专利名称：具有提高的5’-黄苷一磷酸生产力的棒状菌菌株和用其生产5’-黄苷一磷酸的方法
具有提高的5’-黄苷一磷酸生产力的棒状菌菌株和用其生产5’ -黄苷一磷酸的方法
技术领域：
本发明涉及重组载体，其具有
图1的切割图中显示的结构，携带SEQ ID NO. 7的基因；和用该重组载体转化的棒状菌(Corynebacteria)菌株，其具有较内源性苹果酸脱氢酶更高的活性。本发明还与使用该棒状菌菌株产生5’ -黄苷一磷酸的方法有关。
背景技术：
5’ -鸟苷一磷酸(在下文中被称作“GMP”)是广泛使用的作为增味剂的食品添加齐U，如同肌苷一磷酸(在下文中被称作“IMP”)。GMP引出鲜味(umami taste)，其用途取决于也正被使用的谷氨酸一钠(MSG)。它通常与IMP协同使用以增加MSG鲜味的强度。迄今已知的制备GMP的方法的实例包括(1)酵母RNA的酶促降解，(2)直接微生物发酵成GMP，C3)微生物发酵成鸟苷，然后化学磷酸化，(4)微生物发酵成鸟苷，然后酶促磷酸化，( 微生物发酵成黄苷5’ - 一磷酸(在下文中被称作“XMP”)，然后通过棒状菌菌株转化成GMPdP (6)微生物发酵成XMP，然后通过具有氨基酶活性的大肠杆菌(Escherichia coli)将XMP转化成GMP。其中，方法(1)具有材料供应的困难和在经济上不是有益的，方法 (2)由于GMP的膜通透性而遭受低产率的缺点。因此，其它方法在工业应用中广泛使用。对于生产XMP并将其转化成GMP的方法，关键是增加XMP生产力。例如，韩国专利申请号10-1991-018016公开了能以高产率产生XMP的XMP氨基酶无活性的菌株，其是腺嘌呤和鸟嘌呤半营养缺陷型，耐受鸟苷类似物并对溶菌酶非常敏感，溶菌酶是破坏细胞壁的酶。韩国专利申请号10-2001-000513公开了能在培养基中以高浓度直接积累XMP的产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)菌株和使用该菌株产生XMP的方法。菌株通过用UV光照射母体微生物、用诱变剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理和选择耐受正缬氨酸的突变体而制备，正缬氨酸是缬氨酸的类似物，影响XMP的生物合成。韩国专利申请号10-2008-006537描述了增加XMP产率的方法，其中XMP的生物合成中涉及的基因purN 和purH被修饰。另一方面，ATP生产力导致XMP产生，因为XMP的生物合成中涉及ATP。同样，苹果酸脱氢酶的活性对ATP的产生具有很大影响。然而，前述文件中任何地方都没有提及经设计提高苹果酸脱氢酶活性以增加XMP产率的微生物和方法。考虑到增加产生XMP菌株的ATP生产力是重要的，本发明人进行了集中研究并发现了引起该增加的基因。并且发现用串联携带该基因的两个拷贝的重组载体转化的棒状菌菌株能以高产率产生XMP。
发明内容技术问题因此本发明的目的是提供具有较内源性苹果酸脱氢酶更高活性的棒状菌菌株。本发明的另一个目的是提供具有如图1的切割图中显示的结构的重组载体，其携带SEQ ID NO. 7的基因。本发明另外的目的是提供用重组载体转化的棒状菌菌株。本发明还有另外的目的是提供通过培养转化的微生物和从培养物获得XMP而生产XMP的方法。技术方案根据其方面，本发明涉及比内源苹果酸脱氢酶活性增强的棒状菌菌株。优选地，将本发明的棒状菌菌株修饰以具有较内源活性更高的苹果酸脱氢酶活性，导致XMP生产力的增加。术语“苹果酸脱氢酶”，如本文所用，指通过脱氢催化苹果酸盐转化成草酰乙酸盐的酶。该酶伴随乳酸脱氢酶在非常广谱的活体生物中被发现，并且需要DPN和NAD作为其活性的辅因子，这些辅因子通常伴随乳酸脱氢酶。在根据本发明的棒状菌菌株中，将苹果酸脱氢酶活性增加，从而以较高产率产生XMP。如本文所用，术语“内源的活性”意欲指野生型微生物中的目标酶活性。术语“高于内源的活性”指与内源品种的活性相比增加的酶活性，不论起因于由酶自身引起的活性增加还是内源基因或外源基因引起的活性增加。例如，酶活性增加可通过本领域公知的任何方法实现，包括但不限于，增加或减少基因拷贝数、替换、修饰或突变目标启动子等。根据本发明所述的其活性将被增加的靶酶苹果酸脱氢酶由棒状菌的mqo基因编码。只要它与mqo基因在生物学上相同或相应，任何衍生物或类似物可在本发明中使用。 即，如果它的活性与mqo基因的活性基本上相同或相似，落入mqo基因范围内的任何基因在本发明中都是有用的。有利地，在本发明中有用的基因与mqo基因的序列共享至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，甚至远更优选至少95%和最优选至少98%同源性。 更有利地，苹果酸脱氢酶由核苷酸序列SEQ ID NO. :7编码。基因拷贝的增加能通过外源基因的导入和/或内源基因的扩增而达到。基因拷贝数目可容易地被本领域的技术人员根据需要和目的确定。内源基因的扩增也能利用本领域已知的方法进行，例如，通过在压力下在合适的选择性培养基中培养。在优选的实施例中，将携带为苹果酸脱氢酶编码的基因的载体导入棒状菌菌株以产生比内源活性增强的转化的微生物。只要其在本领域已知并属于棒状菌属，任何菌株可毫无限制地在本发明中使用。优选地，本发明中有用的棒状菌菌株的实例包括产氨棒杆菌、谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)禾口乳酸发酵短杆菌(Brevikicterium lactofermentum)，但不限于此。具体地，这些棒状菌菌株之中是产氨棒杆菌 ATCC6872、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539、 谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒状杆菌R、黄色短杆菌ATCC 14067、乳酸发酵短杆菌 ATCC 13869和其衍生物。优选的是从产氨棒杆菌KCCM-10530转化的产氨棒杆菌KCJ-1304。根据其另一个方面，本发明涉及具有如图1的切割图显示的结构的重组载体，其携带SEQ ID N0. 7的基因。SEQ ID N0. 7的基因具有来自棒状菌的mqo基因的野生型核苷酸序列。然而，显然携带mqo基因的衍生物或类似物的重组载体在本发明中也是有用的，只要如上面所描述的，该衍生物或类似物与mqo基因在生物学上相同或相应。如本文所用，术语“mqo基因”、 简称“苹果酸盐醌氧化还原酶”基因，指为用作将苹果酸盐氧化成草酰乙酸盐的苹果酸盐草酰乙酸盐编码的基因。在优选的实施方式中，本发明提供携带SEQ ID NO. 7的mqo基因的重组载体。 只要携带mqo基因，任何常见的重组载体均能没有限制地在本发明中被使用。优选的是 pDZ-mqo。在本发明的优选实施例中，利用含有SEQ ID NO. 7的mqo基因以构建重组的 pDZ-mqo载体(参见图1)。根据其另外的方面，本发明涉及用携带mqo基因的重组载体转化的棒状菌菌株。利用本领域已知的转化方法可没有限制地使用来自棒状菌的mqo基因。优选地， 将mqo基因克隆到载体中，以用于转化到细胞中。如果在本领域已知，任何方法可用于转化。如本文所用，术语“转化”是由外源 DNA的摄取、基因组参入和表达引起的细胞的基因改造。典型的转化方法包括CaCl2沉淀、 Hanahan法——其中与DMSO (二甲基亚砜)结合，CaCl2沉淀的作用得到提高、电穿孔、磷酸钙转染、原生质体融合、碳化硅纤维介导的转化、土壤杆菌(agrobacterium)介导的转化、 PEG介导的转化、葡聚糖硫酸酯、阳离子脂质体(lipofectamine)和干燥/抑制介导的转化 (desiccation/inhibition-mediated transformation)发明用 pDZ_mqo 白勺转化不限于这些转化的实例，而能没有限制地通过使用本领域的任何方法完成。术语“载体”，如本文所用，指用作载体以将外源遗传物质转移到合适宿主细胞中的DNA分子，是含有使转基因与宿主基因组重组的调节元件的DNA构建物。优选地，携带根据本发明的mqo载体的重组载体可具有图1的切割图显示的结构。图1的切割图表示的载体可被依次或同时导入棒状菌。根据本发明的优选实施方式，将重组载体转化到产氨棒杆菌KCCM-10530中，然后将该菌在选择性培养基中培养以使mqo基因的两个拷贝通过同源重组参入到宿主的基因组，导致产生产氨棒杆菌突变体，称为产氨棒杆菌KCJ-1304。其以登录号KCCM10972P保藏(韩国微生物保藏中心(韩国，首尔)，保藏日期2008年12月3日)。产氨棒杆菌KCJ-1304具有参入到KCCM-10530基因组的mqo基因的两个拷贝，是由向其中导入具有图1的切割图显示的结构的pDZ-mqo和mqo基因的两个拷贝与内源基因的同源重组而产生的。根据另外的方面，本发明涉及产生XMP的方法，包括培养转化的棒状菌菌株和从培养物中获得XMP。在本发明中，通过转化的微生物的直接发酵，以较高的产率生产XMP。优选地，转化的微生物是苹果酸脱氢酶活性比内源活性提高的棒状菌菌株。重组载体的mqo 基因优选地参入到转化的微生物的基因组中，该微生物因此能以高产率产生XMP。在优选的实施方式中，该微生物是产氨棒杆菌KCCM10972P。本领域已知的任何培养基可没有限制地用于培养能产生XMP的菌株。优选地，培养基含有葡萄糖作为碳源和任选地各种其它碳源。为了在培养目标微生物中使用，培养基必须满足微生物生长的需求。用于棒状菌菌株的培养基在本领域已知(例如Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D. C.，USA，1981)。对棒状菌菌株有用的碳源的实例包括糖和碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖、 乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素等；油和脂类诸如大豆油、葵花子油、蓖麻油、椰子油等； 脂肪酸诸如棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸等；醇类诸如甘油、乙醇等；和有机酸诸如乙酸。这些碳源可单独或组合使用。有机物诸如胨、酵母提取物、牛肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆等；尿素； 和无机化合物诸如氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵可单独或组合用作培养基中的氮源。磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、或相应的钠盐可用作磷源。此外，培养基可含有金属盐诸如硫酸镁、硫酸亚铁(iron sulfate)等。另外，可需要氨基酸和/或维生素作为必需成分。培养基还可含有合适的前体。可以分批方式或连续方式将这些物质加入到培养基中。可通过碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨等，或酸性化合物诸如磷酸或硫酸调节培养基的pH。消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯可用于防止培养期间泡沫的产生。可用氧气或含有氧气的气体(例如空气)对培养基充气以保持有氧状态，或用氮气、氢气或二氧化碳气体对培养基充气以保持无氧状态。培养温度通常保持在20°C 45°C，优选地在 30°C 35°C。持续培养直到获得XMP的最大量。从这一点上，需要10至160小时的时间段。由此产生的5XMP可被分泌到培养基中或保持在细胞内。根据本发明的产生XMP 的方法包括从细胞或培养基中回收XMP。对于从细胞或培养基中回收XMP，可利用本领域公知的任何方法。这样的方法的实例包括过滤、阳离子交换层析、结晶和HPLC，但不限于此。如本文所用，术语“5'-黄苷一磷酸”是核酸生物合成中的中间体，并在动物和植物中具有生理学重要性。因此，它被用于包括食品工业、制药工业和医学工业在内的多个领域。黄苷一磷酸是食品添加剂，其被用作基于核酸的增味剂以提供蘑菇的味道，特别是与 MSG协同。XMP是嘌呤代谢中的中间体，从IMP形成，形成GMP。当使用根据本发明的转化的微生物时，能以高产率产生XMP，该产率被发现与常规的微生物相比提高了约6%。发明的有益效果由于提高的苹果酸脱氢酶活性，本发明的转化的棒状菌菌株以较常规的微生物更高的产率产生XMP。附图简述图1是显示重组载体pDZ-mqo的结构的示意图，其中mqo基因的两个拷贝被插入到pDZ载体中。发明的方式通过以下实施例可获得对本发明的更好的理解，这些实施例被提出以进行举例说明，但不是被解释为限制本发明。实施例1 来自XMP的生产菌株产氨棒杆菌KCCM-10530的mqo的克隆和用于基因组参入的重组载体(pDZ-mqo)的构建mqo基因(NCBI ID_3345228)的核苷酸序列从来自NIH GenBank的数据获得。基于该序列，合成两对引物(SEQ ID N0S. 1至4)。当棒状菌KCCM-10530的基因组充当模板时，在存在高保真性DNA聚合酶 PfuUltra (Stratagene)的情况下使用SEQ ID N0S. 1至4的引物进行PCR，在95°C变性 30sec、在55°C退火30sec和在68°C延伸2min，进行25个循环。由此获得的PCR产物是mqo 基因的两个拷贝，每个2. Ikb长(mq0-A、mq0-B)，它们分别使用SEQ ID NOS :1和2以及SEQ ID NOS 3和4两组得到扩增。SEQ ID NO 1 ；gctctagaATCGGTCATTCCATGAACCCSEQ ID NO 2 ；cgcggatccCATCGATATCGCCAACTCCASEQ ID NO 3 ；cgcggatccATCGGTCATTCCATGAACCCSEQ ID NO 4 ；gctctagaCATCGATATCGCCAACTCCA
用合适的限制酶(mqo-A :XbaI+BamHI，mqo_B :BamHI+XbaI)处理之后，通过三重连接(three-piece junction)将PCR产物mqo-Α和mqo-Β插入到先前已被XbaI和虾碱性磷酸酶处理的PDZ载体中(参见韩国专利申请号10-2007-9443 。最后，获得重组pDZ-mqo 载体，其中mqo基因的两个拷贝被串联克隆。图1是显示用于参入到棒状菌基因组中的重组pDZ-mqo载体的结构示意图。实施例2 插入mqo的菌株的产生将pDZ-mqo载体构建物转化到KCCM-10530菌株中，并与该基因组进行同源重组以在基因组上与mqo基因相邻的位置插入一个mqo基因拷贝。因此，获得新的XMP产生菌株， 称为产氨棒杆菌KCJ-1304，该菌株在其基因组上具有mqo基因的两个拷贝。mqo基因的两个拷贝的串联插入是通过利用使用引物组(SEQ ID N0S. 5和6)的PCR鉴定的，该引物组靶向mqo基因的两个拷贝的上游和下游核苷酸序列。SEQ ID N0. 5 CTTTTCGATGACGCCCAASEQ ID N0. 6 CCACTTTATCGGGTGAGACCA实施例3 :mqo插入的菌株的苹果酸脱氢酶活性如下测定实施例2中制备的产生XMP的产氨棒杆菌KCJ-1304的苹果酸脱氢酶活性。将菌株接种到含有10g/l细菌用蛋白胨、5g/l细菌用牛肉膏、5g/l细菌用酵母抽提物、 2. 5g/l NaCl、50mg/l腺嘌呤和50mg/l鸟嘌呤的培养基中，并在30°C培养12小时直到获得 OD 10。回收IOmL细胞培养物，将其在含有50mM HEPES、IOmM乙酸钾、IOmM CaCl2和IOmM MgCl2中洗涤两次，并悬浮在ImL同样的缓冲液中。使用声波仪打断之后，将细胞裂解物离心。将上清液再次离心以产生沉淀物，然后将该沉淀物悬浮在IOOyL缓冲液中。将IOyL 该悬浮液用作酶溶液。反应缓冲液通过混合50mM HEPESUOmM乙酸钾和50 μ M 2，6-二氯靛酚(dichloro indolphenol) (ClJnd)制备。反应之前将Cl2Ind解冻和混合。向980 μ L 反应混合物中加入IOyL IOOmM苹果酸盐作为底物和10 μ L酶溶液，之后在30°C摇动温育15min。酶活性通过测量减少的Cl2Ind的浓度而测定。Cl2Ind在600nm具有吸收系数 22cm_1mM_10表1
权利要求
1.一种棒状菌(Corynebacteria)菌株，其具有用于产生5'-黄苷一磷酸的较野生型更高的苹果酸脱氢酶活性。
2.根据权利要求1的棒状菌菌株，其中所述苹果酸脱氢酶活性因mqo表达增加而提高。
3.—种重组载体，其具有图1的切割图显示的结构。
4.一种棒状菌菌株，其用权利要求3所述的重组载体转化。
5.根据权利要求4的棒状菌菌株，其显示增强的苹果酸脱氢酶活性。
6.根据权利要求4的棒状菌菌株，所述菌株是5'-黄苷一磷酸生产力增强的产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)菌株。
7.根据权利要求6的棒状菌菌株，所述菌株是产氨棒杆菌KCCM10972P。
8.产生5'-黄苷一磷酸的方法，其包括培养权利要求4所述的棒状菌菌株；和从所述培养物获得5'-黄苷一磷酸。
全文摘要
公开新的微生物，其具有较野生型更高的苹果酸脱氢酶活性。还公开具有图1的切割图显示的结构的重组载体、以此转化的棒状菌(Corynebacteria)菌株和通过培养该转化的菌株生产5′-黄苷一磷酸的方法。
文档编号C12P19/02GK102317433SQ200980154009
公开日2012年1月11日 申请日期2009年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者吴润锡, 朴长熙, 李智惠, 李珍南, 赵镇满, 金蕙园 申请人:Cj第一制糖株式会社