通过非病毒重编程获得的多潜能干细胞的制作方法

专利名称：通过非病毒重编程获得的多潜能干细胞的制作方法
诵_1 寸非病毒重编程获得的多丨替能干细胞.相关专利申请的交叉引用本专利申请主张2008年10月M日提交的美国临时专利申请No. 61/108，362的权益，该美国临时专利申请以引用的方式并入本文，如同对其全文进行叙述。关于联邦政府资助的研究或开发的声明本发明是在由美国国立卫生研究院(NIH)授予的编号为GM0816^和RR000167的政府支持下进行的。美国政府具有本发明的某些权利。
背景技术：
胚胎干(EQ细胞因其多潜能性而具有巨大的科学和医疗前景，所述多潜能性， 即，以不确定方式复制并且分化成所有三个胚层的细胞的能力。(Thomson等人，《科学》 (Science) 282 1145-1147 (1998)，其以引用方式并入本文，如同对其全文进行叙述)。因为存在被受体免疫系统排斥的可能性，人类ES细胞在治疗和再生医学上的应用变得复杂。因此，非常需要对特定受体而言遗传上基本相同的人类多潜能细胞。同样，对于设计患者特异性治疗策略时ES细胞的使用，遗传同一性可能是十分重要的。从出生后灵长类个体中产生多潜能细胞的最初尝试采用的是体细胞核移植(参见，例如，Byrne, JA等人，《自然》(Nature)450 :497-502(2007))和细胞融合(参见，例如，Yu, J等人，《干细胞》(Stem Cells)24 168-176 (2006)) 0然而，体细胞核移植的临床使用由于效率低而不实用，同时细胞融合导致近四倍体细胞。2007年，两组科学家将来自出生后灵长类个体的体细胞重编程为多潜能干细胞(Yu等人，《科学》(Science)318: 1917-1920(2007)，以及 Takahashi 等人，《细胞》(Cell) 131 :861-872 (2007))，其各自以弓丨用的方式并入本文，如同对其全文进行叙述。通过用于表达潜能决定转基因的病毒载体系统，两个组均将四个转录因子的cDNA导入人类体细胞并在其中表达。Takahashi等人的转录因子是0CT4、S0X2、c-Myc和KLF4，而Yu等人则采用0CT4、S0X2、NANOG和LI拟8。这几组转录因子的表达诱导人类体细胞获取ES细胞特异性特征，包括形态、增殖以及基因和表面标记物表达。以此方式重编程的体细胞被称为诱导多潜能(iPQ细胞。iPS细胞的存在消除了对胚泡的需要，并且减少了有关免疫排斥的问题。此后不久，Lowry等人通过转基因0CT4、S0X2、c_Myc和KLF4的异位表达产生出患者特异性iPS细胞系(lowry等人，《美国科学院院刊》(PNAS) 105 =2883-2888 (2008)) 0最近，从若干不同的人类和鼠类体细胞类型产生了 iPS细胞，诸如上皮细胞、成纤维细胞、肝脏细胞、胃细胞、神经细胞和胰细胞。此外，已成功将iPS细胞分化成各种谱系的细胞(例如，Dimos 等人，《科学》(Science) 321 1218-1221 (2008))。当前用于产生iPS细胞的方法采用的是逆转录病毒载体，诸如来源于慢病毒的那些逆转录病毒载体。这些载体在几乎任何染色体位点稳定地整合到靶细胞DNA中，并且永久改变该靶细胞DNA。重编程载体与基因组之间的这种非靶向相互作用伴随异常细胞基因表达以及病毒基因再活化导致的肿瘤生长的风险。(Okita等人，《自然》(NatUre)448: 313-317(2007))ο
此外，转基因的继续存在和表达可能会干扰受体细胞的生理活动。此外，用于重编程体细胞的转录因子(诸如c-Myc)的异位表达可能诱发编程性细胞死亡(细胞凋亡) (Askew 等人，《致癌基因》(Oncogene)6 :1915-1922(1991) ；Evan 等人，《细胞》(Cell)69 119-128(1992))。此外，诸如0CT4之类因子的继续表达可能会干扰后续的iPS细胞分化。希望将体细胞重编程到较高潜能的状态，而不使细胞基因构成的改变超出重编程相关改变。最近，Stadtfeld等人使用瞬时表达0CT4、S0X2、KLF4和c-Myc的非整合腺病毒产生了鼠类iPS细胞(Stadtfeld等人，《科学快递》(Sciencexpress)，2008年9月25日)。 目前为止，尚未报道未使用逆转录病毒载体产生的灵长类iPS细胞。

发明内容
本发明宽泛的概述为涉及重编程分化的灵长类体细胞来产生灵长类多潜能细胞。在第一方面，本发明概述为一种用于产生灵长类多潜能细胞的方法，该方法包括以下步骤将足以把体细胞重编程为多潜能状态的一组转基因导入灵长类体细胞内并回收多潜能细胞，所述转基因承载于不编码感染性病毒的至少一个附加型载体上。本文所提及的“非病毒”载体或构建体表示该载体或构建体不能编码感染性病毒。在第二方面，本发明涉及灵长类(包括人灵长类)的可补充的重编程多潜能细胞富集群体，其中与现有iPS细胞相反，所述多潜能细胞基本上缺乏至少一种载体(包括其具有病毒源或衍生物的任何元件)。如本文所用，这意味着重编程细胞包含每细胞少于一个拷贝的附加型载体，并且优选地在细胞中没有残余附加型载体。因为细胞分裂期间的不对称分割稀释了载体，所以可以容易地获得丢失了载体的重编程细胞。如本文它处所述，在罕见情况下，重编程载体可能整合到细胞的基因组中，但通过针对载体缺失进行筛选，可避免具有整合载体的细胞。此外，与现有ES细胞相反，本发明的灵长类多潜能细胞与来自胎儿或出生后个体的体细胞在遗传上基本相同。胎儿细胞可以从例如羊水获得。并不容易从形态上(即，圆形、大核仁和少细胞质)或通过生长特性(即，倍增时间；ES细胞的倍增时间为约 17到18个小时)来区分富集群细胞与现有灵长类ES和iPS细胞。如同iPS细胞和ES细胞，重编程细胞还表达多潜能细胞特异性标记物(例如，0CT-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、 TRA-1-81，但没有SSEA-1)。不同于ES细胞，重编程细胞并非直接来源于胚胎。如本文所用，“不直接来源于胚胎”意味着产生多潜能细胞的起始细胞类型是非多潜能细胞，诸如多潜能细胞或终末分化细胞，如从胎儿或出生后个体获得的体细胞。如同iPS细胞，该方法中产生的多潜能细胞可以在衍生期间瞬时表达一个或多个拷贝的所选潜能决定因子。除非另外定义，否则本文所使用的所有科技术语具有与本发明本领域技術人员通常理解的含义相同的含义。虽然用于实施或测试本发明的适合材料和方法在下文进行了描述，但也可使用类似于或等同于本文所述材料和方法的为本领域熟知的其它材料和方法。通过以下结合附图给出的说明，本发明的其它目的、优点和特征将变得明显。


图IA-B示出连接在重编程方法期间导入的载体上的转基因的不同核苷酸序列对重编程效率的作用。图2A-C示出在人类新生儿包皮成纤维细胞中c-Myc、KLF-4和SV40大T抗原基因表达对重编程效率的作用。图3A-C示出根据该方法用于将转基因带入体细胞的适合构建体、附加型载体介导的转基因的瞬时表达以及核转染之后载体数目对细胞存活的作用。图4A-D示出具有附加型载体介导的转基因表达的人类新生儿包皮成纤维细胞的
重编程。图5A-B示出携带用于本发明重编程方法的表达盒的相关构建体。
具体实施例方式本发明广泛涉及用于通过在非病毒载体上引入潜能决定因子而将分化灵长类体细胞重编程为基本不含在其生产时使用的载体的重编程灵长类细胞的新颖方法，所述非病毒载体在重编程期间存在但在重编程细胞内基本消失。如本文所用，“重编程”是指一种遗传过程，其将分化体细胞转化为去分化细胞，所述去分化细胞比其衍生的细胞具有更高的潜能。有利的是，该方法中产生的更高潜能的细胞是整倍体多潜能细胞。如本文所用， “多潜能细胞”是指表达多潜能细胞特异性标记、具有未分化细胞的细胞形态特征(即，紧密集落、高核质比和明显核仁)并且可以分化为所有三个胚层(例如，内胚层、中胚层和外胚层)的细胞群体。当引入免疫受损动物如SCID小鼠中时，所述多潜能细胞形成通常包含所有三个胚层的细胞或组织特征的畸胎瘤。本领域普通技术人员可以使用本领域常用技术来评定这些特征。参见，如，Thomson等人，同上。多潜能细胞既能够在细胞培养时增殖，也能够分化为显示多潜能特性的各种谱系限制性细胞群体。多潜能细胞比多潜能体细胞具有更高潜能，通过比较，多潜能细胞分化更多，但并不是终末分化。灵长类体细胞重编程方法的多潜能产物在本文中被称为“重编程灵长类多潜能细胞”或诱导多潜能(iPQ细胞。此类细胞适用于当前考虑使用人ES细胞或现有iPS细胞的研究和治疗应用中。分化体细胞，包括来自胎儿、新生儿、青少年或成年灵长类(包括人类个体)的细胞，是适合本方法的起始细胞。适合的体细胞包括但不限于骨髓细胞、上皮细胞、内皮细胞、 成纤维细胞、造血细胞、角化细胞、肝细胞、肠细胞、间充质细胞、脊髓前体细胞和脾细胞。另一种适合的体细胞为附着于基底的⑶29+⑶44+⑶166+CD105+⑶73+和⑶3Γ间充质细胞。或者，体细胞可以是能自我增殖和分化为其它类型细胞的细胞，包括血液干细胞、肌肉/骨骼干细胞、脑干细胞和肝脏干细胞。适合的体细胞是接受性的，或可使用科学文献中通常已知的方法使其具有接受性以摄取潜能决定因子，包括编码这些因子的遗传材料。摄取增强方法可根据细胞类型和表达系统而有所不同。本领域普通技术人员了解用于制备具有适合转导率的接受性体细胞的示例性条件。起始体细胞的倍增时间可以是约M小时。可以使用科学文献中通常已知的方法来构建和工程改造本文所述载体，以增加其用于治疗的安全性、包括选择和富集标记物以及(如果希望的话)优化其上所含核苷酸序列的表达。所述载体应包含允许载体在起始体细胞中自我复制的结构性成分。例如，已知的 Epstein Barr oriP/核抗原-1 (EBNA-1)组合(参见，例如，Lindner，S. Ε·和 B. Sugden，The plasmid replicon of Epstein-Barr virus :mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells, Plasmid58 :1 (2007),其以弓| 用的方式并入本文，如同对其全文进行叙述。)足以支持载体自我复制，而且也可以使用已知在哺乳动物(尤其是灵长类)细胞中起作用的其它组合。本领域普通技术人员了解适用于本发明的构建表达载体的标准技术，该技术可见于以下出版物诸如Sambrook J等人， 《分子克隆实验室手册》(第三版)(〃 Molecular cloning :a laboratory manual, “ 3rd ed.Cold Spring harbor Press, Cold Spring Harbor，N. Y. 2001)，该出版物以引用的方式并入本文，如同对其全文进行叙述。在所述方法中，通过一种或多种重编程载体，将编码一组潜能决定因子的遗传材料导入体细胞。适合的潜能决定因子可以包括但不限于0CT-4、S0X2、LIN28、NAN0G、c-Myc、 KLF4和它们的组合。各潜能决定因子可被引入体细胞中作为编码可操作地连接到异源启动子的潜能决定因子的多核苷酸转基因，所述异源启动子能驱动多核苷酸在体细胞内表达。 虽然SV40T抗原并不是潜能决定因子本身，但其被有利地引入体细胞，因为其向细胞提供足以在重编程期间促进细胞存活的条件，同时潜能决定因子被表达。表达所述因子的其它充分条件包括在实例中所述的细胞培养条件。适合的重编程载体是附加型载体，诸如质粒，所述附加型载体不会编码足以产生感染性或可复制病毒的所有或部分病毒基因组，但所述载体可以包含获自一种或多种病毒的结构元件。可将一种或多种重编程载体引入单一体细胞。可以在单一重编程载体上提供一种或多种转基因。一种强力的、构成性转录启动子可以向多种转基因提供转录控制，所述转基因可以作为表达盒来提供。载体上的独立表达盒可以受独立强力的、构成性启动子的转录控制，所述启动子可能是多个拷贝的相同启动子，也可能是不同的启动子。各种异源启动子是本领域已知的，并且可根据诸如潜能决定因子的希望表达水平之类的因素来使用。如下文所例示，可能有利的是，在靶标体细胞中使用具有不同浓度的不同启动子来控制独立表达盒的转录。对转录启动子选择的另一考虑为启动子在靶标体细胞内保持沉默的比率。熟练的技术人员将理解，有利的是，在基因产物基本完成了其在重编程方法中的作用之后，减少一种或多种转基因或转基因表达盒的表达。示例性启动子是人类EFl α延伸因子启动子、CMV巨细胞病毒即刻早期启动子和CAG鸡白蛋白启动子、以及其它种类的相应同源启动子。在人类体细胞中，EFl α和CMV是强启动子，但CMV启动子比EFl α启动子能更有效地沉默，以使得在前者控制下的转基因表达比在后者控制下的转基因表达能更快终止。潜能决定因子能够以可被改变以调整重编程效率的相对比例来在体细胞内表达。 例如，与在独立载体上提供两种因子时相比，当以1 1比例在单一载体上的单一转录物内编码0CT-4和S0X2时，体细胞重编程效率高出四倍，使得进入单一细胞的因子的摄取比例不受控制。优选地，当在单一转录物上编码多种转基因的情况下，在转录启动子远端的转基因的上游提供内部核糖体进入位点。虽然因子的相对比例可根据所导入因子而改变，但本发明所属领域的普通技术人员可以决定因子的最佳比例。熟练的技术人员将理解，通过单一载体而非通过多种载体引入所有因子对效率更有利，但当总的载体大小增加时，则变得越来越难以引入载体。熟练的技术人员还将了解， 因子在载体上的位置能影响其瞬时表达，以及所得的重编程效率。这样，申请人在多种载体组合上使用了各种因子组合。若干此类组合在此表明支持重编程。在引入重编程载体之后并当体细胞正在被重编程时，载体能存留在靶细胞内，而引入的转基因则被转录和翻译。在已重编程为多潜能状态的细胞内，可以有利地下调或终止转基因表达。重编程载体可以残留于染色体外。载体可以极低效率整合到细胞的基因组中。重编程载体与受体细胞的基因组协同地复制，因而，可适度地稳定约两周，这比不能复制其DNA的附加型载体稳定时间更长。然而，因为载体在细胞分裂时未等分，在缺乏选择性压力时，细胞丢失附加型载体，所以技术人员可以容易地用该方法回收无载体的多潜能细胞。例如，oriP/ΕΒΝΑ-Ι-基附加型质粒通常要用两到三周以稳定维持于体细胞内。在最初两到三周内，细胞快速丢失附加型质粒。一旦细胞稳定，则细胞以每代5%的速度继续丢失附加型载体。该方法中产生的多潜能细胞可以在任何支持多潜能细胞生长的培养基中培养， 包括但不限于确定成分培养基，诸如TeSR (StemCell Technologies, Inc. ；Vancouver, Canada)、mTeSR (StemCell Technologies, Inc.)禾口 StemLine 无血i青培养基(Sigma ； St. Louis,Mo.)；或条件培养基，诸如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基。如本文所用， “确定成分培养基”是指仅含生化明确组分的生化明确的制剂，可以包括已知化学组成的组分或来源于已知来源的组分。如本文所用，“条件培养基”是指还补充有来自培养基中培养细胞的可溶性因子的生长培养基。或者，细胞可维持于培养基中的MEF上。在考虑以下非限制性实例之后，将更完全地理解本发明。实例1表达盒的设计和构建使用传统方法，通过直接聚合酶链式反应(PCR)扩增来自转基因中的一些或所有的可读框(ORF)(使用编码区的最初和最后20-22个碱基作为引物)，以及PCR扩增来自表 1中所列内部核糖体进入位点的0RF，产生了适合的表达盒结构。SV40T抗原和人类端粒酶逆转录酶、质粒pBABE-puro SV40LT和pBABE-hygro-hTERT的来源是分别以质粒13970 和 1773 商购自 Addgene，Inc (Cambridge, ΜΑ)。IRESl 禾Π IRES2 的来源、质粒 pIRESpuro3 和 PIRES2EGFP 的来源是商购自 Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View，CA)。以化学方式合成了口蹄疫病毒片段2。使用下文在表1中所述密码描述了框内表达盒。例如，‘‘E-02S〃是指一种具有位于0CT4和S0X2编码区上游且其间有IRES2的EFlα启动子的表达盒。同样地，“C-MI〃是指一种具有位于c-Myc和Klf4编码区上游且其间有 IRES2的CMV启动子的表达盒。在若干构建体内，没有一种用于后续的重编程，而使用了变体02S表达盒(〃 02S⑵")，该02S (2)不同于02S，因为其包含TK启动子-Hyg-TK聚腺苷酸盒(比较图5A与图5B)。通过经验确定各种因子的表达水平，选择具有该所指示结构的盒以便随后用于重编程方法。表示为EF2的启动子(SEQ ID NO 12)是已知EFl α启动子 (SEQ ID NO=Il)的轻微变体，EF2在活性上不同于EFla，并且未在后续的附加型载体重编程试验(如下)中使用。F2A是促进共翻译表达自单一转录物的不同编码区的肽接头。测试了 F2A，但并未将其用于后续的使用附加型载体的重编程试验中。测试了 IRES1，但并未将其用于后续的使用附加型载体的重编程试验中。通过分别将各种转基因表达盒克隆到PSin4(基于改性慢病毒的载体)中来评估各种启动子、IRES测序和转基因排列对上游和下游ORF的表达的相对作用，从而测试其在转染之后重编程人类体细胞的能力，如前文所述(Yu等人，上文)。使用Superfect (Qiagen, Valencia, CA)，使细胞转染了表达由IRESl或IRES2连接的0CT4和S0X2的慢病毒质粒载体，如下文所述。转染后两天收集细胞。图IA示出293FT细胞中0CT-4和S0X2的 Western印迹分析。泳道1，
PSin4-EF2-0ct4-IRESl-Sox2 ；泳道 2，pSIN4-EF2-0CT4-IRES2-S0X2 ；泳道 3，pSIN4-EF2-0CT4-F2A-S0X2 ；泳道 4，pSIN4-EF2-0CT4-IRESl-PUR0 ；泳道 5，pSIN4-EF2-S0X2-IRESl-PUR0 ；泳道6，无质粒(对照)。将小鼠抗人0CT4单克隆抗体(1 ； 500, Santa Cruz Biotechnology, Inc.，Santa Cruz, CA, sc-5279)禾口山羊抗人 S0X2 多克隆抗体(1 500，R&D Systems,Minneapolis,MN AF2018)分别用于检测 0CT4 和 S0X2的相对表达。图IB示出使用连接的潜能决定因子使来源于0CT4敲入人ES细胞的 0. 2X IO6间充质细胞重编程(美国专利申请No. 2006/0128018和Zwaka和Thomson, 《自然生物技术》(Nature Biotechnology) 21 =319-321 (2003),各自以引用的方式并入本文，如同对其全文进行叙述)。这种细胞系在新霉素筛选下得以维持(遗传霉素=IOOygAil, hvitrogen Corp.)。转导16天后计数人类iPS细胞集落。这些基因组合是 pSIN4-EF2-0CT4-IRESl-S0X2(0lQ ；pSIN4-EF2-0CT4-IRES2_S0X2(02S)； PSIN4-EF2-0CT4-F2A-S0X2(0F2AS)；pSIN4-EF2-NAN0G-IRESl-LIN28(NlL)；pSIN4-EF2-NAN0G-IRES2-LIN28(N2L)；pSIN4-EF2-0CT4-IRES 1-PUR0 (0) ；pSIN4-EF2-S0X2-IRES 1-PUR0 (S)； PSIN4-EF2-NAN0G-IRES1-PUR0(N)；pSIN4-EF2-LIN28-IRESl-PUR0 (L)。用于各慢病毒质粒载体的缩写在载体名称之后的括号中示出。实例2使用慢病毒构建体重编程人类新生儿包皮成纤维细胞通过将慢病毒载体引入到人类初生儿包皮成纤维细胞中来进行初步重编程实验。图2A示出当还引入了 0CT4、S0X2、LI拟8和c_MYC时NANOG对重编程效率具有重要积极作用，以及结合0CT4、S0X2和LIN28，NANOG可以支持重编程，即便缺少c_MYC或 KLF4。所用的慢病毒构建体是 pSIN4-EF2-0CT4-IRES2-S0X2 (02S) ；pSIN4-EF2-NAN0G-IR ES2-LIN28(N2L) ；pSIN4-EF2-LIN28-IRESl_PUR0(L) ；pSIN4-CMV-c-Myc-IRESl-PUR0(M)； PSIN4-EF2-KLF4-IRES1-PUR0 (K)。转导后21天，计数碱性磷酸酶阳性的人类iPS细胞集落。 iPS细胞集落的数量来源于输入的2. 5 X IO4个人类新生儿包皮成纤维细胞(第9代)。浅灰色条表示形成的具有典型人ES细胞形态的重编程集落的总数；深灰色条表示具有最低分化的大集落的数量。图2B显示了使用连接的潜能决定因子的重编程。所用的慢病毒构建体是PSIN4-EF2-c-Myc-IRES2-KLF4(EF2-M2K) ；pSIN4-CMV-c-Myc-IRES2-KLF4(CMV-M2K) ；pSIN4_EF2_K LF4-IRES2-c-Myc(EF2-K2M) ；pSIN4-CMV-KLF4-IRES2-c-Myc(CMV-K2M) ；pSIN4-CMV-c-Myc-IRES2-LIN28 (M2L) ；pSIN4-EF2-NAN0G-IRES2-KLF4 (N2K)。转导后 14 天，计数碱性磷酸酶阳性的人类iPS细胞集落。iPS细胞集落的数量来源于输入的大约7. OXlO4个人类新生儿包皮成纤维细胞(第12代)。星号表示大部分碱性磷酸酶阳性的集落出现形态松散。图2C示出SV40大T抗原基因表达对重编程效率的作用。SV40大T抗原鼠类成纤维细胞被c-Myc诱导(Hermeking等人，PNAS91 :10412-10416(1994))并且增强重编程效率 (Hanna 等人，《细胞》(Cell) 133 :250-264(2008) ；Mali 等人，《干细胞》(Stem Cells) doi 10. 1634/stemcells. 2008-0346 Q008))。基因组合的缩写与图2B中相同，但增加了 SV40大 T抗原⑴。c-Myc还促进细胞增殖。转导后12天，计数碱性磷酸酶阳性的人类iPS细胞集落。iPS细胞集落的数量来源于输入的大约3. 5 X IO4个人类新生儿包皮成纤维细胞(第 17代)。图2C证实如果以基于慢病毒的重编程期间达到的水平存在，则T抗原会抑制iPS 细胞衍生的最后阶段。相反，参见下文，其中当T抗原以在使用附加型载体的重编程期间达到的瞬时表达时间和/或水平存在时，则其不具有这种作用。另外，T抗原防止c-Myc诱导的编程性细胞死亡，但不会不利地影响c-Myc诱导的细胞增殖。实例3使用非病毒附加型构建体重编程人类新生儿包皮成纤维细胞将人类新生儿包皮成纤维细胞(目录号CRL-2097 ，ATCC)维持于包皮成纤维细胞培养基内(DMEM(目录号11965，hvitrogen)，该培养基补充有10%热灭活的胎牛血清 (FBS, HyClone Laboratories, Logan, UT)、2mM Glutamax、0· ImM 非必需氛基酸禾口 0. ImM β-巯基乙醇)。使用附加型构建体pCEP4-EGFP (如图3Α所示)，将作为如实例1中和如下表3中详述那样构建的转基因表达盒来提供的潜能决定因子的各种组合引入体细胞，从而产生具有不同效率的重编程。通过在pCEP4BamHI位点与NheI位点之间插入EGFP编码区，由市售的哺乳动物附加型表达载体pCEP4anvitrogen Corp. ,Carlsbad,CA)产生pCEP4_EGFP。通过将指定表达盒插入到PCEP4-EGFP中或插入到缺少P·的相关骨架(指定的ρΕΡ4)中来产生表2的附加型载体。参见图3Α和表2中表达盒插入的克隆位点的脚注。将载体引入到成纤维细胞中是通过单一核转染活动，使用人类真皮成纤维细胞细胞核转染试剂盒(Human Dermal Fibroblasts Nucleofector Kit)(普通人类真皮成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts)，Amaxa，Inc.目录号 VPD-1001)，并且根据制造商说明书来进行的。在核转染之后，将转染的成纤维细胞(每次约0.8到1.0X106 个细胞)即刻接种到已接种了辐照小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的IOcm培养皿上。包皮成纤维细胞培养基每隔一天更换。四天之后，将包皮成纤维细胞培养基更换为人ES细胞培养基(DMEM/F12培养基，补充有20%敲除血清替代物、0. ImM非必需氨基酸(均来自 Invitrogen Corp. )、ImM Glutamax、0. ImM β-巯基乙醇和 100ng/ml 斑马鱼碱性成纤维细胞生长因子(zbFGF)，如前文所述(Amit等人，《发育生物学》(Developmental Biology) 227 271-278(2006) ；Ludwig等人，《自然方法》(Nature Methods) 3 :637-646 Q006)，其中每个均以引用的方式并入本文，如同对其全文进行叙述)。当接种的MEF不能再维持重编程培养物时，即接种后约8到10天，使用经辐照的MEF调节的人ES细胞培养基替换。在恰当时(转染后2-3周)，将培养物染色为碱性磷酸酶以指示人类iPS集落发育。为决定引入转基因构建体的适合参数，在评估了 EGFP从pEGFP_N2(对照)和 PCEP4-EGFP附加型载体到细胞中的引入之后，通过测量随时间的EGFP水平来最初地评估瞬时表达(图3B)。还在初级实验中评估了引入的转基因构建体量对人类新生儿包皮成纤维细胞存活的作用。图3C示出所用pCEP4-EGFP附加型载体量对核转染效率和人类新生儿包皮成纤维细胞存活的作用，这是通过核转染后当天的细胞汇合来评估的。将大约IXlO6核转染包皮成纤维细胞接种到6孔板的每个孔中。灰色线表示未转染的对照成纤维细胞；黑色线表示转染的成纤维细胞。图4A示出表3的包含各种表达盒的示意性转基因表达构建体，当所述表达盒以某些组合引入到人类新生儿包皮成纤维细胞中时，导致成纤维细胞重编程为多潜能细胞。 引入的附加型重编程载体的三种组合已产出了重编程多潜能细胞(l)pEP4-E-02S-E-T2K, PEP4-E-02S-E-N2K 和 pCEP4_C_M2L ； (2)pEP4-E-02S-C-K2M-E_N2L 和 pEP4-E-02S-E_T2K ； 以及(3)pEP4-E-02S-E-N2L、pEP4-E-02S-E-T2K 和 pEP4_E-02S-E_M2K。表 3 示出用于每种成功组合的各载体量。每种成功重编程组合中的一种载体在EFl α启动子的控制下编码T 抗原。图4Β示出具有在附加型载体转染后18天观察到的形态变化的典型集落的明视野显微镜图像。图4C示出附加型载体后转染18天碱性磷酸酶阳性的集落的明视野显微镜图像。在转染后25到30天，由于存在形态类似于人类iPS细胞集落的许多非iPS细胞集落，所以将重编程培养物传代一次到新鲜IOcm MEF培养皿(1 3比例)。随后挑选集落进一步分析。图4D示出在转染重编程培养物后观天的第一次传代之后人类iPS细胞集落的明视野显微镜图像。标尺表示0.1mm。将重编程细胞维持在具有条件培养基的基质胶 (Matrigel) (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ)上的无饲细胞培养物中进行后续分析，如前文所述(Xu等人，《自然生物技术》(Nat. Biotechnol.) 19 :971 (2001)，其以引用的方式并入本文，如同对其全文进行叙述)。有利的是，用比使用四种基因组合所用重编程时间显著更少的重编程时间，实现了新生儿包皮成纤维细胞的大于的重编程效率。应理解，本公开中所描述的本发明的某些改进是本领域技术人员的常规优化实践，并且可以在不脱离本发明精神或所附权利要求书范围的情况下加以实施。以上说明书中提及的所有出版物和专利以引用方式并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变型将对本领域技术人员而言是明显的。然而， 应理解，上文所述的本发明的实例和实施例是说明性的，而并非旨在限制本发明。本发明涵盖与下述权利要求书的范围相符的实例和实施例的所有修改形式。
权利要求
1.一种重编程灵长类体细胞的方法，所述方法包括以下步骤在足以重编程所述细胞的条件下将所述灵长类体细胞暴露于多种潜能决定因子；和培养所述暴露细胞来获得具有比所述灵长类体细胞更高的潜能水平的重编程细胞，所述重编程细胞基本不含与将所述潜能决定因子暴露于所述体细胞有关的任何成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述灵长类体细胞是从胎儿或出生后个体中获得的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述灵长类是人类。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述重编程细胞在遗传上与胎儿或出生后个体相同。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述暴露步骤包括引入至少一种将一种或多种潜能决定因子编码到所述灵长类体细胞中的载体的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述载体是非病毒附加型载体。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种潜能决定因子包括人类0CT-4、人类S0X2、人类LIN28、人类NAN0G、人类c_Myc和人类KLF4，其中当所述载体包含c_Myc时， 所述方法进一步包括将所述灵长类体细胞暴露于SV40T抗原的步骤。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种载体是单一载体。
9.根据权利要求所述的方法，其中所述单一载体包含至少一个内部核糖体进入位点。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述单一载体依次包含第一启动子、0CT4、 IRES2、S0X2、第二启动子、SV40T 抗原、IRES2 和 KLF4。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述载体依次包含第一启动子、0CT4、IRES2、 S0X2、第二启动子、c-Myc、IRES2、KLF4、第三启动子、NANOG、IRES2 和 L拟8。
12.根据权利要求5所述的方法，其中第一载体依次包含第一启动子、0CT4、IRES2、 S0X2、第二启动子、SV40 T抗原、IRES2和KLF4，其中第二载体依次包含第三启动子、0CT4、 IRES2、S0X2、第四启动子、NANOG, IRES2和KLF4，并且其中第三载体依次包含第五启动子、 c-Myc、IRES2和L拟8，其中所述启动子不必相同。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一、第二、第三和第四启动子中的每一个均是延伸因子1 α (EFl α )基因启动子。
14.根据权利要求5所述的方法，其中第一载体依次包含第一启动子、0CT4、IRES2、 S0X2、第二启动子、KLF4、IRES2、c_Myc、第三启动子、NANOG, IRES2和L拟8。其中第二载体依次包含第四启动子、0CT4、IRES2、S0X2、第五启动子、SV40 T抗原、IRES2和KLF4，其中所述启动子不必相同。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一、第三、第四和第五启动子中的每一个均是EFl α基因启动子，并且其中所述第二启动子是巨细胞病毒即刻早期基因(CMV)启动子。
16.根据权利要求5所述的方法，其中第一载体依次包含第一启动子、0CT4、IRES2、 S0X2、第二启动子、NAN0G、IRES2和L拟8，其中第二载体依次包含第三启动子、0CT4、IRES2、 S0X2、第四启动子、SV40 T抗原、IRES2和KLF4，并且其中第三载体依次包含第五启动子、 0CT4、IRES2、S0X2、第六启动子、c-Myc, IRES2和KLF4，其中所述启动子不必相同。
17.一种富集的灵长类多潜能细胞群体，其根据包括以下步骤的方法来产生在足以表达所述潜能决定因子的条件下将灵长类体细胞暴露于多种潜能决定因子，从而重编程所述体细胞来产生所述灵长类多潜能细胞；所述细胞基本不含与将所述潜能决定因子暴露于所述体细胞有关的任何成分。
18.根据权利要求17所述的群体，其中所述灵长类体细胞是从胎儿或出生后个体中获得的。
19.根据权利要求17所述的群体，其中所述灵长类是人类。
20.根据权利要求17所述的群体，其中所述多潜能细胞在遗传上与出生后个体基本相同。
21.根据权利要求17所述的群体，其中所述暴露步骤包括以下步骤引入至少一种将一种或多种潜能决定因子编码到所述灵长类体细胞中的载体。
22.根据权利要求21所述的群体，其中所述载体是非病毒附加型载体。
23.根据权利要求21所述的群体，其中所述一种或多种潜能决定因子包括人类0CT-4、 人类S0X2、人类LIN28、人类NAN0G、人类c_Myc和人类KLF4，其中当所述载体包含c_Myc时， 所述方法进一步包括将所述灵长类体细胞暴露于SV40T抗原的步骤。
24.灵长类诱导的多潜能细胞，其基本不含与多潜能性的诱导有关的任何成分。
全文摘要
本发明公开了使用不编码感染性病毒的附加型载体来重编程灵长类体细胞以具有多潜能性的方法。本发明还公开了在所述方法中产生的多潜能细胞。
文档编号C12N5/074GK102239249SQ200980148013
公开日2011年11月9日 申请日期2009年10月23日 优先权日2008年10月24日
发明者J·托马森, 俞君英 申请人:威斯康星校友研究基金会