用于在细胞中诱导多能性的方法

专利名称：用于在细胞中诱导多能性的方法
技术领域：
本申请涉及在细胞中诱导多能性的领域。
背景技术：
在小鼠和人类中已经证明的是可以通过转录因子的异位表达(Lowry et al., 2008 ；Maherali et al. ,2007 ；Nakagawa et al. ,2008 ；Okita et al. ,2007 ；Park et al.， 2008 ；Takahashi et al. ,2006 ；Takahashi and Yamanaka,2006 ；Wernig et al. ,2007 ；Yu et al. ,2006)来将体细胞重新编程从而变成多能性。诱导多能干细胞(iPQ的产生对于实现真正的个人化再生药物(Yamanaka，2007 Jaenish and Young, 2008)带来了很大的希望，因为可以使用从患者自己皮肤细胞衍生的干细胞来产生细胞以及组织从而修复由疾病或老化引起的损害。已经显示转录因子0ct4、Sox2、Klf4以及c-Myc或0ct4、Sox2、Nanog 以及LiM8的组合的强制表达引起成熟细胞恢复到多能性状态。
在早期研究中，使用多种病毒载体来表达这些转录因子(Takahashi以及 Yamanaka, 2006 ；Okita 等人，2007 ；Maherali 等人，2007 ；Wernig 等人，2007 ；Takahashi 等人，2006 ；Yu等人，2006 ；Park等人，2008)。由于多个整合事件，多载体的使用存在问题，其能够导致致瘤性风险增加(Takahashi以及Yamanaka，2006 ；Aoi等人，2008))。研究人员已经试图通过使用单载体系统(Sommer等人，2009)、可切除载体(Kaji等人，2009 ；SoIdner 等人，2009 ；Woltjen等人，2009)、非整合型载体(Stadtfeld等人，2009 ；Yu等人，2009)以及瞬时转染(Okita等人，2009)来克服这个问题。然而，在实现外遗传性重新编程方面这些方法是极其无效的。
用于诱导多能性的方法包括转染癌基因c-Myc，因为它引起癌的潜力，该基因是不合要求的。在不转染c-Myc下可以产生iPS细胞(Nakagawa等人，2008 Jernig等人，2008)。 然而，重新编程的效率被显著地降低了。类似地，Klf4可以诱导发育异常Ouster等人， 2005)。
因为与多病毒载体整合以及诱导多能性的这些基因中的一些的不希望的副作用相关的这些问题，对于用能够调节多能性诱导基因的表达或其表达被多能性诱导基因所调节的蛋白基因产物以及蛋白或者能够调节诱导多能性的基因或蛋白的表达的小分子来替换多能性诱导基因的一些或全部的使用存在一种需要。对于这个目标，已经报道的是引入基因产物而不是基因也诱导了多能性(aiou等人，2009)。用聚精氨酸标记以易于进入细胞的重组体0ct4、Sox2、Klf4以及c-Myc重新编程了小鼠体细胞。其他人已经使用了小分子来替换对于核心集合的基因之一的需要。上调Nanog的小分子消除了对Klf4基因(该基因也上调Nanog)的需要(Lyssiotis等人，2009)。在另一项研究中，小分子HDAC抑制剂消除了对于Klf4和c-Myc两者的需要(Huangfu等人，2008，a&b)。这些研究显示1)蛋白基因产物可以替代对这些基因的需要；2)上调基因的小分子可以替代对这些基因的需要；以及3)在同一个调节通路中的基因(或基因产物)可以彼此替代。
尽管取得了这些成就，但是仍存在的主要问题是这些方法是重新编程低效率的。 目前在体细胞中诱导多能性的比率太低以至于它们使得iPS细胞的治疗用途变得不切实际。因此，所需要的是鉴别多种蛋白以及小分子，它们或者单独地亦或除了已经被鉴别的那些之外，诱导多能性或提高细胞中诱导多能性的效率。

发明内容
一方面，本发明是针对在细胞中诱导或维持多能性的一种方法，该方法包括将该细胞与增加MUCf活性的一种生物物质亦或化学物质相接触。该生物物质可以是一种基因或一种蛋白。该蛋白可以优选地是一种MUC1*配体，优选地该配体是匪23。该蛋白还可以是一种抗体，优选地是特异性识别MUCf的PSMGFR序列的二价抗体。另一方面，该化学物质可以是一种小分子。优选地，该小分子可以增强MUC1、它的裂解酶、或匪23的转录。优选地，该裂解酶可以是MMP-16、MMP-14或ADAM-17。进一步地，该小分子可以增强对MUCl的切割。该小分子可以是一种佛波酯。
另一方面，上述基因可以编码MUCl或MUC1*、或其有效片段、或MUC1*的配体，例如但不限于MUC1*抗体或匪23。优选地，该片段可以是MUCl或MUC1*的胞质尾区。
在进一步的其他方面中，本发明的目的在于将细胞与提高诱导多能性的基因产物的表达的另外的分子相接触，例如但不限于提高0CT4、S0X2、NANOG、KLF4或LIN28，优选地 0CT4以及S0X2的表达的分子。
从本发明的以下说明、所附的附图以及所附的权利要求书可以更加充分地理解本发明的这些或其他目标。


从下面在此给出的详细说明以及附图可以更加充分地理解本发明，这些附图是仅通过说明的方式给出的，并且因此对于本发明不是限制性的，并且其中 图1A-1F显示了 MUCf提高生长速率。A.克隆形成测定显示用MUC1*转染大鼠成纤维细胞(3Y1)提高了生长速率但是MUCl (全长)未提高生长速率；B. MUCf活性提高了存活率。已经获得对TAXOL 耐受性的乳癌细胞通过提高MUCf表达来做到这一点。用抗-MUCfFab处理将获得的耐受性反转为TAXOL -诱导的细胞死亡；C. MUCf细胞外域的配体诱导的二聚作用刺激了生长。加入二价抗-MUCf抗体刺激了 MUCf-阳性细胞的生长。用抗-MUCf (mv)Fab进行阻断抑制了细胞生长。钟形生长曲线是受体二聚的特征。对照 MUCl-阴性HEK 293细胞的生长没有受到影响；D.使用特异性siRNA来抑制MUC1*消除了加入MUC1* 二聚化配体造成的生长刺激作用；E.匪23是天然的MUC1*激活配体。匪23刺激了 MUCl*-阳性癌细胞的生长并且产生了表明受体二聚的钟形曲线。通过siRNA抑制MUCl来消除影响；F.通过SI3R检测到匪23直接结合到MUC1*肽上。15nM匪23结合到MUC1*胞外域肽上但没有结合到不相关的肽上。使用SPR(表面等离振子共振)以及包被了 NTA-Ni-SAM 的Au芯片来进行测量。
图2A-2F显示了在未分化的hESC上MUCl被切割，但是在已分化的hESC上MUCl 没有被切割。免疫细胞化学显示未分化的(多能性的)干细胞表达MUCr并且不表达全长蛋白；0CT4是多能性的金标准标志物。所有多能性干细胞是MUCf-阳性的。然而，分化一开始(失去0CT4表达)，切割就停止并且仅检测到全长MUCl (MUCl-FL)。图A-C是同一个未分化的干细胞克隆的照片，这些克隆用以下各项来染色A.识别PSMGFR肽的抗-MUCf抗体；B.抗-0CT4 ；C.抗-MUCl全长VU4H5。图D-F是同一个新分化的干细胞克隆的照片，这些克隆用以下各项来染色D.识别PSMGFR肽的抗-MUCf抗体；E.抗-0CT4 ；F.抗-MUCl全长 VU4H5。
图3A-3F显示了 NM23 (MUC1*配体)与MUC1*和0CT4共定位在未分化的hESC上并且不共定位在已分化的细胞上。免疫细胞化学显示未分化的(多能性的)干细胞表达MUCf 以及它的激活配体匪23。然而，当干细胞开始分化时(失去0CT4表达)，则順以以全长蛋白的形式进行表达并且不再分泌匪23。虚线指示未分化的部分与新分化的部分之间的边界。图A-C是同一个未分化的干细胞克隆的照片，这些克隆用以下各项来染色A.识别匪23 的抗体；B.识别PSMGFR肽的抗-MUCf抗体；C. (A)、⑶以及用DAPI来染色从而将细胞核染色的相同细胞的叠加。图D-F是同一个未分化的干细胞克隆的照片，这些克隆用以下各项来染色D.识别匪23的抗体；E.识别0CT4的抗体；F.⑶、(E)以及用DAPI来染色从而将细胞核染色的相同细胞的叠加。
图4A-4B显示在缺少bFGF以及条件培养基下，MUC1*的刺激促进了生长并且抑制了 hESC的分化。使用二价抗-MUCf抗体，在不加入bFGF或条件培养基的基本培养基中生长五周之后，配体诱导的MUCf胞外域的二聚作用产生基本上100%的多能性克隆。将这些克隆生长在基质胶上。当使用匪23或匪23 S120G突变体来激活MUC1*时，得到相同的结果。图A-D(panels A-D)是多个孔的照片，在这些孔中细胞生长培养基添加有来自成纤维细胞喂养细胞的条件培养基加上抗-MUCf或bFGF。图E-H(panels E-H)是多个孔的照片， 在这些孔中干细胞被培养于基本培养基加上抗-MUCf或bFGF中。这些图像是用以下各项染色的细胞A.识别0CT4的抗体；B. (A)的细胞的DAPI染色；C.抗-MUC1* ；D. (C)的细胞的DAPI染色；E.识别0CT4的抗体；F. (E)的细胞的DAPI染色；G.抗-MUCf ；H. (G)的细胞的DAPI染色。
图5显示一个柱形图，该图表明对于多能干细胞生长需要MUCf活性。用抗-MUCfFab阻断MUCf在8_12小时内引起全部干细胞死亡(甚至在bFGF和条件培养基 (CM)存在下)。二价的抗-MUCf刺激了生长。将细胞培养25小时，在钙黄绿素荧光测定中对活细胞进行测量。
图6A-6B显示了证明MUC1*转移到细胞的细胞核中的照片。将MUCfFab进行荧光标记(红色)然后与MUCf-阳性细胞进行孵育。这些照片显示最初MUC1*被均勻分布在细胞表面上。然而，在40分钟之后，MUCf被集中在细胞核中。为了比较，还用识别EEAl的荧光标记抗体(绿色)将这些细胞染色，贯穿整个实验EEAl保持均勻分布于细胞质中。A.在零时刻拍摄的细胞的照片；B.在加入抗-MUCf的Fab之后40分钟拍摄的细胞的照片。
具体实施例方式在本申请中，使用“一”和“一个”是指单数以及复数的对象。
如本文中使用的，“提高MUCf活性”是指直接地或间接地调高MUCf信号，并且包括而不限于MUC1*受体的二聚作用以及通过切割MUCl受体来提高MUC1*的生产。还可以通过MUCl受体的更高的转录表达(该MUCl受体被进一步切割并且二聚)来提高MUCf活性。 因此，一方面，可以通过二聚MUC1*的效应分子的更高活性，或切割MUCl从而形成MUC1*的裂解分子的更高的活性，或MUCl的提高的表达来提高MUCf活性。因此，能够提高MUCf 二聚配体的活性的任何化学的或生物物质、用来形成MUCf的MUCl裂解酶、或增强MUCl表达的任何转录激活因子都被包括为“提高MUCf活性”的物质。
如本文中使用的，“MUC1生长因子受体”(MGFR)是一个功能性定义是指与激活的配体(例如一种生长因子或一种修饰酶(例如一种裂解酶))相互作用的MUCl受体的部分。 MUCl的MGFR区是最接近于细胞表面的胞外部分，并且由PSMGFR的大多数或全部来定义，定义如下。MGFR包括未修饰的肽和已经经历酶修饰(像，例如，磷酸化、糖基化等)的肽。
如在本文中使用的，"MUC1生长因子受体的一级序列”(PSMGFR)是指在一些情况下定义了 MGFR的大多数或全部的肽序列，以及该肽序列的功能性变异体和片段。该PSMGFR 被定义为SEQ ID NO :6，以及它的所有功能性变异体以及片段，其中它的所有功能性变异体以及片段在它们的N端和/或C端具有最高到20个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、或20)的任何整数值的氨基酸取代和/或最高到20个的任何整数值的氨基酸添加或缺失。在上述背景中“功能性变异体或片段”是指这样的变异体或片段， 它具有特异性结合到配体上、或另外地特异性与配体相互作用的能力，这些配体特异性结合到SEQ ID NO :6的肽上，或另外地特异性与其相互作用，同时不强烈地结合到与它们自己一致的其他肽分子的一致的区域上，这样使得这些肽分子将具有与其他一致的肽分子聚集的能力(即自聚集)。PSMGFR的一个实例(它是SEQ NO 6的PSMGFR肽的一种功能性变异体)是SEQ ID NO 8,它与SEQ ID NO 6不同在于包括一个-SPY-序列而不是-SRY-。
如在本文中所使用的，“MUC1*”是指N端被截短的MUCl蛋白，这样使得胞外域基本上由 PSMGFR(SEQ ID NO 5)构成。
如在本文中使用的，“MUC1*相关因子”是指改变、激活、调节MUC1*的活性或调节 MUCf的表达的试剂。相关因子包括但不限于影响MUCf受体二聚的、提高MUCf的产量的、 诱导切割MUCl受体的试剂，通过更高地转录表达MUCl受体来提高MUC1*活性的试剂，该 MUCl受体被进一步切割并且二聚。
如在本文所使用的，“有效量”是足以产生有益的或所希望的临床结果或生物化学结果的量。可以将有效量施用一次或多次。为了本发明的目的，一种抑制剂化合物的有效量是足以诱导或维持细胞的多能性或激活MUCf的量。
如在此所使用的，“片段”或“功能性衍生物”是指本发明的天然配体或受体的生物活性的氨基酸序列变异体以及片段，以及共价修饰，包括通过与有机衍生试剂进行反应得到的衍生物，翻译后修饰、具有非蛋白质的聚合物的衍生物、以及免疫粘附。
如在本文所使用的，“配体”是指任何分子或试剂，或特异性共价地或暂时地结合到一种分子(例如一种多肽)上的化合物。当用于某一背景中时，配体可以包括抗体。在其他背景中，“配体”可以指试图用来被具有高亲和性的另一种分子结合的分子，例如但不限于用于MUCf的天然的或非天然的配体或结合到MUCl或MUC1*上的裂解酶或用于MUC1* 的二聚配体。
如在本文使用的，术语“特异性结合”是指两个分子之间的一种非随机结合反应， 例如在以下各项之间抗体分子与抗原进行免疫反应、或非抗体配体与另一种多肽(例如匪23与MUCf特异性结合)进行反应、或抗体结合到MUC1*上或裂解酶结合到MUCl或MUC1* 上。
如在此使用的，“载体”、“多核苷酸载体”、“构建体”以及“多核苷酸构建体”在此可互换地使用。本发明的多核苷酸载体可以是处于几种形式中的任何一种，包括但不限于 RNA、DNA、封装在逆转录病毒外壳内的RNA、封装在腺病毒外壳内的DNA、包装成另一种病毒的或病毒样的形式的DNA(例如，单纯性疱疹、以及腺病毒相关病毒(AAV))、封装在脂质体中的DNA、与聚赖氨酸络合的DNA、与合成的聚阳离子分子络合的DNA、与多种化合物(例如用来免疫地“遮蔽”分子和/或增加半衰期的聚乙二醇(PEG))络合的DNA或结合到非病毒性蛋白上的DNA。如在本文使用的，“DNA”不但包括碱基A、T、C、以及G，而且包括它们的类似物或这些碱基的修饰形式中任何一种，例如甲基化的核苷酸类、核苷酸之间的修饰(例如不带电连接以及硫代酯)、使用糖类似物、以及修改的和/或可替代的主链结构(例如聚酰胺)。
序列表独立文本 关于使用除了 a、g、c、t之外的核苷酸符号，它们遵循WIPO标准ST. 25中列出的约定(表1附件幻，其中k代表t或g ；η代表a、c、t或g ;m代表a或c ；r代表a或g ；s代表c或g ;w代表a或t,而y代表c或t。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSV LSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATffGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTS APDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTS ASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHS SVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQI YKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVS VSDVPFPFSAQSGAGVPGffGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPAR DTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAA ASANL(SEQ ID NO 1)描述了全长MUCl受体(粘蛋白1前体，Genbank登录号 P15941) MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQ ID NO 2) MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA (SEQ ID NO :3) MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG (SEQ ID NO :4) SEQ ID NO :2、3和4描述了用于将MUCl受体以及截短的同种型引导到细胞膜表面上的N末端MUC-I信号序列。如通过SEQ ID NOS :2、3以及4的变异体所指示的，可以在 C末端缺少达3个氨基酸。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPG WGIALLVLVCVLVALAIVY LIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYP TYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASA NL (SEQ ID NO :5)描述了一种截短的MUCl受体同种型(isoform)，该同种型在它的N末端具有nat-PSMGFR并且包括全长MUCl受体的跨膜序列以及细胞质的序列。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO 6)描述了 MUCl 生长因子受体的天然一级序列(nat-PSMGFR- “PSMGFR”的一个实例) TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO :7)描述了 MUCl 生长因子受体的天然一级序列(nat-PSMGFR- “PSMGFR”的一个实例)，在SEQ ID NO 6的N 端具有一个单氨基酸缺失。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO 8)描述了具有增强的稳定性的MUCl生长因子受体的天然一级序列的“SPY”功能性变异体 (var-PSMGFR- “PSMGFR” 的一个实例)。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO 9)描述了具有增强的稳定性的MUCl生长因子受体的天然一级序列的“SPY”功能性变异体 (var-PSMGFR- “PSMGFR”的一个实例)，在SEQ ID NO 8的N端具有一个单氨基酸缺失。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatg agcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaa g gtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg (SEQ ID NO 10)描述了 MUCl细胞质区核苷酸序列。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKV SAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO 11)描述了 MUCl 细胞质区氨基酸序列。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgctt cac ttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcg caccttt ttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttt tctcgacaa ctggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgc tagcccta attaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactat d.d.CCd.d.d.0 tcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagacccttt ttcaatgagc tgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtg aatggaaaagact gctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctt tggaacagatg gcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttt tttccttcaagtg gaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaa ggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttctt gatgtactttatgtatagaa aataa (SEQ ID NO 12)描述了 NME7 核苷酸序列(NME7 :GENBANK 登录号 AB209049)。
DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYP⑶GSVEMHDVKNHRT FLKRTKYDNLHLEDLFIGN KVNVFSRQLVLIDY⑶QYTARQLGSRKEKTLAL IKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVD HQSRPFFNEL IQFITTGPIIAMEILRDDAICEffKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGI RNAAHGPDSFASA AREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGM LNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQ ID NO 13)描述了 NME7 氨基酸序列(NME7 :GENBANK 登录号 AB209049)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatac agg aaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggaga ga ttatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttct caagg aacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggta gttg ccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagac t ccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtg g agagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaac tggatctatgaatga(SEQ ID NO :14)描述了 NM23-H1 核苷酸序列(NM23-H1 :GENBANK 登录号 AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEI IKRFEQKGFRLVGLKFMQ ASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAM VffEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNI IHGSDSVESAEK ElGLffFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO: 15)描述了 NM23-H1 氨基酸序列 (NM23-H1 :GENBANK 登录号 AF487339)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatac agg aaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggaga ga ttatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttct caagg aacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggt Bgttg ccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcaga ct ccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgt gg agagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaa c tggatctatgaatga(SEQ ID NO :16)描述了 NM23-H1 S120G 突变体核苷酸序列(匪23-H1 GENBANK 登录号 AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEI IKRFEQKGFRLVGLKFMQA SEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAM VWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHG ⑶ SVESAEK ElGLffFHPEELVDYTSCAQNWIYE (SEQ ID NO: 17)描述了 NM23-H1S120G 突变体氨基酸序列(匪23-H1 :GENBANK 登录号 AF487339)。
atg tacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc agcaaacttc ggggggcggc ggcggcaact ccBccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga aaaacagccc ggaccgcgtc aagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc agcggcgcaa gatggcccag gagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc tgggcgccga gtggaaactt ttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta agcggctgcg agcgctgcac atgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcggaaaaccaagacgctcatgaagaaggataagtacacgctgcccggcgggctgCtggCCCCCggcggcaatagcatggcgagcggggtcggggtgggcgccggCCtgggCgCgggcgtgaaccagcgcatggacagttacgcgcacatgaacggctggagcaacggcagctacagcatgatgcaggaccagctgggctacccgcagcacccgggcctcaatgcgcacggcgcagcgcagatgcagcccatgcaccgctacgacgtgagcgccctgcagtacaactccatgaccagctcgcagacctacatgaacggctcgcccacctacagcatgtcctactcgcagcagggcacccctggcatggctcttggctccatgggttcggtggtcaagtccgaggccagctccagcCCCCCtgtggttacctcttcctcccactccagggcgccctgccaggccggggacctccgggacatgatcagcatgtatctCCCCggCgCCgaggtgccggaacccgccgcccccagcagacttcacatgtcccagcactaccagagcggcCCggtgCCCggcacggccattaacggcacactgcccctctcacacatgtga(SEQ ID NO18)描述了
SEQ ID No :1 人 S0X2 核苷酸序列(S0X2 :GENBANK 登录号 003106)。
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFM VWSRGQRRKMAQENPKMHN SEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALH MKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVG VGAGLGAGV NQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSAL QYNSMTSSQTYMNG SPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTS SSHSRAPCQA⑶LRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMS QHYQSGPVPGTAIN GTLPLSHM(SEQ ID NO :19)描述了人 S0X2 氨基酸序列(S0X2 :GENBANK 登录号 003106) ο atggcgggacacctggcttcagattttgccttctcgccccctccaggtggtggaggtgatgggccaggg gggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatc gggc cgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtgggg ggatggc gtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctga gggcgaagca ggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctg gtgccgtgaagctgg agaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcag aaagaactcgagcaatttgc caagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtgg ggctcaccctgggggttctattt gggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttag cttcaagaacatgtgtaagctgc ggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttc aggagatatgcaaagcagaaaccct cgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtg agaggcaacctggagaatttgttcctgcag tgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagc agettgggctcgagaaggatgtggtccgagtgt ggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagca gcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgg gtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggc cccagggccccattttggtaccccaggctatgggagc cctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctg agggggaagcctttccccctgtctctgtcaccactc tgggctctcccatgcattcaaactga(SEQ IDNO :20)描述了人 0CT4 核苷酸序列。
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGP GVGPGSEVWGIPPCPPPYE FCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGV GVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQK ELEQFAKLL KQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEAI^QLSFK匪CKLRPLLQ KWVEEADNNENLQE ICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTL QQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQR EDFEAAGSPFSGGP VSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN (SEQ ID NO 21)描述了人0CT4氨基酸序列。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggc g agatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaaca cctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggc c ggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatc cag cagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtg at tcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgct catgactgggtctatgaataa (SEQ ID NO :22)描述了 N1C3-H2 核苷酸序列(匪M-H2 :GENBANK 登录号 AK3i:3448)。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLK QHYIDLKDRPFFPGLVK YMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKP GTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELV DYKSCAHDWVYE (SEQ ID NO :23)描述了匪M-H2 氨基酸序列(匪M-H2 :GENBANK 登录号 AK313448)。
atggctgtcagcgacgcgctgetcccatctttctccacgttcgcgtctggcccggcgggaagggagaa gacactgcgtcaagcaggtgccccgaataaccgctggcgggaggagctctcccacatgaagcgacttccccc agtg cttcccgccggcccctatgacctggcggcggcgaccgtggccacagacctggagagcgccggagccg gtgcggctt gcggcggtagcaacctggcgcccctacctcggagagagaccgaggagttcaacgatctcctgg acctggactttat tctctccaattcgctgacccatcctccggagtcagtggccgccaccgtgtcctcgtcagcgtca gcctcctcttcg tcgtcgccgtcgagcagcggccctgccagcgcgccctccacctgcagcttcacctatccgatc cgggccgggaacg acccgggcgtggcgccgggcggcacgggcggaggcctcctctatggcagggagtcc gctccccctccgacggctcc cttcaacctggcggacatcaacgacgtgagcccctcgggcggcttcgtggccg agctcctgcggccagaattggac ccggtgtacattccgccgcagcagccgcagccgccaggtggcgggctga tgggcaagttcgtgctgaaggcgtcgc tgagcgcccctggcagcgagtacggcagcccgtcggtcatcagcgt cacgaaaggcagccctgacggcagccaccc ggtggtggtggcgccctacaacggcgggccgccgcgcacg tgccccaagatcaagcaggaggcggtctcttcgtgc acccacttgggcgctggaccccctctcagcaatggcc accggccggctgcacacgacttccccctggggcggcagc tccccagcaggactaccccgaccctgggtcttg aggaagtgctgagcagcagggactgtcaccctgccctgccgct tcctcccggcttccatccccacccggggcc caattacccatccttcctgcccgatcagatgcagccgcaagtcccg ccgctccattaccaagagctcatgccacc cggttcctgcatgccagaggagcccaagccaaagaggggaagacgat cgtggccccggaaaaggaccgcc acccacacttgtgattacgcgggctgcggcaaaacctacacaaagagttccca tctcaaggcacacctgcgaac ccacacaggtgagaaaccttaccactgtgactgggacggctgtggatggaaattc gcccgctcagatgaactga ccaggcactaccgtaaacacacggggcaccgcccgttccagtgccaaaaatgcgacc gagcattttccaggtc ggaccacctcgccttacacatgaagaggcatttt (SEQ ID NO :24)描述了 KLF4 核苷酸序列(KLF4 GENBANK 登录号 AF022184)。
MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVL PAGPYDLAAATVATDLESA GAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILS NSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYP IRAGNDPGV APGGTGGGLLYGRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIP PQQPQPPGGGLMGK FVLKASLSAPGSEYGSPSVISVTKGSPDGSHPVVVAPY NGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHD FPLGRQLPSRTTPT LGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMP PGSCMPEEP KPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTG EKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRP FQCQKCDRAFSRSDHLALH MKRHF (SEQ ID NO 25)描述了 KLF4 氨基酸序列(KLF4 GENBANK 登录号 AF022184)。
atggatttttttcgggtagtggaaaaccagcagcctcccgcgacgatgcccctcaacgttagcttcacca acaggaactatgacctcgactacgactcggtgcagccgtatttctactgcgacgaggaggagaacttctaccag cagcagcagcagagcgagctgcagcccccggcgcccagcgaggatatctggaagaaattcgagctgctgcc caccc cgcccctgtcccctagccgccgctccgggctctgctcgccctcctacgttgcggtcacacccttctccctt cgggg agacaacgacggcggtggcgggagcttctccacggccgaccagctggagatggtgaccgagctgct gggaggagac atggtgaaccagagtttcatctgcgacccggacgacgagaccttcatcaaaaacatcatcatcc aggactgtatgt ggagcggcttctcggccgccgccaagctcgtctcagagaagctggcctcctaccaggctgc gcgcaaagacagcgg cagcccgaaccccgcccgcggccacagcgtctgctccacctccagcttgtacctgca ggatctgagcgccgccgcc tcagagtgcatcgacccctcggtggtcttcccctaccctctcaacgacagcagct cgcccaagtcctgcgcctcgc aagactccagcgccttctctccgtcctcggattctctgctctcctcgacggagtc ctccccgcagggcagccccga gcccctggtgctccatgaggagacaccgcccaccaccagcagcgactctg aggaggaacaagaagatgaggaagaa atcgatgttgtttctgtggaaaagaggcaggctcctggcaaaaggtc agagtctggatcaccttctgctggaggcc acagcaaacctcctcacagcccactggtcctcaagaggtgccacg tctccacacatcagcacaactacgcagcgcc tccctccactcggaaggactatcctgctgccaagagggtcaag ttggacagtgtcagagtcctgagacagatcagc aacaaccgaaaatgcaccagccccaggtcctcggacaccg aggagaatgtcaagaggcgaacacacaacgtcttgg agcgccagaggaggaacgagctaaaacggagctttt ttgccctgcgtgaccagatcccggagttggaaaacaatga aaaggcccccaaggtagttatccttaaaaaagcc acagcatacatcctgtccgtccaagcagaggagcaaaagctc atttctgaagaggacttgttgcggaaacgacg agaacagttgaaacacaaacttgaacagctacggaactcttgtg eg (SEQ ID NO 26)描述了 c-Myc 核苷酸序列(c-Myc :GENBANK 登录号 BC000917)。
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQ QQQSELQPPAPSEDIWKKF ELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDN DGGGGSFSTADQLEMVTELLG⑶MVNQSFICDPDDETFIKNII IQDCMWSGF SAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECID PSVVFPYPLNDSSS PKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHE ETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESG SPSAGGHSKPPHSP LVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPR SSDTEENVK RRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKK ATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKL EQLRNSCA(SEQ ID NO :27)描述了 c_Myc 氨基酸序列(c_Myc :GENBANK 登录号 BC000917)。
atgggctccgtgtccaaccagcagtttgcaggtggctgcgccaaggcggcagaagaggcgcccgag ga ggcgccggaggacgcggcccgggcggcggacgagcctcagctgctgcacggtgcgggcatctgtaagt ggttcaac gtgcgcatggggttcggcttcctgtccatgaccgcccgcgccggggtcgcgctcgaccccccagt ggatgtctttg tgcaccagagtaagctgcacatggaagggttccggagcttgaaggagggtgaggcagtggag ttcacctttaagaa gtcagccaagggtctggaatccatccgtgtcaccggacctggtggagtattctgtattggga gtgagaggcggcca aaaggaaagagcatgcagaagcgcagatcaaaaggagacaggtgctacaactgtgga ggtctagatcatcatgcca aggaatgcaagctgccaccccagcccaagaagtgccacttctgccagagcatca gccatatggtagcctcatgtcc gctgaaggcccagcagggccctagtgcacagggaaagccaacctactttcg agaggaagaagaagaaatccacagc cctaccctgctcccggaggcacagaat (SEQ ID NO :28)描述了 LIN^ 核苷酸序列(LI^8 :GENBANK 登录号 AF521099)。
MGSVSNQQFAGGCAKAAEEAPEEAPEDAARAADEPQLLHGAGICKWFNV RMGFGFLSMTARAGVALDP PVDVFVHQSKLHMEGFRSLKEGEAVEFTFKKSA KGLESIRVTGPGGVFCIGSERRPKGKSMQKRRSKGDRCYNCGG LDHHAKECK LPPQPKKCHFCQSISHMVASCPLKAQQGPSAQGKPTYFREEEEEIHSPTLLP EAQN(SEQ ID NO: 29)描述了 LI似8氨基酸序列(LI^8 :GENBANK登录号AF521099)。
atgtctcccgccccaagaccctcccgttgtctcctgetccccctgctcacgctcggcaccgcgctcgcc t ccctcggctcggcccaaagcagcagcttcagccccgaagcctggctacagcaatatggctacctgcctcccgg g gacctacgtacccacacacagcgctcaccccagtcactctcagcggccatcgctgccatgcagaagttttacg get tgcaagtaacaggcaaagctgatgcagacaccatgaaggccatgaggcgcccccgatgtggtgttccaga caagtt tggggctgagatcaaggccaatgttcgaaggaagcgctacgccatccagggtctcaaatggcaacata atgaaatc actttctgcatccagaattacacccccaaggtgggcgagtatgccacatacgaggccattcgcaagg cgttccgcg tgtgggagagtgccacaccactgcgcttccgcgaggtgccctatgcctacatccgtgagggccat gagaagcaggc cgacatcatgatcttctttgccgagggcttccatggcgacagcacgcccttcgatggtgaggg cggcttcctggcc catgcctacttcccaggccccaacattggaggagacacccactttgactctgccgagccttg gactgtcaggaatg aggatctgaatggaaatgacatcttcctggtggctgtgcacgagctgggccatgccctgg ggctcgagcattccag tgacccctcggccatcatggcacccttttaccagtggatggacacggagaattttgtgct gcccgatgatgaccgc cggggcatccagcaactttatgggggtgagtcagggttccccaccaagatgccccct caacccaggactacctccc ggccttctgttcctgataaacccaaaaaccccacctatgggcccaacatctgtgac gggaactttgacaccgtggc catgctccgaggggagatgtttgtcttcaaggagcgctggttctggcgggtgag gaataaccaagtgatggatgga tacccaatgcccattggccagttctggcggggcctgcctgcgtccatcaaca ctgcctacgagaggaaggatggca aattcgtcttcttcaaaggagacaagcattgggtgtttgatgaggcgtccc tggaacctggctaccccaagcacat taaggagctgggccgagggctgcctaccgacaagattgatgctgctctc ttctggatgcccaatggaaagacctac ttcttccgtggaaacaagtactaccgtttcaacgaagagctcagggca gtggatagcgagtaccccaagaacatca aagtctgggaagggatccctgagtctcccagagggtcattcatgg gcagcgatgaagtcttcacttacttctacaa ggggaacaaatactggaaattcaacaaccagaagctgaaggtag aaccgggctaccccaagtcagccctgagggac tggatgggctgcccatcgggaggccggccggatgaggg gactgaggaggagacggaggtgatcatcattgaggtgg acgaggagggcggcggggcggtgagcgcggct gccgtggtgctgcccgtgctgctgctgctcctggtgctggcggt gggccttgcagtcttcttcttcagacgccatg ggacccccaggcgactgctctactgccagcgttccctgctggac aaggtc (SEQ ID NO :30)描述了 MMP14 核苷酸序列(MMP14 :GENBANK 登录号 BC064803)。
MSPAPRPSRCLLLPLLTLGTALASLGSAQSSSFSPEAWLQQYGYLPPGD LRTHTQRSPQSLSAAIAAM QKFYGLQVTGKADADTMKAMRRPRCGVPDKFGA EIKANVRRKRYAIQGLKWQHNEITFCIQNYTPKVGEYATYEAI RKAFRVWES ATPLRFREVPYAYIREGHEKQADIMIFFAEGFHGDSTPFDGEGGFLAHAYFP GPNIG⑶THFDSAE PWTVRNEDLNGNDIFLVAVHELGHALGLEHSSDPSAIM APFYQWMDTENFVLPDDDRRGIQQLYGGESGFPTKMPP QPRTTSRPSVPDKP KNPTYGPNICDGNFDTVAMLRGEMFVFKERWFWRVRNNQVMDGYPMPIGQFW RGLPASINT AYERKDGKFVFFK⑶KHWVFDEASLEPGYPKHIKELGRGLPTD KIDAALFWMPNGKTYFFRGNKYYRFNEELRAVD SEYPKNIKVWEGIPESPRG SFMGSDEVFTYFYKGNKYWKFNNQKLKVEPGYPKSALRDWMGCPSGGRPDEG TEEE TEVIIIEVDEEGGGAVSAAAVVLPVLLLLLVLAVGLAVFFFRRHGTPR RLLYCQRSLLDKV(SEQ ID NO :31) 描述了 MMP14氨基酸序列(MMP14 :GENBANK登录号BC064803)。
atgatcttactcacattcagcactggaagacggttggatttcgtgcatcattcgggggtgtttttcttg caaa ccttgctttggattttatgtgctacagtctgcggaacggagcagtatttcaatgtggaggtttggttacaaa agtacg gctaccttccaccgactgaccccagaatgtcagtgctgcgctctgcagagaccatgcagtctgccctagc tgcca tgcagcagttctatggcattaacatgacaggaaaagtggacagaaacacaattgactggatgaagaagccc cga tgcggtgtacctgaccagacaagaggtagctccaaatttcatattcgtcgaaagcgatatgcattgacaggac ag aaatggcagcacaagcacatcacttacagtataaagaacgtaactccaaaagtaggagaccctgagactcgtaaagctattcgccgtgcctttgatgtgtggcagaatgtaactcctctgacatttgaagaagttccctacagtgaattag a aaatggcaaacgtgatgtggatataaccattatttttgcatctggtttccatggggacagctctccctttgatgg aga gggaggatttttggcacatgcctacttccctggaccaggaattggaggagatacccattttgactcagatgag cca tggacactaggaaatcctaatcatgatggaaatgacttatttcttgtagcagtccatgaactgggacatgctc tggg attggagcattccaatgaccccactgccatcatggctccattttaccagtacatggaaacagacaacttcaa acta cctaatgatgatttacagggcatccagaaaatatatggtccacctgacaagattcctccacctacaagacct ctac cgacagtgcccccacaccgctctattcctccggctgacccaaggaaaaatgacaggccaaaacctcctcggc c tccaaccggcagaccctcctatcccggagccaaacccaacatctgtgatgggaactttaacactctagctattct t cgtcgtgagatgtttgttttcaaggaccagtggttttggcgagtgagaaacaacagggtgatggatggataccca atgcaaattacttacttctggcggggcttgcctcctagtatcgatgcagtttatgaaaatagcgacgggaattttgt g ttctttaaaggtaacaaatattgggtgttcaaggatacaactcttcaacctggttaccctcatgacttgataacc cttg gaagtggaattccccctcatggtattgattcagccatttggtgggaggacgtcgggaaaacctatttcttca aggg agacagatattggagatatagtgaagaaatgaaaacaatggaccctggctatcccaagccaatcacagtctg ga aagggatccctgaatctcctcagggagcatttgtacacaaagaaaatggctttacgtatttctacaaaggaaag ga gtattggaaattcaacaaccagatactcaaggtagaacctggacatccaagatccatcctcaaggattttatgg gc tgtgatggaccaacagacagagttaaagaaggacacagcccaccagatgatgtagacattgtcatcaaactgga caacacagccagcactgtgaaagccatagctattgtcattccctgcatcttggccttatgcctccttgtattggttt ac actgtgttccagttcaagaggaaaggaacaccccgccacatactgtactgtaaacgctctatgcaagagtgggt g(SEQ ID NO 32)描述了 MMP16 核苷酸序列(MMP16 :GENBANK 登录号 AB009303)。
MILLTFSTGRRLDFVHHSGVFFLQTLLWILCATVCGTEQYFNVEVffLQK YGYLPPTDPRMSVLRSAE TMQSALAAMQQFYGINMTGKVDRNTIDffMKKPRC GVPDQTRGSSKFHIRRKRYALTGQKWQHKHITYSIKNVTPK VGDPETRKAIR RAFDVffQNVTPLTFEEVPYSELENGKRDVDITIIFASGFHGDSSPFDGEGGF LAHAYFPGPGI G⑶THFDSDEPWTLGNPNHDGNDLFLVAVHELGHALGLEHS NDPTAIMAPFYQYMETDNFKLPNDDLQGIQKIYGP PDKIPPPTRPLPTVPPH RSIPPADPRKNDRPKPPRPPTGRPSYPGAKPNICDGNFNTLAILRREMFVFK DQffFff RVRNNRVMDGYPMQITYFffRGLPPSIDAVYENSDGNFVFFKGNKYffV FKDTTLQPGYPHDLITLGSGIPPHGIDS AIffffEDVGKTYFFKGDRYffRYSEE MKTMDPGYPKPITVffKGIPESPQGAFVHKENGFTYFYKGKEYffKFNNQILK V EPGHPRSILKDFMGCDGPTDRVKEGHSPPDDVDIVIKLDNTASTVKAIAIVI PCILALCLLVLVYTVFQFKRK GTPRHILYCKRSMQEffV (SEQ ID NO 33)描述了 MMP 16 氨基酸序列(MMP16 :GENBANK 登录号 AB009303)。
多能性的诱导 最近发现可以将体细胞重新编程以恢复到多能性状态。可以将编码转录因子 0CT4、S0X2、KLF4、NANOG、c-MYC以及LIN28的基因或它们自身的蛋白引入体细胞中并且引起反转到多能性状态。许多这些多能性因子以前被认为是癌基因。C-Myc是熟知的癌基因， 并且类似地，已经显示Klf4诱导了发育异常Ouster等人，200 。0CT4被认为是用于鉴别多能性干细胞的金标准。在细胞核中存在0CT4表明该细胞是多能性的并且它的缺少表明该细胞已经进入分化过程并且不再能够分化成任何细胞类型。< 0} {0 > Recently, it became known that 0CT4 is also present in the nucleus of many cancer cells,but not in normal mature cells. < } 0 { >最近，变得已知的是0CT4还存在于多种癌细胞的细胞核中，但不存在于正常的成熟细胞中。本申请的发明人最近发现MUCl跨膜蛋白(SEQID NO 1)的一种切割形式(MUCl)是一种强生长因子受体，该受体被表达于估计75%的实体瘤癌瘤上(Raina等人，2009)并且它还以这种“致瘤的”形式被表达于多种多能性干细胞上(Hikita等人，2008)。本发明涉及MUC1*和MUC1*相关因子以及使用它们来诱导或维持多能性或用来提高诱导多能性的效率的方法。
本发明包括使用MUCf相关因子(这些因子包括蛋白因子、编码它们的基因、或影响它们的表达的小分子)来诱导或提高产生iPS细胞的效率。我们已经显示MUCl跨膜蛋白的一种切割形式(MUCf)是一种主要的生长因子受体，该受体介导了癌细胞和多能性干细胞两者的生长。干扰MUCf胞外域与它的活化配体(NM23)之间的相互作用对于多能性干细胞是致命性的(Hikita等人，2008)，这表明该通路对于多能性是至关重要的。NM23是激活MUCr的一种配体(Mahanta等人，2008) (SEQ ID NO :12-17以及22-23)。除了它能够刺激多能性干细胞生长同时抑制分化之外，已经显示匪23诱导c-Myc的转录(Dexheimer等人，2009)。因此，将匪23加入到正在转变成多能性状态的细胞中将提供转染该c-Myc癌基因同时减轻相关健康风险的优点。此外，通过匪23或一种二价抗-MUCf抗体来刺激MUCf 激活了 MAP激酶增殖通路，该通路增加了细胞存活率(Mahanta等人，2008)。NANOG表达诱导了多能性；肿瘤抑制剂P53抑制了 Nanog表达(Lin等人，2007)。因此，通过抑制p53 减少或消除了为了诱导多能性而对NANOG的需要。已经显示异位表达的MUCl胞质尾区的 72-氨基酸片段(MUClO-CT)存在于癌细胞的细胞核中，在那里它结合到p53启动子上(Wei 等人，2007)。可以将MUCl-⑶的大致72氨基酸片段(例如SEQ ID NO=Il中所示)与其他多能性诱导因子相结合使用以诱导或增强iPS细胞产生。然而，这种肽不对应于自然发生的MUCl种类，并且因此可能产生不希望的作用。本发明的诸位发明人披露了 MUCf转移到细胞核中(实例1和9，以及图6)并且因此被独自地或与其他多能性诱导因子相结合来使用用来诱导或增强iPS细胞产生。为了支持这种方法，已经报道的是来自该核心集合的多能性基因的几个基因调节了 MUC1、它的裂解酶和/或它的活化配体匪23的转录(Boyer等人，2005)。0CT4和S0X2结合到MUCl启动子上并且还结合到它的裂解酶(MMP-14)的启动子上。S0X2和NANOG结合到匪23启动子上。鉴于MUC1*对于维持hESC是至关重要的并且是这些关键多能性基因的靶，我们披露了可以使用引入MUCf，或增加MUCl裂解为MUCf形式的试剂、连同它的活性配体(匪23) —起来替换先前鉴定的多能性诱导因子中的一些或全部来诱导或增强iPS细胞的产生。
本发明披露了用来在细胞中诱导多能性的、涉及MUCf的新的试剂和方法。使用这些试剂和方法来在体细胞或成熟细胞中诱导多能性。<0}本发明的另一方面，使用它们来增加在成熟细胞中诱导多能性的效率。<0}本发明的另一个方面，使用它们来将未成熟的细胞维持在未成熟的状态。本发明的另一方面，使用它们来抑制分化。本发明的另一方面， 使用这些试剂和方法来将干细胞维持在多能性状态下。
本发明包括通过将影响MUCf以及它的相关因子的表达的基因或基因产物引入到成熟细胞，或稍微分化的细胞中来反转分化或维持干细胞样的特征。MUCr是跨膜蛋白MUCl 的切割形式。MUC1*相关因子包括但不限于全长MUC1、切割MUCl的酶、MUC1*活化配体以及影响MUCl或MUC1*表达的转录因子。本发明还涉及将MUC1*或MUC1*相关因子的基因或基因产物引入到成熟细胞或稍微分化的细胞中将在这些细胞或它们的子代中诱导多能性或干细胞性。本发明描述了它们在干细胞中用于维持多能性的用途。可以将影响MUCf或MUCf相关因子的表达的试剂与已知用来诱导多能性的一种或多种基因或基因产物(包括 0CT4、S0X2、KLF4、NAN0G、c-myc以及LIN28)相结合加入，或者用来将其替换。
已经显示转录因子0ct4、Sox2、Klf4以及c_Myc的组合或0ct4、Sox2、Nanog以及LiM8的组合的强制表达引起成熟细胞恢复到多能性状态(Takahashi以及Yamanaka， 2006)。诱导多能性的这些转录因子的每一个调节了约一打(dozen)基因的转录。在这些之中有几个本发明人已经鉴定为MUCl-相关因子。0CT4和S0X2结合到MUCl启动子自身上。 S0X2和NANOG结合到NM23(NME7)启动子上。NM23(也称为NME)以前被本发明人鉴定为 MUC1*的活化配体(Mahanta等人，2008)。NME7是MUCl*的一种活化配体。0CT4和S0X2两者结合到MMP16的启动子上，我们在此披露的MMP16是MUCl的一种裂解(cleavage)酶。0CT4、 S0X2 或 NANOG 还结合到裂解酶 MMP2、MMP9、MMP10、ADAM TSL-I、ADAM TS-4、ADAM-17 ( 一种 MUCl裂解酶)、ADAM-TS16、ADAM-19以及ADAM-28的启动子位点上。可以将这些裂解酶中的一些或全部上调以增加将MUCl切割成MUCf形式的切割以便诱导多能性或维持它(Boyer 等人，2005)。
我们以前的关于胚胎干细胞(这些胚胎干细胞仅表达MUCl的切割形式MUC1)的工作显示它的胞外域的二聚刺激了生长并且抑制了分化(Hikita等人，2008)。使用二价抗-MUC1*抗体、重组体匪23、亦或优选地形成二聚体的突变体匪23(S120G)通过二聚MUC1* 胞外域来实现这些作用(Kim等人.，2003)。使用单价的抗-MUCfFab来抑制MUC1*胞外域是在数小时内致死的。这些发现表明MUCf是一种显著的“干细胞性”因子。此外，0CT4和 S0X2结合到MUCl基因启动子上并且还结合到它的裂解酶的启动子上。S0X2和NANOG结合到匪23(NME7)启动子上。因为阻断MUC1*的胞外域对于hESC是致死的，它遵循的是多能性基因0CT4、S0X2、以及NANOG诱导表达MUC1、它的裂解酶以及它的活性配体。可以通过转染基因或引入基因产物(例如，单独地MUCf或除了它的裂解酶和/或活化配体之外的NME7、 NME-Hl、NME-H2或将MUCl或MUC1*的PSMGFR表位二聚的抗体)来替换已经显示诱导多能性的基因或基因产物中的一个或多个。
如本领域的普通技术人员所熟悉的，可以将引导所转染的基因产物定位的信号序列加入到该基因中。信号序列的实例被给出为SEQ ID NO :2-4。本发明考虑了可以将MUC1* 的N端结构域截短或延伸达九(9)个氨基酸而基本上不改变这些基因或基因产物的作用。 以SEQ ID NO :5来举例说明的MUC1*以及其胞外域基本上由SEQ ID NO :6、7、8和9中给出的序列组成的变异体是优选的。
MUCK MUC1*、或相关因子(包括上面列出的那些)可以替代诱导多能性的基因或基因产物中的一个或多个并且用于诱导多能性或用于维持它。
在一个实例中，用编码MUCl蛋白的基因来转染体细胞(例如成纤维细胞和真皮成纤维细胞)，该蛋白帮助诱导干细胞样特征以及在一些实例中诱导子代变成多能性干细胞。 本发明的另一方面，将MUCf的基因转染到细胞中以诱导恢复到干细胞样状态并且在一些实例中诱导实际的多能性干细胞。可以将MUCl或MUCf基因的每一个单独地或与帮助诱导多能性或干细胞样特征的其他基因相结合引入细胞。例如，将编码MUCl或优选地MUCf的 DNA连同编码0CT4、S0X2、NAN0G、LI^8、KLF4JP /或c_Myc的基因中的一种或多种一起引入细胞。将对MUC1，优选地MUC1*的截短形式进行编码的DNA连同对0CT4、S0X2、NANOG、以及LIN28进行编码的基因一起转染到成纤维细胞中(Yu等人，2007)。在另一个实施方案中，将编码MUCl，优选地MUC1*的截短形式的DNA连同编码0CT4、S0X2、KLF4、以及c_Myc的基因一起转染到体细胞、成纤维细胞、或其他细胞中(Takahashi等人，2007)。类似地，将对MUCf 和/或它的活性配体、匪23或匪23的S120G突变体进行编码的DNA转染到细胞中以诱导多能性。可以将MUC1*和/或NM23连同其他基因(例如0CT4、S0X2、NANOG, LIN28、KLF4、 和/或c-Myc) —起转染以诱导多能性或干细胞样特征。还可以将对识别MUCf或MUCl的抗体进行编码的DNA独自地或与其他基因一起转染到细胞中以在这些细胞或它们的子代中诱导干细胞特征。如果抗-MUCf抗体被分泌，抗-MUCf抗体将二聚并且因此激活MUC1* 受体以及它的促进或维持干细胞样特征的功能。
类似地，将诸如核酸类、蛋白类、修饰的蛋白类或影响MUC1、MUC1*或它们的相关因子的表达的小分子类的多种因子引入细胞中来诱导干细胞的特征或恢复到多能性。例如，将 MUCl 裂解酶的基因或基因产物 MMP14、MMp 16, MMP2、MMP9、MMP10、ADAM TSL-U ADAM TS-4ADAM-17 ( 一种MUCl裂解酶)、ADAM_TS16、ADAM-19以及ADAM-28引入细胞中以诱导多能性或类似的特征。
在另一个实施方案中，将非蛋白试剂加入到细胞中来诱导或增强多能性的诱导。 例如，佛波酯佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)是一种小分子，该分子增加了将MUCl 切割为MUC1*的切割(Thathiah等人，2003)。本发明的一个方面，将佛波酯加入正在经历转变到多能性的细胞中以诱导或增加iPS产生的效率。
在另一个实例中，将与MUCl或MUC1*相互作用的配体加入到体细胞、真皮成纤维细胞、成纤维细胞、或稍微分化的细胞中独自地或与其他基因相结合来诱导多能性从而诱导或维持多能性。例如，将对0CT4、S0X2、NANOG, LIN28、KLF4、和/或c_Myc进行编码的这些基因中的一个或多个转染到成纤维细胞或其他细胞中并且然后在激活MUCl或MUCf的配体的存在下进行培养。优选MUCr的二聚体的、蛋白配体。在一个优选实施方案中，将一种二价抗-MUCf抗体加入到细胞中，这些细胞已经被影响细胞或它们的子代变成多能性干细胞的基因转染。
在一个优选的实施方案中，将NM23(NM23-H1、NM23-H2、或NME7)引入到细胞中(以编码它的基因的形式、以蛋白本身的形式或以带有前导序列(例如聚精氨酸束)的蛋白的形式)以促进进入细胞，以帮助诱导或维持多能性。最近诸位发明人显示当NM23是由多能性干细胞(以及癌细胞)分泌的时，它是MUCl的切割形式(MUCf)的一种活性配体并且触发了 MAP激酶增殖通路。MUC1*的匪23刺激显示促进了多能性hESC的生长并且抑制了它们的分化(Hikita等人，2008)。NM23还诱导了 c-MYC的转录(Dexheimer等人，2009)并且替代了对c-MYC的需要。将匪23以其天然状态外源性地加入来激活MUC1*生长因子受体亦或具有一个聚精氨酸束来促进进入细胞以及细胞核，在那里它诱导C-MYC表达。可以将 NM23 (NME)以编码核酸的形式、或以表达的蛋白的形式(具有或不具有促进进入细胞的修饰)加入。能够以其天然状态或以有利于二聚体状态的突变体形式(例如S120G突变)来使用 NME-Hl、NME-H2 或 NME-7。
在本发明的另一方面，将结合到MUCf(PSMGFR)的胞外域上的一种二价抗体或一种二聚体MUC1*配体(例如匪23)，或者编码它们的基因加入到表达MUC1*的细胞中用来诱导多能性，增加多能性诱导的效率，用来维持多能性或用来抑制分化。这些MUCl或MUCf相互作用蛋白被加入其中的细胞可以是自然发生的细胞或用来诱导干细胞样特征的基因已经被加入其中，或已经进入分化过程的那些细胞或可以是干细胞。
可以将用来诱导多能性的基因引入到相同的或不同的质粒上，这些质粒可以是慢病毒载体驱动的或者是腺病毒载体或任何整合的或非整合的病毒性或非病毒性载体，或有助于将这些基因引入到所希望的细胞中的任何其他系统。
在多个实例中，优选的是通过引入蛋白本身而不是编码它们的核酸或基因来实现多能性诱导蛋白的作用。本发明包括在此披露的用来诱导干细胞样特征或多能性的基因， 这些基因可以被基因产物、蛋白或者以它们的天然状态亦或用前导序列(例如聚精氨酸束)来修饰以允许进入细胞中的方式来替换。将这些基因的产物(即蛋白)或与这些转染基因的产物中一种或多种相互作用的其他蛋白引入细胞中从而诱导或维持多能性或其他干细胞样特征。
在其他实例中，引入合成的试剂(例如小分子)以在成熟的或已分化的细胞中诱导干细胞性可能是有利的(Lyssiotis等人，2009)。在本发明的一个方面，将小分子加入到细胞中，这些细胞或者直接地亦或间接地诱导基因(这些基因诱导多能性)的转录。在其他实例中，加入直接地或间接地增加MUCf的产量的小分子。在一个实例中，这些小分子增加了将MUCl裂解成为MUC1*形式的裂解，该MUC1*形式是干细胞的一种特征。例如，佛波酯是增加MUCl裂解成为MUC1*的一种小分子，所以当加入细胞时，通过产生MUC1*它促进诱导或维持多能性状态。
P53(它还已知是一种肿瘤抑制剂)促进了凋亡。因此当在体细胞或其他细胞中培养干细胞或诱导多能性时抑制P53将是有利的。本发明预期使用p53抑制剂连同本发明的其他试剂以及方法一起来维持干细胞性或诱导干细胞样特征或多能性特征。可以通过多种方法来抑制P53。小分子(例如Pifithrin-μ (皮斐松- μ ))抑制了 ρ53的促凋亡作用 (Strom等人，2006年9月；Komarov等人，1999)并且因此可选地加入到细胞中以增加诱导多能性的效率或维持干细胞性。在一个优选的实施方案中，将P53抑制剂连同上调MUCl或 MUC1*的基因或基因产物(包括但不限于MUCl或MUC1*基因或基因产物、它们的活性配体以及它们的裂解酶)一起使用。
用来抑制p53活性以增加诱导多能性或维持干细胞性的效率的另一种方法是通过将MUC1*蛋白弓丨入到细胞培养物中。可以通过加上一个聚精氨酸束以有助于进入细胞来修饰MUCf蛋白。已经报道的是MUCl的胞质尾区(MUCl-CD)的独自地过量表达导致它易位到细胞核中，在那里它被发现结合到P53启动子上。这些研究不能确定MUCl-⑶是否上调或下调P53。本发明还涉及通过异位表达MUCf来抑制p53从而增加诱导多能性或其他干细胞样特征的效率。可以通过将该基因插入到细胞中，通过外源性地加入该蛋白自身或者通过加入任选地用聚精氨酸束修饰的MUCf蛋白，来引入MUCf。
本发明不限于在此所述的具体实施方案的范围内。实际上，除了在此所述的那些具体实施方案之外的本发明的多种修改对于本领域的普通技术人员来说根据上述说明以及附图将是清楚的。这类修改旨在落入所附权利要求的范围内。下面的实例是通过说明本发明的方式而非限制的方式来提供的。
SM 实例l.MUCf促进了生长以及细胞死亡耐受性 MUC1*促进了成纤维细胞的克隆形成生长(克隆扩增)。用全长MUCl (SEQ ID NO1)，MUCrillo(SEQ ID NO 5)或空载体转染的3Y1细胞的单细胞克隆以1000个细胞/60匪皿铺于包含10%胎牛血清、青霉素/链霉素以及G418(600yg/ml)的DMEM培养基中。使细胞生长9天，并且然后在室温下在4%多聚甲醛中固定15分钟。用水来洗涤这些皿并且然后在室温下用70%甲醇中结晶紫染色20分钟。用水将这些皿洗涤3次并且允许在室温下干燥过夜并且进行照相。图IA显示了当MUC1*单细胞克隆#3和#44正在生长时，被吸收的结晶紫的量(细胞数量的一种指示物)是高得多的。相比之下，与用空载体转染的细胞相比，用全长MUCl (单细胞克隆#8和#17)转染的细胞未显示出生长速率增加。这表明这种切割形式(MUCf)赋予了生长和/或存活的优点并且全长蛋白没有这些优点。
实例2在曲妥珠单抗(HERCEPTIN )耐受性细胞中(通过在lug/ ml HERCEPTIN 中培养来生成耐受性)抗-MUCfFab通过TAXOL 阻断了对细胞死亡的耐受性。Fessler等人于2009年报道HERCEPTIN 耐受性细胞还对TAXOL 、多柔比星以及环磷酰胺具有耐受性。如所报道的，这些药物耐性的癌细胞通过过量表达MUCf实现了耐受性。以下的实验显示阻断MUCf细胞外域的PSMGFR部分逆转了癌细胞中的获得性耐药性。将亲本细胞(BT474)或耐受性细胞(BTResl)以10，000细胞/孔的密度铺于96孔板中0孔/条件)。第二天，在存在或不存在TAXOL (PaclitaxelSigma T7191)的情况下，将抗-MUCfFab、对照Fab、或无Fab加入细胞中。两天之后，将细胞再悬浮于50 μ 1胰蛋白酶中，并且在台盼蓝的存在下进行计数。将细胞死亡百分比计算为吸收的台盼蓝的百分比。在每种条件下ΒΤ474细胞响应于TAXOL 经历细胞死亡，BTResl细胞仅在MUC1*抗体的存在下经历细胞死亡(图1B)。
实例3MUC1*作为生长因子受体起作用，并且通过使用一种人工的(抗-MUCf抗体)或它的天然配体匪23 (NME)来二聚化它的胞外域被激活。将MUCl*-阳性的ZR-75-30 细胞(6000/孔)，或对照(MUC1-阴性的)HEK293细胞GOOO/细胞)铺于96孔板中。第二天，进行0小时细胞计数，并且每M或48小时将不同浓度的抗-MUCf抗体或Fab加入含有低(0. 1% )血清的培养基中。培育数天之后，将细胞再悬浮于胰蛋白酶中并且进行计数，并且计算归一化的生长百分比。ZR-75-30细胞的刺激显示为一种钟形曲线(如配体诱导的生长刺激所证明的)，但是HEK293细胞没有这种情况(图1C)。在类似的实验中，使用用siRNA靶向的MUC1，或对照siRNA稳定转染的MUCl*-阳性T47D乳癌细胞，刺激生长仅发生在用对照转染的细胞，进一步证明了抗体的特异性(图1D)。对于MUCf的天然配体 (匪23)，证明了相同的结果(图1E)。
实例4.匪23特异性地结合到PSMGFR肽上，该肽基本上由MUCf的胞外域组成。使用一台Biacore3000仪器以及BiaEvaluation软件通过表面等离激元(Surface Plasmon Resonance)来测量结合。将组氨酸标记的MUCl*1110_ecd(SEQ ID NO 5)或不相关的肽(H HHHHH-SSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS-SEQ ID NO 34)固定在包被了 5. 7% NTA-Ni++SAM 的 SPR芯片的多个分开的流动通道上(在我们实验室中制备，如Mahanta et al. 2008中所述)。将35 μ L柱塞的匪23 (纯化的牛的或重组的人的)注入5uL/分钟的恒定流动流中并且将传感图记录下来。将从牛肝中纯化的匪23 (Sigma N4635)独自地稀释在PBS中。使用一个1 1 Langmuir模型在宽的浓度范围上对亲和性进行测量。实际的亲和性可以不同，因为一级动力学不能充分地描述这个系统(图1F)。
实例5. MUC1*生长因子受体以及它的配体匪23是在未分化的hESC上的，并且不在已分化的hESC上。通过免疫细胞化学(ICC)来分析处于未分化(多能性的)状态下或处于新分化状态下的人胚胎干细胞。将人胚胎干细胞(hESC)手工地切开并且铺于8孔腔室载玻片(Nunc)中，这些腔室载玻片已经用基质胶进行了预包被。对于未分化的细胞，在铺板之后将细胞固定5-7天。对于已分化的细胞，在铺板之后5-7天将bFGF从培养基中移去， 并且在固定之前允许细胞分化14天。在4°C下用0. IM 二甲胂酸盐缓冲液中4%多聚甲醛固定15分钟之前，用PBS来洗涤细胞。用BSA以及PBS中1 %驴或山羊血清将细胞封闭1小时。0.1% NP-40与抗细胞内抗原的抗体一起使用。将一抗稀释于封闭液中并且在 4°C下与细胞一起孵育1小时。使用以下蛋白的一抗0CT4 (Santa Cruz，克隆ClonesH_134 以及 C-10，l 100 稀释)、全长 MUCl (VU4H5，Santa CruzBiotechnology, 1 50 稀释)、 MUC1* (Minerva, 1 250 稀释)、或 NM23 (SantaCruz，克隆 NM301，1 100 稀释))。在用以下二抗孵育30分钟之前，在PBS中将细胞洗涤3次每次5分钟=AlexaFluor 488山羊抗-兔 IgG、AlexaFluor555 山羊抗-小鼠 IgG、AlexaFluor 350 山羊抗-兔 IgG(Invitrogen, 1 200)、山羊抗-小鼠IgM-TRGanta Cruz，l 100)。在使用防褪色封片剂(Biomeda) 来封固盖玻片之前，在PBS中将细胞洗涤3次每次5分钟。通过DAPI染色(1 μ g/ml)5分钟从而可以看到细胞核。在一台奥林巴斯BX-51落射荧光显微镜上来看到免疫染色的细胞。这些实验的结果显示MUCf是在未分化的细胞(多能性干细胞)的表面上的(图2A、 3B、3C)并且不在已分化的hESC上(图2D)。图3显示MUC1*的配体(匪23)与MUC1*共定位(图3A-C)。MUC1*和它的配体匪23仅表达于多能性干细胞(0CT4-阳性细胞)上并且不在已分化的那些细胞上，图3C和3F(DAPI染色0CT4-阴性细胞的细胞核)。
实例6. MUCf调节多能性干细胞的生长。
在多能性干细胞上使用二价抗MUCf来进行以下实验以确定刺激性MUCf的影响。 这些结果显示加入MUCf 二聚化配体刺激了多能性(0CT4-阳性)干细胞生长并且还使它们在缺少喂养细胞、喂养细胞的提取物或bFGF下能够进行生长。
多能性(0CT4-阳性)hESC的长期生长是由MUCf刺激来调节的。将hESC进行胰蛋白酶分离并且以4xl04细胞/孔种在预包被有基质胶的8孔腔室载玻片中。更换培养基并且每隔一天以对于二价抗-MUCf终浓度为1 μ g/ml加入抗体直至可以看到分离的克隆。 培养条件包括含有和不含有bFGF添加物的“基本干细胞培养基”(无喂养细胞(feeder)-条件培养基的hESC培养基)以及Hs27-条件培养基。对于每种情况，以一式四份的方式生长细胞。用PBS来洗涤细胞并且进行固定，如上所述进行0CT4免疫染色。图4A-D是在来自加入成纤维细胞喂养细胞的基质胶以及条件培养基上生长的细胞的照片。图E-H是在基质胶上生长的细胞的照片，该基质胶中没有加入来自成纤维细胞喂养细胞的条件培养基。与添加了 bFGF的生长相比(图4A、B)，将抗-MUCf抗体加入到细胞培养物中(图4C、D)导致更多的多能性干细胞。将抗-MUCf抗体加入到在缺少来自成纤维细胞喂养细胞的(图4G、 H)条件培养基下培养的细胞中导致了丰富的多能性干细胞，这与通过加入bFGF(图.4 E， F)生长的细胞形成强烈对比(其导致无多能性细胞(缺少0CT4))。
实例7.在定量钙黄绿素测定法中直接地测量刺激性MUCf对增强多能性干细胞的生长的影响。将人胚胎干细胞(hESC)手动切开并且以1. 9xl04细胞/孔的密度在96孔板的包被了基质胶的孔上进行生长。培养基包含添加有30% Hs27-条件培养基以及如8/ ml bFGF的hESC培养基。在对于二价抗-MUCf终浓度为1 μ g/ml,以及对于一价抗-MUCf终浓度为100 μ g/ml情况下加入抗体。以一式三份的方式进行实验。抗体处理后41小时， 按照制造厂家的说明书用LIVE/DEAD生存力/细胞毒性试剂盒(Molecular Probes)对活的和死亡的细胞进行定量。使用一台Victor3V酶标仪(Perkin Elmer)来测量荧光。图5的柱形图显示使用二聚配体(抗-MUCf)来刺激MUCf增强了干细胞生长，而用抗-MUCfFab 阻断了 MUCf的胞外域，导致了全部干细胞死亡。
实例8.进行长期干细胞生长实验来比较使用二价抗-MUCf抗体、匪23、匪23-突变体、或bFGF对刺激干细胞生长的影响。用胰蛋白酶来分离hESC并且以8. 2xl04细胞 /孔的密度种在预包被有基质胶的8孔腔室载玻片中。更换培养基并且每隔一天以对于抗-MUC1*抗体终浓度80ng/ml，对于野生型重组体匪23或突变体(S120G)匪23终浓度InM， 加入抗体或野生型或突变型NM23蛋白，或以终浓度为“基础干细胞培养基”(无喂养细胞-调节培养基的hESC培养基)中^g/ml的重组体bFGF。细胞还在含有30%来自Hs27 成纤维细胞的条件培养基以及4ng/ml重组体bFGF(P^rotech #100_18B)的基础干细胞培养基中作为对照进行生长。这个实验的结果表明与条件培养基加上bFGF的情况(在基质胶上这些细胞的“正常”生长培养基)相比较，MUCf配体在多能性克隆的基本培养基中刺激生长上表现更好。表1详细描述了这些结果。
表1.在基本培养基中培养4周的hESC
权利要求
1.一种用于在细胞中诱导或维持多能性的方法，包括将所述细胞与增加MUCf活性的生物物质或化学物质相接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物物质是基因。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述生物物质是蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述蛋白是MUCf配体。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述配体是匪23。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述蛋白是识别MUCr的PSMGFR序列的抗体。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述化学物质是小分子。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述小分子增强了MUC1、它的裂解酶或匪23的转录。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述裂解酶是MMP-16、MMP-14或ADAM-17。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述小分子增强了对MUCl的切割。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述小分子是佛波醇酯。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述基因编码MUCl。
13.如权利要求2所述的方法，其中所述基因编码MUC1*。
14.如权利要求2所述的方法，其中所述基因编码MUCr的配体。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述配体是MUC1*抗体或匪23。
16.如权利要求3所述的方法，其中所述蛋白是MUCr或其有效片段。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述片段是胞质尾区。
18.如权利要求1所述的方法，进一步包括将所述细胞与提高基因产物表达的分子相接触，所述基因产物诱导多能性。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述分子提高0CT4、S0X2、NANOG,KLF4或LIN28 的表达。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述分子提高0CT4以及S0X2的表达。
全文摘要
本申请记载了通过将细胞与增加MUC1*活性的生物物质或化学物质相接触从而在细胞中诱导或维持多能性的方法。
文档编号C12N5/071GK102272290SQ200980149448
公开日2011年12月7日 申请日期2009年10月9日 优先权日2008年10月9日
发明者辛西娅·巴姆达德, 肖恩·费斯勒 申请人:米纳瓦生物技术公司, 辛西娅·巴姆达德