专利名称：用于样品中的微生物裂解、所述微生物的核酸提取和纯化以进行分析的自动系统的制作方法
用于样品中的微生物裂解、所述微生物的核酸提取和纯化以进行分析的自动系统本发明的技术领域是生物学分析。更具体地，本发明首先涉及用于裂解存在于环境或临床样品中的微生物、用于提取和纯化所述微生物的核酸的装置。本发明还涉及用于裂解微生物、用于提取和纯化所述微生物的核酸用于分析目的的自动系统。若干年来已经注意到医院中的院内感染的增长。这些感染通过就医者的污物，并且因此通过定义免疫力低下，通过尽管投入了相当大程度的关注在设备和表面的消毒以及空气处理上但仍存在于医院环境中并且没有被消灭掉的病原微生物，来解释。考虑到越来越频繁地发生环境微生物污染的情况，用于改进和帮助环境控制的装置和方法的开发已经成为健康专家面临的主要挑战。除院内感染的问题外，环境条件的控制也是工业上很多年来反复考虑的问题，尤其是在食品工业以及制药或化妆品工业中。在食品工业中，对消费者健康的灾难性结果可能源自产品或者甚至原材料的污染，众所周知的是被病原微生物污染。实际上，由于细菌例如李氏杆菌属(Listeria)或沙门氏菌属(Salmonella)的那些引起的食物中毒目前是普通的事件。空气质量控制也是制药或化妆品工业的质量控制方法中的关键程序。而且，这些控制必须遵守越来越多的要求，因为规定越来越严格。在由健康专家或制造商使用用于进行环境控制的工具中，微生物空气取样器是用于检测空气微生物而选择的解决办法。这些装置被放置于需要测量微生物学空气污染的位置中的适合点上。它们通常由连接至培养基的取样器组成。被空气取样器收集的空气与培养基接触；包含在所收集的空气中的任何微生物将被放置于培养基上。然后回收培养基并且将其放置于炉子中，以促进微生物生长。因此可以通过传统的微生物学技术检测和识别所述微生物。然而，这些装置具有与所使用的技术有关的主要缺陷。这个缺陷就是获得分析结果所需的时间。实际上，使用微生物学特别是细菌学的传统技术需要用于细胞生长所必须的培养时间，或者甚至需要在培养基上重新培育以允许识别的阶段。因此，当我们试图检测和识别造成院内感染或食物中毒的病原体时，获得结果需要的时间相对较长或者甚至过长。这种类型的装置的另一缺陷是虽然使用培养基可以区别细菌的属类(genera) 和种群(species)，但通常它不允许区别同一细菌种群的菌株(strain)。现在，已知微生物的病原性可能相当大程度地根据所讨论的菌株而不同。而且，这种类型的装置具有不能检测有生存能力但不能进行培养的空气微生物的缺陷。另外，具有意于回收空气颗粒特别是微生物的装置。文献GB-2 254 OM描述了一种基于旋风效应(cyclone effect)原理的用于收集空气颗粒的装置。虽然已经发现这种装置适于收集空气颗粒，包括微生物，但还没有关于如何处理如此获得的样品，特别是如何提取用于进行分析的遗传物质的研究。更通常地，在微生物的识别方面和/或传递结果的速度方面，不论关于临床或环境样品，最相关的技术毋庸置疑地是分子诊断技术。基于微生物遗传物质并且特别是感兴趣的某些特殊序列的分析的这些技术可以在记录时间内获得微生物的非常精确的识别，因为它们可以省略培养步骤。然而，这些技术的使用具有一些局限性，最重要的是存在于空气中的以及因此可回收从而进行分析的微生物数量潜在地有限。实际上，已经知道环境样品以及一些临床样品在微生物方面相对缺乏。因而，从原材料中只能获得少量的遗传物质。这样，用于提取核酸所使用的技术的性能在产量方面成为至关紧要的参数。而且，微生物裂解的多数现有技术通常不能应用于所有微生物和/或需要有资格的人员介入以照看手动阶段。文献W0-A-2005/038025描述了一种从微生物特别是从空气样品中提取核酸的方法。该方法包括使用三种不同的裂解方法，也就是化学裂解、通过热冲击(thermal shock) 裂解和机械裂解。虽然这种方法毋庸置疑地可以最优化核酸的提取效率并且因此增加分析可用的遗传物质量，但此效率仍取决于回收的微生物的量。但是，在该文献中没有描述如何最优化所述微生物的回收。文献US-5，707，861描述了一种分裂活细胞例如微生物的装置。此装置可以通过使用玻璃珠而裂解细胞，但另外通过存在于包含微生物的管和保持所述管的支撑体中的孔之间的缝隙而引起的振动的作用进行。因此，这种类型的装置可以最优化细胞裂解并且因此最优化遗传物质的提取。用于最优化遗传物质的提取所使用的所述装置和方法具有与上面描述的那些相同的局限性，也就是它们仍取决于所回收的微生物的数量。而且，它们具有另外的缺陷，即需要随后的核酸集中阶段，以将核酸从细胞碎片中分离。最后，它们需要在集中阶段结束时手动回收核酸。这些问题也在文献US-5，567，050中描述的装置中出现了。还介绍了一些更综合的系统。如此，文献W0-A-2004/018704描述了一种使用聚合酶链式反应(PCR)扩增技术的装置和有关的方法，用于从空气中收集微生物并且识别微生物。本系统特别适于对抗邮政分拣中心内通过生物污染进行的袭击。本系统由下述组成沿着运输邮件的回路布置的空气取样器、通过旋风效应过滤/分离颗粒的装置、用于集中/回收液体中的颗粒的装置，以及用于将一小部分样品传递至从Gpheid公司得到的 GeneXpert PCR分析试验筒的装置。然后，试验筒被手动传输至独立的自动生物分析仪， 用于识别从空气中收集一种或多种微生物。虽然本系统可以解决大量的与上述装置和方法有关的技术问题。但其也具有一些主要的缺陷。这些缺陷中的第一个是在传递至分析试验筒之前处理(收集、分离、集中/回收)样品的系统相对复杂并且昂贵。另一缺陷是没有可以进行核酸裂解和纯化的 GeneXpert 试验筒。第二缺陷是被收集的微生物在液体样品中回收，只有一小部分进行分析。这意味着不能回收所有微生物以及因此不能回收所有核酸的危险非常高程度地、 大大限制了分析的相关性。而且，尽管其很复杂，但本系统需要手动地将试验筒传递至 GeneXpert 自动分析仪。因此，本发明的第一目的是提供一种裂解的装置、系统和通用方法，它们对环境和临床样品，对于大量微生物，不论它们是细菌、病毒或真菌，可选地植物状态的或孢子的形式的，都很有效。
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本发明的另一目的是提供一种装置，其以集成的方式适于高效地裂解包含在环境样品例如空气或临床样品中的所述微生物，以从中提取核酸并且回收所述核酸用于分析目的。本发明的另一目的是提供一种适于收集包含在空气样品中的所有微生物的装置。本发明的另一目的是提供一种设计简单、手动阶段的数量和复杂性最小的装置。本发明的另一目的是提供一种极其紧凑的装置。本发明的另一目的是提供一种其中上述列举的各个阶段在没有外部污染危险的情况下进行的封闭装置。本发明的另一目的是提供一种其中所述阶段在不用操作者传递样品因此防止污染操作者的装置。本发明的另一目的是提供一种限制人员介入并且提供样品处理的可跟踪能力的装置和系统。最后，本发明的另一目的是提供一种装置和自动系统，其能够将目标核酸，在不进行另外的预处理例如离心或过滤的阶段的情况下，供应到可以直接用于，例如包括扩增和检测的阶段，的分子诊断的阶段中的缓冲液中。这些目的通过本发明实现了，本发明首先涉及一种用于收集空气微生物的微生物收集装置，所述微生物收集装置包括-空气收集模块，包括i.上部元件，其具有允许气流进入空气收集模块的进气管，所述进气管在其底部被提供有用于扰动气流的装置，ii.下部元件，其具有排气装置，允许所形成的气流离开，上部元件和下部元件可以被彼此制成一体，以使气流可以在空气收集模块内部形成；-试验筒，其具有大致圆柱形形状，具有微生物保持区，所述微生物保持区具有微生物裂解装置，所述试验筒被定位于所述空气收集模块内。优选地，所述微生物收集装置的试验筒的微生物保持区还包括能够保持微生物， 能够将所述裂解装置保持在位并且能够在液体中溶解的材料。在根据本发明的装置中，所述用于扰动气流的装置包括被定位在所述进气管的孔中心处的尖顶拱形形状的锥形体和连接所述尖顶拱形形状的锥形体与所述进气管的内表面的至少一个叶片。具有优势地，所述空气收集模块被连接至空气循环回路或空气抽吸装置。本发明还涉及一种微生物裂解装置，所述微生物裂解装置包括-试验筒，其为大致圆柱形形状，具有微生物保持区，所述试验筒执行转子的任务；-转子，其可以被置于试验筒内，所述转子具有旋转构件。根据优选实施例，所述微生物裂解装置另外包括意于将转子与试验筒保持为一体的帽。具有优势地，所述旋转构件由在盲管壁上制造的槽组成，所述槽被在直径方向上对置布置并且被构造成接收用于转动所述转子的装置的传动轴的端部。
根据微生物裂解装置的显著特征，所述试验筒的内径大于所述转子的外径，以当转子被安装在试验筒内时，从试验筒内壁到转子外壁的距离大得足以允许所述裂解装置被置于此孔隙空间内并且小得足以使所述裂解装置与所述壁的一个或另一个接触。本发明还涉及一种用于微生物裂解和所述微生物的核酸纯化的系统，包括-用于定位根据本发明的微生物裂解装置的定位装置；-当所述裂解装置被置于所述定位装置上时，用于转动所述转子的装置；-至少一个用于接收核酸的容器；-至少一个用于液体的抽吸/排出的装置；-多路阀，其与所述微生物裂解装置、用于接收被纯化的核酸的容器以及用于液体的抽吸/排出的装置流体连通。优选地，根据前一权利要求的裂解系统另外包括用于磁化的装置。其可以还包括加热装置。根据本发明的特殊实施例，多路阀包括抽吸-排出装置。本发明还涉及一种收集空气微生物的微生物收集方法，所述微生物收集方法由下述阶段组成a)将试验筒放在空气收集模块内，以获得根据本发明的微生物收集装置，试验筒内的微生物保持区与空气收集模块的进气管连通，b)通过任何适合的装置使空气进入所述空气收集模块，c)将空气微生物收集在试验筒的微生物保持区内。本发明还涉及一种空气微生物裂解方法，所述裂解方法由下述阶段组成a)将试验筒放在空气收集模块内，以获得根据本发明的微生物收集装置，试验筒内的微生物保持区与空气收集模块的进气管连通，b)通过任何适合的装置使空气进入所述空气收集模块，c)将空气微生物收集在试验筒的微生物保持区内，d)从空气收集模块上拆下试验筒，e)将转子放置于试验筒内，以获得如权利要求中任一所述的微生物裂解装置，f)将所述微生物裂解装置放置于用于微生物裂解和核酸纯化的系统内，g)将洗脱液引入试验筒，用于悬浮位于试验筒的微生物保持区中的裂解装置，以及h)通过所述转子的转动构件在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子致使所述微生物裂解装置旋转。“洗脱液”是指适于允许核酸在良好条件下裂解，或者甚至提取和回收的任何液体。所述液体通常是缓冲液。在根据本发明的方法用于提取核酸和回收核酸用于分析目的的情况下，所述缓冲液允许所述核酸集中。本领域内的技术人员已知了这种类型的液体。本发明还涉及一种从空气微生物中提取核酸的方法，所述方法由下述阶段组成a)将试验筒放在空气收集模块内，以获得根据本发明的微生物收集装置，试验筒内的微生物保持区与空气收集模块的进气管连通，b)通过任何适合的装置使空气进入所述空气收集模块，c)将空气微生物收集在试验筒的微生物保持区内，
d)从空气收集模块上拆下试验筒，e)将转子放置于试验筒内，f)通过抽吸/排出装置将洗脱液弓I入试验筒内，用于悬浮包含在试验筒内的所述裂解装置，以及g)通过所述转子的转动构件在试验筒内转动转子，机械裂解细胞组织的细胞，所述转子致使所述裂解装置旋转，以及h)抽吸包含在裂解过程中释放出的所述微生物的核酸的洗脱液，i)将洗脱液分配在用于接收和纯化核酸的容器中。优选地，上述的微生物裂解和核酸提取的方法包括由集中在试验筒的保持区中的微生物生长组成的另外的阶段d')。具有优势地，生长通过下述实现在炉子中培养试验筒，持续的时间在2至M小时的范围内。优选地，上述的微生物裂解和核酸提取的方法的阶段f)至i)被应用于用于微生物裂解和核酸纯化的系统中。本发明还涉及一种微生物裂解方法，所述方法由下述阶段组成a)获得试验筒，其中微生物被集中在所述试验筒的保持区内，b)将转子放置于试验筒内，c)将感兴趣的液体引入试验筒内，用于悬浮位于试验筒的微生物保持区中的裂解
装置， d)通过在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子致使所述裂解装置旋转。本发明还涉及一种从微生物中提取核酸的方法，所述方法由下述阶段组成a)获得试验筒，其中微生物被集中在保持区内，b)将转子放置于试验筒内，C)将洗脱液弓I入试验筒内，用于悬浮位于试验筒的微生物保持区中的裂解装置，d)通过在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子致使所述裂解装置旋转，e)抽吸包含在裂解过程中释放出的所述微生物的核酸的洗脱液，以及f)将洗脱液分配在用于接收和纯化核酸的容器中。本发明还涉及一种包含在液体样品中的微生物的裂解方法，所述方法由下述阶段组成a)将包含所述微生物的液体样品引入试验筒中，保持区的附近，以使所述液体样品导致位于试验筒的所述微生物保持区中的裂解装置悬浮，b)将转子放置于试验筒内，c)通过在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子导致位于试验筒的所述微生物保持区中的裂解装置悬浮，所述转子致使微生物被保持于其上的裂解装置旋转。“液体样品”是指可以包含微生物的任何液体样品。其可以是人或动物源的液体样品。所述样品例如可以是全血、血浆或任何其它体液。液体样品可以是食品源的，例如饮料。其还可以环境源的，例如水。另外，液体样品还可以是所谓的传输液，其中呈现在表面取样装置，例如COPAN公司以fIockedSWABS出售的那些，上的任何微生物通过所述清洁棒在所述传输液中的搅动而再次悬浮起来。
本发明还涉及一种从包含在液体样品中的微生物中提取核酸的方法，所述方法由下述阶段组成a)将包含所述微生物的液体样品引入试验筒中，保持区的附近，以使所述液体样品导致位于试验筒的所述微生物保持区中的裂解装置悬浮，b)将转子放置于试验筒内，c)通过在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子导致位于试验筒的所述微生物保持区中的裂解装置悬浮，所述转子致使微生物被保持于其上的裂解装置旋转，d)抽吸包含在裂解过程中释放出的所述微生物的核酸的液体样品，以及e)将液体样品分配在用于接收和纯化核酸的容器中。本发明还涉及一种细胞组织样品的核酸的提取方法，所述方法由下述阶段组成a)将所述细胞组织样品引入试验筒内的洗脱液中，b)将转子放置于试验筒内，c)通过在试验筒内转动转子，机械裂解细胞组织样品，所述转子致使包含在试验筒中的裂解装置旋转，d)抽吸包含在裂解过程释放出的所述细胞的核酸的洗脱液，以及e)将洗脱液分配在用于接收和纯化核酸的容器中。“组织样品”是指从中可以提取核酸的人或动物源的任何组织样品。这种样品可以通过例如器官的、肌肉的或皮肤的切片获得。这些组织可以是健康的或病态的，特别地可以是肿瘤的。应注意，根据具有优势的实施例，所有根据本发明的核酸的提取方法可以具有另外的这些核酸的纯化阶段，目的是随后的处理例如扩增。此纯化阶段允许在核酸和在裂解阶段盐析出的其它细胞成分之间进行分离。本阶段通常可以集中核酸，并且可以被构造成适于DNA或RNA的纯化。其可以借助于磁性颗粒进行。作为示例，可以使用通过吸附或共价键结构可选地涂有寡核苷酸的磁性颗粒(参考专利US 4，672，040和US 5，750，338)，并且因此纯化通过清洗阶段已经被粘附到这些磁性颗粒上的核酸。如果需要随后对所述核酸进行扩增，那么此核酸纯化阶段是特别有用的。这些磁性颗粒的特别感兴趣的实施例在专利文献W0-A-97/45202和W0-A-99/35500中描述了。核酸纯化方法的另一感兴趣的示例是使用柱形式的或惰性颗粒(Boom R.et al. ,J. Clin. Microbiol. ,1990, No. 28 (3), p. 495-503) JlK Wl 1 14 (Merck :MagPrep Silica, Promega :MagneSil Paramagnetic particles) 形式的硅。其它广泛使用的方法是基于纯化柱或顺磁性颗粒形态中的离子交换树脂 (Whatman DEAE-Magarose)(Levison PR et al.，J.Chromatography，1998，p.337-344)。 对于本发明，另一很相关但不排外的方法是在金属氧化物支撑(从Krana公司得到的 Xtra-Bind matrix)体吸附.另外，在上述各种方法中，重构微生物裂解装置，也就是转子被放置于试验筒内， 之后的所有阶段可以具有优势地在用于微生物裂解和核酸纯化的系统中使用。本发明还涉及根据本发明的微生物裂解装置的用法，用于细胞组织样品的细胞的裂解。本发明还涉及根据本发明的用于微生物裂解和所述微生物的核酸的纯化的系统的用法，用于细胞组织样品的细胞的裂解和所述细胞的核酸的纯化用于分析目的。
微生物被从包括下述的组中获得细菌、病毒、酵母菌、霉菌和寄生菌。微生物被从中分离出的样品是环境源的。因此，其可以是空气的或者液体的样品， 例如水，或者可以是表面样品。样品还可以是临床源的，也就是人或动物源的任何样品，其可以是用于检测和识别微生物，可选地病原体，的分析对象。目标核酸的存在可以通过杂交反应的可视化表明。杂交反应是指被捕获的核酸和通过转录阶段、反转录阶段或NASBA (基于核酸序列的扩增)型或聚合酶链式反应(PCR)的扩增阶段而被分离出或产生的目标核酸之间的任何反应。核酸是指寡核苷酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸以及它们的衍生物。术语寡核苷酸表示，天然的或改性的，能够在适合的杂交条件下杂交成至少部分互补的寡核苷酸的至少两个核苷酸的序列(脱氧核苷酸或核苷酸，或两者)。改性的核苷酸例如是指具有改性的碱基和/或在核苷酸间链和/或在骨架上进行了改性的核苷酸。作为改性的碱基的示例， 我们可以提及肌苷(inosine)、5-甲基-脱氧胞苷(methyl-5-de0XyCytidine)、5-二甲氨基-脱氧胞苷(dimethylamino-5-deoxyuridine)、2,6_二氨基口票呤(diamino-2,6-purine) 禾口 5-溴-脱氧尿苷(bromo-5-deoxyuridine)。为了示意改性的核苷酸间链，我们可以提及硫代磷酸酯(phosphorothioate)、 N-烷基氨基磷酸酯(N-alkylphosphoramidate)、烷基膦酸酯(alkylphosphonate)和烷基磷酸二酉旨键(alkylphosphodiester bonds)。alpha-寡核苷酸，例如在FR-A-2 607 507中描述的那些，LNA，例如在Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,Volume 8,Issue 16,18 August 1998,pages 2219-2222 中描述的硫代磷酸(酯)-LNA和2 ‘ -thio-LNA,以及在M. Egholm et al.，J. Am.的文章 Chem. Soc. (1992)，114，1895-1897中讨论的PNA是由具有改性的骨架的核苷酸组成的寡核苷酸的示例。杂交反应可以通过任何检测装置，例如直接或间接装置，看到。在直接检测的情况下，也就是，不用贴标记，杂交反应通过等离子共振技术(plasmon resonance)或通过携带着导电聚合体的电极上的循环伏安法(cyclic voltammetry)观察至Ij0在间接检测的情况下，也就是借助于贴标记，贴标记可以直接在目标核酸上进行或者通过被预先贴标记的所述核酸的特异性结合配偶体进行。目标核酸的特异性结合配偶体是指能够结合到目标核酸上的任何配偶体，并且作为示例，我们可以提及核酸、寡核苷酸或多核苷酸和酶底物(enzyme substrates) 0“贴标记”是指粘贴能够直接或间接产生可检测信号的标记。这些标记的非详尽的列表包括例如通过电化学、色度学、发荧光、发光产生可检测信号的酶，酶例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)、α -半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；酶抑制剂；酶辅因子；颗粒例如金颗粒、磁球、脂质体；发色团例如发光化合物、染料，放射性分子例如32P、35S 或125I，荧光性分子例如荧光素，若丹明，Al exa，伞形花内酯，鲁米诺或藻青苷。在荧光物的情况下，其可以酶底物反应、荧光猝灭剂组合、荧光消光或基于荧光特性的任何其它系统的荧光产物。还可以使用间接系统，例如通过另一配体/抗配体对。本领域内的技术人员已经知道配体/抗配体对，并且例如我们可以提及下述对生物素/链霉亲和素，糖/外源凝集素，多核苷酸/互补多核苷酸。在这种情况下，携带着结合剂的是配体。抗配体可以通过在前述段落中描述的记号检测到或者可以自身通过配体/抗配体检测到。在某些情况下，这些间接系统可以导致信号放大。此信号放大技术已经被本领域内技术人员已知了，并且可以参考申请人以前的专利申请FR-A-2 781 802或 W0-A-95/08000 或参考论文 J. Histochem. Cytochem. 45 :481-491,1997。通过聚合酶、通过激酶(kinase)随机地或特别地在端部直接或间接引入记号，或者通过在分子“内”引入，目标核酸可以被预先贴标记。目标分析物的特异性结合配偶体的贴标记已经被本领域内的技术人员广泛已知了，并且例如Greg T. Hermanson在Bioconjugate Techniques, 1996, Academic Press Inc, 525B Street, San Diego, CA92101 USA 中进行了描述。根据所使用的缀合物的贴标记的类型，例如使用酶，本领域内的技术人员将添加允许标签可视化的试剂。此阶段对应于检测。在这之前利用清洗缓冲液除去在反应中不涉及的，或者结合较弱的或非特异的，那部分分析物或元件。
根据本发明的装置的目的和优势将从下面参考附图给出的不以任何方式进行限制的示例中得到更好的理解，其中图1示出了用于微生物的收集和裂解的试验筒的纵向剖面的视图；图2示出了根据特殊实施例的用于收集空气微生物的装置的纵向剖面的视图；图3示出了如图1所示的微生物收集装置的纵向剖面的放大的局部视图；图4示出了微生物收集装置的上部元件的内部的透视图；图5示出了如图3所示的微生物收集装置的上部元件的内部的局部透视图；图6示出了微生物裂解装置的纵向剖面的视图；图7示出了由微生物裂解装置和多路阀组成的组件的纵向剖面的视图；图8A示出了在多路阀的第一配置中用于微生物裂解的系统在多路阀水平处的纵向剖面的局部视图；图8B示出了在多路阀的第二配置中用于微生物裂解的系统在多路阀水平处的纵向剖面的局部视图。
具体实施例方式试验筒10，在图1中示出了纵向剖面，具有大致圆形横截面的圆柱体的大体形状。 圆柱体的顶端敞开，低端由壁组成，底端中心处有孔，在其延伸部中是延伸到试验筒10内的管12。可以看出，管的内部截面随着靠近其顶端趋于减小。如图1中可以看出，试验筒10的底壁14的内表面是倾斜的，斜面的最低点位于其与管12接触的地方而最高点与试验筒10的竖直壁16接触。此壁14用作裂解装置18的支撑并且构成微生物保持区。在本实例中，这些裂解装置由相同尺寸的珠构成。根据优选实施例，这些珠是玻璃的。但是，它们可以由任何其它等效的材料例如铁构成。这些珠具有优势地直径在200和800微米(μ m)之间。根据具有优势的实施例，珠可以具有不同的尺寸。因此，使用直径在200和300 μ m之间的珠与直径在400和600μπι之间的珠的混合物可能是特别适当的。这些珠由例如 SIGMA公司作为酸洗玻璃珠在市场上出售，规格为直径425-600 μ m, ref :G8772。借助于优选被置于珠上的凝胶材料19层，这些珠被以一个或多个悬浮层 (superposed layer)的形式保持在位。凝胶材料必须满足几个要求。第一是其必须是惰性的，以不影响在试验筒内进行的程序。第二是它必须具有在液体中溶解的能力，以用于微生物裂解。例如，所述材料可以是琼脂糖凝胶(Sigma Aldrich,Agarose-Type I-B Low EEO, Ref. :A0576-25G)。凝胶材料还可以包含甘油。可替代地，凝胶材料可以具有优势地是微生物培养基。实际上，在体外诊断领域按照惯例琼脂培养基已经使用很长时间了。所述培养基的使用提供了若干优势。主要的优势在于其允许在进行微生物裂解前的微生物生长阶段。即使根据本发明的装置目的在于满足与病原微生物快速检测有关的需要，然而，几分钟至几小时的生长阶段将允许微生物繁殖， 这样的直接效果是大量核酸可供我们支配(这使得可以利用收集在需要控制的房间内的空气样品的回收和传递所固有的延迟，直到适当的分析开始为止)。使用培养基的第二优势是对于一个或多个指定种群来说培养基可以是选择性的。因此，这些培养基的使用可以允许选择性的生长并且因此在牺牲不感兴趣并且可能干扰分析的其它微生物的情况下检测某些病原微生物。因此，可以设想供应若干种不同的试验筒，每一个被构造成适于检测特殊种群的微生物。试验筒10的尺寸例如内径可以从8至16mm，优选12mm。珠层的总厚度典型地在 1和2mm之间，这相当于玻璃珠的量为0. 1和Ig之间，优选0. 3g。具有优势地，试验筒10通过注射成型技术制造。所使用的材料例如是聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、循环环烯烃(CCO)或PMMA，优选聚碳酸酯。微生物收集装置20在图2中示出了。本装置由试验筒10被置于其中的空气收集模块组成。本空气收集模块由上部元件22和下部元件M组成。上部元件22是大体圆柱形形状。在图4和5中示出了其透视图。此圆柱体的底端敞开，顶端被水平壁26部分密封。此壁沈在其中心处具有通过管28延伸到上部元件22 内的孔。实际上本部分构成了允许空气进入空气收集模块20内的管。根据特殊实施例，此进气管可以通过任何适合的装置被连接至空气循环回路的通道。尖顶拱形的锥形体30被放置于此管底部的中心处。此锥形体30通过叶片32被联接至管观的壁。这些叶片32可以在图4和5中清楚地看到。在这些图示给出的实施例中，它们的数目是三。但是，它们的数目可以改变。如图2中所示，锥形体30和叶片32的组件的作用是在管观的底部制造进入微生物收集装置的气流的扰动，以使此被扰动的气流与微生物保持区的凝胶材料接触， 导致排空微生物保持区。此排空大大改善了空气微生物的捕获。如图2和4中所示，上部元件22还具有三个定心销34和三个锁销38。定心销34 用于保证试验筒10相对于上部元件22的正确定心。锁销38提供试验筒在上部元件22的其定心位置上的锁定。这在图2中被清楚地示出了。上部元件22在其下部分上具有肩部和槽，它们被在竖直壁的整个外周上制造并且意于帮助将上部元件22和下部元件M联接在一起。下部元件M也是大体圆柱形形状。此圆柱体的顶端敞开，底端被水平壁40部分密封。水平壁40在其中心部分具有大致圆柱形开口 42用于排空空气。下部元件对还包括用于支撑和定位试验筒10的销44。下部元件M接着被定位于上部元件22上。借助于销44，试验筒10被再次定位搁靠在下部元件M上。实际上，当试验筒10被置于下部元件 24上时，元件44进入试验筒的管12，因而，将试验筒放置并且锁定在正确的位置中。下部元件M的竖直圆形壁的顶端在其内表面上可以具有在此壁的整个外围上制造的唇缘。此唇缘意于与提供于上部元件22上的肩部和槽相互作用，以在上部元件22和下部元件M之间提供锁紧。分别通过上22和下M元件的下和上端的互补形状而允许将它们安装到一起。有必要使此连接是可逆的。用于将元件22和M联接在一起的可替代地方式是通过将一个元件螺纹连接到另一上而进行连接。为此目的，元件22或M的一个的壁的端部可以具有外螺纹，而第二元件的壁的端部可以具有相应的内螺纹。重要的是对收集装置进行密封，以避免空气的任何寄生进入。根据使用空气收集装置的特殊方式，排气管22的底端可以被连接至空气抽吸泵 (图中未示出)或任何等效的泵吸装置。此泵被用于将环境空气抽吸到空气收集装置内，例如当我们希望在特殊的环境下，例如医院房间或用于生产医药品或食物的房间，对环境空气进行分析时。为此目的，具有自动并且连续操作的泵吸装置可能是优选的。空气收集模块，22和M，例如外径可以在10和40mm之间，优选20mm。进气管的内径例如为6mm。具有优势地，空气收集模块20可以由能够被消毒，特别是通过高压灭菌消毒，的材料制成。因此，其可以是金属的，例如铝或钢。其还可以是聚合体例如聚碳酸酯、循环环烯烃(CCO)或PMMA的。当微生物收集装置中的空气循环被接通时，空气行进的路径在图2中用箭头表示了。因此可以看出空气通过进气管观进入微生物收集装置。试验筒10的管12被部分插入进气管观中，更具体地被插入锥形体30中。管观底部的气流在锥形体30的顶点处被改变成外围流(peripheral flow)。而且，锥形体30的存在还防止了空气进入管12。如上所述，被扰动的气流到达凝胶材料19上(珠18没有被示出)，通过在气流中输送的微生物的撞击而得以保持在这一点上。因此，此过程相对类似于在微生物学空气取样器中发生的那样。至于空气，其在其路径上继续被泵吸装置抽吸。空气沿着试验筒10的竖直壁16 的内表面上升。再沿着此同一壁的外表面下来并且通过排气口 42离开空气收集模块20。收集在空气收集模块20中的气流可以例如在20和100升/分钟(Ι/min)之间。 具有优势地，为501/min。微生物在试验筒内的保持/集中阶段完成后，通过从空气收集模块上拆开上22和下M元件，或者通过分开或者通过拧开，试验筒被从所述装置上拆除。如果我们希望对集中在所述试验筒中的微生物进行培养，那么在此阶段，具有在炉子中在37°C下培养试验筒的机会。如上面已经解释的，所述培养通常持续几十分钟至几个小时，以不过渡延长分析时间。但是，如果在获得分析结果方面没有紧急情况，可以设想试验筒的培养持续时间越长越符合细菌生长的要求，也就是约二十四小时。类似地，还可以设想将试验筒存储在适于所述存储的环境例如冷室中，如果我们希望推迟分析的话。
根据本发明的一个实施例，试验筒10可以被提供直接放置于空气收集模块内。这种类型的表述的优势是使用者不必须将试验筒放在空气收集模块内，因此，降低了在此阶段期间污染的危险。在这种情况下，如果空气收集模块与试验筒由相同材料制成，也就是由聚丙烯、聚碳酸酯或PMMA制成，将是特别具有优势地。通过注射成型制造是特别适合的。当微生物的收集以及可能的培养完成时，试验筒10被连接至转子50，从而组成微生物裂解装置，如图6中所示。为此目的，转子50被通过试验筒的自由端利用竖直平移运动而插入试验筒10中。转子50，在图6中示出了其纵向剖面，具有圆形横截面的大体圆柱形形状的本体。 本体在其外壁的上部分上具有凸缘52，其功能是保证当转子被完全插入试验筒10内抵靠在试验筒10的竖直壁的顶端上时试验筒10和转子50的组件是液体密封的。为了加强密封，帽M可以通过任何适合的装置安装在试验筒10上，以使转子50 与试验筒保持为一体。例如，帽M可以通过形状配合或螺纹连接而被安装。帽是大体环形形状并且将被绕装在转子的顶部上，转子的顶部构成提供于转子内的盲管56。在盲管的顶端，两个在直径方向上对置的槽57被形成在壁上。这些槽具有接收用于转动所述转子的装置92的传动轴90端部的功能，如图8A和8B中所示。因此，此轴的端部具有与这些槽互补的形状，即将被插入到这些槽内的肋的形式。驱动轴可以是电动机轴。可替代地，其可以是用于手动旋转的装置的一部分。如图6中所示，转子50在其下部分具有优选与试验筒10的内部形状互补的外部形状。因此，转子50将优选被定位于试验筒10内，而管12通过被插入提供于转子50底部的腔58中而行使导引功能。此腔58是具有圆形截面的大体圆柱形形状并且其顶端是大体圆锥形形状。转子50被定位成直到其底壁59靠在由珠18和凝胶材料19组成的组件上。具有优势地，转子50和帽M被由与试验筒相同的聚合体材料制成，也就是由聚丙烯、聚碳酸酯或PMMA制成。优选地，这些部分通过透明聚碳酸酯(Makrolon ^58，Bayer) 的注射成型制成。因此，试验筒10和转子50和帽M的组件构成根据本发明的微生物裂解装置60 并且在下文中将被称为“裂解装置”。裂解装置被构造成后，被放置于4通阀上，如图7中所示。此阀70具有意于接收裂解装置60的第一通路701。所述裂解装置通过试验筒10的管12的底部而被连接到阀上。第二通路具有意于被连接至第一吸入-排出装置上的连接孔702，第一吸入-排出装置是根据本发明的用于微生物裂解和核酸纯化的系统的一部分。具有优势地，此吸入-排出装置是还被连接至包含洗脱缓冲液的溶液的容器的泵。所述泵在图8A和8B中被示意性示出了。其操作将在下面进行解释。第三通路具有在上面固定有一次性锥形体72的连接孔 703。最后，第四通路由第二吸入-排出装置704构成。此第二装置是与阀集成为一体的注射器。此注射器704意于与形成根据本发明的用于微生物裂解和核酸纯化的系统的一部分的平移致动装置互相作用并且意于用于移动所述注射器的活塞。最后，阀70具有包括两个流体通道的中心轴74。如在图7中所示，这两个通道分别一方面，在裂解装置60和连接孔702之间，另一方面，在注射器704和在上面固定有一次性锥形体72的连接孔703之间， 提供连接。轴74可以被转四分之一圈，以改变流体连接。这样，连接孔702被连接至连接孔703并且裂解装置60被连接至注射器704。
由裂解装置60和阀70构成的组件构成可消耗部分。然后将其放置在用于微生物裂解和核酸纯化的系统上。它是具有三个独立的主要功能的自动系统裂解功能，、液体传输功能和纯化功能。这些功能将在下面进行描述。裂解装置60和阀70的组件被以下面的方式放置于用于微生物裂解和核酸纯化的系统统中。首先，具有安装此组件的专用位置。此位置的特征在于其具有用于固定阀70的装置。这些固定阀70的装置可以例如由臂或爪构成，阀被用力插入它们之间。裂解装置60和阀70的组件入位后，对阀制造各种连接。这在图8A和8B中示意性示出了。这样，第一连接通过阀70的连接孔702产生。将永久地位于自动系统上的吸入-排出装置80连接至连接孔702是最后的连接。如上面解释的，优选被固定的泵的形式的此吸入-排出装置80是自动系统的集成部分，这在图8A和8B中没有完全示出。更精确地，泵80实际上被连接至也被永久置于自动系统上的阀82。而且，此被固定的阀82—方面通过连接孔702与阀70流体连接，另一方面与包含所谓的洗脱缓冲液的储蓄池84连接。这样，被固定的阀82使得被固定的泵80根据其位置或者连接至阀70或者连接至储蓄池84。裂解装置和阀的组件还被连接至用于转动裂解装置的转子的装置92的传动轴 90。应注意，一旦形成此连接，传动轴90即沿着图8A的箭头A的竖直分量在转子上施加压力，以使此压力被从转子传递到由珠18和凝胶材料19组成的组件上。裂解装置和阀的组件与自动系统之间的第三连接由阀70的注射器704和所述注射器的致动装置94之间的连接组成。此致动装置是平移致动装置例如由步进电机和蜗杆组成的组件，并且使得可以或拉或推注射器704的活塞，从而或者将液体吸入注射器内，或者排出包含在注射器中的液体。最后，裂解装置和阀的组件与自动系统之间的第四连接涉及用于旋转致动阀70 的轴74的装置。此装置没有在图8A和8B中示出。能够致使传动轴转动的是电机，所述传动轴被连接至阀70的轴74。在应用收集在试验筒10中的微生物裂解方案的过程中，阀70被配置成使裂解装置60与由泵80和被固定的阀82构成的组件流体连接。注射器704与在上面固定有一次性圆锥体的连接孔703流体连接。被固定的阀82初始被配置成使泵80与洗脱缓冲液储蓄池84流体连接。泵80抽吸预定量的洗脱缓冲液。然后改变被固定的阀82的配置以使泵 80通过阀70与裂解装置60流体连接。之后泵80排出被吸收的所述体积的洗脱缓冲液，洗脱缓冲液流入裂解装置60内并且更特别地流入试验筒10的内壁和转子50的外壁之间的孔隙空间内(参考图6)。洗脱缓冲液弄湿凝胶材料19和珠18。通过洗脱缓冲液以及转子 50的慢速旋转的组合作用，凝胶材料18被溶解。珠之后悬浮在凝胶材料19内。此悬浮操作，与转子施加的压力作用以及转子的转动相结合，导致一小部分珠18移动进入试验筒10 的内竖直壁和转子50的外竖直壁之间的孔隙空间内。应注意，此孔隙空间的宽度优选600 和SOOym之间。此宽度与所使用的珠18的直径直接相关。实际上，珠必须同时能够在此空间内容易地流通并且能够通过转子50的旋转而被转动。为此目的，转子的竖直外壁可以具有帮助转动珠的粗糙表面。—旦珠被在试验筒的保持区域内并且沿着转子的竖直壁分布，转子即能够被完全插入试验筒中。当然，保持在凝胶材料上以及保留在珠上的微生物被洗脱缓冲液液流以与珠18相同的方式转移至孔隙空间内。一旦珠18被沿着转子50的竖直外壁分布，适当的裂解阶段即被开始。通过转动装置/电机92并且借助于传动轴90，转子50被转动。然而，在不使用用于微生物裂解和核酸纯化的系统的更简单的方案中，可以设想手动地转动转子。作为示例，转动速度的数值可以在200和3000转/分之间。优选地，为了使珠和洗脱缓冲液在孔隙空间内的分布和均质化，转子初始以200转/分的慢速度转动。此慢速旋转约持续15秒。接着提高转速，到达1000和3000转/分的数值，持续的时间在1和5分钟之间。 在此期间，对从空气中收集来的任何微生物进行裂解。非常明显地，转子的速度和转动时间的选择取决于将要裂解的微生物类型。在此阶段期间，珠18通过与转子的竖直外表面和试验筒的竖直内表面的摩擦而围绕着它们的对称轴线转动。此双旋转(double rotation)导致被捕获在珠18与转子的相应表面或者与试验筒的相应表面之间的微生物的机械裂解。这使得核酸被释放到洗脱缓冲液中。一旦裂解阶段结束并且核酸已经被释放，包含核酸的洗脱缓冲液必须被吸出。因此通过转动轴74改变阀70的配置，以使裂解装置60和注射器704再次流体连接，如图8B 中所示。通过致动装置94平移移动注射器704的活塞，以将包含核酸的洗脱缓冲液抽吸到所述注射器704内。此抽吸阶段在转子50仍被转动但在低速度下转动(约200转/分) 的同时发生。之后，阀70返回其初始配置，如图8A中所示，以使注射器704与连接孔703流体连接。包含核酸的洗脱缓冲液已经准备好通过锥形体72被分配到管中了，从而实现纯化所述核酸的目的。实际上，包含在洗脱缓冲液中的裂解物不但有效地包含核酸，而且还包含所有细胞碎片。为此，使分析管96靠近锥形体72。具有优势地，自动系统具有用于接收所述管的保持器。在这种情况下，所述保持器可以被连接至可以在其中管可以被插入保持器中的底部位置或停靠位置与其中管位于锥形体72附近的顶部位置或工作位置之间移动的臂(如图8A和8B中所示)。当然，优选锥形体72进入管96内。管96包含所谓的裂解缓冲液和核酸纯化所需要的磁性硅颗粒。这些颗粒直径在1和3μπι之间。而且，预先穿通的隔膜 (图中未示出)被放置于管96的孔上，以避免对管96的任何污染。当管96升高时，锥形体72通过被预先穿通的孔而穿过隔膜。具有裂解物的洗脱缓冲液被分配到分析管中。在此阶段，优选使用注射器704进行若干次吸入/排出，以使裂解物与裂解缓冲液和磁性颗粒均质化，裂解缓冲液的功能是稳定核酸(保护其不受核酸酶影响)以及将PH调整到捕获阶段的最佳值。如果混合物被恰当地均质化，管可以被保持静止以允许通过磁性颗粒被动捕获 (passive capture)核酸。静止的时间例如可以是2分钟。在均质化不恰当或缺乏均质化的情况下，核酸的捕获将主动进行。实际上，管和其包含的磁性颗粒将被呈现到不同方向的磁场中。为此，管被置于底部位置并且然后通过承载它的臂使之与磁铁接触。这些磁铁可以被放置在与承载它的臂集成在一起的两个平行板上。这两个板可借助于特殊的移动装置 (ad hoc displacement means)在水平的平移中移动并且被如此移动以使管位于所述板之间。每个板上的磁铁数目是可变的。使磁铁位于板上的不同高度是具有优势的。而且，重要的是一个板上的磁铁不与另一板上的磁铁相对，而是按照预定的顺序相对于管的移动方向偏置。因此，在板的移动过程中，管或者被逐渐呈现到第一板上的磁铁的磁场中，或者被逐渐呈现到第二板上的磁铁的磁场中。这些磁场可以被定位在相对于板的轨迹的不同高度处。因此，被这些磁铁吸引的磁性颗粒形成簇，并且致使所形成的簇与磁铁施加的吸引力以及特别是与它们相对于管的位置相关地在管中移动。应注意，磁铁相对于分析管的相对定位也可以通过使管沿着竖直轴线移动而得到；在该情况下，所有磁铁被置于同一高度并且按照预定的顺序布置。在核酸主动捕获(active capture)的情况下，所述捕获专用的时间将更长(在4和6分钟之间)。一旦核酸被捕获，即应用一个或多个连续的清洗阶段。为此目的，管被放置成与处于高位置中的磁铁相对，以将携带核酸的磁性颗粒积聚在抵靠着竖直壁的管的上部分内。 然后，管被移动至高位置，以使锥形体72与包含在管中的液体接触。通过致动其活塞包含在管中的液体被抽吸到注射器704中。注射器704用作被抽吸在管中的液体废物的存储容器。为了开始核酸的清洗，阀74被置于其中连接孔702以及因此泵80与连接孔703流体连通的配置中。阀82被置于允许通过泵80抽吸洗脱缓冲液的位置中。被抽吸的洗脱缓冲液的体积例如是300μ 1。改变阀82的位置以使泵80能够将洗脱缓冲液分配到管96内。 为了保证最佳的清洗，管被返回到低位置并且携带着磁铁的板被再次移动以最优化颗粒和洗脱缓冲液之间的交换。根据要求板能够在变速度中实现若干个往复移动。然后包含在管中的洗脱缓冲液被借助于注射器704抽吸，如上面所述的。可选地，新的清洗阶段可以以相同的方式进行。应注意，注射器704的活塞在这些阶段中被致动，以使注射器704被逐渐充满被抽吸在分析管中的液体，不管其是裂解缓冲液或是用于清洗的洗脱缓冲液。一旦核酸被转移至分析管中，注射器704将只被分配存储液体废物的作用，这代表着巨大的优势。而且，应注意，泵80只用于分配洗脱缓冲液并且永不与“被污染”的物质接触。本方面也是特别重要的，因为泵80和阀82永久地保持在自动系统上，与意于只使用一次的作为阀74的集成部分的注射器704相比。执行了核酸清洗之后，管72中的洗脱缓冲液的最后抽吸只是部分的。实际上，预定体积的洗脱缓冲液被留在管内并且构成其中核酸将被洗脱，也就是被从磁性颗粒上离解，的洗脱体积。洗脱体积可以在5和150 μ 1之间变化，并且优选在25至40 μ 1之间变化。对于此最后的抽吸，通过使管与处于低位置中的磁铁相对，磁性颗粒的簇被形成在管的底部。相反，抽吸被从液体的表面上实现，以避免对颗粒的任何抽吸。在剩余的体积中，进行核酸的洗脱。为此目的，通过与管保持器集成为一体的加热模块，将管被加热至75°C，直到液体中的温度达到65°C约5分钟。同时，利用加热步骤，管被呈现至位于低位置中的磁铁上，以促进洗脱。在洗脱体积中完成了核酸的纯化和洗脱之后，核酸可以被扩增以用于分析目的。 为此，洗脱体积的一些或所有必须与用于扩增的所谓的条件缓冲液接触GOmM Tris HCl, pH 8. 5,12mM MgC12,70mM KC1，5mM 二硫苏糖醇，15 % v/v DMSO, ImM dNTP，每 NTP 2mM, 0. 2 μ M引物(primers)，0. 1 μ M分子信标)。此接触可以根据在自动系统上可获得的功能性按照两个不同的方案实现。根据第一方案，洗脱和扩增调节在两个不同的管中进行。在这种情况下，必须从分
1析管中取出包含被纯化的核酸的预定部分的洗脱体积。将这一部分分配到将在其中进行扩增调节并且已经包含了所需量的用于扩增调节的缓冲液的第二管中。然后，将此管转移至在其中进行核酸扩增的器械中。借助于被固定的泵80取出反应体积的部分。在这种情况下，阀70和82已经被配置成允许泵80和连接孔703之间流体连通。分析管被置于高位置以使锥形体被浸入洗脱体积中。这一部分被泵80抽吸。据回顾，贯穿裂解和纯化的方案，此泵80以及更通常地那部分洗脱体积使用的流体回路只与洗脱缓冲液接触。因此不可能污染将被用于核酸扩增的那部分。取得这一部分后，即用用于扩增调节的管替代分析管。为此目的，分析管被移至低位置，以使其可以被从保持器上取下并且可以将用于扩增调节的管放入位。接着将管升高至高位置以使锥形体进入管内并且通过泵80分配那部分洗脱体积。可替代地，自动系统可以被提供有用于管理和传递用于扩增调节的管的特殊模块。此第一方案提供了避免在硅颗粒和用于扩增调节的缓冲液之间接触的优势。实际上，已经知道这些颗粒可以抑制核酸的扩增反应。根据第二方案，用于扩增调节的缓冲液和洗脱体积被在分析管中直接接触，在这种情况下，用于扩增调节的缓冲液被添加至分析管中。所述添加可以手动或自动进行。在这种情况下，自动系统必须被永久装备有第二分配系统，也就是包含用于扩增调节的缓冲液的容器、用于所述缓冲液的抽吸和排出的注射器、与阀82等效的阀以及可以穿过安装在分析管上的隔膜的针管或锥形体。不管使用哪种方案，在获取最终用于扩增的那一部分之前，将硅颗粒的簇移除到单独的洗脱体积外面，或移除到包含在分析管中的洗脱体积与用于扩增调节的缓冲液的混合物的外面可能是具有优势地。这可以通过移动管使之被处于高位置中的磁铁磁化而实现。而且，所有根据本发明的系统和装置，如上所述的，被构造成适于允许具有贯穿微生物裂解和核酸纯化的方案的完全跟踪能力。实际上，首先，所有消耗品(试验筒、转子、多路阀、管)被利用特殊的识别装置识别(1D或2D条形码、RFID标签等)。而且，在微生物被空气抽吸装置收集的情况下，抽吸装置必须能够具有无线通信装置，使其能够与用于微生物裂解和核酸纯化的系统通信。所述无线通信装置例如是WiFi (标准802. lib)、蓝牙(标准802. 15)或ZigBee (标准802. 15.4)系统。可以通过这些无线连接系统传输的数据可能例如与位置(收集房间/点)、取样条件(时间、流速、湿度测定法、温度、大气压力)、操作者以及当然识别消耗品的元件的身份证明有关。根据本发明的装置和系统也完全适于临床样品，例如来自全血或来自组织切片的样品，的分析。在这种情况下，试验筒在没有空气收集模块的情况下使用。在液体样品例如全血的情况下，样品被置于试验筒中，然后试验筒被与帽内的转子组合，构成微生物裂解装置。将微生物裂解的装置放置在用于微生物裂解和核酸回收的自动系统中。在组织切片的实例中，组织首先被切成几毫米的切片然后放置在试验筒中，试验筒与与帽内的转子组合， 构成微生物裂解装置。将微生物裂解的装置放置在用于细菌裂解和核酸回收的自动系统中。示例
示例1 参考方案制备消耗品-制备试验筒试验筒被充填预定量的玻璃珠和琼脂糖凝胶-0. 3 至 0. 45g 的玻璃珠(直径=420-600 μ m)-凝胶体的成分琼脂-1%甘油用于执行微生物裂解的洗脱缓冲液的体积是300 μ 1。制备分析管被置于自动系统中并且意于回收裂解物的分析管被充填有30 μ 1的磁性硅颗粒和200 μ 1的裂解缓冲液(硫氰酸胍)。-裂解参数裂解时间4分钟转子转速200转/分(低速)；2000转/分(高速)-裂解参数人i式膽献路_髓軸白_及注射器的抽吸体积=1000 μ 1注射器的抽吸速度=70mms-l抽吸过程中转子的转动时间=9s抽吸过程中转子的转速=200rpmmm^hk^mmmm^vMix^w^w,从多路阀的注射器抽吸的体积=1000 μ 1注射器的抽吸速度=7(toims-l-核酸纯化的参数纯化包括3个阶段-核酸的分离-用洗脱缓冲液清洗(3次)-在洗脱缓冲液洗脱(pH8. 5)将裂解物转移至分析管(0. 5ml)后，分析管包含30 μ 1的硅珠，200 μ 1的裂解缓冲液和120-150 μ 1的裂解物。借助于磁铁施加两种类型的硅颗粒的振荡(oscillations) 在处于高位置中的磁铁之间产生的高振荡 在处于低位置中的磁铁之间产生的低振荡高振荡被用于通过磁性颗粒实现核酸的捕获，还用于清洗阶段(除去上层液 (supernatant))0低振荡被用于洗脱阶段并且与管的加热相结合。核酸捕获参数振荡速度=5mms_1振荡次数=112振荡振幅=27mms_1清洗参数
振荡速度=5mms_1振荡次数=10振荡振幅=27mms_1除去上层液的参数被多路阀的注射器抽吸的体积=600 μ 1泵吸速度=IOOmms-1iM寸掘軸俯軸白倾侧膽■碰赫分配体积=400 μ 1泵吸速度=IOOmms"1洗脱参数振荡速度=50mms_1振荡振幅=9mms_1目标温度=75 0C加热时间=300s洗脱缓冲液的体积=45 μ 1示例2 组织的机械裂解进行了一项研究，用于评估以破坏微生物的活细胞壁释放tRNA为目的的根据本发明的裂解装置中的机械裂解的性能。这些试验被在固体肿瘤样品上进行。制作和试验的方案·试剂&设备-乳癌肿瘤，被预先脱脂并且用Qiagen销售的RNAlater 设备稳定，-皮式培养皿，-消过毒的2mL管，-塑料镊子和一次性解剖刀，-用碘苯腈净化过的根据本发明的裂解装置(试验筒和转子)，-400-600 μ m 的玻璃珠，-Qiagen销售的RNeasy Plus试剂盒+Qiacube自动提取系统。·制备-开始提取前，用RNAseZap清洗工作台和吸量管，-将肿瘤在-80V下冷冻，解冻，-将肿瘤放在皮式培养皿上，避免取出RNAlater< ,-用300μ L的RLT缓冲液^jiagen)清洗两次，以除去残留的RNAlater。·研磨肿瘤-用解剖刀细心切割肿瘤(直径约4mm)，-使用塑料镊子回收肿瘤碎片并且将它们转移至包含300μ L RLT (+3 μ L的β-巯基乙醇)的2mL管中，-用下述研磨肿瘤的碎片· Qiagen Tissue Ruptor 速度 2 持续 2 分钟，或者 根据本发明的微生物裂解装置0. 4-0. 5g的玻璃珠000-600 μ m)，2000转/分，2X20 秒。-回收样品并且用RLT缓冲液调节体积以在纯化前具有300μ L的体积。·用 Qiagen RNeasy Plus Mini 试剂盒纯化 tRNA 1.将研磨后回收的没有剩余肿瘤碎片的300 μ L的RLT缓冲液放入2mL管中，2.准备2种类型的纯化柱用于RNA的纯化和固定column gDNA Eliminator和 RNAspin,3.准备缓冲器，Qiagen提取穿梭器(extraction shuttle)和洗脱管，4.按照机器人的指导准备Qiacube试验器并且开始运行，5.回收80 μ 1的洗脱液并且在_80°C下冷冻纯化的tRNA，6.剂量每Nanodrop 1 μ L纯洗脱液，7.测量所提取的tRNA的质量质量分析根据Agilent生物分析仪上的RNA 6000 Nano方案进行。正如传统的电泳中那样，观察到了转录体的分布，具有18s和^s rRNA的两个主要峰值。结果在本研究中使用了两个切片，它们被相同地制备和存储。这些切片是圆形的，直径约4mm厚度1.5mm。估计它们的质量约10mg。这些切片大致被分成两半以并行进行两种类型的机械裂解(参考裂解Tissue Ruptor和PPM)。但应注意，所使用的组织的量从一个试验到另一试验不同，目的是保证试验的正确进行，而不是比较参考技术和根据本发明的方案之间的性能。纯度的分析是基于不同波长下吸光值之间的比值核酸260nm，盐230nm和蛋白质 ^Onm。比值接近2反映核酸纯度很好。
权利要求
1.一种用于收集空气微生物的微生物收集装置，所述微生物收集装置包括 空气收集模块，包括上部元件，其具有允许气流进入空气收集模块的进气管，所述进气管在其底部被提供有用于扰动气流的装置，下部元件，其具有排气装置，允许所形成的气流离开，所述上部元件和下部元件可以被彼此制成一体，以使气流可以在空气收集模块内部形成；试验筒，其具有大致圆柱形形状，具有微生物保持区，所述微生物保持区具有微生物裂解装置，所述试验筒被定位于所述空气收集模块内。
2.根据前一权利要求所述的微生物收集装置，其中，所述试验筒的微生物保持区还包括能够保持微生物，能够将所述裂解装置保持在位并且能够在液体中溶解的材料。
3.根据权利要求1或2所述的微生物收集装置，其中，所述用于扰动气流的装置包括被定位在所述进气管的孔中心处的尖顶拱形形状的锥形体和连接所述尖顶拱形形状的锥形体与所述进气管的内表面的至少一个叶片。
4.根据前述任一权利要求所述的微生物收集装置，其中，所述空气收集模块被连接至空气循环回路或空气抽吸装置。
5.一种微生物裂解装置，所述微生物裂解装置包括试验筒，其为大致圆柱形形状，具有微生物保持区，所述试验筒执行转子的任务； 转子，其可以被置于试验筒内，所述转子具有旋转构件。
6.根据前一权利要求所述的微生物裂解装置，另外具有用于将转子与试验筒保持为一体的帽。
7.根据权利要求5或6所述的微生物裂解装置，其中，所述旋转构件由在盲管壁上制造的槽组成，所述槽被在直径方向上对置布置并且被构造成接收用于转动所述转子的装置的传动轴的端部。
8.根据权利要求5至7中任一所述的微生物裂解装置，其中，所述试验筒的内径大于所述转子的外径，以当转子被安装在试验筒内时，从试验筒内壁到转子外壁的距离足够大以允许所述裂解装置被置于此孔隙空间内并且足够小以使所述裂解装置与所述壁的一个或另一个接触。
9.一种用于微生物裂解和所述微生物的核酸纯化的裂解系统，包括 用于定位如权利要求5至8中任一所述的微生物裂解装置的定位装置； 当所述裂解装置被置于所述定位装置上时用于转动所述转子的装置； 至少一个用于接收核酸的容器；至少一个用于液体的抽吸/排出的装置；多路阀，其与所述微生物裂解装置、用于接收被纯化的核酸的容器以及用于液体的抽吸/排出的装置流体连通。
10.根据前一权利要求所述的裂解系统，另外包括用于磁化的装置。
11.根据权利要求9或10所述的裂解系统，另外包括加热装置。
12.根据权利要求9至11中任一所述的裂解系统，其中，所述多路阀包括抽吸-排出装置。
13.一种收集空气微生物的方法，所述方法由下述阶段组成a)将试验筒放在空气收集模块内，以获得如权利要求1至3中任一所述的微生物收集装置，试验筒内的微生物保持区与空气收集模块的进气管连通，b)通过任何适合的装置使空气进入所述空气收集模块，c)将空气微生物收集在试验筒的微生物保持区内。
14.一种空气微生物的裂解方法，所述方法由下述阶段组成a)将试验筒放在空气收集模块内，以获得如权利要求1至3中任一所述的微生物收集装置，试验筒内的微生物保持区与空气收集模块的进气管连通，b)通过任何适合的装置使空气进入所述空气收集模块，c)将空气微生物收集在试验筒的微生物保持区内，d)从空气收集模块上拆下试验筒，e)将转子放置于试验筒内，以获得如权利要求5至8中任一所述的微生物裂解装置，f)将所述微生物裂解装置放置于用于微生物裂解和核酸纯化的系统内，g)将洗脱液引入试验筒，用于悬浮位于试验筒的微生物保持区中的裂解装置，以及h)通过所述转子的转动构件在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子致使所述微生物裂解装置旋转。
15.一种从空气微生物中提取核酸的方法，所述方法由下述阶段组成a)将试验筒放在空气收集模块内，以获得如权利要求1至3中任一所述的微生物收集装置，试验筒内的微生物保持区与空气收集模块的进气管连通，b)通过任何适合的装置使空气进入所述空气收集模块，c)将空气微生物收集在试验筒的微生物保持区内，d)从空气收集模块上拆下试验筒，e)将转子放置于试验筒内，以获得如权利要求5至8中任一所述的微生物裂解装置，f)通过抽吸/排出装置将洗脱液引入试验筒内，用于悬浮包含在试验筒内的裂解装置，g)通过所述转子的转动构件在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子致使裂解装置旋转，以及h)抽吸包含在裂解过程中释放出的所述微生物的核酸的洗脱液，i)将洗脱液分配在用于接收和纯化核酸的容器中。
16.根据前一权利要求所述的方法，包括清洗和纯化核酸的另外阶段。
17.根据权利要求13至16中任一所述的方法，包括由集中在试验筒的保持区中的微生物生长组成的另外的阶段d')。
18.根据前一权利要求所述的方法，其中，生长通过下述实现在炉子中培养试验筒， 持续的时间在2至M小时的范围内。
19.根据权利要求15至18中任一所述的方法，其中，阶段f)至i)被在根据权利要求 9至12中任一所述的用于微生物裂解和核酸纯化的系统中使用。
20.一种微生物裂解方法，所述方法由下述阶段组成a)获得试验筒，其中微生物被集中在所述试验筒的保持区内，b)将转子放置于试验筒内，以获得如权利要求5至8中任一所述的微生物裂解装置，C)将洗脱液引入试验筒内，用于悬浮位于试验筒的微生物保持区中的裂解装置， d)通过在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子致使裂解装置旋转。
21.一种从微生物中提取核酸的方法，所述方法由下述阶段组成a)获得试验筒，其中微生物被集中在保持区内，b)将转子放置于试验筒内，以获得如权利要求5至8中任一所述的微生物裂解装置，c)将洗脱液引入试验筒内，用于悬浮位于试验筒的微生物保持区中的裂解装置，d)通过在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子致使微生物裂解装置旋转。e)抽吸包含在裂解过程中释放出的所述微生物的核酸的洗脱液，以及f)将洗脱液分配在用于接收和纯化核酸的容器中。
22.根据前一权利要求所述的方法，包括清洗和纯化核酸的另外阶段。
23.一种包含在液体样品中的微生物的裂解方法，所述方法由下述阶段组成a)将包含所述微生物的液体样品引入试验筒中，保持区的附近，以使所述液体样品导致位于试验筒的所述微生物保持区中的裂解装置悬浮，b)将转子放置于试验筒内，以获得如权利要求5至8中任一所述的微生物裂解装置，c)通过在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子致使微生物被保持于其上的裂解装置旋转。
24.一种从包含在液体样品中的微生物中提取核酸的方法，所述方法由下述阶段组成a)将包含所述微生物的液体样品引入试验筒中，保持区的附近，以使所述液体样品导致位于试验筒的所述微生物保持区中的裂解装置悬浮，b)将转子放置于试验筒内，以获得如权利要求5至8中任一所述的微生物裂解装置，c)通过在试验筒内转动转子，机械裂解微生物，所述转子致使裂解装置旋转，d)抽吸包含在裂解过程中释放出的所述微生物的核酸的液体样品，以及e)将液体样品分配在用于接收和纯化核酸的容器中。
25.—种从细胞组织样品中提取核酸的方法，所述方法由下述阶段组成a)将所述细胞组织样品引入试验筒内的洗脱液中，b)将转子放置于试验筒内，c)通过在试验筒内转动转子，机械裂解细胞组织样品，所述转子致使包含在试验筒中的裂解装置旋转，d)抽吸包含在裂解过程中从所述细胞中释放出的核酸的洗脱液，以及e)将洗脱液分配在用于接收和纯化核酸的容器中。
26.根据权利要求M或25所述的方法，包括清洗和纯化核酸的另外阶段。
27.根据权利要求5至8中任一所述的微生物裂解装置的用法，用于细胞组织样品的细胞的裂解。
28.根据权利要求9至12中任一所述的用于微生物裂解和所述微生物的核酸的纯化的系统的用法，用于细胞组织样品的细胞的裂解。
全文摘要
本发明涉及一种用于收集空气微生物的微生物收集装置，所述微生物收集装置包括空气收集模块，包括上部元件，其具有允许气流进入空气收集模块的进气管，所述进气管在其底部被提供有用于扰动气流的装置，下部元件，其具有排气装置，允许所形成的气流离开，上部元件和下部元件可以被彼此制成一体，以使气流可以在空气收集模块内部形成；试验筒，其具有大致圆柱形形状，具有微生物保持区，所述微生物保持区具有用于微生物裂解的裂解装置，所述试验筒被定位于所述空气收集模块内。
文档编号C12N1/06GK102245756SQ200980149907
公开日2011年11月16日 申请日期2009年12月9日 优先权日2008年12月10日
发明者A·杜邦菲利亚尔, E·G·M·费尔温普, E·马约内, H·J·M·克罗伊韦尔, M·加尔迪耶罗, M·盖伊, P·布鲁瓦耶 申请人:生物梅里埃公司