分离的肾细胞及其用途的制作方法

专利名称：分离的肾细胞及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离的肾细胞(包括肾小管细胞群和生成促红细胞生成素(EPO)的肾细胞群)，及其分离和培养方法，以及用所述细胞群治疗有需要的受试者的方法。
背景技术：
在美国，有超过1900万的慢性肾病(CKD)患者，该疾病往往是由包括肥胖症、糖尿病和高血压在内的代谢障碍所致。数据检索显示，慢性肾病发病率的增加源于由高血压和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)所继发的肾衰竭的发展(美国肾病数据系统(United States Renal Data Service(USRDS))用于CKD和ESRD 的费用(Costs of CKD and ESRD) 第223-238页0007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases) Bethesda，MD 编著)所述两种疾病在全球范围内也呈上升趋势。已证实肥胖症、高血压和血糖控制不良是肾损害的独立危险因素，引起肾小球和肾小管损害并引起蛋白尿和其它全身可检测到的肾过滤功能的改变(Aboushwareb 等，World J Urol, 26 :295-300,2008 ；Amann, K.等，^phrol Dial Transplant, 13 1958-66，1998)。对于处于1_3进行期的CKD患者，通过改变生活方式和旨在控制一种或多种潜在病情的药物介入进行控制；而对于处于4-5期的CKD患者，则通过透析和药物疗法进行控制，该药物疗法通常包括抗高血压药、红细胞生成刺激剂(ESA)、补充铁和维生素D。根据美国肾病数据系统(USRDQ，晚期肾病(ESRD)患者每个月在注射型红细胞生成刺激剂(ESA)、维生素D补充剂和铁补充剂上的平均费用超过$600(美国肾病数据系统用于CKD和ESRD的费用第223-238页(2007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所Bethesda，MD编著)。再加上用于透析的年平均费用($65，405)，用于维持每位患者的医疗费用上升至每年超过$72，000(美国肾病数据系统用于CKD和ESRD的费用第223-238页(2007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所Bethesda， MD编著)-该数值仅反映了标准治疗的费用，并不包括其它并发症的治疗、紧急治疗或辅助治疗(例如放置用于透析通路的血管移植物)的费用。2005年，用于CKD和ESRD的联合医疗保健费用总计为$620亿-占该年所有医疗保健支出的19% (美国肾病数据系统用于CKD和ESRD的费用第223-238页Q007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所Bethesda，MD编著)。虽然对于4_5期患者而言，肾移植作为先行措施以避免透析或当透析已不足以控制病情时是有效的方案，但在美国，可受益于全肾移植的5期CKD患者人数(> 400，000)远超过任何指定年份可获得的合适供体肾的数量( 16，000) (Powe, NR等，Am J Kidney Dis，53 :S37_45，2009)。因此，需要新的治疗模式来延缓或降低对透析的依赖性并填补由供体肾短缺留下的空白。进行性肾病是由初期疾病损伤(如，高血压)和随后对该损伤适应不良的肾反应联合所致。此类反应包括产生促炎性和促纤维化细胞因子和生长因子。因此，延缓CKD恶化的一种策略为改善炎性和纤维化反应以及通过肾组织的修复和/或再生来减轻或逆转肾溃变。慢性肾衰竭常见于人类以及一些驯养的动物中。肾衰竭的患者不仅经受肾功能丧失(尿毒症)，而且会由于骨髓不能经由红细胞生成而产生足量的红细胞(RBC)而发展成贫血症。红细胞稳态取决于由驻留于肾脏中的特化间质成纤维细胞产生的促红细胞生成素 (EPO)和骨髓中的靶红系祖细胞响应EPO并生成更多RBC的能力。肾衰竭的贫血源于肾脏中的EPO的生成的量的降低和尿毒症因素对骨髓中EPO作用的负面影响。迄今为止，治疗慢性肾衰竭的临床方法包括用于恢复肾过滤和尿液生成的透析和肾移植，以及用于恢复红细胞团块的重组EPO或EPO类似物的全身性递送。透析延长了中期至晚期肾衰竭患者的生存期，但却导致严重的生活质量问题。肾移植对于晚期肾衰竭患者而言是非常理想(并且往往是唯一)的方案，但优质的供体肾的供应不能满足肾衰竭群体的需求。用于治疗贫血的含重组EPO的丸剂现已与严重的下游健康风险相关，致使FDA 对该药物发出黑框警告(black box warning)，并且需要进一步研究用于恢复此群体中红细胞稳态的替代疗法。临床前研究已检测了经由基因治疗方法所产生的EPO生成细胞的体内功效和安全性。这些研究表明，可通过EPO生成细胞的体内递送来瞬时刺激红细胞生成和RBC数量。然而，迄今为止，这些方法均未提供可调的红细胞稳态或长期的体内功能性。 因此，HCT和RBC数量通常增加超过正常值，导致真性红细胞增多症和其它并发症。与治疗相关的并且相比重组EPO递送提供更多优势的EPO生成细胞的递送不仅必须增加HCT，而且还应恢复红细胞稳态，同时保持正调节机制和负调节机制未受损。需要指出的是，虽然EPO 缺乏性贫血常见于肾病患者中，但是其发病也可由其它病情引起，包括心力衰竭、多器官系统功能衰竭和其它慢性疾病。肾是由许多不同的特化细胞类型(10种以上)构成的独特器官，这些细胞类型均从间介中胚层起源发育，但在成熟时却形成形态学上和功能上不同的区室以及解剖单元， 这些解剖单元协同作用以过滤血液、产生尿液、调节酸碱及电解质平衡和调节内分泌功能， 诸如产生促红细胞生成素(Epo)、维生素D、肾素和血管紧张素。肾的细胞区室在稳态功能方面具有很大的相互依赖性，这在下列实例中重点描述。入球小动脉细胞与髓袢升支粗段 (the thick ascending limb of the loop of Henle)中的特化肾小管细胞(致密斑)协同作用，以调节流经肾小球的血流(Castrop，H. Acta Physiol (Oxf)，189 :3_14，2007)。肾小球的有孔内皮细胞、足细胞和基底膜与特化的近端肾小管细胞对来自肾小球滤液的蛋白质所进行的受体介导的内吞和重吸收相配合，以此实现肾对蛋白质的处理(Jarad，G & Miner， JH-Curr Opin Nephrol Hypertens, 18 -.226-32, 2009) 由肾小管细胞生成的活性维生素 D通过直接或间接机制调节间质细胞的稳态，这些机制控制细胞外基质的沉积、间质细胞向肌成纤维细胞的转化以及上皮-间充质细胞转化(Tan，X等，J Steroid Biochem Mol Biol,103 :491-6，2007)。无论具体实例如何，肾中细胞间的相互作用至少部分地取决于空间和结构关系。在细胞水平上，CKD的进展可涉及由细胞机能不全或稳态细胞间相互作用的缺失而导致的特定细胞类型的缺失或一种或多种细胞类型的功能丧失。因此，治疗CKD的有效再生方法必须通过恢复细胞组织和细胞间通讯来对稳态进行部分重建。
已设想通过增强特定的肾功能(例如肾小管转运或Epo生成)来降低与CKD进展相关的发病率和死亡率。大多数基于细胞的肾病治疗方法侧重于用干细胞或祖细胞类型对急性肾衰竭(ARF)进行治疗干预(Hopkins, C等，J Pathol, 217 =265-81, 2009) 目前存在许多临床前研究，其涉及在诱发ARF之前或之后便立即递送各种细胞类型，包括肾内或全身性递送 MSC (Humphreys BD & Bonventre JV, Annu Rev Med 2008,59:311-325)、 内皮祖细胞(EPC) (Chade AR 等，Circulation 2009,119 :547-557 ；Patschan D 等，Curr Opin Pharmacol 2006,6 :176-183)以及胎儿细胞或组织原基(Hammerman MR, Curr Opin Nephrol Hypertens 2001,10 :13-17 ；Kim SS 等，Stem Cells 2007，25 1393-1401 ； Marshall D 等，Exp Physiol 2007,92 :263-271 ；Yokoo T 等，JAm Soc Nephrol 2006,17 1026-1034)。将包含肾小管细胞的体外中空纤维过滤装置进行测试作为治疗人类ARF的传统透析的辅助(Ding, F & Humes, HD. Nephron Exp N印hrol，109 :ell8_22，2008 ；Humes, HD 等，Kidney ht，66 1578-88，2004 ;Humes，HD 等，Nat Biotechnol，17 :451_5，1999)。还对心血管外科手术继发性ARF发作的高危患者群体进行了经肾动脉移植间充质干细胞的临床试验(Westenfelder，C. Experimental Biology. New Orleans，LA，2009)。针对基于细胞的CKD治疗干预而进行的临床前研究数量有限(Chade，AR等，Circulation, 119 =547-57, 2009 ；Eliopoulos，N 等，J Am Soc N印hrol，17 1576-84，2006 ；Kucic，T 等，Am J Physiol Renal Physiol, 295 :F488_96，2008)。已在啮齿动物中对胎儿肾原基+/-间充质干细胞的组合进行了研究(Yokoo，T 等，Transplantation, 85 1654-8，2008 ；Yokoo, T 等，J Am Soc N印hrol，17:1026-34,2006)，其中移植到合适环境(如网膜)的整个胎儿肾组织显然可发展成为功能有限的肾结构。然而，MSC作为胎儿肾组织原基组分的治疗作用并不明确，并且用于治疗目的之人体胎儿肾组织的来源面临着许多操作和伦理的挑战。在其它研究中，将来源于健康供体骨髓的细胞移植到经辐射的C0L4A3(-/_)小鼠体内，该小鼠为患有肾小球性肾炎、蛋白质流失和纤维样变性的奥尔波特综合征(Alport Syndrome)模型，其中所述细胞通过用没有胶原基因突变的健康细胞替换渗漏肾小球足细胞从而部分延缓了模型中综合征的进展(Prodromidi, EI 等，Stem Cells, 24 :2448-55,2006, Sugimoto, H 等，Proc Natl Acad Sci U S A, 103 :7321-6, 2006) 认为细胞移植有助于使sCREAT、BUN和钠的水平稳定，而在研究M中，未治疗的/肾受损对照组没有给出比较结果。Chade等采用单侧肾动脉狭窄的猪模型对损伤6周后于肾内递送的自体EPC的效果进行检验(Chade AR等， Circulation 2009,119 :547-557)。EPC在某种程度上改善了肾小管-间质纤维化，显著改善了肾小球硬化症并改善了肾血流量，但在治疗后未观察到血压的变化(Chade AR等， Circulation 2009，119 :547-557)。迄今为止，对基于细胞的CKD疗法的体内功效进行检验的研究已产生即时和/或局部效应，且很少有研究同时收集到功能的全身性和组织学证据。少数研究提供对进行性CKD模型干预后的临床相关益处的证据，这些研究提出了有关基于细胞的疗法完全恢复肾功能潜力的问题。然而，稳定肾功能并延缓进展的再生疗法能够解决此患者群体范围内未得到满足的医疗需求。
进行性CKD的体内可再生模型对于评价候选疗法的治疗潜力而言必不可少。虽然ARF模型数目众多并且包括多种化学物质或局部缺血/再灌流诱发的肾小管损伤，但未经显著干预的进行性和晚期CKD模型较少。在大鼠中进行两步5/6肾切除手术再生地产生了晚期和进行性肾衰竭状态，导致全身地和组织学上地可检出的疾病，这些疾病伴有CKD 的若干关键特征，包括高血压、肾小球滤过率(GFR)降低、血清肌酸酐(sCREAT)和BUN升高、肾小球和肾小管-间质纤维化、高脂血症、高磷酸盐血症和贫血(Kaufman，JM等，Kidney Int, 6 :10-7,197422 ；Platt，R 等，Clin Sci(Lond)，11 :217-31,1952 ；Ormrod,D & Miller, Τ· N印hron，26 :249-54,1980 ;Brenner，BM. Am J Physiol，249 :F324_37，1985)。这些临床相关特征的存在，连同技术再现性和商业可用性为本文所述研究模型的选择提供了基础。因此，需要显著并持久增强肾功能的新治疗模式，以延缓病情发展和改善此患者群体的生活质量，并减轻医疗保健体系的年度费用负担。再生医疗技术可提供CKD的下一代治疗方案。发明概述在一个方面，本发明提供了一种人肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群，并且其中第二细胞群包括促红细胞生成素 (EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在一些实施方案中，混合物还包括第三细胞群。 在一个实施方案中，B2细胞群还包括集合管上皮细胞。在一个实施方案中，B2细胞群具有耐低氧性。在一个实施方案中，B2细胞群能够通过HAS-2(透明质酸合酶-2)的表达在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)。在另一个实施方案中，B2 细胞群具有碘克沙醇耐受性。在某些实施方案中，B2细胞群的密度介于约1.045g/mL和约 1.052g/mL之间。在其它实施方案中，第二细胞群为B4细胞群。在一个实施方案中，B4细胞群的密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间。在某些其它实施方案中，第二细胞群为B3细胞群。在一个实施方案中，B3细胞群的密度介于约1. 052g/mL和约1. 063g/mL之间。在其它实施方案中，混合物包括B2细胞群和B3细胞群。在其它实施方案中，混合物缺乏惰性或不需要的组分。在一个实施方案中，混合物不包括或缺乏Bl细胞群。在一个实施方案中，Bl细胞群包括集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，其密度小于 1. 045g/mL。在某些其它实施方案中，混合物不包括或缺乏B5细胞群。 在一个实施方案中，混合物不包括密度大于 1. 091g/mL的B5细胞群，B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。在某些实施方案中，细胞混合物可稳定和/或改善和/或恢复肾功能。在一个实施方案中，混合物能够吸收受体介导的白蛋白。在其它实施方案中，细胞混合物能够表达氧可调促红细胞生成素(EPO)。在其它实施方案中，混合物含有能够在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)的HAS-2表达细胞。在一个实施方案中，经由体内递送，混合物能够提供再生刺激。在其它实施方案中，经由体内递送，混合物够减轻肾小球滤过、肾小管重吸收、尿液生成和/或内分泌功能的衰退，使这些功能稳定或改善。在所有实施方案中，第一细胞群和第二细胞群可源自肾组织或培养的肾细胞。 在一个实施方案中，B2通过选自下列各项的肾小管细胞标记物的表达来表征巨蛋白 (megalin)、cubilin、透明质酸合酶2 (HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-I(Aqpl)、水通道蛋白-2 (Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab 17)、GATA结合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员 Bl (AldMbl)、醛脱氢酶1家族成员A3 (AldhlU)和钙蛋白酶_8 (Capn8)。在另一个实施方案中，B2还通过集合管标记物水通道蛋白_4(Aqp4)标记物的表达来表征。在所有实施方案中，B4可通过选自PECAM、VEGF, KDR、HIFla的血管标记物的表达来表征。在某些其它实施方案中，B4可通过肾小球标记物Podocin(Podn)或^phrin(Neph) 的表达来表征。在另一个实施方案中，B4可相对于未分化的(UNFX) B2和B3细胞群表征为氧可调EPO富集群。在另一个实施方案中，B4通过选自下列各项的标记物的表达来表征趋化因子(C-X-C基序)受体4(Cxcr4)、内皮素B型受体(Ednrb)、V型胶原α 2 (Col5a2)、钙黏着蛋白5 (CdM)、组织纤溶酶原激活因子(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘连蛋白)(Sparc)、丝甘蛋白(Srgn)、 ΜΡ 金属肽酶抑制因子3 (Timp3)、维耳姆斯瘤1 (Wtl)、无翅型MMTV整合位点家族成员4 (Wnt4)、 G蛋白信号转导调节子4(Rgs4)、血小板-内皮细胞粘附分子(Pecam)和促红细胞生成素 (Epo) ο在所有实施方案中，B3可通过选自下列各项的标记物的表达来表征水通道蛋白7(Aqp7)、含FXYD域的离子转运调节子2(Fxyd2)、溶质载体家族17(磷酸钠)成员 3(Slcl7a3)、溶质载体家族 3 成员 1 (Slc3al)、紧密连接蛋白(claudin) 2 (Cldn2)、napsin A天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2 (易化葡萄糖转运蛋白)成员2 (Slc2a2)、丙氨酰 (膜)氨肽酶(Anp印)、跨膜蛋白27(Tmem27)、酰基辅酶A合成酶介质链家族成员2 (Acsm2)、 谷胱甘肽过氧化物酶3(Gpx3)、果糖-1，6- 二磷酸酶1 O^bpl)和丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶2(Agxt2)。在某些其它实施方案中，B3通过血管表达标记物血小板内皮细胞粘附分子 (Pecam)和肾小球表达标记物podocin(Podn)来表征。在一个方面，本发明提供了一种人肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群，并且其中第二细胞群包括表达血管表达标记物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标记物podocin (Podn)的一个或多个细胞群。在另一个方面，本发明提供了一种分离的人肾细胞富集群，其包括B2细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群。在一个实施方案中，B2细胞群能够通过HAS-2(透明质酸合酶-2)的表达在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)。 在某些实施方案中，B2细胞群不包括密度小于 1. 045g/mL的Bl细胞群，Bl细胞群包括集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。在另一个实施方案中，B2细胞群不包括密度介于约 1. 052g/mL和约1. 063g/mL之间的B3细胞群，B3细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，B2细胞群不包括密度介于约1.063g/mL 和约1.091g/mL之间的B4细胞群。在另外一个实施方案中，B2细胞群不包括密度大于 1. 091g/mL的B5细胞群，B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。在另一个方面，本发明提供了一种制备人B2细胞群的方法，其包括a)将包括非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；和b)提取包括B2细胞群的第一细胞组分。在一个实施方案中，相比非富集细胞群时，通过本发明方法得到的B2细胞群包括较大比例的肾小管细胞以及较小比例的EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，该步骤包括将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约 1. 045g/mL和约1. 052g/mL之间的梯度中。在另一个方面，本发明提供了一种制备人B4细胞群的方法，其包括a)将包括非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；和b)提取包括B4细胞群的第一细胞组分。在一个实施方案中，相比非富集细胞群时，通过本发明方法得到的B4细胞群包括较大比例的EPO生成细胞、血管细胞和肾小球细胞以及较小比例的非EPO生成细胞、非血管细胞和非肾小球细胞。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，该步骤包括将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间的梯度中。在另一个方面，本发明提供了一种制备人B3细胞群的方法，其包括a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；和b)提取包括B3细胞群的第一细胞组分。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，该步骤包括 将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中第一细胞组分在离心后存在于比密度介于1. 052g/mL和约1. 063g/mL之间的梯度中。在另一个方面，本发明还提供了一种制备B2细胞制剂的方法，其包括a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；b)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将B2细胞亚群与细胞群分离，其中相对于所述细胞群的大部分而言，B2细胞亚群通过高前向散射和高侧向散射来表征。在另一个方面，本发明还提供了一种制备B4细胞制剂的方法，其包括a)将包括非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；b)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将B4细胞亚群与细胞群分离，其中相对于所述细胞群的大部分而言，B4细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。在所有实施方案中，前向散射对应于细胞尺寸。在所有实施方案中，侧向散射对应于细胞颗粒度。在另一个方面，本发明提供了一种用于向有需要的受试者提供稳定和/或改善的肾功能的可植入构建体，其包括a)生物材料，其包括一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和b)哺乳动物肾细胞的混合物，其包括用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的第一细胞群、B2和第二细胞群。在一个实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的第二细胞群为B4。在另一个实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和 /或以其它方式与其结合的第二细胞群为B3。在另一个实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的混合物还包括第三细胞群。在某些实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、 悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的混合物包括B3和B4。在所有实施方案中，混合物可源自哺乳动物肾组织或培养的肾细胞。在一个实施方案中，构建体包括被构建为适于截留和/或附着混合物的三维(3-D)多孔生物材料的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括被构建为适于包埋、附着、悬浮或包覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括被构建为由呈水凝胶形式的主要为高分子量类型的透明质酸(HA)构成的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由呈多孔泡沫形式的主要为高分子量类型的透明质酸构成的生物材料。在另外一个实施方案中，构建体包括由大小范围为5. IkDA至2X106kDA以上的HA分子构成的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由具有介于约50微米至约300微米之间的孔的聚乳酸基泡沫构成的生物材料。在另外一个实施方案中，构建体包括源自自体肾样本的一个或多个细胞群。在一个实施方案中，肾样本为肾活组织检查样本。在另外一个实施方案中，构建体包括源自非自体肾样本的一个或多个细胞群。在一个实施方案中，构建体提供红细胞稳态。在另一个方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的肾病的方法，其包括a) 对受试者施用包含哺乳动物肾细胞混合物的组合物，所述哺乳动物肾细胞混合物包括第一细胞群、B2和第二细胞群；和b)确定来自受试者的试样的肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的一种或多种肾功能衰退的减轻、稳定或改善。 在某些实施方案中，所述方法包括含有第三细胞群的细胞混合物。在一个实施方案中，第二细胞群为B4或B3。在另一个实施方案中，第三细胞群为B4或B3。在某些实施方案中，待由本发明方法治疗的肾病伴随有促红细胞生成素(EPO)缺乏。在某些实施方案中，EPO缺乏为贫血。在一些实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于受试者的肾衰竭。在一些其它实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于选自下列的疾病慢性肾衰竭、原发性EPO缺乏、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统衰竭。在某些实施方案中，用于该方法的组合物还包括包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和 /或天然存在的蛋白质或肽的生物材料，其中混合物用生物材料包覆、沉积在其上或其中、 截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合。在另一个方面，本发明提供了本发明的细胞制剂及其混合物或可植入构建体用于制备治疗有需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的制剂的用途。在一个方面，本发明提供了一种选定的肾细胞群，其在约至约5%的氧含量下暴露约12至约M小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为约1. 045g/mL 至约1. 052g/mL的部分，其中细胞群(i)在离心后保留于密度介于1. 045g/mL至约1. 052g/ mL之间的梯度中；(ii)包括肾小管细胞群，其通过至少一种肾小管细胞标记物的表达来表征；(iii)包括肾小管细胞亚群，其能够转运受体介导的白蛋白；(iv)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能。在另一个方面，本发明提供了一种选定的肾细胞群，其在约至约5%的氧含量下暴露约12至约M小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为约1. 063g/ mL至约1.091g/mL的部分，其中细胞群(i)在离心后保留于密度介于约1. 063g/mL至约 1. 091g/mL之间的梯度中；(ii)包括氧可调促红细胞生成素(EPO)表达细胞、肾小球细胞和血管细胞；(iii)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能；和(iv)能够在联合施用时通过权利要求65所述的肾细胞群增强对一种或多种肾功能的调节。
在另一个方面，本发明提供了一种肾细胞群，其中将所述细胞进行如下操作i) 置于经组织培养处理的标准塑料盘上进行贴壁培养，其中初始密度为25，000个细胞/厘米 2，培养基由高含量葡萄糖DMEM和完全补充KSFM培养基的1 1混合物组成，其中含5%的胎牛血清，在37°C和21%的氧气条件下培养M-72小时；ii)用相同培养基更换50-100% 的培养基，并在37°C和2%的氧气条件下培养18-M小时；iii)经由胰蛋白酶消化来收集， 再悬浮，并用不含血清的KSFM培养基或PBS洗涤；iv)加载到制备好的密度梯度中，所述梯度包含限定密度介于1. 045g/mL至约1. 052g/mL之间的层，并包含密度较大的至少一层和密度较小的至少一层，其中梯度在15mL圆锥管中制备，液体总体积不小于5mL且不大于 14mL,并且加载到该梯度中的细胞数目至少为5000万但不超过1亿；ν)通过在800x G下连续离心20-30分钟来迫使细胞通过梯度；在介于1. 045g/mL和1. 052g/mL之间的密度处分段；和/或通过选自下列各项的标记物表征巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2 (HAS2)、 维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、N-钙黏着蛋白(Ncad)、E_钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-I (Aqpl)、水通道蛋白_2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rabl7)、GATA结合蛋白 3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(RycM)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员 4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员Bl (AldMbl)、醛脱氢酶1家族成员A3 (Aldhla3)、钙蛋白酶-S(CapnS)和水通道蛋白_4 (Aqp4)标记物；和/或能够使患有肾病的免疫相容受试者的一种或多种肾功能的衰退减轻，使其稳定或改善。在另一个方面，本发明提供了一种肾细胞群，其中将所述细胞进行如下操作i) 置于经组织培养处理的标准塑料盘上进行贴壁培养，其中初始密度为25，000个细胞/厘米 2，培养基由高含量葡萄糖DMEM和完全补充KSFM培养基的1 1混合物组成，其中含5%的胎牛血清，在37°C和21%的氧气条件下培养M-72小时；ii)用相同培养基更换50-100% 的培养基，并在37°C和2%的氧气条件下培养18-24小时；iii)经由胰蛋白酶消化来收集，再悬浮，并用不含血清的KSFM培养基或PBS洗涤；iv)加载到制备好的密度梯度中，所述梯度包含限定密度介于1. 063g/mL至约1. 091g/mL之间的层，并包含密度较大的至少一层和密度较小的至少一层，其中梯度在15mL圆锥管中制备，液体总体积不小于5mL且不大于14mL，并且加载到该梯度中的细胞数目至少为5000万但不超过1亿；ν)通过在800x G 下连续离心20-30分钟来迫使细胞通过梯度；在介于1. 063g/mL和约1. 091g/mL之间的密度处分段；和/或通过选自下列各项的标记物表征VEGF、KDR、HIFla、Podocin(Podn) 或N印hrin(N印h)、趋化因子(C-X-C基序)受体4(Cxcr4)、内皮素B型受体(Ednrb)、V 型胶原a2(Col5a2)、钙黏着蛋白5(CdM)、组织纤溶酶原激活因子(Plat)、血管生成素 2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘连蛋白) (Sparc)、丝甘蛋白(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制因子3 (Timp3)、维耳姆斯瘤1 (Wtl)、无翅型 MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G蛋白信号转导调节子4(Rgs4)、血小板-内皮细胞粘附分子(Pecam)和促红细胞生成素(Epo)；和/或能够使患有肾病的免疫相容受试者的一种或多种肾功能的衰退减轻，使其稳定或改善。在一个方面，本发明提供了分离的促红细胞生成素(EPO)生成肾细胞群。在一个实施方案中，该细胞群为分离的EPO生成哺乳动物细胞富集群。在另一个实施方案中，该细胞群为分离的促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞富集群，其相比包含促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞群的非富集群而言，其包含较大比例的EPO生成细胞。
该细胞群可源自肾组织或培养的肾细胞。该细胞群可源自得自受试者的肾样本。 该样本可为来源于得自受试者的肾样本的肾组织或培养的肾细胞。在另一个实施方案中， 该细胞群相比包含EPO生成哺乳动物细胞的非富集群而言包含较大比例的EPO生成细胞。 在另一个实施方案中，该细胞群相比包含促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞的非富集群而言包含较小比例的肾小管细胞。在所有实施方案中，该细胞群可富集EPO生成细胞。在所有实施方案中，该细胞群可富集非EPO生成细胞。在所有实施方案中，该细胞群可富集肾小管细胞。在另一个方面，本发明提供了在某些培养条件下生物应答的促红细胞生成素 (EPO)生成细胞的细胞群。在另一个实施方案中，当相对于在非低氧条件下培养的细胞群而将细胞群在低氧条件下培养时，生物应答为EPO表达的诱导。在另一个实施方案中，当相对于在非低氧条件下培养的细胞群而将细胞群在低氧条件下培养时，生物应答为EPO表达的增加。在一些实施方案中，低氧培养条件包括但不限于相对于在氧含量未降低的条件下培养的细胞群而言，将细胞群的培养体系中的可用氧含量降低。在另一个实施方案中，可用氧含量的降低约小于5%，而氧含量未降低的条件为大气氧含量(约21%)。在另一个实施方案中，相比在大于或等于21%的氧含量下试验的培养物而言，可在低于大气水平(21%)的氧含量下观察到EPO表达的增加。在另一个实施方案中，当将细胞在约小于5%的氧气(即低氧培养条件)下培养时，并且将诱导水平和/或增加的表达与在大气氧含量(约21%) (即非低氧培养条件)下培养的细胞进行比较时，可观察到EPO表达的诱导和/或增力卩。在一个实施方案中，对低氧条件生物应答的EPO表达通过低氧诱导因子HIF来调节。在另一个实施方案中，对低氧条件生物应答的EPO表达通过HIFl α来调节。在另一个实施方案中， 对低氧条件生物应答的EPO表达通过低氧诱导因子HIF2 α来调节。在一个实施方案中，当相对于未经灌流培养的细胞群而将细胞群经由灌流培养时，生物应答为EPO表达的诱导。在另一个实施方案中，相对于未经灌流培养的细胞群而言，生物应答为EPO表达的增加。在一些实施方案中，灌流条件包括但不限于对流体进行短暂、间歇或连续的循环或搅拌，使得动力经由流体流动传递至细胞。在另一个实施方案中， 所进行的灌流培养条件应使得细胞群在可提供允许形成三维结构的骨架和/或空间的材料中或其上培养。在另一个方面，本发明提供了包含本文所述细胞群的肾细胞的混合物或组合。在一个实施方案中，细胞混合物包括富集EPO生成细胞的第一细胞群和未富集EPO生成细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，第二细胞群可包含一种或多种类型的肾源细胞，其可包括但不限于下列一种或多种细胞源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质组织的细胞、源自集合管的细胞、源自结缔组织的细胞、源自血液的细胞或源自血管的细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。在所有实施方案中，本文所述的肾小管细胞可通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于下列各项的一种或多种透明质酸合酶 2 (HAS2)、CYP2D25 (维生素D325-羟化酶)、巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1、水通道蛋白-2、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rabl7)、GATA结合蛋白 3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(RycM)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员 4 (Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员Bl (AldMbl)、醛脱氢酶1家族成员A3 (Aldhla3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。在一个方面，本发明提供了分离的哺乳动物肾小管细胞富集群。在一个实施方案中，分离的细胞群富集肾小管细胞并包含至少一些EPO生成哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，该细胞群相比包含肾小管细胞的非富集群而言具有较大比例的肾小管细胞。在另一个实施方案中，分离的哺乳动物肾小管细胞富集群相比包含肾小管细胞的非富集群而言包含较大比例的肾小管细胞和至少一些EPO生成哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，相比未分化的异质性混合物或相比EPO生成细胞富集群而言，哺乳动物肾小管细胞富集群相对缺乏EPO生成细胞。在所有实施方案中，本文所述的肾细胞群或肾细胞群混合物的来源类型可为自体的、同种异体的、同系的(自体的或同基因的)及其任意组合。例如，在一些实施方案中，细胞混合物可包含(i)源自自体源的第一细胞群和源自自体源的第二细胞群；或(ii)源自自体源的第一细胞群和源自同种异体源的第二细胞群。在另一个方面，本发明提供了产生富集EPO生成细胞的细胞群的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤a)由机械分离或酶消化的哺乳动物肾组织制备具有非富集异质性啮齿动物肾细胞群的细胞悬液；b)将细胞悬液与密度梯度接触，以基于浮力密度分离一种或多种细胞组分；c)将步骤b)的细胞悬液离心以限定一种或多种细胞组分；和 d)提取包含富集细胞群的第一细胞组分，其中富集细胞群相比非富集细胞群具有较大比例的EPO生成细胞和较小比例的非EPO生成细胞。在另一个实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1. 025g/mL和约1. 035g/mL之间或小于约1. 045g/mL的层。在另一个实施方案中， 步骤d)的第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1. 025g/mL和约1. 035g/mL之间或小于约1.045g/mL的梯度中。在另一个实施方案中，离心步骤(c)还产生至少一种附加细胞组分，其未富集所述EPO生成富集细胞群。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤e) 提取至少一种附加细胞组分。在另一个实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1. 062g/mL 和约1.088g/mL之间的层。在另一个实施方案中，附加细胞组分在离心后存在于比密度介于约1. 062g/mL和约1. 088g/mL之间的梯度中。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤a)由培养的包含至少一些表达或能够表达EPO的细胞的非富集异质性哺乳动物细胞群制备细胞悬液；b)使细胞悬液与密度梯度接触，以基于浮力密度分离一种或多种细胞组分；c)将步骤b)的细胞悬液离心，以限定一种或多种细胞组分；和d)提取包含富集细胞群的第一细胞组分，其中相比非富集细胞群，富集细胞群具有较大比例的EPO生成细胞和较小比例的非EPO生成细胞。在一个实施方案中，步骤a)的细胞悬液得自培养的非富集异质性啮齿动物细胞群。在此实施方案中， 密度梯度包括比密度介于约1.073g/mL和约1.091g/mL之间的层。在一个实施方案中，步骤d)的第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1. 073g/mL和约1. 091g/mL的梯度中。 在另一个实施方案中，离心步骤(c)还产生至少一种附加细胞组分，其未富集所述EPO生成富集细胞群。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤e)提取至少一种附加细胞组分。在另一个实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1.041g/mL和约1.062g/mL之间的层。在另一个实施方案中，附加细胞组分在离心后存在于比密度介于约1. 041g/mL和约1. 062g/ mL之间的梯度中。在一些实施方案中，富集细胞群富集EPO生成细胞，而缺乏非EPO生成细胞。在其它实施方案中，富集细胞群富集间质成纤维细胞，而缺乏肾小管细胞和集合管细胞。在另一个实施方案中，富集细胞群富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，离心步骤(C)还产生至少一种附加细胞组分，其未富集所述富集细胞群。在一些实施方案中，相比非富集细胞群而言，附加细胞组分包含较大比例的非EPO生成细胞和较小比例的EPO生成细胞。在一个实施方案中，相比第一细胞组分而言，至少一种附加细胞组分具有较小比例的EPO生成细胞。在另一个实施方案中，相比第一细胞组分而言，附加细胞组分包含较大比例的肾小管细胞。在一些实施方案中，产生富集EPO生成细胞的细胞群的方法中所使用的密度梯度为碘克沙醇密度梯度。在另一个方面，本发明提供了使用流式细胞术产生促红细胞生成素EPO生成细胞富集群的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤a)由机械分离或酶消化的哺乳动物肾组织制备包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液；b)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射； c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将细胞亚群与细胞群分离，其中相对于整个细胞群而言，细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤a)由培养的包含至少一些表达或能够表达EPO的细胞的哺乳动物细胞群制备细胞悬液；b)将细胞悬液施加到流式细胞仪中， 该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将细胞亚群与细胞群分离， 其中相对于整个细胞群而言，细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。在另一个实施方案中，前向散射对应于细胞尺寸。在一个实施方案中，侧向散射对应于细胞粒度。本发明的其它实施方案提供了富集的细胞组分，其i)富集EPO生成细胞而缺乏非EPO生成细胞；或ii)富集生成EPO的特化间质皮质成纤维细胞而缺乏上皮细胞细胞。在另一个实施方案中，选择步骤c)包括产生所述未富集细胞群的至少一种附加组分。 在另一个实施方案中，相比EPO富集组分而言，一种或多种附加组分包含较小比例的EPO生成细胞。在本发明的另一方面，所述方法包括进一步体外培养的步骤。在一个实施方案中， 在分离后将富集细胞群进行体外培养。在另一个实施方案中，该培养步骤包括在适于支持所述细胞群生长和/或维持的培养基中，在适于哺乳动物细胞培养的玻璃或塑料表面上采用二维单层培养。在其它实施方案中，培养步骤包括在适于细胞维持和/或生长的三维 (3D)支架上培养细胞。在另一个实施方案中，支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽。在另一个实施方案中，支架被构建为适于截留或附着哺乳动物细胞的多孔支架。在其它实施方案中，支架被构建为适于包埋、附着或包覆哺乳动物细胞的凝胶。在另一个方面，本发明提供了包括在灌流条件下进行培养步骤的方法。在一个实施方案中，灌流条件包括但不限于对流体进行短暂、间歇或连续的循环或搅拌，使得动力经由流体流动传递至细胞。在另一个实施方案中，所进行的灌流培养条件应使得细胞群在可提供允许形成三维结构的骨架和/或空间的材料中或之上培养。在另一个方面，本发明提供了包括在低氧条件下进行培养的步骤的方法。在一些实施方案中，低氧培养条件包括但不限于相对于在氧含量未降低的条件下培养的细胞群而言，将细胞群的培养体系中的可用氧含量降低。在另一个实施方案中，可用氧含量的降低约小于5%，而氧含量未降低的条件为大气氧含量(约21%)。在另一个实施方案中，低氧条件以氧含量小于21% (大气)为代表。在另一个方面，本发明提供了包括对细胞群中的EPO表达进行测量的步骤的方法。在所有实施方案中，EPO表达为EPO mRNA表达。在所有实施方案中，可检测和/或检测出EPO表达。在另一个实施方案中，相对于未经灌流培养的细胞群而言，EPO表达在经由灌流培养的细胞群中诱导。在其它实施方案中，相对于在非低氧条件下培养的细胞群而言， EPO表达在低氧条件下培养的细胞群中诱导。在另一个实施方案中，相对于未经灌流培养的细胞群而言，经灌流培养的细胞群中可检测到的EPO表达较高。在其它实施方案中，相对于在非低氧条件下培养的细胞群而言，低氧条件下培养的细胞群中可检测到的EPO表达较高。在另一个实施方案中，当将细胞在约小于5%的氧气(即，低氧培养条件)下培养，并且将诱导水平和/或增加的表达与在大气氧含量(约21%)(即，非低氧培养条件)下培养的细胞进行比较时，可观察到EPO表达的诱导和/或增加。在另一个实施方案中，在低于 21%氧气(大气)的条件下培养细胞时可观察到EPO表达的增加。在另一个方面，本发明提供了包含本文所述的一个或多个细胞群的可植入构建体。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于向有需要的受试者提供促红细胞生成素 (EPO)生成细胞群的可植入构建体，其中该构建体包括a)支架，其包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和b)富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群，其沉积在支架表面上或表面中。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于向有需要的受试者提供促红细胞生成素EPO生成细胞群的可植入构建体，其中该构建体包括a)多孔支架，其包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和b)细胞混合物，其包含i)富集EPO 生成哺乳动物细胞的第一细胞群，和ii)富集非EPO生成细胞的第二细胞群，其中细胞混合物沉积在支架表面上和/或支架孔内。在一些实施方案中，相对于第二细胞群而言，第一细胞群中的EPO表达较高。在另一个实施方案中，第二细胞群包含一种或多种肾源细胞类型，其可包括但不限于下列一种或多种细胞源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质组织的细胞、源自结缔组织的细胞、源自集合管的细胞、源自血液的细胞或源自血管的细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。本发明的一些实施方案提供了富集肾小管细胞的细胞群，所述肾小管细胞通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物包括但不限于下列蛋白的一种或多种巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、 上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1和水通道蛋白_2。在一个实施方案中，本发明所提供的肾细胞混合物可包括源自本文所述类型的肾组织源的细胞群。在其它实施方案中，第一细胞群和第二细胞群源自肾组织或培养的肾细胞。在另一个实施方案中，相比包含促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞的非富集群而言，第一细胞群包含较大比例的EPO生成细胞。在另一个实施方案中，除了 EPO生成细胞外，第一细胞群还包含肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，相比第二细胞群而言，第一细胞群包含较大比例的EPO生成细胞。本发明的其它实施方案包括第一细胞群，相比促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞的非富集群而言，该第一细胞群包含较小比例的肾小管细胞。在其它实施方案中，相比第二细胞群而言，第一细胞群包含较小比例的肾小管细胞。在一些实施方案中，用细胞和生物材料配合。在一个实施方案中，将支架或生物材料构建为三维(3-D)多孔支架。在另一个实施方案中，3-D多孔支架适于截留或附着哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，将支架或生物材料构建为适于包埋、附着或包覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶。在一个实施方案中，适用于本发明构建体的细胞群源自自体或非自体肾样本。在另一个实施方案中，样本为肾活组织检查样本。在另一个方面，本发明提供了对需要富集EPO生成细胞的细胞群的受试者进行治疗的方法。在一个实施方案中，治疗有需要的促红细胞生成素(EPO)缺乏的受试者的方法包括对受试者施用组合物的步骤，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群。在另一个实施方案中，第一细胞群富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在一个实施方案中，EPO缺乏为贫血。在另一个实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于受试者的肾衰竭。在另一个实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于选自下列的疾病慢性肾衰竭、原发性EPO 缺乏、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统衰竭。在另一个实施方案中，治疗有需要的肾病受试者的方法包括对受试者施用组合物的步骤，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群。在另一个实施方案中，第一细胞群富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在一些实施方案中，向有需要的受试者施用的组合物还包含未富集EPO生成细胞的第二肾细胞群。在其它实施方案中，所述组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群沉积在支架表面上和/或支架的孔内。在另一个实施方案中，该组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群和第二细胞群沉积在支架表面上和/或支架孔内。在另一个实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自哺乳动物肾组织或培养的哺乳动物肾细胞。在其它实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自自体或非自体肾样本。在一个实施方案中，样本为肾活组织检查样本。在一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，肾小管细胞通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于下列蛋白的一种或多种巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1和水通道蛋白-2。在所有的实施方案中，第二细胞群包含选自下列的一种或多种肾源细胞类型源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质组织的细胞、源自集合管的细胞、源自结缔组织的细胞、源自血液的细胞或源自血管的细胞。在所有实施方案中，相对于异质性未分化群或第一细胞群而言，第二细胞群相对缺乏肾小球细胞、血管细胞和氧应答EPO生成细胞。在另一个方面，本发明包括为有需要的受试者提供红细胞稳态的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群；和b)确定来自受试者的样本中红细胞生成功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的红细胞稳态。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群和未富集EPO生成细胞的第二细胞群；和b) 确定来自受试者的样本中红细胞生成功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的红细胞稳态。在另一个方面，本发明包括改善有需要的受试者的肾功能的方法。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群；和b)确定来自受试者的样本中肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的肾功能得到改善。在另一个实施方案中，所述组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群沉积在支架表面上和/或支架孔内。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群和未富集EPO生成细胞的第二细胞群；和b) 确定来自受试者的样本中肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的肾功能得到改善。在另一个实施方案中，所述组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群和第二细胞群沉积在支架表面上和/或支架孔内。在其它实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自哺乳动物肾组织或培养的哺乳动物肾细胞。在另一个实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自自体或非自体肾样本。在另一个实施方案中，样本为肾活组织检查样本。在一个实施方案中，第一细胞群富集低氧应答EPO生成细胞。在另一个实施方案中，第一细胞群富集低氧应答EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，肾小管细胞通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于以下物质的一种或多种透明质酸合酶2(HAS2)、CYP2D25(维生素D3 25-羟化酶)、巨蛋白、 cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1、水通道蛋白-2和水通道蛋白-4。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞并包含集合管的上皮细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群相对富集肾小管细胞，包含集合管上皮细胞，而相对缺乏低氧应答EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。附图简述


图1示出突出患病肾组织相比正常肾组织的纤维化的Gomori Trichrome染色。
图2示出患慢性肾病的猪的细胞中促红细胞生成素基因的氧调节表达。
图3示出增殖培养物中的小管样结构。
图4示出培养的功能性肾小管细胞对受体介导的白蛋白吸收。
图5示出EPO表达在分离后比在初始人肾组织中相对更高。
图6示出培养的人肾细胞中对EPO基因表达的保留水平。
图7示出大气(21%)氧含量下的3D培养物中动态培养的(+)EPO表达的结果。
图8示出低)氧含量下的3D培养物中动态培养的(+)ΕΡ0的表达。
图9示出长期培养物中动态培养的(+)肾小管基因的表达。
图10示出低氧培养物(相对常氧培养物)中的EPO表达。
图11示出体外动态3D培养物对EPO表达的刺激。
图12示出从2D培养物和3D培养物中收集的细胞裂解物(上图)和条件培养基 (下图)中定量靶蛋白的ELISA结果。图13示出H&E染色的接种OPLA和1型胶原支架(灌流或静态培养(7)天后染色)，其通过标准技术固定在10%福尔马林缓冲液中并经石蜡包埋。进行H&E染色以检验细胞的存在和形态。灌流支架中的细胞含量高于静态支架中的细胞含量，相比OPLA支架， 1型胶原支架中的细胞含量明显更高。灌流1型胶原支架中的细胞形成相比静态1型胶原支架中更为显著。图14示出(灌流或静态)培养(7)天后OPLA和1型胶原支架的扫描式电子显微照片(SEM)。注意到灌流(相比静态)具有更高的细胞含量，并且在1型胶原支架灌流(相比静态)条件下具有优良的细胞形成和互联性。图15示出通过添加裂解缓冲液Oliagen)从支架或2D培养物分离的mRNA的 RT-PCR结果。对于3D支架，利用电勻浆化(polytron)来确保RNA的充分裂解与释放。用对目标靶基因特异的内含子跨越引物对纯化的mRNA进行RT-PCR分析(泳道1-7 各3D结构(灌流)/5日培养物；泳道8-10 各2D结构/5日培养物；泳道11-17 各初始细胞群(接种前)；泳道18-19 :2D培养物/4日培养物；泳道21 宏观解剖的新鲜组织)。
0084]图16示出三种不同接种的支架中的代谢活性。0085]图17示出原代肾细胞的灌流和静态3D培养物对葡萄糖和谷氨酰胺的消0086]图18示出治疗后的啮齿动物平均存活率(天)。0087]图19示出整个研究过程中的啮齿动物体重。0088]图20图示了治疗前至死亡期间的重量增量。0089]图21示出每周平均血清BUN浓度。0090]图22示出每周平均血清肌酸酐浓度。0091]图23示出中期时的相对BUN/个体大鼠数据。0092]图24示出中期时的相对血清肌酸酐/个体大鼠!数据。0093]图25示出每周中期时的平均HCT、相对HCT(个体大鼠数据)。0094]图26a示出中期时的相对HCT (个体大鼠数据)。0095]图26b示出肾切除术后的血清肌酸酐(A)和血细胞比容(B)。0096]图27示出每周的平均RBC#。0097]图28示出中期时的相对RBC#/个体大鼠数据。0098]图29示出最终血清电解质浓度。0099]图30示出相对血清磷(最终)/个体大鼠数据。0100]图31示出最终血清蛋白浓度。0101]图32示出相对血清白蛋白&蛋白总量(最终)/个体大鼠数据。0102]图33示出最终血清肝功能。0103]图34示出最终血清胆固醇、三酸甘油酯和葡萄_ο0104]图35示出相对血清胆固醇、三酸甘油酯、葡萄糖(最终)/个体大鼠数据0105]图36示出最终Hb、MCH禾口 MCHC。0106]图37示出最终相对[Hb]/个体大鼠数据。0107]图38示出最终WBC计数。
图39示出最终WBC组成。图40示出最终网织红细胞。图41示出最终血小板数据。图42示出游泳试验结果。图43示出每个试验组的代表性H&E-染色的骨髓组织切片。上图显示，与对照组相比，肾切除+细胞注入组的骨髓细胞含量和骨髓与红细胞的比率看起来相同。相比之下，肾切除+构建体组和未治疗动物组中的骨髓分别显示出中度、显著降低的骨髓细胞含量(放大率200倍)。下图示出上图中被框起的图的高清视图(放大率未知)。图44示出每个试验组的代表性H&E-染色的脾组织切片。上图显示在对照组和肾切除+细胞注入组之间没有观察到显著的组织学差异或变化。相比之下，在肾切除+构建体组和未治疗动物组中的紧邻囊下的红髓间隙，显示成人红细胞(RBC)和RBC前体分别存在中度和显著的降低(放大率200倍)。下图示出上图中被框起的图的高清视图(放大率未知)。图45示出每个试验组的代表性H&E-染色的肝组织切片。相比对照组，在肾切除 +构建体组或未治疗的肾切除动物组中未观察到显著的肝实质和/或肝门三联征变化。相比之下，未在肾切除+细胞注入组中观察到窦状隙血细胞生成焦点区(圆形)(放大率200 倍)。下图示出上图中示出的肝门三联征的高清视图(放大率未知)。图46示出每个试验组的代表性H&E-染色的肾组织切片(放大率1倍)。上图显示，相比对照组，其它三组的肾切片显示出结构缺失的进行性肾小球和肾小管变性，在所有对照组中，通过不良的血铁黄素和多灶性肾小管再生来表征(放大率200倍)。箭头指向构建体治疗部位。下图示出上图中被框起的图的高清视图(放大率未知)。图47示出个体大鼠数据/HCT% (相对血清肌酸酐)。第5组=实心圆；第6组= 环绕的“3” ；第4组=环绕的“1” ；第1组=环绕的“4” ；第2组=环绕的“2”。图48示出采用多层分级梯度技术(左图)或单层混合梯度技术使来自新鲜分离肾组织的印ο生成细胞组分富集。两种方法均导致非印ο生成细胞组分(主要为肾小管细胞)从印O带局部缺失，该印O带介于1. 025g/mL和1. 035g/mL之间。图49a示出确定上皮钙黏着蛋白表达的定量实时PCROiRTPCR)结果。图49b示出采用密度分级梯度确定Epo富集的定量实时PCROiRTPCR)结果。图50图示了分级梯度组分在分离和培养时的相对基因表达。图(a)和(b)示出在组织分离后立即进行密度梯度分离的两批独立的原代肾细胞。在两批细胞中，促红细胞生成素(Epo)mRNA的表达在分级梯度的带1中可再生地富集。将所有样本中的Epo表达标准化为新鲜消化的异质性肾细胞群。图(c)清楚地显示除了富集EPO表达外，带1还相对缺乏肾小管细胞，这可通过肾小管标记物、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白1 和水通道蛋白2的低表达来证实。相比之下，肾小管标记物在带2和带3中富集，突出分级梯度的附加特征-同时富集肾小管细胞组分。图51示出水通道蛋白-1(肾小管细胞标记物)的蛋白质印迹分析(Western Blot analysis) 0此蛋白质印迹示出水通道蛋白1在带2和带3中有清晰和明确的富集，这进一步支持了组分2和组分3的肾小管细胞富集，如图2中图(d)所描述。图52示出治疗后16周的血细胞比容水平。
图53示出治疗后12周的血红蛋白水平。图M示出用两种不同剂量的rEPO治疗的5/6肾切除大鼠(与对照组和未治疗组相比)随时间变化的血细胞比容水平。图55示出用高和低剂量的EPO富集细胞治疗的5/6肾切除大鼠(与肾小管富集细胞和rEPO相比)随时间变化的血细胞比容水平。图56a和56b示出治疗后16周的血清肌酸酐浓度以及治疗前至治疗后16周期间肌酸酐占对照组的百分比。图57示出治疗后12周的游泳耐力结果。图58示出治疗后16周的重量增量占初始重量的百分比。图59示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗的尿毒症大鼠中血清肌酸酐占健康对照组的百分比。图60示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中白蛋白/球蛋白的比率。图61示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中磷钙的比率。图62示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中的血清三酸甘油酯水平。图63示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中的血清胆固醇水平。图64示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)处理后12周的尿毒症大鼠中的血清血红蛋白水平。图65示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中的血细胞比容水平。图66示出功能性啮齿动物肾小管细胞对罗丹明缀合白蛋白的吸收。图67示出与未治疗的尿毒症大鼠相比，新肾细胞(异质性EPO生成细胞)治疗的尿毒症大鼠的血清肌酸酐、肾功能指标维持在接近正常的水平。图68示出对从正常人体肾脏分离和增殖的肾小管和肾小球细胞的表型特征的维持。图69示出与3D动态培养物中的肾小管缺乏群相比，肾小管富集群中的肾小管标记物、钙黏着蛋白的表达增加。图70示出通过流式细胞术对EPO生成细胞进行分离。图71示出“常氧”(21%氧)和“低氧” 氧)啮齿动物培养物的分级梯度，这些培养物分别收集并一起施加至相同的分级梯度中。图72示出“常氧”(21%氧)和“低氧” 氧)犬科动物培养物的分级梯度，这些培养物分别收集并一起施加至相同的分级梯度中。图73示出低氧培养对B4中基因表达的影响。图74示出B2和B4亚组分的组成分析结果。使用定量实时PCR(qRTPCR)来评价B2 和B4亚组分中肾细胞型特异基因的表达。(a，b)根据维生素D羟化酶(CYP2R1)和Cubilin 的相对表达，亚组分B2相对于B4和所有其它亚组分富集近端肾小管细胞。(c)与B4相比，亚组分B2中也富集远端肾小管标记物上皮钙黏着蛋白。(e，f)亚组分B4中富集肾小球标记物Mphrin和podocin，还富集血管标记物kdr(d)。(g，h)B4中还富集氧调节间质标记物Hif2a和Epo。(i)B2和B4的结果定量展示。(j)通过对亚分级分离后培养的细胞进行免疫细胞化学分析来确定B2近端(神经钙黏着蛋白/绿色)和远端(上皮钙黏着蛋白 /红色)肾小管标记物的高效表达。(j)相比之下，上皮钙黏着蛋白-或神经钙黏着蛋白阳性细胞很少存在于B4培养物中。图75示出B2和B4亚组分的功能特征。(a)将B2和B4细胞进行继代培养并评价 cubilin表达及受体介导的白蛋白吸收。图表示i.用cubilin的同型匹配IgG对照抗体染色的B2细胞；ii用竞争性抑制剂RAP预处理并用罗丹明缀合的人血清白蛋白(HSA-罗丹明)脉冲处理15分钟(10yg/ml)的B2细胞；iii.用HSA-罗丹明脉冲处理15分钟(10 μ g/ ml)(红色)并用抗-(^bilin抗体(绿色)标记的B2细胞；iv. (iii)的重叠图像，其显示出cubiIin+细胞(绿色)与HSA-罗丹明(红色)吸收的共定位；？与(iii/iv)相同，但 B4细胞显示出极少的cubilin+细胞(绿色)并且几乎无白蛋白吸收(红色)。在所有情况中，用烟酸己可碱(Hoechst)(蓝色)对细胞核复染。(b)检验各组分(B1-B4)中Epo的表达，其在大气(21%)或低氧张力下(均在37°C下)暴露M小时后产生。在亚组分B4中，能够响应氧张力的降低而上调Epo的Epo表达细胞的相对比例最大。注意B2和 B4中Epo相对表达的一致性，结果在图l(i)中示出。图76示出B2和B4的体内移植对尿毒症/贫血大鼠的存活率、体重和心脏重量的影响。(a)示出研究期间(肾切除后30周，治疗后6个月)各对照组和治疗组的存活率。 在治疗组中，仅B2治疗的大鼠具有100%的存活率，等于健康对照组。(b)按下式分别计算每只大鼠随时间的体重变化百分比((死亡时的重量)-(开始研究时的重量))/ (开始研究时的重量)。相比肾切除对照动物的5%体重损失，B2治疗的动物的14. 3%的体重增量视为极其显著(P值< 0.0001)。B4(P值=0.0239)和载体(P值=0. 0125)也表现出显著高于肾切除动物的重量增量。(c)计算相对心脏重量占尸体剖检时体重的百分比。未治疗的肾切除大鼠在尸体剖检时具有显著增大的心脏(健康对照组的150%)。相比肾切除动物(P值< 0. 0001)，治疗后六个月，B2仅表现出25%的相对心脏重量增量(图3c)。与肾切除对照组相比，B4(P值=0. 0002)和载体(P值< 0. 0001)也具有统计意义上的显著性。图77示出对滤过性和红细胞生成治疗效果的时间和统计评价。采用得自SAS Institute Inc(Cary,NC)的7. 0版JMP对来自10至20周数据的血清化学结果进行单因素方差分析(ANOVA)。(a，b，c)观察到治疗组中的红细胞生成存在显著差异(HCT，p = 0. 0005 ； RBC, p = 0. 00 )，其中与未治疗的肾切除组、UNFX治疗组和rEPO治疗组相比，B2和B4治疗的大鼠显示最大的改善。(d，e，f)观察到治疗组中的滤过功能存在显著差异(sCREAT，p < 0. 0001 ；BUN, ρ < 0. 0001)，其中B2治疗的效果最为显著，其次为B4。图78示出研究中期(12-14周)的临床评价结果。在研究中期(12_14周)采集血液，以进行临床化学分析，突出健康对照组和肾切除组之间或肾切除组相对于B2、B4或 UNFX治疗组差异的参数在图(a)中示出。两种B2治疗特有的显著效果为(b)增强的蛋白质保留性，正如B2组相对于肾切除组在血清白蛋白(sALB)和白蛋白/球蛋白(A/G)比率方面的增加(P <0.001)所证实，和(c)B2相对于肾切除组在血清甘油酸三酯和胆固醇方面的降低(P < 0.001)。
图79显示肾脏质量与肾功能相关。在尸体剖检时采集(右)肾重量。(a)B2治疗的肾中的单侧肾脏质量等于健康对照组。对在尸体剖检时收集的血清中的sCREAT的检验显示，肾脏质量和sCREAT之间存在明显的相反关系(图a，副轴)。(b)对所有所研究大鼠的肾脏质量和sCREAT的线性回归分析确定了肾重量和肾功能存在显著逆相关性(r2 = 0. 38 ；ρ 值< 0. 001)。图80示出用SRY探针进行基于PCR的DNA分析。图81示出对肾和骨髓的组织病理学分析。(a)假手术对照组和残肾(Masson Trichrome染色和PAS染色)的代表性光显微图。假手术组(对照组)的肾具有正常的实质结构，其通过界限清楚的皮质-髓质节和肾小管或肾小球无损伤来表征。肾切除未治疗的动物表现出由中度至显著的肾小管-间质纤维化和肾小球硬化组成的进行性肾小球肾小管变性(通过Masson Trichrome法染成蓝色)、具有管腔管型的肾小管扩张(PAS嗜伊红染色)和降低的骨髓细胞含量(骨髓细胞与红细胞比率)。相比肾切除动物，B2治疗的大鼠证明了治疗效果，其通过肾小管-间质纤维化和肾小球硬化的减轻、近乎正常的骨髓细胞含量和等于健康对照组的骨髓细胞与红细胞比率来表征。(b)H&E染色的骨髓充分证明了未治疗的肾切除大鼠中存在骨重吸收，显著的破骨细胞并形成骨质糜烂的陷窝。类似于健康对照组，B2治疗的大鼠的骨内膜表面平滑，无破骨细胞、陷窝或骨质糜烂的迹象。(c)终末血清磷(mg/dl)和钙(mg/dl，更正蛋白总量[Ca]-0.4[TP]+3. 3)为模型中骨重吸收的组织学观察和经B2治疗的重吸收改善提供了全身支持。图8 示出治疗后12周的存活率。图82b示出治疗25周后的存活率。图83a示出初始重量至死亡期间的总体重。图8 示出在用递送体系中的细胞群治疗的啮齿动物中，初始重量至死亡期间的重量变化百分比。图84示出所有治疗组在12周期间的血清肌酸酐水平。图85示出B2和B4治疗组以及肾切除组、健康对照组和假手术肾切除组在12周期间的血清肌酸酐水平。图86示出在所有时间点对血清肌酸酐进行的单因素ANOVA分析。图87示出血液尿素氮(BUN)水平。图88示出所有治疗组在12周间的HCT百分比。图89示出B2和B4治疗组以及肾切除组、健康对照组和假手术肾切除组在12周期间的HCT百分比。图90示出在所有时间点对HCT百分比进行的单因素ANOVA分析。图91示出心脏重量占总体重的百分比。图92示出研究终点时的总血清蛋白水平。图93示出3个月时间点的组织学评价。图94示出治疗后12周的存活率数据。图95示出治疗前至治疗后12周间的重量变化百分比。图96示出12周时的血清肌酸酐水平。图97示出12周时的血清BUN水平。0170]图98示出相对于健康对照组表达的尿蛋白水平。0171]图99示出治疗后六周时的血清A/G比率。0172]图100示出12周时的HCT百分比。0173]图101示出12周时的RBC个数。0174]图102示出治疗后6周和12周时的平均全身血压。0175]图103示出3-5个月时间点时的组织学评价。0176]图104示出工作原型对血清肌酸酐水平的影响。0177]图105示出非工作原型对血清肌酸酐水平的影响。0178]图106示出B3和B2/B4对血清肌酸酐水平的影响。0179]图107示出B2、B2/B4和B2/B3对尿蛋白水平的影响。0180]图108示出B2/B4、B2/B3和B3/B4对血压的影响。0181]图109示出研究初期末期肌酸酐水平之间的差值。0182]图110示出研究初期与末期BUN水平之间的差值。0183]图111示出研究初期与末期ALB水平之间的差值。0184]图112示出研究初期与末期TPRO水平之间的差值。0185]图113示出研究初期PHOS水平与研究末期PHOS水平之间的差值。0186]图114示出研究初期末期更正总蛋白修的钙之间的差值。0187]图115示出犬科动物肾细胞生长。0188]图116示出猪肾细胞生长。0189]图117示出人肾细胞生长。0190]图118示出人活组织检查的细胞扩增结果。0191]图119示出细胞的免疫细胞化学结果。0192]图120示出流式细胞术的结果，证明大鼠培养物中所含的EPO表达细胞与近端和
远端肾小管细胞(图120a、图120b)截然不同。经由荧光缀合的白蛋白的吸收评估培养物中cubilin阳性近端肾小管细胞的功能性，吸收的特异性通过添加竞争性抑制剂RAP来确定(图 120c-f)。图121示出每个月对对滤过功能的监测((a)示出sCREAT ； (b)示出HCT ； (C)示出比较临床化学结果)。图122示出用于鉴定肾和骨髓中组织水平影响的组织学分析。图123示出来自猪和人的CKD样本的组织病理学特征和非CKD肾样本的组织学特征组织比较。图IM示出源自CKD-和非CKD培养物之间的扩增能力(a)；通过观察一部分cubilin阳性细胞中受体介导的白蛋白吸收来确定建系培养物中的肾小管细胞功能 (b-d)。图125示出CKD组织样本(相对于非CKD组织样本)中的EPO mRNA表达(a)；这些样本的等电聚焦和蛋白质印迹分析确定了将基因表达模式一般在蛋白质水平上重复(b)； 由CKD和非CKD肾样本构建的EPO表达细胞培养物响应低氧刺激，同时在刺激的M小时内对EPO基因转录进行可变上调(C)。图126示出成年啮齿动物分级梯度的细胞带。
图127示出促红细胞生成素、η印hrin、podocin、cubilin和Cyp在成年啮齿动物细胞制剂中的基因表达模式。图128示出自患病成年啮齿动物肾脏分离的细胞制剂(5X)。图1 示出分离自患末期肾衰竭的成年大鼠的细胞中B4特异基因的表达。图130示出幼年和成年B2细胞制剂中肌酸酐值的直接比较。图131示出幼年和成年B2细胞制剂中血清BUN值的直接比较。图132示出B2和B4细胞制剂中Has_2的表达。图133示出HAS mRNA(qRTPCR，下图)和蛋白质(上图，蛋白质印记)的体内表达。发明详述本发明涉及分离的肾细胞(包括肾小管细胞群和生成促红细胞生成素(EPO)的肾细胞群)，及其分离和培养方法，以及用生物活性肾细胞(包括富集的肾小管和EPO生成细胞群)治疗有需要的受试者的方法。定义除非另有定义，本文所用技术和科学术语的与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。由R Lanza,R Langer和J Vacanti编著的Principles of Tissue Engineering第三版Q007)为本领域技术人员提供了本申请中所用许多术语的一般性指导。本领域的技术人员将认识到许多方法和材料与本文所述的方法和材料类似或等同，这些方法和材料可用于本发明的实施。实际上，本发明决不限于所述方法和材料。如本文所用，术语“细胞群”是指通过从合适的组织源(通常从哺乳动物)直接分离得到的细胞数量。可随后对分离的细胞群进行体外培养。本领域的普通技术人员将意识到用于分离和培养与本发明一起使用的细胞群的各种方法以及适用于本发明的细胞群中的各种数量的细胞。细胞群可为源自肾的未分化、异质性细胞群。例如，异质性细胞群可从肾活检组织或全肾组织中分离。作为另外的选择，异质性细胞群可源自哺乳动物细胞的体外培养物，这些培养物由肾活检组织或全肾组织构建。也可将未分化的异质性细胞群称为非富集细胞群。如本文所用，术语“混合物”是指两个或更多个分离的富集细胞群的组合，这些分离的富集细胞群源自未分化的异质性细胞群。根据某些实施方案，本发明的细胞群为肾细胞群。“富集”细胞群或制剂是指源自原始肾细胞群(例如，未分化的异质性细胞群)的细胞群，其相比原始细胞群包含较大比例的特定细胞类型。例如，原始肾细胞群可富集第一、第二、第三、第四、第五等目标细胞群。如本文所用，术语“细胞群”、“细胞制剂”和“细胞原型”可互换使用。在一个方面，如本文所用，术语“富集”细胞群是指源自原始肾细胞群(例如，肾活检或培养的哺乳动物肾细胞的细胞悬液)的细胞群，其相比原始细胞群包含较大比例的能够生成EPO的细胞。例如，术语“B4”为源自原始肾细胞群的细胞群，其相比原始细胞群包含较大比例的EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。本发明的细胞群可富集一种或多种细胞类型而缺乏一种或多种其它细胞类型。例如，相对于非富集细胞群(即富集细胞群源于此的原始细胞群)中的间质成纤维细胞和肾小管细胞而言，富集的EPO生成细胞群可富集间质成纤维细胞而缺乏肾小管细胞和集合管上皮细胞。在提及EPO-富集或“B4”细胞群的所有实施方案中，富集细胞群为异质性细胞群，其包含可以氧调节的方式生成EPO的细胞， 正如内源EPO基因的氧可调EPO表达所证实。在另一个方面，富集细胞群也可指上述源自原始肾细胞群的细胞群，其相比原始细胞群包含较大比例的表达一种或多种肾小管细胞标记物的细胞。例如，术语“B2”是指源自原始肾细胞群的细胞群，其相比原始细胞群包含较大比例的肾小管细胞。此外，富集表达一种或多种肾小管细胞标记物的细胞的细胞群(或“B2”)可包含一些来自集合管系统的上皮细胞细胞。尽管富集表达一种或多种肾小管细胞标记物的细胞的细胞群(或“B2”)相对缺乏EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞，但与原始细胞群相比，富集群可包含较小比例的这些细胞(ΕΡ0生成细胞、肾小球细胞和血管细胞)。通常，异质性细胞群缺乏一种或多种细胞类型，使得相对于缺乏前异质性细胞群中所含一种或多种细胞类型的比例而言， 缺乏的细胞群含有较小比例的一种或多种细胞类型。可能缺乏的细胞类型为任何类型的肾细胞。例如，在某些实施方案中，可能缺乏的细胞类型包括集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，其密度小于约1.045g/mL，称为“Bi”。在某些其它实施方案中，可能缺乏的细胞类型包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞，其密度大于约1.095g/mLj$*“B5”。在一些实施方案中，富集肾小管细胞的细胞群相对缺乏下列所有细胞“B1”、“B5”、氧可调EPO表达细胞、肾小球细胞和血管细胞。如本文所用，术语“低氧”培养条件是指相对于将细胞在大气氧含量(约21% )下培养的标准培养条件而言，在培养体系中使细胞经受可用氧含量降低的培养条件。本文将非低氧条件称为正常或常氧培养条件。如本文所用，术语“氧可调”是指细胞根据其中可用氧量调节(上调或下调)基因表达的能力。“低氧诱导”是指响应氧张力的降低而上调基因表达(无论是先期诱导还是初始氧张力)。如本文所用，术语“生物材料”是指适于导入活组织的天然或合成的生物相容性材料。天然生物材料是由生命体系产生的材料。合成生物材料不是由生命体系产生的材料。 本文所公开的生物材料可为天然和合成的生物相容性材料的组合。如本文所用，生物材料包括例如聚合物基质和支架。本领域的普通技术人员将意识到，一种或多种生物材料可被构建为多种形式(例如，构建为液体水凝胶悬浮液、多孔泡沫)，并且可包括一种或多种天然或合成的生物相容性材料。如本文所用，术语“贫血”是指红细胞数量和/或血红蛋白水平不足，这是由受试者的EPO生成细胞生成的功能性EPO蛋白不足、和/或释放于体循环内的EPO蛋白不足、和 /或骨髓中的成红血细胞无法响应EPO蛋白所导致。患有贫血的受试者不能维持红细胞稳态。通常，贫血可能伴随肾功能衰退或丧失(例如，慢性肾衰竭)，还包括与相对EPO缺乏相关的贫血、与充血性心力衰竭相关的贫血、与骨髓抑制性疗法如化学疗法或抗病毒疗法 (如AZT)相关的贫血、与非骨髓癌相关的贫血、与病毒感染(如HIV)相关的贫血以及与慢性疾病如自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎)、肝病和多器官系统衰竭相关的贫血。术语“ΕΡ0缺乏”是指可用促红细胞生成素受体激动剂(例如，重组EPO或EPO类似物)治疗的任何病症或疾病，包括贫血。如本文所用，术语“肾病”是指与任何阶段或程度的急性或慢性肾衰竭疾病相关的疾病，所述肾衰竭导致肾丧失执行血液滤过功能和从血液中排除多余的体液、电解质和废物的功能的能力。肾病还包括内分泌功能障碍，诸如贫血(促红细胞生成素缺乏)和矿物质不平衡(维生素D缺乏)。肾病可发生于肾脏中或可继发于多种病症，包括(但不限于) 心力衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫疾病或肝病。术语“治疗”是指治针对肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的治疗剂治疗和预防性或防治性措施，其中目的是逆转、预防或延缓(减轻)目标疾病。需要治疗的患者包括已患和易患或需预防肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的患者。术语如本文所用，“治疗”包括稳定和/或改善肾功能。术语“构建体”是指沉积在支架或基质表面上或表面中的一个或多个细胞群，该支架或基质由一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料制成。所述一个或多个细胞群可用生物材料包覆、沉积在其上、包埋于其中、附着到其上或截留于其中，该生物材料由一种一种或多种合成或天然存在的生物相容性聚合物、蛋白质或肽制成。所述一个或多个细胞群可与生物材料或支架或基质在体外或体内结合。通常，选择用于形成支架/生物材料的一种或多种生物相容性材料，以引导、促进或允许形成至少一个细胞群沉积在其上的多室三维结构。也可选择用于形成构建体的一种或多种生物材料，以引导、促进或允许构建体或构建体细胞组分的分散和/或其与内源性宿主组织的整合，或引导、促进或允许构建体或构建体细胞组分的存活、移植、耐受或功能性。术语“受试者”应指任何单一的人受试者，包括需要治疗的患者，其正在患有或已患有肾病、贫血或EPO缺乏的一种或多种病征、症状或其它指征。此类受试者包括但不限于新近确诊的或以前已确诊且正在经历复发或再发，或具有患肾病、贫血或EPO缺乏风险的受试者(无论何种原因)。此前已针对受试者肾病、贫血或EPO缺乏对受试者进行了治疗或未如此进行治疗。术语“患者”是指需要治疗的单个动物，更优选哺乳动物(包括非人动物，例如犬、 猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、绵羊和非人灵长类)。最优选的是，本文中的患者为人。术语“样本”或“患者样本”或“生物样本”通常应指从受试者或患者、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其它来源获得的任何生物样本。该术语包括组织活检样本，诸如肾活检样本。该术语包括培养的细胞，诸如培养的哺乳动物肾细胞。从哺乳动物获取组织活检及培养细胞的方法是本领域所熟知的。如果术语“样本”单独使用，则其仍应意味着该 “样本”是“生物样本”或“患者样本”，即，这些术语可互换使用。术语“试样”是指得自经本发明方法治疗的受试者的样本。试样可源于哺乳动物受试者的各种来源，包括但不限于血液、精液、血清、尿液、骨髓、粘液、组织等。术语“对照物”或“对照样本”是指阴性或阳性对照物，其中预期阴性或阳性结果有助于使试样的结果相关联。适于本发明的对照物包括但不限于已知表现出正常红细胞稳态指征的样本、已知表现出贫血指征的样本、得自已知未贫血受试者的样本和得自已知贫血受试者的样本。适用于本发明方法的其它对照物包括但不限于源自经已知可调节红细胞生成的药理学药剂(如重组EPO或EPO类似物)治疗的受试者的样本。此外，对照物可为得自经本发明方法治疗之前的受试者的样本。另外的合适对照物可为得自已知患有任何类型或阶段肾病的受试者的试样，和得自已知未患有任何类型或阶段肾病的受试者的样本。对照物可为正常健康的对比对照物。本领域的技术人员将意识到适用于本发明的其它对照物。细胞群
本发明提供了用于治疗肾病，即，使肾功能稳定和/或改善和/或再生的分离的异质性肾细胞群及其混合物，所述肾细胞群和混合物富集特定的生物活性组分或细胞类型和 /或缺乏特定的无活性或不需要的组分或细胞类型。生物活性细胞群在一个方面，本发明基于意外的发现，S卩，富集生物活性组分而缺乏无活性或不需要的组分的异质性肾细胞群的某些亚组分提供了优于原始细胞群的治疗和再生效果。例如，本发明的缺乏无活性或不需要的组分的生物活性组分(例如B2、B4和B3)，例如Bl和 B5，可单独或在混合时使肾功能得到意想不到的稳定和/或改善和/或再生。在一个优选的实施方案中，生物活性细胞群为B2。在某些实施方案中，将B2细胞群与B4混合。在其它实施方案中，将B2细胞群与B3混合。B2细胞群通过选自下列一种或多种的肾小管细胞标记物的表达来表征巨蛋白(megalin)、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Aqpl)、水通道蛋白-2 (Aqp2)、 RAB17、RAS癌基因家族成员(Rabl7)、GATA结合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员 Bl (AldMbl)、醛脱氢酶1家族成员A3 (AldhlU)和钙蛋白酶_8 (Capn8)以及集合管标记物水通道蛋白-4 (Aqp4)，其中B2细胞群比B3和/或B4具有更大和更多的颗粒细胞，因此其浮力密度介于约1. 045g/mL和约1. 063g/mL之间(啮齿动物)、介于约1. 045g/mL和1. 052g/ mL之间(人)和介于约1. 045g/mL和约1. 058g/mL之间(犬科动物)。B3细胞群通过用EPO生成细胞表达血管、肾小球和近端肾小管标记物来表征，与 B2和B4相比，所述B3细胞群具有中等大小和中等粒度，因此其浮力密度介于约1.063g/mL 和约1. 073g/mL之间(啮齿动物)、介于约1. 052g/mL和约1. 063g/mL之间(人)和介于约1. 058g/mL和约1. 063g/mL之间(犬科动物)。B3可通过选自下列一种或多种的标记物的表达来表征水通道蛋白7(Aqp7)、含FXYD域的离子转运调节子、溶质载体家族 17(磷酸钠)成员3(Slcl7a3)、溶质载体家族3成员1 (Slc3al)、紧密连接蛋白2 (Cldn2)、 napsinA天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2 (易化萄糖转运蛋白)成员2(Slc2a2)、 丙氨酰(膜)氨肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27 (Tmem27)、酰基辅酶合成酶介质链家族成员 2 (Acsm2)、谷胱甘肽过氧化物酶3(Gpx3)、果糖_1，6_ 二磷酸酶1 O^bpl)和丙氨酸乙醛酸氨基转移酶2 (Agxt2)。B3还通过血管表达标记物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标记物podocin(Podn)来表征。B4细胞群通过选自下列一种或多种的血管标记物的表达来表征PECAM、VEGF, KDR、HIFla ；包含下列一种或多种的肾小球标记物组Podocin (Podn)和N印hrin (N印ti)；和相对于未分化(UNFX)B2和B3的氧可调EPO富集群。B4还通过选自下列一种或多种的标记物的表达来表征趋化因子(C-X-C基序)受体4(Cxcr4)、内皮素B型受体(Ednrb)、 V型胶原a2(Col5a2)、钙黏着蛋白5(CdM)、组织纤溶酶原激活物(Plat)、血管生成素 2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘连蛋白) (Sparc)、丝甘蛋白(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制因子3 (TimpIB)、维耳姆斯瘤1 (Wtl)、无翅型 MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G蛋白信号转导调节子4(Rgs4)、血小板-内皮细胞粘附分子(Pecam)和促红细胞生成素(Epo)。B4还通过比B2或B3更少、更小的颗粒细胞来表征，其浮力密度介于约1. 073g/mL和约1. 091g/ml之间(啮齿动物)、介于约1. 063g/mL和约1. 091g/mL之间(人和犬科动物)。B2和B4生成的透明质酸透明质素(hyaluronan)(也称为透明质酸或透明质酸盐)为糖胺聚糖(GAG)，其由非硫酸化二糖单元(具体为N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸)的规则重复序列组成。其分子量的范围可为400道尔顿(二糖)至一百万道尔顿以上。经发现，透明质酸以各种量存在于所有组织(诸如皮肤组织、软骨组织和眼组织)中，并存在于成年动物的大部分(如果不是所有)体液中。其尤其富含于早期胚胎中。由透明质素(实际上通常为GAG)形成的空间使其可在细胞迁移、细胞附着、伤口修复期间、器官形成、免疫细胞粘附、细胞内信号转导的激活以及肿瘤转移方面发挥作用。这些作用由结合至透明质素的特异蛋白和蛋白聚糖介导。细胞运动和免疫细胞粘附由细胞表面受体RHAMM介导(Rec印tor for Hyaluronan-Mediated Motility ；Hardwick 等，1992)和 CD44 (Jalkenan 等，1987 ；Miyake 等，1990)。透明质素直接在细胞表面的内膜处合成，在其合成过程中，生长的聚合物从膜中伸至细胞外部。合成由单一蛋白酶、透明质素合酶(HAS)介导，其中透明质素合酶的基因家族由至少3个成员组成。近来已证实透明质酸可与⑶44相互作用，并且此类相互作用(除了其它作用外) 可为损伤肾组织补充非居留细胞(诸如间充质干细胞(MSC))并增强肾脏再生性(Kidney International(2007)72，430—441)。意外地的是，已发现B2和B4细胞制剂均能够通过透明质酸合酶-2(HASD-更特异地富集在B2细胞群中的标记物的作用在体外和体内表达较高分子量类型的透明质酸 (HA)。经证实，在5/6Nx模型中用B2进行治疗可减轻纤维化，同时增强HAS-2的体内表达， 并预期可在治疗过的组织内产生高分子量HA。值得注意的是，未经治疗的5/6Nx模型产生纤维化，同时检测到有限的HAS-2且产生极少的高分子量HA。不希望受理论束缚，假定主要由B2 (在一定程度上由B4)产生的这种高分子量类型的抗炎HA与细胞制剂协同作用，以减轻肾脏纤维化并辅助肾脏再生。因此，本发明包括在包含透明质酸的生物材料中递送本发明的细胞原型。本发明还构思了通过直接生成或经植入细胞刺激生成来提供再生刺激的生物材料组分。在一个方面，本发明提供了分离的异质性EPO生成肾细胞群，其用于治疗有需要的受试者的肾病、贫血和/或EPO缺乏。在一个实施方案中，细胞群源自肾活检。在另一个实施方案中，细胞群源自全肾组织。在另一个实施方案中，细胞群源自哺乳动物细胞的体外培养物，这些培养物由肾活检组织或全肾组织构建。在所有实施方案中，这些细胞群为未分化的细胞群，在本文中也称为非富集细胞群。在另一个方面，本发明提供了分离的促红细胞生成素(EPO)生成肾细胞群，其进一步富集，使得富集亚群相对于原始或初始细胞群而言包含较大比例的EPO生成细胞。在一个实施方案中，相对于未富集的初始细胞群而言，富集的EPO生成细胞组分包含较大比例的间质成纤维细胞和较小比例的肾小管细胞。在某些实施方案中，相对于未富集的初始细胞群而言，富集的EPO生成细胞组分包含较大比例的肾小球细胞和血管细胞以及较小比例的集合管细胞。在此类实施方案中，这些细胞群在本文中称为“B4”细胞群。在另一个方面，本发明提供了与一种或多种附加肾细胞群混合的EPO生成肾细胞群。在一个实施方案中，EPO生成细胞群为富集EPO生成细胞的第一细胞群，例如，B4。在另一个实施方案中，EPO生成细胞群为未富集EPO生成细胞的第一细胞群，例如，B2。在另一个实施方案中，第一细胞群与第二肾细胞群混合。在一些实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞，这可通过肾小管细胞表型的存在来证实。在另一个实施方案中，肾小管细胞表型可通过一种肾小管细胞标记物的存在来指示。在另一个实施方案中，肾小管细胞表型可通过一种或多种肾小管细胞标记物的存在来指示。肾小管细胞标记物包括但不限于巨蛋白、 cubilin、透明质酸合酶2 (HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、 上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Aqpl)、水通道蛋白_2 (Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rabl7)、GATA结合蛋白3 (feita3)、含FXYD域的离子转运调节子4 (i^Xyd4)、溶质载体家族9 (钠/氢交换剂)成员4 (Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员Bl (AldMbl)、醛脱氢酶 1家族成员A3 (AldhlU)和钙蛋白酶-8 (CapnS)。在另一个实施方案中，第一细胞群与若干种肾细胞中的至少一种混合，所述肾细胞包括但不限于源自间质的细胞、肾小管细胞、源自集合管的细胞、源自肾小球的细胞和/或源自血液或脉管系统的细胞。
在一个方面，本发明的EPO生成肾细胞群通过EPO表达和对氧的生物应答来表征， 使得培养体系中氧张力的降低而诱导EPO的表达。在一个实施方案中，EPO生成细胞群富集 EPO生成细胞。在一个实施方案中，相对于在正常大气( 21%)含量的可用氧下培养的细胞群而言，当细胞群在培养体系中使细胞经受可用氧含量降低的条件下进行培养时，EPO 表达得以诱导。在一个实施方案中，低氧条件下培养的EPO生成细胞的EPO表达水平比常氧条件培养的EPO生成细胞相对更高。通常，相比将细胞在正常大气含量的可用氧(也称为正常或常氧培养条件)下培养时，将细胞在低含量的可用氧(也称为低氧培养条件)下进行培养意味着低氧含量相对降低。在一个实施方案中，低氧细胞培养条件包括在约小于的氧、约小于2%的氧、约小于3%的氧、约小于4%的氧或约小于5%的氧下培养细胞。 在另一个实施方案中，正常或常氧培养条件包括在约10%的氧、约12%的氧、约13%的氧、 约14%的氧、约15%的氧、约16%的氧、约17%的氧、约18%的氧、约19%的氧、约20%的氧或约21%的氧下培养细胞。在另一个实施方案中，通过将细胞在约小于5%的可用氧下培养，并且将EPO表达水平与在大气(约21% )氧下培养的细胞进行比较时，可获得EPO表达的诱导或增加。在另一个实施方案中，通过下述方法在能够表达EPO的细胞培养物中获得EPO的诱导，所述方法包括第一培养阶段，其中细胞培养物在大气氧(约21% )下培养一段时间；和第二培养阶段，其中可用氧含量降低并且在约小于5%的可用氧下培养相同的细胞。在另一个实施方案中，响应低氧条件的EPO表达通过HIFl α调节。本领域的普通技术人员将意识到，本领域中已知的其它氧操纵培养条件也可用于本文所述的细胞。在一个方面，EPO生成哺乳动物细胞的富集群通过对灌流条件的生物应答(例如 EPO表达)来表征。在一个实施方案中，灌流条件包括短暂、间歇或连续的流体流(灌流)。 在一个实施方案中，当以使得动力经由流动传递至细胞的方式对培养细胞的培养基进行间歇或连续的循环或搅拌时，可机械诱导EPO表达。在一个实施方案中，将经受短暂、间歇或连续流体流的细胞以使其在材料中或之上呈三维结构的方式进行培养，所述材料提供用于形成此类三维结构的骨架和/或空间。在一个实施方案中，将细胞在多孔珠上培养，并借助于平台摇晃式摇床、轨道式平台或旋转瓶使其经受间歇或连续流体流。在另一个实施方案中，将细胞在三维支架上培养并置于装置中，通过所述装置使支架固定并且使流体定向地流经或穿过支架。本领域的普通技术人员将意识到，本领域中已知的其它灌流培养条件也可用于本文所述的细胞。无活性细胞群如本文所描述，本发明部分基于意外的发现，即，富集生物活性组分而缺乏无活性或不需要的组分的异质性肾细胞群的某些亚组分提供了优于原始细胞群的治疗和再生效果。在优选的实施方案中，本发明的细胞群缺乏Bl和/或B5细胞群。Bl细胞群包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，其中细胞群中细胞的浮力密度小于约1.045g/m。B5细胞群由低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞构成，其浮力密度大于约 1. 091g/mL。分离和培养细胞群的方法在一个方面，本发明提供了用于离析和分离肾细胞组分(例如，富集细胞群)的方法，所述肾细胞组分用于治疗用途，包括治疗肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷和肾小球滤过缺陷。在一个实施方案中，将细胞群与新鲜消化的(即，机械或酶消化的)肾组织分离或与哺乳动物肾细胞的异质性体外培养物分离。意外地发现，将肾细胞的异质性混合物在密度梯度上分离之前在低氧培养条件进行培养可使得B4和B2组分中的细胞分布和组成得以改善。在从患病或非患病肾分离的肾细胞中，观察到氧依赖性细胞从B2至B4的富集。不希望受理论束缚，这可归因于下列现象中的一种或多种1)特定细胞组分在低氧培养期间的选择性存活、死亡或增殖；幻细胞颗粒度和/或大小为响应低氧培养而变化，从而导致密度梯度分离过程中浮力密度和随后的定位发生变化；和幻细胞基因/蛋白质表达响应低氧培养期而变化，从而导致任何给定的梯度组分中的细胞存在差异特征。因此，在一个实施方案中，富集肾小管细胞的细胞群(例如，B2)具有抗低氧性。用于离析和分离本发明细胞群的示例性技术包括基于目标群中所含不同细胞类型的比重差而进行的密度梯度分离。任何给定细胞类型的比重可受细胞内的颗粒度、细胞内水的体积和其它因素影响。在一个方面，本发明提供给了用于分离本发明细胞制剂(如， B2和B4)的最佳梯度条件，这些细胞制剂遍及多个物种，包括但不限于人、犬科动物和啮齿动物。在一个优选的实施方案中，密度梯度用于获得肾小管细胞组分的新富集群，即，B2细胞群，其源自异质性肾细胞群。在一个实施方案中，密度梯度用于获得EPO生成细胞组分的新富集群，即，B4细胞群，其源自异质性肾细胞群。在其它实施方案中，密度梯度用于获得肾小管细胞、肾小球细胞和肾内皮细胞的富集亚群。在一个实施方案中，将EPO生成细胞和肾小管细胞与红细胞和细胞碎片分离。在一个实施方案中，将EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞与其它细胞类型分离，并且与红细胞和细胞碎片分离，而将肾小管细胞和集合管细胞亚群同时与其它细胞类型分离，并且与红细胞和细胞碎片分离。基于下述某些关键特征，本发明通过部分采用包含60%非离子碘化化合物碘克沙醇水溶液的OPTIPREP (Axis-aiield)密度梯度介质来产生新细胞群。然而，本领域的技术人员将认识到，包括用于分离本发明细胞群的必要特征的任何密度梯度或本领域中已知的其它方式(例如使用细胞表面标记物的免疫分离)均可根据本发明进行使用。本领域的技术人员也将认识到，可利用有助于经由密度梯度分离细胞亚群的相同细胞特征(大小和颗粒度)来通过流式细胞术分离细胞亚群(前向散射=流式细胞术对大小的反映，并且侧向散射=对颗粒度的反映)。重要的是，密度梯度介质应对特定的目标细胞具有低毒性。虽然密度梯度介质应对特定的目标细胞具有低毒性，但本发明也构思了使用在目标细胞选择过程中发挥作用的梯度介质。不希望受理论束缚，通过包含碘克沙醇的梯度回收的本发明细胞群似乎具有碘克沙醇耐受性，因为在加载和回收步骤之间存在相当的细胞损失，这表明在梯度条件下暴露于碘克沙醇会导致某些细胞的消除。经碘克沙醇梯度后出现在特定条带中的细胞对碘克沙醇和/或密度梯度暴露的不利影响具有耐受性。因此，本发明还构思了在本发明细胞群的分离和/或选择中使用对中度肾毒素温和的附加对比介质。此外， 密度梯度介质也不应与人血浆中的蛋白质结合或不利地影响目标细胞的关键功能。在另一个方面，本发明提供了对肾细胞群进行三维培养的方法。在一个方面，本发明提供了经由连续灌流培养细胞群的方法。在一个实施方案中，相比静态培养的细胞群而言，经由三维培养和连续灌流培养的细胞群显示出较高的细胞含量和互联性。在另一个实施方案中，经由三维培养和连续灌流培养的细胞群相比此类此类细胞群的静态培养物而言，显示出较多的EPO表达以及增强的肾小管相关基因(如上皮钙黏着蛋白)表达。在另一个实施方案中，相比静态培养的细胞群而言，经由连续灌流培养的细胞群显示出较高的葡萄糖水平和谷氨酰胺消耗。本领域的普通技术人员将意识到，本领域中已知的其它分离和培养方法也可用于本文所述的细胞。生物材料(聚合物基质或支架)如已公布的Bertram等的美国专利申请20070276507 (其全文以引用方式并入本文)所述，可将聚合物基质或支架成形为任意数量的所需构型，以满足任意数量的整个系统、几何形状或空间限制。在一个实施方案中，本发明的基质或支架可为三维的，并且可成形为符合器官或组织结构的尺寸和形状。例如，在使用聚合物支架治疗肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的过程中，可使用三维(3-D)基质。可使用多种不同形状的3-D支架。当然，聚合物基质可成形为不同的尺寸和形状，以符合不同体型的患者。 聚合物基质也可以其它方式成形以满足患者的特殊要求。在另一个实施方案中，聚合物基质或支架可为生物相容性的多孔聚合物支架。支架可由多种合成的或天然存在的材料形成，这些材料包括但不限于开孔聚乳酸(OPLA )、纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、酚醛、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯、聚芳醚腈、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、 聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚恶二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、多硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅酮、尿素甲醛、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、丝蛋白、弹性蛋白、藻酸盐、透明质酸、琼脂糖或它们的共聚物或物理共混物。支架构型的范围可为液体水凝胶悬浮液到柔性多孔支架至刚性保形多孔支架。水凝胶可由多种聚合物材料形成并可用于多种生物医学应用中。水凝胶可在外形上描述为亲水性聚合物的三维网络。根据水凝胶的类型，其含有多种百分比的水，但整体不溶于水。虽然其具有高含水量，但由于存在亲水残基，水凝胶能够另外结合大量液体。水凝胶大范围溶胀而未改变其凝胶状结构。可根据所用聚合物的性质和附加的产品专用设备对水凝胶的基本物理特征进行具体的改进。优选地，水凝胶可由聚合物、生物衍生材料、合成衍生材料或其组合制成，其具有生物惰性并与哺乳动物组织在生理上相容。水凝胶材料优选地不包括炎症应答。可用于形成水凝胶的其它材料的实例包括(a)改性的藻酸盐；(b)多糖(例如，结冷胶和角叉菜胶)，其通过接触一价阳离子而胶凝；(C)多糖(例如透明质酸)，其为极粘滞的液体或通过结构的缓慢演变而随时间触变并形成凝胶；和(d)聚合物水凝胶前体(例如，聚氧乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白质)。美国专利No. 6，224，893B1对适于制备根据本发明的水凝胶的各种聚合物以及此类聚合物的性质做了详细的描述。支架或生物材料特性能够使细胞附着到支架或生物材料上并与其相互作用，和/ 或可提供截留细胞的多孔空间。在一个实施方案中，本发明的多孔支架或生物材料允许将一种或多种细胞群或细胞混合物添加或沉积到被构建为多孔支架的生物材料上(例如，通过附着细胞)和/或支架孔内(例如，通过截留细胞)。在另一个实施方案中，支架或生物材料允许或促进支架内细胞细胞和/或细胞生物材料的相互作用，以形成本文所述的构建体。在一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由呈水凝胶形式的透明质酸(HA) 构成，其还包含大小范围在5. IkDA至大于2X106kDA的HA分子。在另一个实施方案中， 根据本发明使用的生物材料由呈多孔泡沫形式的透明质酸(HA)构成，其还包含大小范围在5. IkDA至大于2X106kDA的HA分子。在另一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由聚乳酸(PLA)基泡沫构成，其具有开孔结构和约50微米至约300微米的孔径。在另一个实施方案中，特定的细胞群(优选B2和B4)尤其可在肾内植入后通过透明质酸合酶-2 (HAS-2)直接合成和/或刺激合成高分子量透明质酸。本领域的普通技术人员将意识到，可使用本领域中已知的其它类型合成或天然存在的材料以形成本文所述的支架。在一个方面，本发明提供了由上述支架或生物材料制成的本文所述的构建体。构建体在一个方面，本发明提供了用于治疗有需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的可植入构建体，其具有本文所述的一种或多种细胞群。在一个实施方案中，构建体由生物相容性材料或生物材料、一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料构成的支架或基质、以及通过附着和/或截留沉积在支架表面上或包埋于其中的一种或多种本文所述的细胞群或细胞混合物构成。在某些实施方案中，构建体由生物材料和本文所述的一种或多种细胞群或细胞混合物构成，所述细胞群或细胞混合物用一种或多种生物材料组分包覆、沉积在其上、与其附着、截留于其中、包埋于其中和/或与其结合。在另一个实施方案中，构建体的沉积细胞群或细胞组分为富集氧可调EPO生成细胞的第一肾细胞群。在另一个实施方案中，除了氧可调EPO生成细胞外，第一细胞群还包含肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，构建体的沉积细胞群或一种或多种细胞组分包括第一富集肾细胞群和第二肾细胞群。在一些实施方案中，第二细胞群未富集氧可调EPO生成细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞并包含集合管上皮细胞。在其它实施方案中，肾小管细胞可通过一种或多种肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Aqpl)、水通道蛋白_2 (Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab 17)、GATA结合蛋白3 (feita3)、含FXYD域的离子转运调节子4 (i^Xyd4)、溶质载体家族 9 (钠/氢交换剂)成员4 (Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员Bl (AldMbl)、醛脱氢酶1家族成员 A3 (Aldhla3)和钙蛋白酶 _8 (Capn8)。在一个实施方案中，沉积在生物材料或支架上或与其结合以形成本发明构建体的细胞群源自多种来源，诸如自体、同种异体、或同系(自体或同基因)来源。本领域的普通技术人员将意识到，存在若干种适用于沉积细胞群或将其以其它方式与生物材料结合以形成构建体的方法。在一个方面，本发明的构建体适用于本文所述的方法。在一个实施方案中，构建体适于对有需要治疗任何病源的肾病、贫血或任何病源的EPO缺乏的受试者进行施用。在其它实施方案中，构建体适于对有需要改善或恢复红细胞稳态的受试者进行施用。在另一个实施方案中，构建体适于对有需要改善肾功能的受试者进行施用。使用方法在一个方面，本发明提供了用本文所述的肾细胞群和肾细胞混合物治疗有需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的方法。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用包括富集EPO生成细胞的第一肾细胞群的组合物。在另一个实施方案中，第一细胞群富集EPO 生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，组合物还可包括一种或多种附加的肾细胞群。在一个实施方案中，附加的细胞群是未富集EPO生成细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，附加的细胞群是未富集EPO生成细胞、肾小球细胞或血管细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，组合物还包括沉积于生物材料中、沉积在其上、包埋于其中、 用其包覆或截留于其中以形成本文所描述的可植入构建体的肾细胞群或肾细胞混合物，其用于治疗本文所述的疾病或病症。在一个实施方案中，将细胞群单独使用或与其它细胞或生物材料(例如水凝胶、多孔支架或天然或合成肽或蛋白质)联合使用，以刺激急性或慢性病情恢复。在另一个方面，通过本发明方法对受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的有效治疗可通过红细胞生成和/或肾功能各种指标进行观察。在一个实施方案中，红细胞稳态的指标包括但不限于血细胞比容(HCT)、血红蛋白(HB)、红细胞平均血红蛋白(MCH)、红细胞计数(RBC)、网织红细胞数量、网织红细胞百分比、平均红细胞容积(MCV)和红细胞分布宽度 (RDW)。在另一个实施方案中，肾功能指标包括但不限于血清白蛋白、白蛋白与球蛋白的比率(A/G比率)、血清磷、血清钠、肾大小(可通过超声测量)、血清钙、磷钙比率、血清钾、 尿蛋白、尿液肌酸酐、血清肌酸酐、血液尿素氮(BUN)、胆固醇水平、三酸甘油酯水平和肾小球滤过率(GFR)。此外，一般健康和健康的若干指标包括但不限于重量增量或重量损失、存活率、血压(平均全身血压、心脏舒张压或心脏收缩压)和体能耐力表现。在另一个实施方案中，有效治疗通过一个或多个肾功能指标的稳定来证实。通过对经本发明方法治疗的同一受试者的相同指标的变化(相对于未经本发明方法治疗的受试者的指标而言)进行观察来证实肾功能的稳定。可选地，可通过对经本发明方法治疗的同一受试者的相同指标的变化(相对于治疗前的受试者的指标而言)进行观察来证实肾功能的稳定。第一指标的变化可为值的增加或降低。在一个实施方案中，通过本发明提供的治疗可包括使受试者的血液尿素氮(BUN)水平稳定，其中在该受试者体内观察到的BUN水平与病情相同但未经本发明方法治疗的受试者相比时相对较低。在另一个实施方案中，治疗可包括使受试者的血清肌酸酐水平稳定，其中在该受试者体内观察到的血清肌酸酐水平与病情相同但未经本发明方法治疗的受试者相比时相对较低。在另一个实施方案中，治疗可包括使受试者的血细胞比容(HCT)水平稳定，其中在该受试者体内观察到的HCT水平与病情相同但未经本发明方法治疗的受试者相比时相对较高。在另一个实施方案中，治疗可包括使受试者的红细胞(RBC)水平稳定，其中在该受试者体内观察到的RBC水平与病情相同但未经本发明方法治疗的受试者相比时相对较高。本领域的普通技术人员将意识到，可测量本文所述或本领域中已知的一个或多个附加指标来确定对受试者肾病的有效治疗。在另一个方面，本发明涉及为有需要的受试者提供红细胞稳态的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤(a)对受试者施用肾细胞群，例如B2或B4或肾细胞混合物，如B2/B4和/或B2/B3，如本文所述；和(b)确定来自受试者的生物样本的红细胞生成指标水平与对照的指标水平不同，其中指标水平的差值(i)指示受试者响应施用步骤(a)，或 ( )指示受试者的红细胞稳态。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤(a)对受试者施用组合物，其包括本文所述的肾细胞群或肾细胞混合物；和(b)确定来自受试者的生物样本的红细胞生成指标水平与对照的指标水平不同，其中指标水平的差值(i)指示受试者响应施用步骤(s)，或(ii)指示受试者的红细胞稳态。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤(a)提供生物材料或生物相容性聚合物支架；(b)以本文所述的方式将本发明的肾细胞群或肾细胞混合物沉积在生物材料或支架上或沉积在其中，以形成可植入构建体；(C) 向受试者植入构建体；和(d)确定来自受试者的生物样本的红细胞生成指标水平与对照的指标水平不同，其中指标水平的差值(i)指示受试者响应施用步骤(a)，或(ii)指示受试者的红细胞稳态。在另一个方面，本发明涉及使有需要的受试者的肾功能稳定并使红细胞稳态恢复的方法，所述受试者患有肾功能缺陷和贫血和/或EPO缺乏。在一个实施方案中，该方法包括施用本文所述的肾细胞群或肾细胞混合物的步骤，所述肾细胞群或肾细胞混合物包含下列细胞类型中的至少一种源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质的细胞、源自集合管的细胞、源自间质组织的细胞或源自脉管系统的细胞。在另一个实施方案中，细胞群或混合物包含EPO生成细胞和肾小管上皮细胞，所述肾小管细胞通过下列标记物中的至少一种来鉴定巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶 (CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白_1 (Aqpl)、水通道蛋白_2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rabl7)、GATA结合蛋白3 (Gata3)、含FXYD 域的离子转运调节子4(i^Xyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员Bl (AldMbl)、醛脱氢酶1家族成员A3 (AldhlU)和钙蛋白酶_8 (CapnS)。在此实施方案中，相对于未经治疗或治疗前的受试者的指标水平而言，对受试者的治疗可通过至少一个肾功能指标的改善以及伴随的至少一个红细胞生成指标的改善来证实。在一个方面，本发明提供了通过施用本文所述的富集EPO生成细胞的肾细胞群或包含富集EPO生成细胞的细胞群的肾细胞混合物来(i)治疗肾病、贫血或EPO缺乏；(ii)稳定肾功能；(iii)恢复红细胞稳态或(iv)其中任何组合的方法，其中施用的有益效果优于施用未富集EPO生成细胞的细胞群的效果。在另一个实施方案中，富集细胞群使血清血液尿素氮(BUN)水平得以改善。在另一个实施方案中，富集细胞群使血清中蛋白质的保留得以改善。在另一个实施方案中，富集细胞群提供了血清胆固醇和/或三酸甘油酯水平。在
6另一个实施方案中，富集细胞群使维生素D水平得以改善。在一个实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使磷钙比率得以改善。在另一个实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使血红蛋白水平得以改善。在另一实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使血清肌酸酐水平得以改善。在另一个实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使血细胞比容水平得以改善。在另一实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使红细胞数量(RBC#)水平得以改善。在一个实施方案中，改善的血细胞比容恢复至正常健康水平的95%。在另一实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使网织红细胞数量得以改善。在其它实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使网织红细胞比例得以改善。在其它实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使红细胞容积分布宽度(RDW)水平得以改善。在另一个实施方案中，相对于非富集细胞群而言， 富集细胞群使血红蛋白水平得以改善。在另一个实施方案中，富集细胞群使骨髓中具有红细胞生成应答，使得骨髓细胞含量接近正常并且使得骨髓细胞与红细胞比率接近正常。在另一个方面，本发明提供了通过施用富集细胞群来⑴治疗肾病、贫血或EPO缺乏；(ii)稳定肾功能；(iii)恢复红细胞稳态或(iv)其任何组合的方法，其中相对于施用重组EPO(rEPO)所提供的有益效果而言，施用本文所述的肾细胞群或肾细胞群混合物的有益效果通过改善的红细胞稳态来表征。在一个实施方案中，相比施用重组EPO蛋白质而言， 细胞群或混合物在施用至有需要的受试者时使红细胞稳态得以改善(通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#确定)。在一个实施方案中，相比重组EPO而言，细胞群或混合物在施用时使血细胞比容、RBC或血红蛋白的水平得以改善，其不大于对照组中血细胞比容的约10% 左右。在另一实施方案中，单次剂量或单次递送的细胞群或混合物在施用时使经治疗的受试者的红细胞稳态在一段时间内得以改善(通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#的增加来确定)，其中改善时间显著超过单次剂量或单次递送的重组EPO蛋白质使红细胞稳态得以改善的时间。在另一个实施方案中，细胞群或混合物在以本文所述的剂量施用时未导致血细胞比容、血红蛋白或RBC#大于对比的健康对照组中正常水平的约110%。在另一实施方案中，相比以本文所述的剂量递送的重组EPO蛋白质而言，细胞群或混合物在以本文所述的剂量施用时提供了较好的红细胞稳态(通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#来确定)。在另一个实施方案中，以约 100IU/kg、约 200IU/kg、约 300IU/kg、约 400IU/kg 或约 500IU/kg 的剂量递送重组ΕΡ0。本领域的普通技术人员将意识到，本领域中已知的其它剂量的重组EPO 也是适用的。本发明的另一个实施方案涉及本文所述的至少一种细胞群或本文所述的可植入构建体在制备药物方面的用途，所述药物可用于治疗有需要的受试者的肾病、贫血或EPO 缺乏，为有需要的受试者提供红细胞稳态，或使有需要的受试者的肾功能得以改善。本发明的另一个实施方案涉及一种或多种特定富集细胞群(本文所述)治疗特定病源的肾病的用途，这基于根据已证实的特定治疗特性对一种或多种特定细胞亚群进行的选择。施用方法和途径本发明的细胞制剂可单独施用或可与其它生物活性组分组合施用。本文所述的肾细胞群或肾细胞群混合物的治疗有效量的范围可为从受试者可安全接受的最大细胞数量到治疗肾病(例如，使一种或多种肾功能稳定、降低其衰退率或使其改善)所必需的最小的细胞数量。在某些实施方案中，本发明的方法提供了以下列剂量对本文所述的肾细胞群或肾细胞群混合物进行施用约10，000个细胞/千克、约20，000个细胞/千克、约30，000个细胞/千克、约40，000个细胞/千克、约50，000个细胞/千克、 约100，000个细胞/千克、约200，000个细胞/千克、约300，000个细胞/千克、约400，000 个细胞/千克、约500，000个细胞/千克、约600，000个细胞/千克、约700，000个细胞/ 千克、约800，000个细胞/千克、约900，000个细胞/千克、约1. 1 X 106个细胞/千克、约
1.2父106个细胞/千克、约1. 3X 106个细胞/千克、约1.4X106个细胞/千克、约1. 5X106 个细胞/千克、约1.6X106个细胞/千克、约1.7X106个细胞/千克、约1.8X106个细胞/千克、约1.9X106个细胞/千克、约2. 1X106个细胞/千克、约2. 1X106个细胞/千克、约1. 2X106个细胞/千克、约2. 3X106个细胞/千克、约2. 4X106个细胞/千克、约
2.5X 106个细胞/千克、约2. 6X 106个细胞/千克、约2. 7 X 106个细胞/千克、约2. 8 X 106 个细胞/千克、约2. 9X106个细胞/千克、约3X106个细胞/千克、约3. 1X106个细胞 /千克、约3. 2X106个细胞/千克、约3. 3X106个细胞/千克、约3. 4X106个细胞/千克、约3. 5X106个细胞/千克、约3. 6X 106个细胞/千克、约3. 7X106个细胞/千克、约 3.8X106个细胞/千克、约3. 9X 106个细胞/千克、约4X 106个细胞/千克、约4. 1 X 106 个细胞/千克、约4. 2X106个细胞/千克、约4. 3X106个细胞/千克、约4. 4X106个细胞 /千克、约4. 5X106个细胞/千克、约4. 6X 106个细胞/千克、约4. 7X106个细胞/千克、 约4. 8X 106个细胞/千克、约4. 9X 106个细胞/千克或约5X 106个细胞/千克。在另一个实施方案中，对受试者施用的细胞剂量可为单剂量或单剂量加附加剂量。在其它实施方案中，剂量可经由本文所述的构建体提供。在其它实施方案中，对受试者施用的细胞剂量可根据估计的肾脏质量或功能性肾脏质量来计算。治疗有效量的本文所述的肾细胞群或其混合物可悬浮于药学上可接受的载体或赋形剂。此类载体包括但不限于基础培养基加血清白蛋白、盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、 胶原、藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、羧甲基纤维素以及它们的组合。 制剂应适合施用方式。因此，本发明提供了肾细胞群或其混合物(例如，单独的B2细胞群或其与B3和/或B4细胞群的混合物)在制备治疗受试者肾病的药物方面的用途。在一些实施方案中，药物还包含重组多肽，诸如生长因子、趋化因子或细胞因子。在其它实施方案中，药物包含源自人肾的细胞群。可采用提供给本文所述方法的任何变型形式来分离、衍生或富集用于制备所述药物的细胞。按照常规步骤将一种或多种肾细胞制剂或其混合物或组合物配制为适于对人类施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用、动脉内施用或肾包膜内施用的组合物例如为在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包括局部麻醉剂以缓解注射部位的任何疼痛。一般而言，将成分单独或混合在一起以单位剂型提供，例如提供为密闭容器(如指示活性剂量的安瓿瓶)中的冷藏保存浓缩物。当组合物通过输注施用时，其可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶进行分配。当组合物通过注射施用时，可提供一安瓿无菌注射用水或盐水，以使得所述成分可在施用前混合。药学上可接受的载体部分由要施用的具体组合物以及用于施用组合物的具体方法决定。因此，存在多种合适的药物组合物制剂(参见例如Alfonso R Germaro(编著),Remington :The Science and Practice of Pharmacy,以前为 Remington ' sPharmaceutical Sciences,第 20 版，Lippincott, Williams & Wilkins, 2003,其全文以弓| 用方式并入本文)。一般将药物组合物配制为无菌的、基本上等渗的，且与美国食品与药物管理局的所有药品生产质量管理规范(GMP)的规定完全相符。本发明的一个方面还提供了一种药物制剂，其包含本发明的肾细胞制剂，，例如单独的B2细胞制剂或其与B3和/或B4细胞制剂的组合，以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，该制剂包含104至109个哺乳动物肾源细胞。在一个方面，本发明提供了对有需要的受试者提供本文所述的一种或多种细胞群，包括混合物。在一个实施方案中，一种或多种细胞群的来源可为自体的或同种异体的、 同系的(自体的或同基因的)及其任何组合。在来源并非自体来源的情况下，所述方法可包括施用免疫抑制剂。合适的免疫抑制药物包括但不限于硫唑嘌呤、环磷酰胺、咪唑立宾 (mizoribine)、环孢素、他克莫司(tacrolimus)水合物、苯丁酸氮芥、氯苯扎利二钠、金诺芬(auranofin)、前歹[|地尔(alprostadil)、盐酸月瓜立莫司(gusperimus hydrochloride) > biosynsorb、莫罗莫那(muromonab)、阿法赛特(alefac印t)、喷司他丁、达利珠单抗 (daclizumab)、西罗莫司(sirolimus)、霉酚酸酯、来氟米特(Ieflonomide)、巴利昔单抗 (basiliximab)、链道酶 α、bindarid、克拉屈滨(cladribine)、口比美莫司(pimecrolimus)、 伊洛白介素(ilodecakin)、西利珠单抗(cedelizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、依维莫司(everolimus)、阿尼莫司(anisperimus)、力口维莫单抗(gavilimomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、氯法拉滨(clofarabine)、雷帕霉素(rapamycin)、希普利珠单抗 (siplizumab)、saireito、LDP-03、CD4、SR-43551、SK&F-106615、IDEC-114, IDEC-131、 FTY-720、TSK-204、LF-080299、A-86281、A-802715、GVH-313、HMR-1279、ZD-7349、 IPL-423323、CBP-1011、MT-1345、CNI-1493、CBP-2011、J-695、UP-920、L-732531、ABX-RB2、 AP-1903、IDPS、BMS-205820、BMS-224818、CTLA4_lg、ER-49890、ER-38925、ISAtx-247、 RDP-58、PNU-156804、LJP-1082、TMC-95A、TV-4710、PTR-262-MG 和 AGI-1096 (参见美国专利No. 7，563，822)。本领域的普通技术人员将意识到其它合适的免疫抑制药物。本发明的治疗方法涉及向个体递送分离的肾细胞群或其混合物。在一个实施方案中，优选将细胞直接递送至目标受益部位。在一个实施方案中，本发明的细胞制剂或其混合物经由递送载体递送至个体。依据本说明书，对患者施用细胞的多种方法对本领域的技术人员是显而易见的。 此类方法包括将细胞注射到受试者的靶部位内。可将细胞插入递送装置或载体中，该递送装置或载体有利于通过向受试者体内注射或植入来导入。在某些实施方案中，递送载体可包括天然材料。在某些其它实施方案中，递送载体可包括合成材料。在一个实施方案中，递送载体提供一定的结构来模拟或适当地符合器官结构。在其它实施方案中，递送载体具有类似流体的性质。此类递送装置可包括用于将细胞或流体注射到受体受试者体内的管，例如导管。在一个优选的实施方案中，所述管另外具有针头，例如注射器，通过其可将本发明的细胞导入到患者的预期位置。在一些实施方案中，配制哺乳动物肾源细胞群用于经由导管施用到血管中(其中术语“导管”意在包括多种用于将物质递送至血管的管样系统中的任一种)。作为另外的选择，可将细胞插入生物材料或支架中或插在其上，所述生物材料或支架包括但不限于纺织物，如梭织、针织、编织、筛，和非纺织物、有孔膜、海绵和泡沫，以及珠，例如实体或多孔珠、微粒、纳米颗粒等。可将细胞制备为以多种不同形式递送。例如，细胞可悬浮在溶液或凝胶中。可将细胞与药学上可接受的载体或稀释剂混合，其中本发明的细胞在所述载体或稀释剂中保持存活。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的用途是本领域中所熟知的。溶液优选是无菌的且为液体，并且通常是等渗的。优选地，溶液在生产和储存条件下是稳定的，并通过使用例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、乙基汞硫代水杨酸钠等防腐，以对抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用。本领域的技术人员将意识到，用于递送本发明的细胞群及其混合物的递送载体可包括上述特性的组合。一种或多种分离的肾细胞群(例如，单独的B2细胞群或其与B4和/或B3的混合物)的施用方式包括但不限于全身性、肾脏内(例如实质)、静脉内或动脉内注射和直接注射到组织中的预期作用部位。可根据本发明使用的另外的施用方式包括通过直接剖腹手术、直接腹腔镜检查、经腹或经皮进行的一次或多次注射。可根据本发明使用的另外的施用方式包括例如逆行输注和输尿管肾盂输注。施用的外壳手术方法包括一步手术，例如但不限于部分肾切除术和构建体移植、部分肾切除术、部分肾盂切除术、带网膜士腹膜的血管化、多灶性活检针迹、圆锥或锥体、至圆柱体和肾极状替换，以及两步手术，包括例如用于移植的类器官内部生物反应器。在一个实施方案中，将细胞混合物在同一时间经由相同途径进行递送。在另一个实施方案中，通过本文所述的一种或多种方法，将包含控释混合物的每种细胞组合物分别递送至特定位置，或经由特定方法将其同时或以时序可控的方式进行递送。人的适宜细胞植入剂量可由涉及细胞活性(例如EPO生成)的现有信息来确定， 或根据临床前研究所进行的剂量研究来推测。由体外培养和体内动物实验可对细胞量进行定量，并用该量计算植入材料的适宜剂量。此外，可监测患者以确定是否可进行额外的植入，或相应减少植入材料。可向本发明的细胞群及其混合物中添加一种或多种其它组分，包括选定的细胞外基质组分，诸如本领域中已知的一种或多种类型的胶原或透明质酸和/或生长因子、富含小板块的血浆和药物。本说明书所引用的所有专利、专利申请和参考文献的全文均在此以引用的方式并入。以下提供的实施例仅为示例性目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。 实施例实施例1-来自患肾衰竭成年猪的生物应答肾细胞的分离和特征患有伴随贫血的特发进行性慢性肾病(CKD)的成年公猪(野猪)提供了新鲜的患病肾组织，以通过与年龄相一致的正常猪肾组织的直接比较来评价细胞组成和特征。收集时的肾组织的组织学检查证实，由重度弥漫性慢性间质纤维化和伴随多灶性纤维化的新月体性肾小球肾炎表征的肾病。临床化学证实了氮血症(血液尿素氮和血清肌酸酐升高)和轻度贫血(血细胞比容轻度降低且血红蛋白水平降低)。将细胞从患病和正常肾组织中分离、扩增并表征。图1示出突出患病肾组织相比正常肾组织的纤维化的Gomori Trichrome染色(箭头指示的蓝染色)。表达cubulin 巨蛋白并且能够转运受体介导的白蛋白的功能性肾小管细胞从患病和正常肾组织中增殖。促红细胞生成素(EPO)表达细胞存在于培养物中并经多次传代和冻-融循环保留。此外，分子分析证实来自患病和正常肾组织的EPO表达细胞通过EPO和低氧调节基因靶位(包括vEGF)的HIFl驱动诱导响应体外低氧条件。经由胶原酶+分散酶的酶消化从猪肾组织分离细胞，或通过进行简单的机械消化和外植体培养，在独立的实验中分离细胞。传代时，使两种源自外植体的包含印ο表达细胞的细胞培养物经受大气(21% )和变化的低氧(< 5% )的培养条件，以确定低氧下的暴露是否最终使EPO基因表达上调。正如通过啮齿动物培养物(见实施例3)可注意到，正常猪表现出EPO基因的氧依赖性表达和调节。意外的是，尽管CKD猪存在尿毒症/贫血状态(血细胞比容< 34，肌酸酐> 9. 0)，ΕΡ0表达细胞仍易于从组织中分离并增殖，并且EPO基因的表达仍保持低氧调节，如图2所示。如图3所示，增殖培养物中的细胞显示出自组织成小管样结构的能力。如所示图4，通过观察经培养的细胞对FITC缀合白蛋白的受体介导吸收来证实培养物(第3代)中存在功能性肾小管细胞。(由白色细箭头指示的)绿色圆点代表内吞的荧光素缀合白蛋白，其由肾小管细胞特异受体、巨蛋白和Cubilin介导，指示功能性肾小管细胞的蛋白质重吸收作用。(由白色粗箭头指示的)蓝染色为Hoescht染色的细胞核。合在一起，这些数据表明可从猪肾组织，甚至已严重受CKD损害的肾组织中分离并增殖功能性肾小管细胞和内分泌细胞。此外，这些发现支持了基于自体细胞的治疗产品在治疗CKD方面的进展。实施例2-从人肾分离牛物应答EPO细胞通过酶解从正常成人肾中分离EPO生成细胞(如上文实施例1所述)。如图5所示，分离程序导致相对EPO表达在分离后比在初始组织中更多。如图6所示，可在培养物中维持保留EPO基因表达的人EPO生成细胞。在经组织培养处理的平塑料板或用一些细胞外基质(诸如纤连蛋白或胶原)包覆的塑料板上培养/增殖人细胞，并且发现所有细胞均支持随时间的EPO表达。实施例3-来自啮齿动物肾的生物应答EPO表达细胞和肾小管细胞的培养本研究利用分离自Lewis大鼠(Lewis rat)的原代肾细胞对响应低氧和剪切力的 EPO表达和肾小管标记物表达进行了体外分析。使用适于小鼠的标准方法从Lewi s大鼠中分离原代肾细胞(Aboustwareb等， 2008. World J. Urol. Aug ；26 (4) :295-300)，并使其在低氧和高氧或静态和动态3D培养物
中增殖。通过将细胞在大气“常氧”培养条件(平衡至21% 02,5% C02的37°C培养箱) 下进行培养，然后将氧张力减至低氧培养(平衡至2% 02,5% C02的37°C培养箱)以活化 Epo的低氧依赖性基因转录，从而确定Epo生成细胞的氧依赖性。最终转回常氧条件会抑制在低氧条件下发生的基因转录。将原代肾细胞在常氧条件下于2维QD)板和3D(见下文 Cultisphere实施例)构建体上进行培养，以使细胞附着(通常48小时)。然后将附着的细胞移至低氧培养箱中，并将其培养48小时。48小时的低氧培养时间点结束后，将细胞移回至常氧培养。在初始常氧培养、然后低氧培养并且最终转回常氧培养下的每个规定时间点处，收集来自三个板上的样本的细胞。分析前，将收集的样本在液氮中急冻、储存在_80°C 下。通过从每个样本中分离总mRNA，再由总mRNA进行cDNA合成来进行基因表达分析，并且用实时定量pcr(qrtpcr)来确定相对基因表达。除了 3个板上的样本外，还通过qrtpcr分析了 2个技术性样本，从而在每种培养条件下于每个时间点处获得总共6个样本。Cultisnhere-S 明胶微载体珠采用标准方法从幼鼠分离原代肾细胞。将大约200，000个细胞置于培养物中， 该培养物中包含无菌Cultisphere-S (Sigma-Aldrich cat#M9043)大孔明胶微载体珠 (130-380 μ m)的200 μ 1 50% (ν/ν)的浆料，所述大孔明胶微载体珠位于低附着6孔板上。 静态(包含细胞的板在整个实验过程中不作任何移动)条件或动态(持续移动)条件下将细胞置于含2%或21%氧的室中。随研究的时间时程(7天)定期收集每种条件下的样本。 每天收集每种条件下的三个样本。将所有样本的基因表达均标准化为起始物料、来自初始分离的原代细胞的未分化细胞悬液。进行QRTPCR以分别检验肾小管细胞和内分泌细胞标记物、上皮钙黏着蛋白和EPO的表达。结果培养的内分泌细胞中的EPO表达经由动态培养而上调，这与静态和/或低氧培养相反。图7示出大气(21%)氧含量下的3D培养物中动态培养的(+)ΕΡ0表达的结果。 图8示出低氧含量下的3D培养物中动态培养的(+)ΕΡ0的表达。图9同样示出长期培养时动态培养的(+)肾小管基因的表达。相对于高氧和静态培养而言，低氧和动态3D培养分别显著增加了 EPO表达(ρ < 0. 05)。图10示出低氧培养物(相对常氧培养物)中的 EPO表达。图11示出图11示出体外动态3D培养物对EPO表达的刺激。EPO表达的增加往往伴随着其调节子、HIFl α和其它HIFl α靶基因(如VEGF)表达的增加。因此，清楚的是培养的新肾细胞中的EPO表达经由HIFl α、通过氧含量来调节。以上结果表明保持氧和对 EPO表达的机械转导调节的生物应答性原代啮齿动物肾细胞可分离并在体外增殖。实施例4-3D构建体和对比培养物为了确定包含细胞、支架和培养基的新组织/新器官结构的体内功能性(如治疗潜力)的最佳体外指征，设计了许多三维培养结构。新组织/新器官结构设计如下将原代肾细胞培养物(包含EPO生成细胞和肾小管细胞)接种到直径为5mm、高度为5mm的多孔圆柱形支架上。将细胞以500K至1，000，000个细胞/支架的密度接种，并在原型多孔灌流系统(MPS，BDTechnologies)上进行培养，该系统在整个实验过程中提供连续的单向流体流。 培养基由DMEM+10% FBS (培养基A)或DMEM+10% FBS与KSFM培养基的1 1混合物(培养基B)构成。这些实验中评估的支架包括采用标准方法制成的开孔聚乳酸(OPLA)和胶原 1支架(均得自BD)和聚乙醇酸基支架(PGA)。特征包括足以使流体流经细胞-支架复合物的孔径和结构；可为细胞-支架和细胞-细胞相互作用提供微环境的支架结构和组成；存在表达和/或生成和/或转运肾再生和/或稳态中所涉及的蛋白质和/或分子或具有表达和/或生成和/或转运肾再生和/ 或稳态中所涉及的蛋白质和/或分子的潜力的细胞。例如，在由开孔聚乳酸(OPLA)构成的优选3D支架中接种哺乳动物肾细胞，并使其在生物反应器装置中进行体外培养，该装置在整个支架中提供连续的培养基灌流。体外条件支架+细胞复合物通过下列表征存在存活的、代谢活性细胞；细胞-细胞以及细胞-材料的相互作用；包括但不限于巨蛋白、Y-谷氨酰转肽酶(GGT)、上皮钙黏着蛋白和神经钙黏着蛋白的肾小管标记物的表达；以及包括但不限于促红细胞生成素的肾内分泌标记物的表达。
MM 从所示2D和3D培养物中收集到条件培养基和总蛋白裂解物。进行ELISA 分析以定量细胞裂解物(图12中上图)和条件培养基(图12中下图)中的靶蛋白。经数天灌流或静态培养后，采用标准技术将接种的OPLA和1型胶原支架固定在 10%福尔马林缓冲液中并经石蜡包埋。进行苏木精和伊红(H&E)染色以检验细胞的存在和形态。灌流支架中的细胞含量高于静态支架中的细胞含量，相比1型胶原支架，整个OPLA 支架中的细胞分布更为显著(见图13)。图14示出(静态和灌流)培养七天后OPLA和1型胶原支架的扫描式电子显微镜 (SEM)照片的结果。相比静态培养物，灌流培养物显示出较大的细胞含量和细胞组织。通过添加裂解缓冲液^jiagen)使mRNA从支架或2D培养物中分离，并通过在裂解缓冲液中进行电均化(polytron)使其从3D支架中分离。通过用对目标靶基因特异的内含子跨越引物对纯化的mRNA进行RT-PCR分析显示，所检验的3/73D结构经5天培养后表现出靶基因(即ΕΡ0)的表达。相反，2D结构(图15中泳道8-10)在5天中没有可检测的靶基因mRNA。图15的泳道1表示3D结构，其在5天中的表达水平接近已知表达靶基因的显微解剖的新鲜组织 (泳道21)中所观察到的水平。图16示出CellTiter Blue (刃天青代谢)的结果，其用于评价支架中的代谢活性。支架结构C在灌流和静态条件下均得到了最佳的代谢反应，接着分别为支架B和支架 A。在所有支架结构中，就刃天青代谢而言，灌流培养优于静态培养。为检验原代肾细胞的灌流和静态3D培养物对葡萄糖和谷氨酰胺的消耗，收集条件培养基并在NOVaBioProfile 400对其进行分析。葡萄糖的消耗在灌流(相比静态)条件下显著加快。谷氨酰胺在所有3D条件下均消耗至一定的程度，其中在灌流(相比静态) 条件下消耗略多。在所有测试的支架结构中，谷氨酸盐(谷氨酰胺代谢的副产物)的生成在灌流(相比静态)条件下较多，乳酸盐(葡萄糖代谢的副产物)的生成同样如此(见图 17)。^MM 5- ^Mm^mmM^m^mm (#H式品 #1) ^^ 将主要由肾小管细胞构成但也包含集合管、肾小球、内分泌、血管和其它细胞类型的较小亚群的未分化的肾细胞混合物(UNFX)富集群按以下方式从全肾中分离细胞供体将二十只00)2周大的雄性Lewis大鼠处死并获取其肾脏。将新切离的肾置于含 5OmL 冷(4°C )HypothermasoKBiolife Solutions, Inc. Bothell, WA)的 5OmL 圆锥管中(每个管中10个肾)并保存在冰块上。第二天，用70%的乙醇冲洗装有肾的管， 然后置于生物学安全柜(BSC)中，以供处理。肾细胞分离方法用包含50 μ g/ml庆大霉素(Sigma，St. Louis, MO)的 IXPBS(Gibco,Grand Island,NY)冲洗肾，并用镊子和解剖刀手动移除结缔组织和肾盏。用无菌镊子和解剖刀将肾手动切碎成细胞/组织浆液。在平台摇晃式摇床上，将细胞/组织制剂在包含分散酶GU/mL) (#07193Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) +5mM CaC12+IV M月交原Bl (300U/mL) (fforthington, Newark, NJ)的Kreb缓冲液中在37°C下用酶消化30分钟。然后将所得细胞悬液通过带70 μ m孔的细胞过滤网(BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)过滤到包含50 50肾细胞生长培养基(1 1的高糖DMEM KSFM)的50mL无菌聚丙烯圆锥管中。然后将悬浮液在300 X g下离心5分钟，并再悬浮于IOml的50 50肾细胞生长培养基中。将IOmL细胞悬液分装在两个15mL的圆锥管中(每个管中5ml)。将5ml 30% w/v Optiprep (Sigma, St. Louis,MO)添加到每个管中并翻转6次。混合后，将1毫升IX PBS小心铺在各悬浮液的顶部。将管在SOOxg下连续离心15分钟(室温)。经IOmL无菌移液管移除细胞带(包含存活的新肾细胞原型#1)，用50 50肾细胞生长培养基(用低糖DMEM 制备)稀释5倍，并且在300xg下离心5分钟。离心后，小心移除上清液，并将细胞沉淀在 10ml50 50(低糖)肾细胞生长培养基中再悬浮并计数。对500K细胞进行抽样用于基因表达测试。存活细胞的总收率为230X106 (94%存活率)。将总共46. 8X106个细胞接种在50 50 (低糖)培养基中的00)plOO组织培养处理的聚苯乙烯板(BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)上(每块板1. 17X106个细胞)，然后放置在标准C02培养箱(21% 0 中。48小时后，用50 50 (低糖)培养基对培养物进行100%的培养基更换，并将其置于37°C的2% 02环境中。M小时后，将细胞在2% 02下收集以供移植。将每块板在无菌PBS中洗涤1次，然后添加5. OmL 0. 25%的温胰蛋白酶w/EDTA(Sigma)，并回放在37°C下并保持5_7分钟。将生长培养基(5. OmL)添加至每块板中，并移除细胞悬液，然后倒入50mL无菌聚丙烯圆锥管中。通过在300xg下离心5分钟使细胞沉淀，在无菌PBS中洗涤2次，再悬浮于冷)PBS中，然后经由血细胞计数器计数。在无菌冷PBS中制备10X106个细胞/IOOyL的等分试样。存活细胞的培养后总收率为91 X 106 (90%存活率)。扩增倍数(接种一收集)为3. 91倍。棚列6-細卞麗_、混劲勿細糊￥遍口1膽# (舰口口口 #2)细胞供体将十只(10)2周大的雄性Lewis大鼠处死并获取其肾脏。将新切离的肾置于含 50mL7令(4°C )Hypothermasol (Biolife Solutions, Inc. Bothell,WA)的 50mL 圆锥管中(每个管中10个肾)并保存在冰块上。第二天，将装有肾的管用70%的乙醇冲洗， 然后置于生物学安全柜(BSC)中以供处理。肾细胞分离方法将肾用包含50 μ g/ml庆大霉素(Sigma, St. Louis, MO)的IX PBS(Gibco,Grand Island,NY)冲洗，并用镊子和解剖刀手动移除结缔组织。用无菌镊子和解剖刀将肾手动切碎成细胞/组织浆液。在平台摇晃式摇床上，将细胞/组织制剂在包含分散酶GU/mL) (#07193Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) +5mM CaC12+IV M月交原Bl (300U/mL) (fforthington, Newark, NJ)的Kreb缓冲液中在37°C下用酶消化30分钟。然后将所得细胞悬液通过带70 μ m孔的细胞过滤网(BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)过滤到包含50 50肾细胞生长培养基(1 1的高糖DMEM KSFM)的50mL无菌聚丙烯圆锥管中。然后将细胞悬浮液在300xg 下离心5分钟，并再悬浮于IOml的50 50肾细胞生长培养基中。将IOmL细胞悬液分装在两个15mL的圆锥管中(每个管中5ml)。将5ml 30% w/v Optiprep (Sigma, St. Louis, M0)添加到每个管中并翻转6次。混合后，将1毫升IX PBS小心铺在各悬浮液的顶部。将管在SOOxg下连续离心15分钟(室温)。经IOmL无菌移液管移除细胞带(包含存活的新肾细胞原型#1)，用50 50肾细胞生长培养基(用低糖DMEM制备)稀释5倍，并且在300xg下离心5分钟。离心后，小心移除上清液，并将细胞沉淀在10ml50 50(低糖)肾细胞生长培养基中再悬浮并计数。存活细胞的总收率为 71 X 106 (97%存活率)。
将M个无菌封装的开孔聚乳酸.(OPLA )』支架(BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)用50 50 (低糖)培养基预润湿，并且在50 μ L 50 50 (低糖)培养基中，在支架上接种1\106个孤42新肾细胞原型#1。使支架在37°C /21% 02下适应2小时，然后转移至装有MPS(多孔灌流系统)的装置(BD Technologies,RTP NC)中，并在2% 02下连续流动的50 50 (低糖)培养基中保持5天。每隔两天更换(50%体积变化)培养基。 第五天，将支架从MPS中小心移除，在无菌PBS中冲洗，并将其在运送以备移植时于环境温度下保持大约2小时。棚列7-胞嫩_入騰聽贫血白狄鼠綱Φ要评价新肾细胞原型#1 (UNFX)的治疗潜力和安全性，应评价新肾细胞原型#1在肾切除手术啮齿动物中延缓或逆转肾衰竭和/或贫血的能力，其中新肾细胞原型#1包含异质性细胞混合物，其包括分离自大鼠肾脏的EPO生成间质成纤维细胞、近端和远端肾小管上皮细胞、肾小球细胞和内皮细胞，如上文所述。下表1中示出了研究设计。非限制性成功因素包括下列各项1)对HCT和/或RBC数量的显著积极效果2)血清BUN和/或肌酸酐的显著降低3)红细胞刺激的组织学证据4)肾再生的组织学证据5)生物体水平改善(体重增量、存活率)根据研究设计，从Charles River Laboratories (Wilmington，ΜΑ)获取二十四 (24)只成年雌Lewis大鼠(8-10周大)，并指定为下表1中所示的研究受体。通过每天的健康评估以及每周的血液学和血清学分析来监测每组个体的病情发作情况。所有受体动物在用新肾原型进行治疗前均已患有贫血/尿毒症。在研究开始前，要求肾切除大鼠在连续两周中的血清肌酸酐升高O倍于对照水平)。将肾切除大鼠分配到四组之一中(见下表 1)。第1组大鼠接受10，000, 000个新肾细胞原型#1 (供试品1)，该新肾细胞原型#1悬浮在无菌PBS中并经由直接注射到肾的皮髓区域进行递送。通过使新肾构建体原型#1(接种有1 X 106个新肾原型#1细胞并培养4天的OPLA支架)附着到残肾远极上来对第2组大鼠进行治疗。通过使空OPLA支架附着到残肾远极上来对第3组大鼠进行治疗。第4组大鼠未接受治疗。将未处理的、年龄相一致的对照大鼠指定为第5组；将经受肾切除假手术但未做进一步处理的年龄相一致的对照大鼠指定为第6组。每周经由尾静脉从所有动物抽取血液(500 μ L)，以评价肾功能(肌酸酐和BUN)和红细胞生成(HCT、RBC和有核RBC(nRBC))。在研究过程中，每周进行健康观察并收集体重。 研究结束(84天)时，使存活的大鼠经受游泳耐力试验。在尸体剖检时采集股骨、肾、肝、脾、 心脏和肺，称重并通过福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)以用于组织学分析。将肾的一部分包埋到OCT培养基中，冷冻并经由冰冻切割处理。将FFPE组织进行处理并进行H&E染色。表1.研究设计
权利要求
1.一种人肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群，并且其中所述第二细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
2.根据权利要求1所述的混合物，其中B2还包括集合管上皮细胞。
3.根据权利要求1所述的混合物，其中所述B2细胞群的密度介于约1.045g/mL和约 1. 052g/mL 之间。
4.根据权利要求1所述的混合物，其中所述第二细胞群为B4细胞群。
5.根据权利要求3所述的混合物，其中所述B4细胞群的密度介于约1.063g/mL和约 1. 091g/mL 之间。
6.根据权利要求1所述的混合物，其中所述第二细胞群为B3细胞群。
7.根据权利要求4所述的混合物，其中所述B3细胞群的密度介于约1.052g/ml和约 1. 063g/ml 之间。
8.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物不包括密度小于 1.045g/mL的Bl 细胞群，所述Bl细胞群包括所述集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。
9.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物不包括密度大于 1.091g/mL的B5 细胞群，所述B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。
10.根据权利要求1所述的混合物，其中所述细胞混合物能够摄取受体介导的白蛋白。
11.根据权利要求1所述的混合物，其中所述细胞混合物能够表达氧可调促红细胞生成素(EPO)。
12.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物含有能够在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)的HAS-2表达细胞。
13.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物在体内递送后能够提供再生刺激。
14.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物在体内递送后能够减轻肾小球滤过、肾小管重吸收、尿液生成和/或内分泌功能的衰退，使这些功能稳定或改善。
15.根据权利要求1所述的混合物，其中所述第一和第二细胞群源自肾组织或培养的肾细胞。
16.根据权利要求1所述的混合物，其中B2通过选自下列各项的肾小管细胞标记物的表达来表征巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、 神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-l(Aqpl)、水通道蛋白_2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rabl7)、GATA结合蛋白3 (feita3)、含FXYD域的离子转运调节子4O^xycM)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3 家族成员Bl (AldMbl)、醛脱氢酶1家族成员A3 (AldhlU)和钙蛋白酶-8 (Capn8)。
17.一种分离的人肾细胞富集群，其包括B2细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群ο
18.根据权利要求1所述的B2细胞群，其中所述B2细胞群能够通过HAS-2(透明质酸合酶-2)的表达在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)。
19.根据权利要求17所述的B2细胞群，还包括集合管上皮细胞。
20.根据权利要求17所述的B2细胞群，其密度介于约1.045g/mL和约1. 052g/mL之间。
21.根据权利要求17所述的B2细胞群，其能够摄取受体介导的白蛋白。
22.根据权利要求17所述的B2细胞群，其在体内递送后能够提供再生刺激。
23.根据权利要求17所述的B2细胞群，其在体内递送后能够减轻肾小球滤过、肾小管重吸收、尿液生成和/或内分泌功能的衰退，使这些功能稳定或改善。
24.根据权利要求17所述的B2细胞群，其源自肾组织或培养的肾细胞。
25.根据权利要求17所述的B2细胞群，其通过选自下列各项的肾小管细胞标记物的表达来表征巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Aqpl)、水通道蛋白-2 (Aqp2)、 RAB17、RAS癌基因家族成员(Rabl7)、GATA结合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9 (钠/氢交换剂)成员4 (Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员 81仏1(&北1)、醛脱氢酶1家族成员六3仏1(1111￡1；3)和钙蛋白酶_8 (Capn8)。
26.根据权利要求17所述的B2细胞群，其不包括密度小于 1.045g/mL的Bl细胞群， 所述Bl细胞群包括所述集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。
27.根据权利要求17所述的B2细胞群，其不包括密度介于约1.052g/mL和约1. 063g/ mL之间的B3细胞群，所述B3细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
28.根据权利要求17所述的B2细胞群，其不包括密度介于约1.063g/mL和约1. 09Ig/ mL之间的B4细胞群，所述B4细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
29.根据权利要求17所述的B2细胞群，其不包括密度大于 1.091g/mL的B5细胞群， 所述B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。
30.一种制备人B2细胞群的方法，包括a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；知b)提取包含所述B2细胞群的第一细胞组分。
31.根据权利要求30所述的方法，其中相比所述非富集细胞群，所述B2细胞群包括较大比例的肾小管细胞以及较小比例的EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
32.根据权利要求30所述的方法，还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，所述步骤包括将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中所述第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1. 045g/mL和约1. 052g/mL之间的梯度中。
33.一种制备人B4细胞群的方法，包括a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；知b)提取包含所述B4细胞群的第一细胞组分。
34.根据权利要求33所述的方法，其中相比非富集细胞群，所述B4细胞群包括较大比例的EPO生成细胞、血管细胞和肾小球细胞以及较小比例的非EPO生成细胞、非血管细胞和非肾小球细胞。
35.根据权利要求33所述的方法，还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，所述步骤包括将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中所述第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1. 063g/mL和约1. 091g/mL之间的梯度中。
36.一种产生B2细胞群的方法，包括a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；b)将所述细胞悬液施加到流式细胞仪中，所述流式细胞仪能够同时测量所述细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从所述细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自所述细胞群的细胞亚群；和e)将所述B2细胞亚群与所述细胞群分离，其中相对于所述细胞群的大部分而言，所述B2细胞亚群通过高前向散射和高侧向散射来表征。
37.一种产生B4细胞群的方法，包括a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；b)将所述细胞悬液施加到流式细胞仪中，所述流式细胞仪能够同时测量所述细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从所述细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自所述细胞群的细胞亚群；和e)将所述B4细胞亚群与所述细胞群分离，其中相对于所述细胞群的大部分而言，所述B4细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述前向散射对应于细胞尺寸。
39.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述侧向散射对应于细胞颗粒度。
40.一种用于向有需要的受试者提供改善的肾功能的可植入构建体，包括a)生物材料，其包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和b)哺乳动物肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，所述混合物用所述生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合。
41.根据权利要求40所述的可植入构建体，其中所述第二细胞群为B4。
42.根据权利要求40所述的可植入构建体，其中所述第二细胞群为B3。
43.根据权利要求40所述的构建体，其中所述混合物源自哺乳动物肾组织或培养的肾细胞。
44.根据权利要求40所述的构建体，其中所述生物材料被构建为适于截留和/或附着所述混合物的三维(3-D)多孔生物材料。
45.根据权利要求40所述的构建体，其中所述生物材料被构建为适于包埋、附着、悬浮或包覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶。
46.根据权利要求40所述的构建体，其中所述生物材料由呈水凝胶形式的主要为高分子量类型的透明质酸(HA)构成。
47.根据权利要求40所述的构建体，其中所述生物材料由呈多孔泡沫形式的主要为高分子量类型的透明质酸构成。
48.根据权利要求40所述的构建体，其中所述生物材料由具有介于约50微米至约300 微米之间的孔的聚乳酸基泡沫构成。
49.根据权利要求40所述的构建体，其中所述细胞群源自自体肾样本。
50.根据权利要求49所述的构建体，其中所述样本为肾活组织检查样本。
51.根据权利要求40所述的构建体，其中所述细胞群源自非自体肾样本。
52.根据权利要求40所述的构建体，其中所述改善的肾功能为红细胞稳态。
53.一种治疗有需要的受试者的肾病的方法，包括a)对所述受试者施用包含哺乳动物肾细胞混合物的组合物，所述哺乳动物肾细胞混合物包括第一细胞群、B2和第二细胞群；以及b)确定来所述自受试者的试样的肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中所述指标水平的差值指示所述受试者的一种或多种肾功能衰退的减轻、稳定或改善。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述第二细胞群为B4。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述第二细胞群为B3。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述肾病伴随有促红细胞生成素(EPO)缺乏。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述EPO缺乏为贫血。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述EPO缺乏或贫血继发于所述受试者的肾衰竭。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述EPO缺乏或贫血继发于选自下列的疾病 慢性肾衰竭、原发性EPO缺乏、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统衰竭。
60.根据权利要求34所述的方法，其中所述组合物还包括包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽的生物材料，其中所述混合物用所述生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结I=I ο
61.根据权利要求34所述的方法，其中所述混合物源自哺乳动物肾组织或培养的哺乳动物肾细胞。
62.根据权利要求34所述的方法，其中所述混合物源自自体肾样本。
63.根据权利要求46所述的方法，其中所述样本为肾活组织检查样本。
64.根据权利要求53所述的方法，其中所述混合物源自非自体肾样本。
65.一种选定的肾细胞群，其在约至约5%的氧含量下暴露约12至约M小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为约1. 045g/mL至约1. 052g/mL的部分，其中所述细胞群(i)在离心后保留于密度介于1.045g/mL至约1. 052g/mL之间的梯度中；(ii) 包括肾小管细胞群，其通过至少一种肾小管细胞标记物的表达来表征；(iii)包括肾小管细胞亚群，其能够转运受体介导的白蛋白；(iv)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能。
66.一种选定的肾细胞群，其在约至约5%的氧含量下暴露约12至约M小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为约1. 063g/mL至约1. 091g/mL的部分，其中所述细胞群(i)在离心后保留于密度介于约1.063g/mL至约1. 091g/mL之间的梯度中； ( )包括氧可调促红细胞生成素(EPO)表达细胞、肾小球细胞和血管细胞；(iii)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能；和(iv)能够在联合施用时通过权利要求65所述的肾细胞群增强对一种或多种肾功能的调节。
全文摘要
本发明涉及分离的肾细胞，其包括肾小管细胞群和生成促红细胞生成素(EPO)的肾细胞群，及其分离和培养方法，以及用所述细胞群治疗有需要的受试者的方法。
文档编号C12N5/071GK102271692SQ200980153736
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月12日 优先权日2008年11月12日
发明者H.S.拉波波特, 埃里克.S.沃丁, 奥鲁瓦托英.A.奈特, 安德鲁.布鲁斯, 帕特里夏.D.塔特苏米, 拉塞尔.W.凯利, 曼纽尔.J.杰奥, 杰西卡.J.莱因施, 沙伦.普里斯内尔, 罗杰.M.伊拉甘, 苏玛纳.乔德赫里, 蒂莫西.A.伯特拉姆, 谢伊.M.华莱士 申请人:坦吉恩股份有限公司