0. 4μ 1 25mM dNTP、l. 25 μ 1 引物 172450 (lOOng/μ 1)、1· 25μ 1 引物 172499 (lOOng/μ 1)、
0.5μ 1 pJaL504-[BglII] (lOOng/μ 1)、2μ 1 Pfu DNA 聚合酶(Promega Corporation, Madison, WI, USA) (2. 5U/ μ 1)和39. 6 μ 1灭菌蒸馏水组成。将扩增反应物在 ROBOCYCLER 中温育，其程序为在95°C进行1个循环45秒，然后进行28个循环，每个在95°C进行45秒，57°C进行45秒和72°C进行5分钟。在72°C进行10分钟的最终延伸。对扩增反应物使用低熔点琼脂糖凝胶在50mM Tri s-50mM硼酸-ImMEDTA 二钠 (TBE)缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶切出2522bp片段，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit 提取。然后将凝胶纯化的 DNA 使用TOPO Blunt Cloning Kit 依照生产商的指示插入pCR 4Blunt- TOPO 。将克隆反应物根据生产商的指示转化入 ONE SHOT 化学感受态T0P10细胞。使用BIOROBOT 9600从八个所得的转化体提取质粒DNA，并通过使用Eco RI和Bgl II的限制性酶切筛选。来自两个具有正确限制性酶切样式的质粒DNA的DNA测序确证两者均携带所需序列。一个命名为pJaL574(图8)。实施例9 构建质粒 pWTY1449-02-01将质粒PJaL574依照生产商推荐的试验方案转化入感受态大肠杆菌SCS 110细胞 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)。使用BIOROBOT 9600 从二十四个所得的转化体提取质粒DNA，然后使用Eco RI和BglII对其进行分析性消化。之后的DNA序列分析导致了具有正确序列的克隆的鉴定，其命名为PWTY1449-02-01 (图9)。实施例10 :tri5缺失载体pJfyS1579-21_16的生成将大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因盒从质粒pEmY23使用 ADVANTAGE GC Genomic PCR Kit (Clonetech, Palo Alto, CA, USA)和如下所示的基因特异性正向和反向引物进行PCR扩增。反向引物中的下划线区域是用于克隆的BglII位
点ο正向引物5，-TTGAACTCTCAGATCCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3，(SEQ ID NO 27)反向引物5，-CAGATAACGAAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3> (SEQ ID NO :28)PCR反应物在50 μ 1的终体积中含有362ng pEmY23作为DNA模板，200 μ m dNTPs,
1.ImM 乙酸镁，0·4μΜ 引物，IX GC Reaction Buffer (Clonetech, Palo Alto, CA, USA), 0. 5M GC Melt(Clonetech, Palo Alto,CA, USA)禾口 IX GC Genomic Polymerase Mix(Clonetech, Palo Alto, CA, USA)。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER (Eppendorf, Munich,
32Germany)中温育，其程序为在95°C进行1个循环2分钟；25个循环，每个在94°C进行30秒和66°C进行3分钟；和在66°C进行1个循环3分钟；以及在4°C保持。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1. 9kb的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将所述片段使用TOPO TA Cloning Kit依照生产商的指示克隆入pCR 2. 1。将ONE SHOT TOP 10 感受态细胞anvitrogen，Carlsl3ad，CA，USA)用2 μ 1 TOPO TA反应物转化。来自8个转化体的DNA的序列分析确证了与预计序列并无偏差，且该质粒命名为pJfySlM0-75-5(图 10)。将hpt插入物通过用Bam HI和BglII的消化从pJfySlM0-75_05释放，并在TAE 缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳分离。将1. 9kb的片段切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。使用Rapid DNALigation Kit将该片段连接至经BglII 线性化的空tri5缺失载体pWTY1515-02-01 (实施例7)，其已经使用小牛小肠磷酸酶脱磷酸。将大肠杆菌SURE 化学感受态细胞用所述连接反应物转化，并将来自M个所得的转化体的质粒DNA通过用Eco RI的限制性消化分析确证插入物的取向。选择了一个携带所需取向的插入物的转化体并命名为pJfyS1579-l-13(图11)。将单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因(DNA序列为SEQ ID NO :29，而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 30)使用pWTY1449-2_l作为模板和如下所示的基因特异性正向和反向引物进行PCR扩增。粗体序列代表引入的BglII位点。正向引物5，-GCCGACTACTAGATCGACCGGTGACTCTTTCTGGCATGCG-3，(SEQ ID NO 31)反向引物5，-CAGATAACGA AGATCT GAGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGC-3，(SEQ ID NO 32)PCR反应物在50 μ 1的终体积中含有IX HERCULASE 反应缓冲液 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)，200 μ M dNTPs，55ng pWTY1449-2_l，0. 2 μ M 引物，2 % DMSO 和 2· 5 单位HERCULASE DNA 聚合酶(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C 进行ι个循环ι分钟；25个循环，每个在94°C进行30分钟，在60°C进行30秒，和在68°C进行2分45秒；和在68°C进行1个循环2分45秒；并在4°C保持。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约2. Skb的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将所述片段使用TOPO TA Cloning Kit 克隆入pCR 2. 1。将 ONE SHOT T0P10 感受态细胞 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)用2 μ 1 TOPO TA反应物转化。来自一个转化体的质粒 DNA的序列分析在tk编码序列鉴定了一个突变(C1621G)，其导致甘氨酸至丙氨酸的氨基酸变化。使用QUIKCHANGE II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla,CA,USA)依照生产商的指示和如下所示的正向和反向引物校正了该突变。小写字母表示所需突变。16个克隆的序列分析导致选择其中一个，命名为pJfyS1579-8-6(图12)。正向引物5，-CCCTGTTTCGGGgCCCCGAGTTGCTGG-3，(SEQ ID NO :33)反向引物
5，-CCAGCAACTCGGGGcCCCGAAACAGGG-3，(SEQ ID NO :34)将质粒pJfyS1579-08_06用Bam HI和BglII消化以释放所述2. 8kbtk片段，并如上所述纯化片段。将该片段使用QUICK LIGATION Kit连接于经BglII线性化并经小牛小肠磷酸酶处理的pJfyS1579-l-13，并用于依照生产商的实验方案转化SURE 化学感受态细胞。将所得的质粒命名为pJfyS1579-21-16(图13)并用作tri5缺失盒。实施例11 构建Δ tri5镶片镰孢菌株JfyS1604-47_02将镶片镰孢A3/5原生质体用经Bst Z171/BamHI线性化的pJfyS1579-21_16使用实施例1所述方法转化。将转化体在含有每ml 125 μ g潮霉素B (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)的 VNO3RLMT 板上选择。在第 7 日之后，将 123 个转化体中的48个亚培养至含有相同培养基的新板上。然后通过Southern分析如下所述分析八个转化体。这些株的真菌生物质是通过用来自如上所述获得的7日龄转化体的四个Icm 琼脂栓接种25ml的M400培养基生成的。将培养物在以150rpm振荡温育3日。去除琼脂栓，并将培养物经过MIRACL0TH 过滤。将收获的生物质用液氮冷冻，并使用研钵和杵磨碎菌丝体。基因组DNA是使用DNEASY Plant Maxi Kit依照生产商的指示分离的，只是 65°C的裂解温育期间从10分钟延长至1. 5小时。将二 μ g基因组DNA用16单位的SphI和22单位的Dra I在50 μ 1反应体积中在37°C消化22小时。对消化物进行TAE缓冲液中的1.0%琼脂糖凝胶电泳。将DNA在凝胶中通过用 0. 25M HCl 处理片段化，用 1. 5MNaCl-0. 5M NaOH 变性，用 1. 5M NaCl-IM Tris pH 8 中和，然后在 20X SSC 中使用 TURB0BL0TTER Kit 转移至NYTRAN Supercharge 尼龙膜。将DNA使用UV STRATALINKER UV交联至膜上，并在20ml DIG Easy Hyb中在42°C预杂交1小时。针对tri5基因的3’侧翼序列的PCR探针是使用下述正向和反向引物生成的。正向引物5' -GTGGGAGGATCTGATGGATCACCATGGGC-3'，(SEQ ID NO :35)反向引物5' -CCGGGTTTCGTTCCGAACGATCTTTACAAGG-3' (SEQ ID NO 36)探针是使用PCR Dig Probe Synthesis Kit依照生产商的指示生成的。将探针在TAE缓冲液中通过1. 2%琼脂糖凝胶电泳纯化，并将对应于探针的条带切出，并使用 MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将探针煮沸5分钟，并添加至IOml DIG Easy Hyb以产生杂交溶液。杂交在42°C实施15_17小时。然后将膜在高严格条件下在室温在2X SSC加0. 1 % SDS中洗涤，然后在65 °C进行两次洗涤，每次在0. IX SSC加 0.1% SDS中进行15分钟。探针-靶杂交体通过化学发光测定法(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)依照生产商的指示检测。将一个根据Southern分析在tri5位点携带单一拷贝的缺失盒的转化体镶片镰孢JfyS1579-43-23通过从含有VNO3RLMT培养基的7日板使用灭菌牙签切下四个Icm2栓并将其转移至含有25ml RA培养基的125ml带挡板的摇瓶来进行孢子形成。将烧瓶在
以150rpm振荡温育48小时。将孢子培养物经过灭菌的MIRACL0TH 过滤，并收集于50ml 聚丙烯管。使用血细胞计数器确定孢子浓度，并将IO5个孢子(Iml中)转移至含有补充了50 μ M5-氟代-5，脱氧尿苷(FdU) (Sigma Chemical Co. ,St. Louis,MO,USA)的 VNO3RLMT 培养基的150mm板，并在温育4日。使用灭菌牙签挑取孢子分离物，并将其转移至含有补充了 10 μ M FdU的VNO3RLMT培养基的新板，并使其在M_28°C生长7日。将基因组DNA从7个孢子分离物提取，并如上所述实施Southern分析以确保盒正确地从基因组切出。如预计，所有通过Southern印迹分析的孢子分离物切出了盒，留下一个重复序列。将一个孢子分离物通过如前述段落中所述通过在株中诱导孢子形成来纯化孢子一次，并使用血细胞计数器确定孢子浓度，并稀释至每ml 40个孢子。将一 ml的稀释孢子溶液铺板于含有VNO3RLMT培养基的150mm板，并将板在温育4日。将孢子分离物亚培养至含有VNO3RLMT培养基的新板，并将一个命名为镶片镰孢JfyS1604-17-02 ( Δ tri5) 的孢子分离物用作PyrG基因缺失的起始株。实施例12 构建携带胸苷激酶(tk)阴性选择性标记和潮霉素磷酸转移酶(hpt) 阳性选择性标记的通用缺失载体。构建了携带胸苷激酶(tk)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)标记两者的通用缺失载体以便于装配后续的缺失质粒。靶向缺失的基因的5’和3’区域的侧翼序列在用Riie I或 Asc I用于5’侧翼序列)以及SbfI或Swa I (用于3’侧翼序列)消化载体之后可容易地连接于后者。为了 PCR扩增来源于镶片镰孢pyrG基因5，侧翼区域的直接重复，在两个PCR反应物中使用50皮摩尔如下所示的引物，所述反应物在50 μ 1的总体积中含有50ng pDM156. 2， IX Pfx Amplification Buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 6 μ 1 IOmM dNIPs 混合物， 2. 5 单位PLATINUM Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)和 1μ 1 50mM MgSO4。引物重复 #1有义引物5，-GTTTAAACGGCGCGCC CGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCAGG-3，(SEQ ID NO 37)反义引物5，-TTGTCGCCCGGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3，(SEQ ID NO 38)重复#2有义引物5，-AGTATTCCCGGG CGACAAAACAAGGCTACTGCA-3，(SEQ ID NO 39)反义引物5，-ATTTAAATCCTGCAGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3‘ (SEQ ID NO 40)将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，其程序如下。对
于重复#1 在98°C进行1个循环2分钟，然后5个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行 30秒和68°C进行1分钟。接着进行35个循环，每个在94°C进行30秒，在59°C进行30秒和68°C进行1分钟。对于重复#2，循环参数为在98°C进行1个循环2分钟；然后5个循环，每个在94°C进行30秒，在55°C进行30秒，和68°C进行1分钟。接着进行35个循环，每个在94°C进行30秒，在56°C进行30秒和68°C进行1分钟。在35个循环之后，将两个反应物(即重复#1和#2)在68°C温育10分钟，然后在10°C冷却直至进一步加工。
将来自两个反应的PCR产物使用TAE缓冲液通过0. 8 % GTG-琼脂糖(Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, USA)分离。对于重复#1和重复#2，从凝胶切出大约 0. ^kb 的片段，并使用Ultrafree -DA旋转杯(spin cup) (Millipore，Billerica，MA，USA) 依照生产商的指示纯化。然后将十微升每种纯化的重复用于单一的重叠PCR(overlapping PCR)反应，其反应物在50 μ 1的总体积中含有IX Pfx Amplification Buffer,6 μ 1 IOmM dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 混合物，2. 5 单位PLATINUM Pfx DNA 聚合物和 1 μ 1 50mM MgSO4。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，其程序为在
98°C进行1个循环2分钟，然后5个循环，每个在94°C进行30秒，在50°C进行30秒和68°C 进行1分钟。然后将反应物与在50 μ 1的终体积中含有50皮摩尔用于重复#1的有义引物和 50 皮摩尔用于重复 #2 的反义引物，IX Pfx Amplification Buffer, 6 μ 1 IOmM dNTPs, 2. 5单位PLATINUM Pfx DNA聚合酶和1 μ 1 50mM MgSO4的预温热的溶液混合。将新的100 μ 1的扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育， 程序为35个循环，每个在94°C进行30秒，在58°C进行30秒和68°C进行1分钟。在35个循环之后，将反应物在68°C温育10分钟，然后在10°C冷却直至进一步加工。将0. 5kb PCR 产物(携带所述重复装配体)如上所述通过0. 8% GTG-琼脂糖凝胶电泳分离。将质粒pCR4(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)用作用于构建通用缺失载体的载体骨架的来源。为了去除PCR4DNA的非必需部分，将2. 5μ g质粒pTter61C(W0 2005/074647) 顺序用 Bsp LUllI 和Bst XI 消化。然后用 Antarctic 磷酸酶(New England Biolabs Inc., Ipswich,MA, USA)处理消化的载体。将3. Ikb经消化的骨架如上所述通过0. 8% GTG-琼脂糖凝胶电泳来分离。然后将纯化的重复装配体用Rapid Ligation Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)连接于纯化的载体骨架。连接反应物由如下组成 75ng纯化的载体骨架好3μ 1纯化的重复装配体。将一微升该连接反应物用于使用生产商推荐的实验方案来转化化学感受态SOLOPACK Supercompetent细胞(Stratagene， Car 1 skid，CA，USA)。将二十四个转化体通过Nco I/Pme I限制性消化分析。二十四个转化体中的二十三个具有预计的限制性酶切样式。随机选择克隆pFvRs#10用于测序以确证无 PCR诱导的错误。序列分析显示克隆pFvRs#10中的重复装配体具有预计的序列，并因此将其选作镶片镰孢通用载体的骨架，并命名为PAlLol492-M(图14)。将携带潮霉素磷酸转移酶(htp)基因的盒从pEmY23使用如下所示的基因特异性正向和反向引物进行PCR扩增。下划线序列代表Xma I位点，而粗体字母代表BglII位点。 在每个5’端的四个“a”使得PCR产物的末端能够进行后续的消化。正向引物5，-aaaacccKggCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3' (SEQ ID NO :41)反向引物5’ -aaaacccRR AGATCT ACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3’ (SEQ ID NO 42)扩增反应物在50 μ 1的终体积中含有60ng pEmY23, 200 μ m dNTPs, ImM乙酸镁， 0.4 μ M引物，IX Pfx扩增缓冲液，0. 5Μ GC Melt和2. 5单位PLATINUM Pfx聚合酶。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，其程序为在95°C进行1个循环 2分钟；10个循环，每个在94°C进行30秒，在60°C进行30秒和68°C进行1分50秒；和在68°C进行一个循环1分钟，接着在4°C保持。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1. Skb的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。随后将经凝胶纯化的PCR产物用Xma I消化，并在1 %琼脂糖凝胶上运行并如上所述再次凝胶纯化。将 QUICK LIGATION Kit用于将hpt PCR产物连接于经小牛小肠磷酸酶处理、经Xma I-线性化的pAlLol492-24。将所得的质粒命名为pJfyS1579-35_2 (图15)并用作受体以供插入胸苷激酶基因。单纯疱疹病毒tk盒的来源是质粒pJfyS1579-8_6 (实施例10)，通过用BamHI和 BglII的消化将该插入物释放。将消化产物通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳分离，并将对应于2.8kbtk基因插入物的片段切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将QUICK LIGATION Kit用于将tk基因盒连接于经小牛小肠磷酸酶处理的、经BglII-线性化的pJfyS1579-35-02。所得的质粒命名为pJfyS1579-41_ll (图 16)并将其用作起始点以供构建pyrG、amyA、alpA和dpsl缺失载体。实施例13 :pyrG缺失载体pJfyS1604-55_13的生成将镶片镰孢A3/5pyrG基因(DNA序列为SEQ ID NO :43而推导的氨基酸序列碱 SEQ ID NO 44)的 3，侧翼序列使用EXPAND High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和如下所示基因特异性正向和反向引物进行扩增。下划线部分是引入用于克隆的Sbf I位点，而斜体部分是引入用于之后的消化以在转化之前去除质粒的pCR 2. 1部分的Not I位点。正向引物5，-aaaaaacctgcaggatcctgcgcggactcttgattattt-3' (SEQ ID NO :45)反向引物5' -aaaaaacctgcagggcggccgcaattccattcctgtagctgagtata-3' (SEQ ID NO 46)扩增反应物以50 μ 1的终体积含有125ng镶片镰孢A3/5基因组DNA，200 μ m dNTPs,0. 4μΜ 引物，含 5mM MgCl2 的 IX EXPAND Buffer(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和 2. 5 单位 EXPAND DNA 聚合酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis,IN, USA)。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C 进行ι个循环2分钟，10个循环，每个在94°C进行30秒，进行30秒，和72°C进行1分钟；和20个循环，每个在94°C进行30秒，进行30秒，和72°C进行1分10秒。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳分离，并将0. 71Λ片段切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将0. 7kb PCR产物用SbfI消化，并通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳消化。将大约0. 7kb的片段从凝胶切出，并进一步使用Ultrafree -DA旋转杯(spin cup)纯化。将 0. 7kb 片段使用 QUICK LIGATION Kit 连接于 pJfyS1579-41_ll (其经 SbfI 消化并使用小牛小肠磷酸酶脱磷酸)，并将连接混合物用于依照生产商的实验方案转化大肠杆菌 SURE 化学感受态细胞。所得的质粒命名为pJfyS1604-35-13。将来自pEmY23 (实施例 5)的 5，pyrG 侧翼序列使用EXPAND High Fidelity PCR System和如下所示的基因特异性正向和反向引物来扩增。下划线部分是引入用于克隆
37的Pme I位点而斜体部分是引入 用于之后的消化以在真菌转化之前去除内酰胺酶基因的Not I位点。正向引物5' -aaaaaagtttaaacgcggccgcctgttgcctttgggccaatcaatg-3' (SEQ ID NO 47)反向引物5，-aaaaaagtttaaacctagttggagtattgtttgttctt-3，(SEQ ID NO :48)扩增反应物含有20ng pEmY23,200ym dNTPs，0. 4 μ M 引物，含有 15mM MgCl2W IX EXPAND Buffer 和 2. 5 单位EXPAND DNA 聚合酶。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C 进行ι个循环2分钟；10个循环，每个在94°C进行30秒，53°C进行30秒，和72°C进行40 秒；和20个循环，每个在94°C进行30秒，53°C进行30秒，和72°C进行40秒，并在每个后续循环中另外加10秒。将PCR产物使用MINELUTE PCRPurification Kit(QIAGEN Inc. ,Valencia, CA, USA)纯化。将纯化的PCR产物用Riie I消化并通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳分离。将大约0. 51Λ的片段从凝胶切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit 进行琼脂糖提取。将0. 51Λ片段使用QUICK LIGATION Kit连接于经Riie I消化和小牛小肠磷酸酶处理的pJfyS1604-35-13。连接反应物在20 μ 1反应体积中含有50ng载体，20ng 插入物，IX QUICK LIGATION Reaction Buffer (New England Biolabs Inc. ,Ipswich,MA, USA)，和 10 单位 Quick T4DNA Ligase (New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA，USA)。将反应物在室温温育5分钟并将2μ 1连接物用于依照生产商的指示转化大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。使用序列分析鉴定含有在所需取向的插入物的转化体，并确证无PCR错误。所得的质粒命名为pJfyS1604-55-13(图17)并用作pyrG基因缺失盒。实施例14 Δ tri5 Δ pyrG镶片镰孢菌株JfyS1643-18_2的生成将依照实施例1中所述的方法用经Not I消化和经凝胶纯化的pJfyS1604-55_13 转化的镶片镰孢JfyS1604-17-2(Atri5)的五十一个推定的转化体用灭菌牙签从转化板转移至含有补充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在M-28°C生长7日。然后对转化体通过将栓转移至两个含有或不含有尿苷(IOmM)的 VNO3RLMT中的每一个进行表型分析。将九个在不含尿苷的板上呈现无或不良的生长的转化体通过Southern分析进行分析。将来自9个转化体中的每一个的基因组DNA如实施例2 所述进行提取，并将每个的2 μ g用观单位Mfe I和14单位Dra I消化。如实施例11中所述用下述正向和反向引物生成了针对PyrG基因3’侧翼序列的PCR探针正向引物5’ -GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3，(SEQ ID NO 49)反向引物5' -GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3，(SEQ ID NO 50)Southern分析表明9个尿苷自养型中的2个以单一拷贝携带所述缺失盒，而其余维持该盒的异位整合(ectopic integration)。将一个转化体，镶片镰孢JfyS1604_85_5， 如实施例1中所述在含有IOmM尿苷的RA培养基中进行孢子形成，并将IO5个孢子铺板于含有补充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm板。将所得的孢子分离物亚培养至含有补充了 10 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板上，并随后通过 Southern分析进行分析确保从基因组的正确切出。经分析的株均正确地切出了所述盒，并将一个株，镶片镰孢JfyS1643-10_3，如前述段落中所述进行孢子形成。使用血细胞计数器确定孢子浓度，并将储液稀释至每ml 40 个孢子的浓度。将一 ml铺板于含有补充了 IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm板。将所得的孢子集落亚培养至含有补充了 IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板上，并将一个孢子分离物，镶片镰孢JfyS1643-18-2(Atri5ApyrG)用作供缺失镶片镰孢α -淀粉酶A基因(amyA)的株。实施例15 :amyA缺失载体pJfyS1604-17_2的生成为了获得上游和下游侧翼序列的信息以供完全去除镶片镰孢amyA基因(DNA 序列为SEQ ID NO :51而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO :5 ，使用了 GENOME WALKER Universal Kit (Clonetech, Palo Alto, CA, USA) 对每个用该试剂盒生成的镶片镰孢A3/5 基因组DNA文库使用如下所示的5’基因特异性引物和5’嵌套引物进行两轮针对5’侧翼序列的PCR。3’侧翼序列使用如下所示的3’基因特异性引物和3’嵌套引物获得。5’基因特异性引物5，-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3，(SEQ ID NO 53)5，嵌套引物5，-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3，(SEQ ID NO 54)3’基因特异性引物5，-CTACACTAACGGTGAACCCGAGGTTCT-3，(SEQ ID NO 55)3’嵌套引物5' -GCGGCAAACTAATGGGTGGTCGAGTTT-3‘ (SEQ ID NO 56)初级PCR反应物在50 μ 1的反应体积中含有IX HERCULASE ReactionBuffer,2y 1每种基因组DNA文库(如试剂盒中所述生成)，200nM试剂盒提供的APl(衔接头引物1)，200ηΜ基因特异性引物(见上)，200μΜ dNIPs和2.5单位 HERCULASE DNA 聚合酶。初级扩增在EPPENDORF MASTERCYCLER 中实施，程序为7个循环，每
个在94°C进行25秒，和72°C进行3分钟，和32个循环，每个在94°C进行25秒，和67°C进行3分钟以及在67°C进行1个循环7分钟。次级PCR反应物在50 μ 1的反应体积中含有IX HERCULASE Reaction Buffer, 1 μ 1每种初级PCR反应物，200ηΜ试剂盒提供的ΑΡ2 (衔接头引物2)，200ηΜ基因特异性嵌套引物(见上)，200 μ M dNTPs和2. 5单位HERCULASE DNA聚合酶。次级扩增在EPPENDORF MASTERCYCLER 中实施，程序为5个循环，每个在94°C进行25秒，72°C进行3分钟，以及20个循环，每个在94°C进行25秒和67°C进行 3分钟，以及在67°C进行1个循环7分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约0. 7kb的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit依照生产商的指示纯化。将 PCR产物使用如上所述相应的嵌套引物和试剂盒提供的引物2直接进行测序。将获得的序列用于设计引物以扩增amyA基因5’侧翼序列的11Λ区和3’侧翼序列的0. 7kb区以供插入空的缺失载体pJfyS1579-41-ll。将amyA3’侧翼序列从镶片镰孢A3/5基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。正向引物5，-AAAAAAcctgcaggTAATGGGTGGTCGAGTTTAAAAGTA-3，(SEQ ID NO :57)反向引物5，-AAAAAAcctgcagggcggccgcTTTAAGCATCATTTTTGACTACGCAC-3，(SEQ ID NO :58)下划线字母代表用于之后去除β -内酰胺酶的Not I位点，而斜体字母代表用于载体克隆的SbfI位点。PCR 反应物含有 IX HERCULASE Reaction Buffer, 120ng 基因组 DNA 模板， 400nm 引物，200 μ M dNTPs 和 2. 5 单位HERCULASE DNA 聚合酶。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C 进行1个循环2分钟；10个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行1分钟；和20个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行1分10秒。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约0. 7kb的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。用SbfI消化PCR片段以产生粘性末端。将该片段插入经SbfI-线性化、小牛小肠磷酸酶处理的通用缺失载体pJfyS1579-41-ll。连接反应物在20 μ 1的反应体积中含有80ng载体，80ng插入物，IX Quick Ligation Reaction Buffer 和 10 单位 Quick T4 DNA Ligase0 将 1·5μ1 体积的连接反应物用于依照生产商的指示转化100 μ 1大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。就插入物的取向使用用Eco RI的限制性分析和序列分析筛选克隆，鉴定出不含PCR错误的克隆。该质粒命名为pJfyS1579-93-l (图18)并用作5’ amyA侧翼序列插入的受体。使用如下所示的正向和反向引物PCR扩增5’ amyA侧翼序列。下划线的碱基代表用于bla基因去除的Not I位点，而其它小写字母代表Riie I位点以确保所述片段是平末端的以供克隆入平末端载体位点。正向引物5 ‘ -AAAAAAgtttaaacGCGGCCGCTTGATTATGGGATGACCCCAGACAAGTGGT-3‘ (SEQ ID N0: 59)反向引物5，-AAAAAAgtttaaacCCGCACGAGCGTGTTTCCTTTTCATCTCG-3，(SEQ ID NO :60)PCR扩增与上述相似，只是使用不同的循环参数。将扩增反应物在 EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环2分钟；10个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行1分15秒；和20个循环，每个在 94°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行1分15秒，并在每个后续的循环另外进行10 秒。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约11Λ的片段从凝胶切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。用Rne I消化该11Λ片段以产生平端，并将该插入物克隆入经Riie I-消化、经小牛小肠磷酸酶脱磷酸的 pJfyS1579-93-l。
连接反应物在20 μ 1反应体积中含有75ng载体，IOOng插入物，IX Quick Ligation Reaction Buffer 和 10 单位 Quick T4DNA Ligase0 在 5 分钟的温育之后， 将2μ 1连接反应物用于依照生产商的指示转化100μ 1大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。使用序列分析确证插入为正确的取向并不含PCR错误。鉴定所得的载体命名为 pJfyS1604-17-2(图 19)。实施例16 Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA 镶片镰孢菌株 JfyS1643_95_4 的生成将依照实施例1中所述方法用经Not I消化和凝胶纯化的pJfyS1604-17_2转化的镶片镰孢JfyS1643-18_2 ( Δ tri5 Δ pyrG)的五个推定的转化体用灭菌牙签从转化板转移至含有补充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在M-28°C 温育7日。对于Southern分析，将2 μ g基因组DNA用25单位kp I消化。如实施例21 中所述用如下所示的正向和反向引物生成针对amyA基因5’侧翼序列的DIG探针。正向引物5，-GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3，(SEQ ID NO 61)反向引物5' -GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3，(SEQ ID NO 62)Southern分析如实施例2中所述加以实施，其结果表明五个转化体中的两个用缺失盒的单独整合替代了编码序列。将命名为镶片镰孢JfyS1643-73-2的初级转化体如实施例1中所述进行孢子形成，并将IO5个孢子铺板于含有补充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm直径板。将获得的孢子分离物亚培养至补充了 10 μ M FdU和 0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板。对两个镶片镰孢孢子分离物(JfyS1643-83_2和JfyS1643_83_4)进行一次孢子纯化，得到株 JfyS1643-95-l 和 JfyS1643-95_2 (来自 JfyS1643-83_2)和 Jfys 1643-95-4 (来自JfyS1643-83-4)。将从FdU板挑取的起始孢子分离物，以及其相应的一次孢子纯化分离物通过Southern分析进行分析以确保从基因组的正确切出。所有分析的株正确地切出了该盒。将镶片镰孢JfyS1643-95_4 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)用作用于缺失镶片镰孢碱性蛋白酶A基因(alpA)的株。实施例17 构建质粒pEJG61质粒pEJG61 (图20)如美国专利7，368，271中所述构建，只是bar盒的取向逆转 (即核苷酸5901-5210编码amdS启动子，核苷酸5209-4661编码bar编码序列，而核苷酸 4660-4110编码黑曲霉葡糖淀粉酶(AMG)终止子)。实施例18 构建质粒pEJG69将Microdochium nivale 乳糖氧化酶(LOx)基因(DNA 序列为 SEQ ID NO 63 而推导的氨基酸序列为 SEQ ID NO 64)从 pEJG33 (Xu 等，2001，European Journal of Biochemistry 268 :1136-1142)使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。正向引物5' -CCCGCATGCGTTCTGCATTTATCTTG-3‘ (SEQ ID NO 65)反向引物5' -GGGTTAATTAATTATTTGACAGGGCG-3‘ (SEQ ID NO 66)下划线部分代表引入用于克隆的SphI (正向)或I^acI (反向)位点。
PCR 在 50 μ 1 的终体积中含有 200 μ M dNTPs, 1 μ M 每种引物，50ngpEJG33, IXPwo 缓冲液(Promega, Madison, WI, USA)禾口 1 μ 1 of Pwo Hot Start Polymerase (Promega, Madison, WI, USA)。将扩增反应物在ROBOCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环2分钟； 10个循环，每个在95°C进行30秒，55°C进行45秒，和72°C进行1分钟；20个循环，每个在 95°C进行30秒，55°C进行45秒，和72°C进行1分钟，在每个后续循环中另外进行20秒延伸；和在50°C进行1个循环10分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1. 5kb的片段从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。使用相同的条件重新扩增乳糖氧化酶基因，并如上所述进行纯化，只是将聚合酶和缓冲液分别用iTaq DNA聚合酶和Taq DNA Polymerase Buffer替代，并用经凝胶纯化的上述PCR产物作为模板。将PCR产物使用TOPO TACloning Kit克隆入pCR 2. 1 并测序以确保无PCR错误。将所得的无错误质粒用Sph I消化，用T4DNA聚合酶(New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA)处理，使用QIAQUICK Nucleotide Removal Ki靡AGEN Inc.，Valencia, CA, USA)纯化，并用PacI消化。将该片段在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并将大约1. 5kb的片段从凝胶切出，并使用QIAQUICK GelExtraction Kit进行琼脂糖提取。将质粒pEJG61用BspLUllI消化，依照生产商的指示用Klenow DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA, USA)处理，然后用Pac I消化。将消化的质粒在 TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，并将81Λ片段切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit将其进行琼脂糖提取。将Lox编码序列使用T4DNA Ligase依照生产商的指示连接于经Bsp LUllI-和 Pac I-消化的pEJG61。通过序列分析筛选质粒以确保不含PCR错误，并鉴定了一个所得的质粒，将其命名为PEJG69 (图21)。实施例19 构建质粒pEJG65将质粒pEJG61 (实施例17)用Bsp LUllI消化，用Klenow DNA聚合酶处理并用 Pac I消化。将消化的质粒在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳分离，并将8. 11Λ片段切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A编码序列(DNA序列为SEQ ID NO :67而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 68)从pMT12^ (W094/01M1)使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。正向引物5' -GCATGCGAGTGTCCTTGCGC-3，(SEQ ID NO 69)反向引物5，-TTAATTAACTAAGGTGGTGTGATG-3，(SEQ ID NO 70)PCR 反应物含有 200 μ M dNTPs, 1 μ M 每种弓| 物，20ng pMT1229, IXPwo 缓冲液 (Promega, Madison, WI, USA)，禾口 1 μ 1 Pwo Hot Start 聚合酶。将扩增反应物在ROBOCYCLER 中温育，其程序为在94°C进行1个循环2分钟；10个循环，每个在94°c进行30秒，55°C进行45秒，和72°C进行1分钟；17个循环，每个在94°C进行30秒，55°C进行45秒，和72°C进行1分钟，在每个后续循环中另行进行20秒的延伸；以及在72°C进行1个循环10分钟。将PCR产物在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳分离，并将1. 4kb片段接触， 并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将PCR片段使用TOPO TA Cloning Kit克隆入pCR 2. 1并测序以验证不含PCR错误。由于该基因编码序列中内部SphI位点的存在，通过分别消化将南极假丝酵母脂肪酶A编码序列从pCR 2. 1作为两个不同的片段来释放。为了释放第一片段(11Λ)，将质粒用SphI消化并用T4DNA聚合酶处理。将该聚合酶在75°C热失活10分钟，并用Nhe I消化质粒。将第二片段(0.41Λ)用Nhel/Pac I消化从质粒释放。对两个消化物进行TAE缓冲液中的琼脂糖凝胶电泳并将来自Sph I/Nhe I消化的11Λ片段和来自Nhe I/Pac I消化的0.41Λ片段切出，并使用QIAQUICK (}el Extraction Kit进行琼脂糖提取。将两个片段使用iMDNA连接酶连接于消化的pEJG61。连接反应物含有IX Ligation Buffer (New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA，USA)，IOOng 上述 Ikb 片段，50ng 0. 4kb 片段，50ng 消化的PEJG61和10单位T4DNA连接酶。将反应物在室温温育16小时，并用其依照生产商的指示转化大肠杆菌XLIO-GOLD Ultra-感受态细胞。通过序列分析筛选转化体，并鉴定了一个含有具有所需无错误编码序列的质粒的克隆，并命名为PEJG65(图22)。实施例20 构建质粒pMStrl9通过将来自pA2W!lO(WO 1998Λ6057)的尖镰孢磷脂酶基因克隆入镶片镰孢表达载体pDM181 (W0 2000/56900)构建质粒pMStrl9。使用PCR扩增来分离方便的DNA片段上
的磷脂酶基因。尖镰孢磷脂酶基因具体是使用标准扩增条件用Pwo DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals,Basel, Switzerland)和45°C的退火温度用如下所示的引物从pA2PhlO扩增的。PLMStrlO 5，-TCAGATTTAAATATGCTTCTTCTACCACTCC-3‘ (SEQ ID NO 71)SwaIPLMStrll 5，-AGTCTTAATTAAAGCTAGTGAATGAAAT-3，(SEQ ID NO 72)将所得的DNA片段凝胶纯化，并用Swa I消化。还用Swa I消化质粒pDM181，并将其脱磷酸。然后将DNA片段连接在一起以产生质粒pMMrlS。将在两个使用连接混合物生成的单独的大肠杆菌pMStrlS转化体，#4和#17中的磷脂酶基因使用标准引物步移方法测序。突变由Nar I位点分隔，该限制性酶切割pMMrlS 两次。因此在镰孢表达载体pDM181中通过用NarI消化pMStrl8#4和pMStrl8#17，分离不含错误的片段，并将其连接在一起以产生pMMrl9(图23)而装配了不含错误的磷脂酶基因。使用标准方法确证了 pMMrl9中的磷脂酶序列。实施例21 构建质粒pEJG49镶片镰孢表达载体pEJG49是通过修饰pSheBl (W0 2000/56900)生成的。所述修饰包括(a)通过定点诱变去除一个pSheBl序列之内的Bsp LUllI位点；(b)去除850bp的尖镰孢胰蛋白酶启动子；(c)通过接头连接引入BspLUllI位点以协助插入21Λ镶片镰孢葡糖淀粉酶启动子；和(d)引入尖镰孢磷脂酶基因。pSheBl序列之内Bsp LUllI位点的去除是使用QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit依照生产商的指示用下述诱变引物对达成的。5' -GCAGGAAAGAACAAGTGAGCAAAAGGC-3‘ (SEQ ID NO 73)5' -GCCTTTTGCTCACTTGTTCTTTCCTGC-3‘ (SEQ ID NO 74)这产生了 pSheBl中间物1。930bp的尖镰孢胰蛋白酶启动子的去除是通过用Mu I和I^c I消化pSheBl中间物1 (6，971bp)，对消化物进行使用TBE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳，切出6，040bp的载体片段，并用QIAQUICK Gel Extraction Kit纯化切出的片段来达成的。为了引入新的 Bsp LUllI位点，使用下述引物产生接头5' -dCCTACATGTTTAAT-3’ (SEQ ID NO :75)BspLul II5' -dTAAACATGTAGG-3' (SEQ ID NO :76)将每个引物(每个2 μ g)在70°C加热10分钟，然后经过1小时冷却至室温。将该接头连接入经MuI-Pac I-消化的pSheBl中间物1载体片段，产生pSheBl中间物2。然后将载体PSheBI中间物2用Bsp LullI和I^c I消化。将消化的载体在TBE缓冲液中通过
琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。尖镰孢磷脂酶基因片段还通过PCR使用pMSTR19作为模板来生成。使用下述PCR 引物在该基因的5’端引入Sph I位点而在3’端引入I^c I位点5' -GGGGGCATGCTTCTTCTACCACTCC-3‘ (SEQ ID NO 77)SphI5' -GGGGTTAATTAAGAGCGGGCCTGGTTA-3‘ (SEQ ID NO 78)Pac I实施PCR和纯化的条件如上所述。将磷脂酶基因片段依照生产商的指示克隆入 pCR -TOPO 。然后将pCR -TOPO 磷脂酶克隆用SphI消化并用T4DNA聚合酶处理以去除突出的3'端。使用QIAQUICK Nucleotide Removal Kit纯化片段，并用I^ac I 消化。将消化物在TBE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，并将11Λ条带从凝胶切出并使用QIAQUICK GelExtraction Kit 纯化。将质粒pShebl中间物2 (见上)用Mu I和Bsp LullI消化，并使用QIAQUICK Nucleotide Removal Kit纯化。然后将片段连接于2kb Stu I-Bsp LullI镶片镰孢葡糖淀粉酶启动子片段(W0 2000/056900)。该载体，称作pShebl中间物3，用Bsp LullI消化，用Klenow片段处理以填充5 ‘悬突(overhang)，用I^ac I消化，并使用QIAQUICK Nucleotide Removal Kit纯化。然后将该片段连接于SphI、平端I^c I尖镰孢磷脂酶片段 (如上所述)。所得的质粒，命名为PEJG49(图，携带镶片镰孢葡糖淀粉酶启动子转录调控之下的磷脂酶报道基因。实施例22 构建质粒pEmY15使用定点诱变从表达质粒pEJG49去除Eco RI和Not I限制位点各一个，并使得这些在双丙氨膦(bialaphos)抗性标记(bar基因)侧翼的限制位点唯一。诱变是使用如下所示的正向和反向引物和QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit来完成的。正向引物5' -cctgcatggccgcCgccgcCaattcttacaaaccttcaacagtgg-3‘ (SEQ ID NO 79)反向引物5' -ccactgttgaaggtttgtaagaattGgcggcGgcggccatgcagg-3‘ (SEQ ID NO 80)大写字母表示所需的变化，而所得的质粒命名为pEmY15(图25)。实施例23 构建质粒pEmYM为了用镶片镰孢pyrG基因替代表达质粒pEmY15中的bar基因，进行了下述实验方案。将质粒pEmY15用Eco RI和Not I消化，并在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化。将7. 11Λ片段切出，并使用QIAQUICK GelEXtracti0n Kit进行琼脂糖提取。将pyrG基因的2. 3kb片段从pDM156. 2使用如下所示的正向和反向引物进行PCR 扩增。正向引物5，-ATAAGAAT gcggccgCTCCAAGGAATAGAATCACT-3，(SEQ ID NO :81)反向引物5，-CG gaattcTGTCGTCGAATACTAAC-3，(SEQ ID NO :82)粗体序列对应于引入分别用于正向和反向引物的Not I位点和Eco RI位点。扩增反应物由在50 μ 1的终体积中的IX ThermoPol Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)，200 μ M dNTPs, 31pDM156. 2，1μΜ每种引物和 1 单位 VENT
DNA聚合酶组成。将反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，其程序为在95°C进行1个循环3分钟；30个循环，每个在95°C进行30秒，55 °C进行1分钟；和72°C进行3分钟；并在72°C进行1个循环7分钟。将PCR产物在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳分离，并将2. 3kb片段切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。然后将该片段用Eco RI和 Not I消化，并将消化反应物使用MINELUTE Reaction Cleanup Kit纯化。将片段使用 T4 DNA连接酶依照生产商的指示连接于经Not I/Eco RI消化的pEmY15。将连接混合物依照生产商的指示转化入大肠杆菌XL I-Blue亚克隆级感受态细胞(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。对转化体进行测序以确保不含PCR错误，并鉴定了含有无错误pyrG片段的质粒。 所得的质粒命名为PEmYM (图26)。实施例24 构建质粒pDM257将质粒pEmYM (实施例23)用Af 1 II和Sna BI消化。将6. 5kb片段在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将质粒PEJG65用Afl II和Sna BI消化。将3. 3kb片段在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。将两个片段使用T4DNA连接酶依照生产商的指示连接在一起。将连接混合物依照生产商的指示转化入大肠杆菌XLl-Blue亚克隆级感受态细胞。通过序列分析筛选转化体， 并鉴定了含有具有所需片段的质粒的克隆。将所得的质粒命名为pDM257(图27)。实施例25 构建质粒pDM258将质粒pDM257用ka I和Afl II消化并在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化，并将4. 11Λ片段从凝胶切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。还将质粒pEJG69用 a I和Afl II消化，并在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并将5. Skb片段从凝胶切出，并如上所述进行琼脂糖提取。将两个片段使用T4DNA连接酶依照生产商的指示连接在一起。将连接混合物依照生产商的指示转化入大肠杆菌XLl-Blue亚克隆级感受态细胞。通过序列分析筛选转化体， 并鉴定了所需的质粒，并命名为pDM258(图28)。实施例沈在镶片镰孢菌株JfyS1643-95_4中表达乳糖氧化酶。镶片镰孢JfyS1643-95_04 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)的原生质体如实施例1中所述生成。然后将该原生质体依照实施例1中所述的方法用携带Microdochium nivale乳糖氧化酶表达载体的PDM258转化，以衡量镶片镰孢JfyS1643-95-04株的表达潜力。将转化体如实施例21中所述在摇瓶中生长，只是所述烧瓶在以200rpm振荡温育5日。对摇瓶培养液就乳糖氧化酶活性使用与BIOMEK 3000 (Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, USA) 一同的活性测定法进行测定。该乳糖氧化酶测定法是Glucose Oxidase Assay Procedure (K-Glox) (Megazyme,Wicklow, Ireland)的修饰版本。将培养上清适当地在0. IM MOPS缓冲液pH 7.0(样品缓冲液)中稀释，然后对稀释样品进行从0倍至 1/3倍至1/9倍的系列稀释。将乳糖氧化酶标样(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)使用两倍逐步稀释，在样品缓冲液中的浓度以0. 056mg/ml开始并以0. 007mg/ml终止。将包括标样的总共20 μ 1的每个稀释物转移至96孔平底板。将一百微升POD溶液(Peroxidase， 4AA，在磷酸钾缓冲液pH 7加对羟基苯甲酸和叠氮化钠中的稳定剂)添加至每孔，然后添加 100 μ 1葡萄糖底物(样品缓冲液中的0.5Μ葡萄糖)。反应速率在环境温度(大约
在510nm测量总共10分钟。样品浓度通过从使用乳糖氧化酶作为标样生成标准曲线外推来确定。选择产量最高的乳糖氧化酶转化体在2升发酵罐中进行生长和分析。发酵培养基(pH 6)由每升20g大豆粉，20g蔗糖，2. Og MgSO4 · 7H20, 2. Og无水 KH2PO4, 2. Og K2SO4, 5. Og (NH4) 2S04，1. Og 柠檬酸，0. 5ml 的 200X AMG 痕量金属溶液(不含镍) 和 0. 5ml 含 20 %麦芽糖补料(feed)的 pluronic acid 组成。发酵在 29. 0+/-1. 0°C，1200rpm 和l.Ovvm通气下进行，其中％ DO维持在30%以上。对发酵液使用 Alpha-Amylase Assay Kit (Megazyme International Ireland Ltd. ,fficklow, Ireland)连同BIOMEK 3000 和BIOMEK NX (Beckman Coulter, Inc, Fullerton CA,USA)进行α -淀粉酶活性的测定。如上所述对发酵液测定乳糖氧化酶活性。所得的转化体镶片镰孢JfyS1643-95_04，在2升发酵罐中具有与其它无缺失镶片镰孢转化体等同的乳糖氧化酶产生水平(图四)，表明amyA基因的缺失并不对异源蛋白质产生具有不利作用。然而该缺失确实消除了该株和该种系所有后续株在培养液中的α-淀粉酶活性(图30)。由于该转化体与现有的生产株具有等同的异源蛋白质产生能力，并在发酵过程中减少了 α -淀粉酶水平，选择镶片镰孢JfyS1643-95-04宿主株用于缺失碱性蛋白酶A基因(alpA)。
实施例27 镶片镰孢碱性蛋白酶A(alpA)缺失载体pJfyS1698-72_10的生成用于完全去除镶片镰孢A3/5碱性蛋白酶A(alpA)基因(DNA序列为SEQ ID NO 83 而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 84)的上游侧翼序列使用GENOME WALKER Universal Kit获得。将每个用该试剂盒生成的文库使用如下所示的5’基因特异性引物和5’嵌套引物进行针对5’侧翼序列的两轮PCR。5’基因特异性引物5，-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3，(SEQ ID NO 85)5’嵌套引物5，-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3，(SEQ ID NO 86)序列信息是从PCR产物使用GENOME WALKER Universal Kit中提供的Nested Adaptor I^rimer和上述5’嵌套引物获得的。将获得的序列用于设计引物以扩增5’ alpA 侧翼序列的11Λ区域以供插入空的缺失载体pJfyS1579-41-ll。将alpA 5’侧翼序列从镶片镰孢A3/5基因组DNA使用如下所示的区域特异性正向和反向引物进行PCR扩增。下划线字母代表供之后去除载体pCR 2.1部分的Not I位点，而斜体字母代表用于载体克隆的Asc I位点。正向引物5，-aaaaaaggcgcgccgcggccgcGTTACGGTGTTCAAGTACATCTTACA-3，(SEQ ID NO :87)反向引物5' -aaaaaaggcgcgccATTGCTATCATCAACTGCCTTTCTT-3，(SEQ ID NO :88)扩增反应物含有IX HERCULASE Reaction Buffer, 120ng 基因组 DNA，400nm 引物，200 μ M dNTPs 和 2. 5 单位HERCULASE DNA 聚合酶。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C 进行1个循环2分钟；20个循环，每个在94°C进行30秒，56°C进行30秒，和72°C进行1分 10秒；和在72°C进行1个循环7分钟。将扩增反应物的5 μ 1部分通过使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳显现以确保该反应产生了所需的11Λ条带。然后将该插入物从所述扩增反应物依照生产商的指示使用 TOPO TA Cloning Kit直接克隆入pCR 2. 1。对转化体通过用Eco RI的限制性分析加以筛选以确保插入物的存在，并合并了 5个正确的制备物。用Asc I将该插入物从pCR 2.1释放，并如上所述通过琼脂糖凝胶电泳纯化片段。将该插入物使用QUICK LIGATION Kit克隆入经Asc I-线性化的pJfyS1579-41-ll，并使用连接混合物依照生产商的实验方案转化大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。将转化体通过序列分析进行筛选以确保不含 PCR错误。一个含有侧翼序列不含错误的质粒命名为pJfyS1698-65-15(图31)并用于插入 3’侧翼序列。将alpA基因的3’侧翼序列从镶片镰孢A3/5基因组DNA使用如下所示的区域特异性正向和反向引物进行PCR扩增。下划线字母代表供之后去除β内酰胺酶的Not I位点，而斜体字母代表用于载体克隆的SbfI位点。正向引物5，-aaaaacctgcaggGGATGTGTGTGGAATAGGATATG-3，(SEQ ID NO :89)反向引物
5，-aaaaacctgcagggcggccgcCCTCAAGGTGGAGAAATAATCTGT-3，(SEQ ID NO :90)PCR 反应物含有 IX HERCULASE Reaction Buffer, 120ng 基因组 DNA 模板， 400nm 引物，200 μ M dNTPs 和 2. 5 单位HERCULASE DNA 聚合酶。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C 进行1个循环2分钟；20个循环，每个在94°C进行30秒，56°C进行30秒，和72°C进行1分 10秒；和在72°C进行1个循环7分钟.将扩增反应物的5μ 1部分通过使用TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳显现以确保该反应产生了所需的11Λ条带。然后将该直接来自PCR反应的11Λ插入物使用ΤΟΡΟ TA Cloning Kit克隆入pCR 2. 1。对所得的质粒进行测序以鉴定含有正确序列的菌落。 然后通过SbfI消化将该片段从该质粒释放，并在TAE缓冲液中通过1 %琼脂糖凝胶电泳纯化。将11Λ条带切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。然后将该片段使用QUICK LIGATION Kit连接于经Sbf I线性化的 pJfyS1698-65-15(经小牛小肠磷酸酶处理)，并使用该连接混合物依照生产商的指示转化大肠杆菌SURE 化学感受态细胞。将转化体通过用Not I的限制性分析筛选以确保片段以正确的取向插入，并进行测序以确保没有偏离预计的序列。将所得的质粒 pJfyS1698-72-10(图 32)用于缺失 alpA 基因。实施例沘Δtri5 ApyrG AamyA AalpA 镶片镰孢菌株 JfyS1763_l 1-1 的生成将依照实施例1中所述方法用经Not I-消化和凝胶纯化的pJfyS1698-72_10转化的镶片镰孢JfyS1643-95_4 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)(实施例16)的三个转化体从转化板用灭菌牙签转移至含有补充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在室温温育7日。对于Southern分析，将来自3个转化体每一个的2 μ g镶片镰孢基因组DNA用34单位SphI消化。根据实施例11中所述方法使用如下所示的正向和反向引物生成针对aplA基因5’侧翼序列的DIG探针。正向引物5' -GCACGTTAGGCTCAAGCCAGCAAGG-3‘ (SEQ ID NO 91)反向引物5' -GAGGCTCATGGATGTGGCGTTAATG-3‘ (SEQ ID NO 92)如实施例11中所述实施的Southern分析表明三个转化体之一含有缺失盒在alpA 基因位点的单一拷贝，并将该转化体命名为镶片镰孢JfyS1698-83-2。将镶片镰孢JfyS1698-83_2如实施例1所述进行孢子形成，并将IO5个孢子铺板于含有补充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm直径板。将所得的孢子分离物亚培养至含有补充了 10 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板。将所得的孢子分离物如实施例2中所述通过Southern分析进行分析，并鉴定了一个正确地切出盒的孢子分离物。该分离物命名为Fusarium venenatum JfyS1698-94_04。将镶片镰孢 JfyS1698-94-04如实施例11中所述进行一次孢子纯化，并挑取一个孢子分离物，并命名为镶片镰孢 JfyS1763-l 1-01 (Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA Δ alpA)。如实施例1中所述生成并用pDM258转化了镶片镰孢JfyS1763-ll_01的原生质体。将转化体如实施例26中所述进行分析，并对摇瓶液就碱性蛋白酶活性进行测定。将 PROTAZYME AK 片(Megazyme，Wicklow，Ireland)通过轻柔地搅拌悬于 2. Oml 0. 01%TRITON X-100中。将五百微升该悬液和500 μ 1补充了PROTAZYME AK片的测定缓冲液在EPPENDORF 管中混合并置于冰上。添加了二十微升的蛋白酶样品(稀释于0. 01%TRITON X-100)。该测定通过将该EPPENDORF 管转移至设定为测定温度EPPENDORF 热混合器而起始。将管在EPPENDORF 热混合器上以1300rpm温育 15分钟。该温育通过将管转移回冰浴而停止。然后将管在冰冷的离心机中以16，OOOxg离心几分钟，并将200 μ 1上清转移至微滴定板。读取在650nm的吸光度作为蛋白酶活性的量度。如amyA缺失，alpA基因的缺失不对乳糖氧化酶表达具有有利影响。然而，在发酵上清中碱性蛋白酶的副活性减少了 10倍(图33)。实施例四:dpsl缺失载体PJfySlll的生成将镶片镰孢缩酚酸肽合酶(dpsl)基因(DNA序列为SEQ ID NO 93而推导的氨基酸序列为SEQ ID NO 94)的3，侧翼序列从镶片镰孢JfyS1763-ll_01基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。引物中的下划线部分代表引入用于克隆的SbfI位点，而斜体部分对应于引入的用于之后去除β内酰胺酶的Not I位点。正向引物5' -GACTAAGCCCTGCAGGTTGGTCTCAATCGTCGCGACAG-3' (SEQ ID NO 95)反向引物5' -AGTCTACCCCTGCAGGCGGCCGCTGGCATCGGTGGACGTAACACGC-3' (SEQ ID NO 96)扩增反应物以50 μ 1 的终体积含有 IX HERCULASE Reaction Buffer, 400nM 每种引物，200 μ M dNTPs, IOOng基因组DNA和1. 5单位HERCULASE DNA聚合酶。将扩增反应物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中温育，程序为在95°C进行1个循环2分钟；25个循环，每个在95°C进行30秒，57°C进行30秒，和72°C进行1分20秒；和在 72 °C进行1个循环7分钟。扩增反应物使用MINELUTE PCR Purification Kit纯化。然后用^fI消化纯化的反应物并对其进行使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳。将11Λ条带从凝胶切出， 并使用MINELUTE Gel Extraction Kit进行琼脂糖提取。然后将消化的载体依照生产商建议的实验方案使用QUICK LIGATI0N Kit连接于经SbfI-消化的pJfyS1579-41_ll (实施例12)(其经小牛小肠磷酸酶脱磷酸)。对所得的克隆通过用Eco RI的限制性分析(以检查插入物的存在和取向)和序列分析(以确保不含PCR错误)进行分析，并将所得的质粒命名为 pJfyS1879-32-2(图 34)。为了获得dpsl基因5’端的侧翼序列，如实施例15中所述与如下所示的基因特异性和基因特异性嵌套引物一同使用GENOME WALKER Universal Kit。基因特异性引物5' -GCTATTGAGGGGACTATCTCCATGACTACA-3' (SEQ ID NO 97)基因特异性嵌套引物5' -GCCTACCATCGACAGCAGTAAGATATTCC-3' (SEQ ID NO 98)将5’ dpsl侧翼序列从镶片镰孢JfyS1763-ll_l基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行扩增。正向引物中的下划线部分代表引入用于克隆的Asc I位点而斜体部分对应于引入的用于之后β-内酰胺酶去除的Not I位点。扩增反应和循环参数与上述的那些相同，只是使用的引物是下述那些，所用的退火温度是53°C，而延伸时间为1分15秒。正向引物5' -ATGTGCTACAGGCGCGCC GCGGCCGCGAGTTCCAACATGTCTTATTATCC-3， (SEQID NO: 99)反向引物5，-TACTGTACCGGCGCGCCATCTGAGCCAAGAGACTCATTCAT-3，(SEQ ID NO :100)PCR 反应物使用MINELUTE PCR Purification Kit 纯化。用 Asc I 消化纯化的反应物，并对其进行使用TAE缓冲液的1 %琼脂糖凝胶电泳。将0. 7kb条带从凝胶切出，并如上所述进行琼脂糖提取。将0.71Λ条带使用QUICKLIGATION Kit连接于 pJfyS1879-32-2(经Asc I消化而经小牛小肠磷酸酶脱磷酸)。对所得的克隆通过序列分析加以分析以确保不含PCR错误，并将所得的质粒命名为pJfySlll (图35)并用于缺失镶片镰孢dpsl基因。实施例30 Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA Δ alpA Δ dpsl 镶片镰孢菌株 JfyS1879-57-01 的生成当(依照实施例1中所述的方法)用经Not I消化的和凝胶纯化的pJfySlll转化镶片镰孢JfyS1763-ll-01原生质体时，获得了 77个转化体。将其中48个从转化板用灭菌牙签转移至含有补充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板， 并在室温温育7日。真菌生物质是通过用四个来自实施例1中所述生成的7日龄转化体的Icm琼脂栓接种25ml补充了 IOmM尿苷M400培养基来产生的。将培养物在以150rpm振荡温育3 日。去除琼脂栓，并将培养物经过MIRACL0TH 过滤。将收获的生物质用液氮冻结，并使用研钵和杵磨碎菌丝体。使用DNEASY Plant Maxi Kit依照生产商的指示分离基因组DNA，只是将在 65°C的裂解温育期从10分钟延伸至1. 5小时。将两μ g基因组DNA用Nco I和Spe I各28单位在50 μ 1反应体积中在37°C消化22小时。在TAE缓冲液中对消化物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。在凝胶中将DNA通过用 0. 25M HCl 处理进行片段化，用 1. 5M NaCl-O. 5MNa0H 变性，用 1. 5M NaCl-IM Tris pH 8 中和，然后在 20X SSC 中使用 TURBOBLOTTER Kit 转移至NYTRAN Supercharge 尼龙膜。 将DNA使用UV STRATALINKER UV交联至膜，并在42°C在20ml DIG Easy Hyb中预杂交1 小时。依照实施例11中所述的方法使用如下所示的正向和反向引物生成针对dpsl基因 3’侧翼序列的DIG探针。正向引物5' -CTTGACTATTATCTCACGTTGTCAG-3‘ (SEQIDN0:101)反向引物5' -TCAAGTGTTGTGTAATGTTGGAACA-3‘ (SEQ ID NO :102)如实施例11中所述实施的Southern分析表明获得的8个转化体中的三个在dpsl 位点单一拷贝的缺失片段。将一个命名为镶片镰孢JfyS1879-43-05。Southern分析表明8个转化体中的三个在dpsl位点以单一拷贝含有缺失片段。
50其中一个命名为镶片镰孢JfyS1879-43-5。将镶片镰孢JfyS1879-43_5如实施例1所述进行孢子形成，并将IO5个孢子铺板于含有补充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm直径板。将所得的孢子分离物亚培养至含有补充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板。将所得的孢子分离物如实施例2中所述通过Southern分析进行分析，并鉴定了一个正确地切出盒的孢子分离物。该分离物命名为镶片镰孢JfyS1879-52-3。将镶片镰孢JfyS1879_52_3如实施例11中所述进行一次孢子纯化，并挑取一个孢子分离物，并命名为镶片镰孢JfyS1879 -57-1 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA Δ alpA Δ dpsl)。本发明进一步由下述编号的段落描述[1] 一种产生多肽的方法，包括(a)在用于产生所述多肽的培养基中培养亲本镶片镰孢菌株的突变体，其中所述突变体菌株包含编码所述多肽的多核苷酸以及一个或多个(几个)选自下组的基因pyrG、 amyA和alpA，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α -淀粉酶和碱性蛋白酶；和(b)从培养基回收所述多肽。[2]段落1的方法，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因的修饰。[3]段落1的方法，其中所述突变体菌株包含对amyA基因的修饰。[4]段落1的方法，其中所述突变体菌株包含对alpA基因的修饰。[5]段落1的方法，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因和amyA基因的修饰。[6]段落1的方法，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因和alpA基因的修饰。[7]段落1的方法，其中所述突变体菌株包含对amyA基因和alpA基因的修饰。[8]段落1的方法，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因、amyA基因和alpA基因的修饰。[9]段落1-8任一项的方法，其中所述突变体菌株还包含基因tri5和dpsl之一或两者，其中所述基因之一或两者经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。[10]段落9的方法，其中所述突变体菌株包含对tri5基因的修饰。[11]段落9的方法，其中所述突变体菌株包含对dpsl基因的修饰。[12]段落9的方法，其中所述突变体菌株包含对tri5基因和dpsl基因的修饰。[13]段落9-12任一项的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者。[14]段落9-12任一项的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比完全缺陷于单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者。[15]段落1-14任一项的方法，其中所述多肽对于镶片镰孢菌株是天然的或外源的。[16]段落15的方法，其中所述多肽选自下组抗原、酶、生长因子、激素、免疫调节剂、神经递质、受体、报道蛋白、结构蛋白和转录因子。[17]段落16的方法，其中所述酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。[18]段落1-17任一项的方法，其中所述突变体菌株包含至少两个拷贝的编码多肽的多核苷酸。[19]段落1-18任一项的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的选自下组的一个或多个(几个)酶乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。[20]段落1-18任一项的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比完全缺陷于选自下组的一个或多个(几个)酶乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。[21]段落1-20任一项的方法，其中编码具有乳清苷-5' _单磷酸脱羧酶活性的多肽的PyrG基因选自下组(a)编码多肽的基因，所述多肽具有乳清苷-5' _单磷酸脱羧酶活性，包含与SEQ ID NO 44具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :43或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 43具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[22]段落21的方法，其中所述pyrG基因编码多肽，所述多肽具有乳清苷_5'-单磷酸脱羧酶活性，包含SEQ ID NO :44或其具有乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 44或其具有乳清苷_5'-单磷酸脱羧酶活性的片段组成。[23]段落1-20的方法，其中编码具有α _淀粉酶活性的多肽的amyA基因选自下组(a)编码具有α-淀粉酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 52具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :51或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 51具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[24]段落23的方法，其中所述amyA基因编码多肽，所述多肽具有α _淀粉酶活性，包含SEQ ID NO :52或其具有α-淀粉酶活性的片段，或者由SEQ ID NO :52或其具有 α-淀粉酶活性的片段组成。[25]段落1-20的方法，其中编码具有碱性蛋白酶活性的多肽的alpA基因选自下组(a)编码具有碱性蛋白酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO :84具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :83或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 83具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[26]段落25的方法，其中所述alpA基因编码多肽，所述多肽具有碱性蛋白酶活性，包含SEQ ID NO :52或其具有碱性蛋白酶活性的片段，或者由SEQ ID N0:52或其具有碱性蛋白酶活性的片段组成。[27]段落1-20的方法，其中编码具有单族毒素合酶活性的多肽的tri5基因选自下组(a)编码具有单族毒素合酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 20具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :19或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 19具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[28]段落27的方法，其中所述tri5基因编码多肽，所述多肽具有单族毒素合酶活性，包含SEQ ID NO :20或其具有单族毒素合酶活性的片段，或者由SEQ ID N0:20或其具有单族毒素合酶活性的片段组成。[29]段落1-20的方法，其中编码具有环己缩肽合成酶活性的多肽的dpsl基因选自下组(a)编码具有环己缩肽合成酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 94 具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :93或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 93具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[30]段落四的方法，其中所述dpsl基因编码多肽，所述多肽具有环己缩肽合成酶活性，包含SEQ ID NO :94或其具有环己缩肽合成酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 94或其具有环己缩肽合成酶活性的片段组成。[31] 一种亲本镶片镰孢菌株的突变体，包含编码所述多肽的多核苷酸以及一个或多个(几个)选自下组的基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α-淀粉酶和碱性蛋白酶。[32]段落31的突变体菌株，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因的修饰。[33]段落31的突变体菌株，其中所述突变体菌株包含对amyA基因的修饰。[34]段落31的突变体菌株，其中所述突变体菌株包含对alpA基因的修饰。[35]段落31的突变体菌株，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因和amyA基因的修饰。[36]段落31的突变体菌株，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因和alpA基因的修饰。[37]段落31的突变体菌株，其中所述突变体菌株包含对amyA基因和alpA基因的修饰。[38]段落31的突变体菌株，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因、amyA基因和 alp基因的修饰。[39]段落31-38任一项的突变体菌株，其还包含基因tri5和dpsl之一或两者，其中所述基因之一或两者经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。[40]段落39的突变体菌株，其包含对tri5基因的修饰。[41]段落39的突变体菌株，其包含对dpsl基因的修饰。[42]段落39的突变体菌株，其包含对tri5基因和dpsl基因的修饰。[43]段落39-42任一项的突变体菌株，其与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者。
[44]段落39-42任一项的突变体菌株，其与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比完全缺陷于单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者。[45]段落31-44任一项的突变体菌株，其中所述多肽对于镶片镰孢菌株是天然的或外源的。[46]段落31-45任一项的突变体菌株，其中所述多肽选自下组抗原、酶、生长因子、激素、免疫调节剂、神经递质、受体、报道蛋白、结构蛋白和转录因子。[47]段落46的突变体菌株，其中所述酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、 异构酶或连接酶。[48]段落31-47任一项的突变体菌株，其与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的选自下组的一个或多个(几个)酶乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。[49]段落31-47任一项的突变体菌株，其与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比完全缺陷于选自下组的一个或多个(几个)酶乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。[50]段落31-49任一项的突变体菌株，其中编码具有乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶活性的多肽的PyrG基因选自下组(a)编码具有乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 44具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :43或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 43具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[51]段落50的突变体菌株，其中所述pyrG基因编码多肽，所述多肽具有乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶活性，包含SEQ ID NO :44或其具有乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 44或其具有乳清苷_5'-单磷酸脱羧酶活性的片段组成。[52]段落31-49的突变体菌株，其中编码具有α-淀粉酶活性的多肽的amyA基因选自下组(a)编码具有α-淀粉酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 52具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :51或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 51具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[53]段落52的突变体菌株，其中所述amyA基因编码多肽，所述多肽具有α-淀粉酶活性，包含SEQ ID NO :52或其具有α-淀粉酶活性的片段，或者由SEQ ID Ν0:52或其具有α-淀粉酶活性的片段组成。[54]段落31-49的突变体菌株，其中编码具有碱性蛋白酶活性的多肽的alpA基因选自下组(a)编码具有碱性蛋白酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO :84具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :83或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 83具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[55]段落M的突变体菌株，其中所述alpA基因编码多肽，所述多肽具有碱性蛋白
54酶活性，包含SEQ ID NO :52或其具有碱性蛋白酶活性的片段，或者由SEQ ID N0:52或其具有碱性蛋白酶活性的片段组成。[56]段落31-49的突变体菌株，其中编码具有单族毒素合酶活性的多肽的tri5基因选自下组(a)编码具有单族毒素合酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 20具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :19或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 19具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[57]段落56的突变体菌株，其中所述tri5基因编码多肽，所述多肽具有单族毒素合酶活性，包含SEQ ID NO :20或其具有单族毒素合酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 20 或其具有单族毒素合酶活性的片段组成。[58]段落31-49的方法，其中编码具有环己缩肽合成酶活性的多肽的dpsl基因选自下组(a)编码具有环己缩肽合成酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 94 具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :93或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 93具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[59]段落58的方法，其中所述dpsl基因编码多肽，所述多肽具有环己缩肽合成酶活性，包含SEQ ID NO :94或其具有环己缩肽合成酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 94或其具有环己缩肽合成酶活性的片段组成。[60]段落31-59任一项的突变体菌株，其包含编码对于突变体菌株为外源的多肽的多核苷酸。[61] 一种获得亲本镶片镰孢菌株突变体的方法，包括(a)修饰选自下组的一个或多个(几个)基因pyrG、amyA和alpA ；和(b)鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中所述一个或多个(几个)选自下组的基因pyrG、amyA和alpA经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α-淀粉酶和碱性蛋白酶。[62]段落61的方法，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因的修饰。[63]段落61的方法，其中所述突变体菌株包含对amyA基因的修饰。[64]段落61的方法，其中所述突变体菌株包含对alpA基因的修饰。[65]段落61的方法，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因和amyA基因的修饰。[66]段落61的方法，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因和alpA基因的修饰。[67]段落61的方法，其中所述突变体菌株包含对amyA基因和alpA基因的修饰。[68]段落61的方法，其中所述突变体菌株包含对pyrG基因、amyA基因和alpA基因的修饰。[69]段落61-68任一项的方法，还包括修饰基因tri5和dpsl之一或两者，其中所述基因之一或两者经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。
[70]段落69的方法，其中所述突变体菌株包含对tri5基因的修饰。[71]段落69的方法，其中所述突变体菌株包含对dpsl基因的修饰。[72]段落69的方法，其中所述突变体菌株包含对tri5基因和dpsl基因的修饰。[73]段落69-72任一项的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者。[74]段落69-72任一项的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比完全缺陷于单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者。[75]段落61-74任一项的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的选自下组的一个或多个(几个)酶乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。[76]段落61-74任一项的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比完全缺陷于选自下组的一个或多个(几个)酶乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。[77]段落61-76任一项的方法，其中编码具有乳清苷-5' _单磷酸脱羧酶活性的多肽的PyrG基因选自下组(a)编码具有乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 44具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :43或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 43具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[78]段落77的方法，其中所述pyrG基因编码多肽，所述多肽具有乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶活性，包含SEQ ID NO :44或其具有乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 44或其具有乳清苷_5'-单磷酸脱羧酶活性的片段组成。[79]段落61-76的方法，其中编码具有α-淀粉酶活性的多肽的amyA基因选自下组(a)编码具有α-淀粉酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 52具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :51或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 51具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[80]段落79的方法，其中所述amyA基因编码多肽，所述多肽具有α _淀粉酶活性，包含SEQ ID NO :52或其具有α-淀粉酶活性的片段，或者由SEQ ID NO :52或其具有 α-淀粉酶活性的片段组成。[81]段落61-76的方法，其中编码具有碱性蛋白酶活性的多肽的alpA基因选自下组(a)编码具有碱性蛋白酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO :84具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :83或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 83具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[82]段落81的方法，其中所述alpA基因编码多肽，所述多肽具有碱性蛋白酶活性，包含SEQ ID NO :84或其具有碱性蛋白酶活性的片段，或者由SEQ ID NO :84或其具有碱性蛋白酶活性的片段组成。[83]段落61-76的方法，其中编码具有单族毒素合酶活性的多肽的tri5基因选自下组(a)编码具有单族毒素合酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 20具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :19或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 19具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[84]段落83的方法，其中所述tri5基因编码多肽，所述多肽具有单族毒素合酶活性，包含SEQ ID NO :20或其具有单族毒素合酶活性的片段，或者由SEQ ID N0:20或其具有单族毒素合酶活性的片段组成。[85]段落61-76的方法，其中编码具有环己缩肽合成酶活性的多肽的dpsl基因选自下组(a)编码具有环己缩肽合成酶活性的多肽的基因，所述多肽包含与SEQ ID NO 94 具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)在至少低严格条件下与(i)SEQ ID NO :93或其全长互补链杂交的基因；和(c)包含与SEQ ID NO 93具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的基因。[86]段落85的方法，其中所述dpsl基因编码多肽，所述多肽具有环己缩肽合成酶活性，包含SEQ ID NO :94或其具有环己缩肽合成酶活性的片段，或者由SEQ ID NO 94或其具有环己缩肽合成酶活性的片段组成。本文中描述和要求保护的本发明的范围并不受本文中具体公开的方面限制，因为这些方面意欲说明本发明的几个方面。任何等同的方面意欲在本发明的范围之内。事实上， 除了本文中显示和描述的之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员从前述描述而言是显而易见的。此类修饰也意欲落入所附权利要求的范围之内。在出现冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。本文中引用了多种参考文献，其公开通过提述以其整体并入。
5权利要求
1.一种产生多肽的方法，包括(a)在用于产生所述多肽的培养基中培养亲本镶片镰孢(Fusariumvenenatum)菌株的突变体，其中所述突变体菌株包含编码所述多肽的多核苷酸以及选自下组的一个或多个 (几个)基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α -淀粉酶和碱性蛋白酶；和(b)从培养基回收所述多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述突变体菌株还包含基因tri5和dpsl之一或两者，其中所述基因之一或两者经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素(trichodiene)合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。
3.权利要求2的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者。
4.权利要求2的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者中是完全缺陷的。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述多肽对于镶片镰孢菌株是天然的或外源的。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的选自下组的一个或多个(几个)酶乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。
7.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比在选自下组的一个或多个(几个)酶中是完全缺陷的乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。
8.一种亲本镶片镰孢菌株的突变体，包含编码所述多肽的多核苷酸以及选自下组一个或多个(几个)基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α -淀粉酶和碱性蛋白酶。
9.权利要求8的突变体菌株，其还包含基因tri5和dpsl之一或两者，其中所述基因之一或两者经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。
10.权利要求9的突变体菌株，其与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者。
11.权利要求9的突变体菌株，其与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者中是完全缺陷的。
12.权利要求8-11任一项所述的突变体菌株，其中所述多肽对于镶片镰孢菌株是天然的或外源的。
13.权利要求8-12任一项所述的突变体菌株，其与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的选自下组的一个或多个(几个)酶乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。
14.权利要求8-12任一项所述的突变体菌株，其与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比在选自下组的一个或多个(几个)酶中是完全缺陷的乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。
15.一种获得亲本镶片镰孢菌株的突变体的方法，包括(a)修饰选自下组的一个或多个(几个)基因pyrG、amyA和alpA；和(b)鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中所述选自下组的一个或多个(几个)基因 pyrG、amyA和alpA经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷_5’ -单磷酸脱羧酶、α-淀粉酶和碱性蛋白酶。
16.权利要求15任一项所述的方法，还包括修饰基因tri5和dpsl之一或两者，使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者的产生中有缺陷。
17.权利要求16的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者。
18.权利要求16的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比在单族毒素合酶和环己缩肽合成酶之一或两者中是完全缺陷的。
19.权利要求15-18任一项所述的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比少产生至少25%的选自下组的一个或多个(几个)酶乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。
20.权利要求15-18任一项所述的方法，其中所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比在选自下组的一个或多个(几个)酶中是完全缺陷的乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶，α-淀粉酶和碱性蛋白酶。
全文摘要
本发明涉及产生多肽的方法，包括(a)在用于产生所述多肽的培养基中培养亲本镶片镰孢菌株的突变体，其中所述突变体菌株包含编码所述多肽的多核苷酸以及一个或多个(几个)选自下组的基因pyrG、amyA和alpA，其中所述一个或多个(几个)基因经修饰使得所述突变体菌株与在相同条件下培养的亲本镶片镰孢菌株相比分别在选自下组的一个或多个(几个)酶的产生中有缺陷乳清苷-5′-单磷酸脱羧酶、α-淀粉酶和碱性蛋白酶；和(b)从培养基回收所述多肽。本发明还涉及镶片镰孢菌株的酶缺陷突变体和产生此类突变体的方法。
文档编号C12N15/80GK102227502SQ200980147258
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年9月30日
发明者杰弗里·沙斯基, 温迪·约德 申请人:诺维信股份有限公司