专利名称：积累疫苗的转化的大豆植物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及在其种子中积累阿尔茨海默病疫苗的转化的大豆植物及其用途。
背景技术：
阿尔茨海默病是由于病原物质例如β-淀粉状蛋白在脑中的积累而引起的神经变性疾病，其引起对神经细胞的损害。虽然预料到随着老龄化社会的到来，患阿尔茨海默病的患者数将会增加，但是难以获得针对该疾病的预防药和治疗药，需要开发新的预防药、 治疗药、疫苗等等。已经使用淀粉状蛋白作为抗原开发了针对阿尔茨海默病的疫苗，
淀粉状蛋白是该疾病的病原物质，但疫苗的开发是艰难的，因为存在例如副作用的问题。因此，需要使用不引起副作用的淀粉状蛋白抗原决定簇(表位)来开发疫苗并建立大量生产该疫苗的技术。大豆是无胚乳的种子，其不具有胚乳并且其营养物质在对应于子叶的胚中积累。 种子的整个体积的大约40% (对应于胚)被贮藏蛋白占据。因此，作为贮藏组织，大豆具有不同于其它作物例如水稻和玉米的特征，水稻和玉米将淀粉作为主要的储存物质贮藏在胚乳中，所以大豆是适合于产生和积累异源蛋白的作物。大豆中主要的种子贮藏蛋白是lis 球蛋白(大豆球蛋白)和7S球蛋白(β-伴大豆球蛋白(conglycinin))。这些种子贮藏蛋白的空间结构和它们在细胞中的积累机制已经被阐明，并且已知编码它们的基因具有被称作可变区的部分。人们认为，即使将异源基因插入可变区中之后，也可以维持所述蛋白的空间结构，并且贮藏蛋白的特性不会被这种插入影响。一般而言，β -淀粉状蛋白抗原决定簇是包括数个氨基酸的分子量相对较低的蛋白(肽)，难以通过将编码该肽的基因导入大豆而使该肽在转化的大豆的种子中大量积累以实现大量生产该肽的目的，这是因为该肽被细胞中的酶例如蛋白酶降解。另一方面，已知有下列在其种子中积累生物活性肽和疫苗的转化的作物积累低血压肽的转化的大豆(专利文献1)、积累针对雪松花粉引起的过敏症的疫苗的转化的水稻 (专利文献幻、产生β-淀粉状蛋白的马铃薯(非专利文献1)和产生β-淀粉状蛋白的番茄(非专利文献2)。然而，大量积累包括β -淀粉状蛋白抗原决定簇(表位)的阿尔茨海默病疫苗的转化的大豆以及使用所述大豆大量生产疫苗的技术目前为止仍然是未知的。菜豆(common bean)是属于豆科(Leguminosae)的植物，大豆也属于该豆科，菜豆种子中的蛋白含量是20%。已知菜豆中的主要种子贮藏蛋白之一 arcelin可以被分为多种类型，S卩，arcelin 1至7，编码它们的结构蛋白的部分的核苷酸序列之间具有高度同源性。 相对于大豆而言，对菜豆中的arcelin蛋白的结构分析较少，仅揭示了 arcelin 1和5的空间结构。另外还已知，水稻中的主要种子贮藏蛋白之一谷醇溶蛋白(prolamin)是难消化的蛋白，其可以被分为具有不同分子量的数种类型(例如，IOKUI和16K)。尚未揭示谷醇溶蛋白的空间结构。
现有技术文献专利文献专利文献1 JP 2006-238821 A专利文献2 JP 2004-321079 A非专利文献1 federation of European Biochemical Societies (2005) % 579 卷，第 6737-6744 页·非专利文献2 =Biotechnology Letters (2008)第 30 卷，第 1839-1845 页.
发明内容
本发明旨在提供转化的大豆植物，可以在其种子中产生并积累阿尔茨海默病疫苗。另外，本发明旨在提供使用该转化的大豆产生阿尔茨海默病疫苗的方法。本发明人进行了深入研究以解决上述问题。结果，本发明人成功制备出其中导入了编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的转化的大豆植物，所述基因是通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而获得的，并且还成功地在所述转化的大豆植物的种子中产生并积累了阿尔茨海默病疫苗。另外，本发明人发现，通过将编码修饰的种子贮藏蛋白的基因导入缺失内源性种子贮藏蛋白的大豆而产生的转化的大豆植物能够有效地在其种子中产生并积累阿尔茨海默病疫苗。S卩，本发明提供了 [1]其中导入了编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的转化的大豆植物，其中通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而不发生移码，从而获得所述的编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，该修饰的种子贮藏蛋白在种子中表达并在其中积累。[2]根据[1]的转化的大豆植物，其中所述阿尔茨海默病疫苗是β -淀粉状蛋白抗原决定簇。[3]根据[2]的转化的大豆植物，其中所述β -淀粉状蛋白抗原决定簇具有如下序列含有彼此相连的1至3个拷贝的具有SEQ ID NO 3所示序列的肽。[4]根据[1]至[3]任一项的转化的大豆植物，其中缺失内源性大豆IlS球蛋白和 /或大豆7S球蛋白。[5]根据[1]至[4]任一项的转化的大豆植物，其中所述野生型种子贮藏蛋白是大豆IlS球蛋白的AlaBlb亚基、菜豆的arcelin或水稻的谷醇溶蛋白。[6]根据[5]的转化的大豆植物，其中所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQ ID N0 2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有不少于90%同一性的氨基酸序列，并且编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码选自对应于SEQ ID N0 2的氨基酸位置111-128、氨基酸位置198-216、氨基酸位置268-315和氨基酸位置490-495 的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列的区域。[7]根据[5]的转化的大豆植物，其中所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQ ID N037所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO :37所示的氨基酸序列具有不少于90%同一性的氨基酸序列，并且编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码对应于SEQ ID N0:37的氨基酸位置149-150和/或氨基酸位置250-251的氨基酸序列的区域。[8]根据[5]的转化的大豆植物，其中所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQ ID NO 45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO :45所示的氨基酸序列具有不少于90%同一性的氨基酸序列，并且编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码对应于SEQ ID N0:45的氨基酸位置110-111的氨基酸序列的区域。[9]根据[1]至[8]任一项的转化的大豆植物，其中编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的表达由菜豆arCelin2的启动子或大豆IlS球蛋白的AlaBlb亚基的启动子调节。[10]根据[1]至[9]任一项的转化的大豆植物的细胞。[11]根据[1]至[9]任一项的转化的大豆植物的种子。[12]通过加工根据[11]的种子而产生的加工的大豆种子。[13]使用根据[1]至[9]任一项的转化的大豆植物产生阿尔茨海默病疫苗的方法，其中在所述转化的大豆植物的种子中产生阿尔茨海默病疫苗。[14]载体，其包含诱导大豆种子特异性表达的启动子；和编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，其中通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而不发生移码，从而获得所述的编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，并且所述编码修饰的种子贮藏蛋白的基因连接于所述启动子的下游。[15]根据[14]的载体，其中所述启动子是菜豆arCelin2的启动子或大豆IlS球蛋白的AlaBlb亚基的启动子。由于本发明的转化的大豆植物能够在其种子中大量积累阿尔茨海默病疫苗，所以可以使用所述转化的大豆植物有效生产阿尔茨海默病疫苗。
图1是示意图，其显示了大豆的大豆球蛋白的AlaBlb亚基的氨基酸序列中的可变区编码的氨基酸序列。图2是示意图，其显示了质粒pUHGAlaBlbM的构建程序。图3是示意图，其显示了用于引入编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的质粒pUHG的结构。任意修饰的种子贮藏蛋白的基因被插入到SmaI位点。图4显示了照片，其显示了在导入了编码修饰的AlaBlMl的基因的转化的大豆的种子中积累的淀粉状蛋白抗原决定簇的检测，所述检测通过蛋白质印迹进行。各个泳道中的样品如下。1 通过将AlaBlMl导入品种Jack中而产生的转化的大豆10_2 No. 1 ；2 通过将AlaBlMl导入品种Jack中而产生的转化的大豆10_2 No. 2 ；3 通过将AlaBlMl导入品种Jack中而产生的转化的大豆10-2 No. 3 ；4 品种Jack (对照)；5 通过将AlaBlMl导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆16-2 No. 1 ；6 通过将AlaBlMl导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆16-2 No. 2 ；7 通过将AlaBlMl导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆16-2 No. 3 ；和8 贮藏蛋白缺陷型品系(对照)。图5显示了照片，其显示了在导入了编码修饰的arcelin的基因(Arc5Ml)的转化的大豆的种子中积累的β -淀粉状蛋白抗原决定簇的检测，所述检测通过蛋白质印迹进行。各个泳道中的样品如下。1:通过将Arc5Ml导入品种Jack中而产生的转化的大豆2-1 No. 1 ；2 通过将Arc5Ml导入品种Jack中而产生的转化的大豆2_1 No. 2 ；3 通过将Arc5Ml 导入品种Jack中而产生的转化的大豆2-2 No. 1 ；和4 通过将Arc5Ml导入品种Jack中而产生的转化的大豆2-2 No. 2。图6显示了照片，其显示了在导入了编码修饰的谷醇溶蛋白的基因(PRlOMl)的转化的大豆的种子中积累的β -淀粉状蛋白抗原决定簇的检测，所述检测通过蛋白质印迹进行。各个泳道中的样品如下。1:通过将I3RlOMl导入品种Jack中而产生的转化的大豆1-1 No. 1 ；2 通过将PRlOMl导入品种Jack中而产生的转化的大豆1_1 No. 2 ；3 通过将PRlOMl 导入品种Jack中而产生的转化的大豆4-2 No. 1 ；和4 通过将I3RlOMl导入品种Jack中而产生的转化的大豆4-2 No. 2。图7显示了照片，其显示了在导入了编码修饰的AlaBlMl或A2PAlaBlbM3的基因的转化的大豆的种子中积累的β -淀粉状蛋白抗原决定簇的检测，所述检测通过蛋白质印迹进行。各个泳道中的样品如下。1 通过将A2PAlaBlbM3导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆品系4-6 ；2 通过将AlaBlbMl导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆品系7-1 ；3 通过将AlaBlbMl导入品种Jack而产生的转化的大豆品系8_1 No. 1 ；4 通过将AlaBlbMl导入品种Jack而产生的转化的大豆品系8_1 No. 2 ；5 贮藏蛋白缺陷型品系； 6 通过将A2PAlaBlbM3导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆品系3-1 No. 1 ；和7 通过将A2PAlaBlbM3导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆品系3_1 No. 2。图8显示了图(照片)，其显示了转化的大豆々1动让10的种子中的六0 4-10(具有 SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的肽)的稳定性测验的结果。各个泳道中的样品如下。A-1、 A-2 未经热处理的组；Β-1、Β-2 经烘烤的组；C-l、C-2 经水煮的组；D_1、D_2 经热处理的提取物组。图9显示了图(照片)，其显示了 Αβ4_10的重复数目与抗体效价之间的关系的评价。各个泳道中的样品如下。1 反应组，其中使纯化的抗体匙孔血蓝蛋白 (key-limpet-hemocyanin, KLH) -Pl与底物A β 42 000皮摩尔)反应；2 反应组，其中使纯化的抗体KLH-Pl与底物A β 42 (1000皮摩尔)反应；3 反应组，其中使纯化的抗体KLH-P2 与底物A β 42 GOO皮摩尔)反应；4 反应组，其中使纯化的抗体KLH-P2与底物A β 42 (1000 皮摩尔)反应；5 反应组，其中使纯化的抗体KLH-P3与底物A β 42 GOO皮摩尔)反应；和 6 反应组，其中使纯化的抗体KLH-P3与底物A β 42 (1000皮摩尔)反应。
具体实施例方式现在将详细描述本发明。1.编码野生型种子贮藏蛋白的基因本发明中的野生型种子贮藏蛋白的实例包括构成大豆IlS球蛋白的各个亚基、构成大豆7S球蛋白的各个亚基、菜豆中的arcelin、水稻中的谷醇溶蛋白、水稻中的球蛋白， 以及其它作物中的种子贮藏蛋白。野生型种子贮藏蛋白的优选的实例包括大豆中的IlS 球蛋白的AlaBlb亚基和7S球蛋白的α亚基和β亚基，其中大豆中的IlS球蛋白的AlaBlb 亚基更为优选。
此外，本发明中的野生型种子贮藏蛋白的实例包括含有SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 37和SEQ ID NO :45所示的氨基酸序列的蛋白，以及含有与这些氨基酸序列具有不少于 80 %，优选不少于90 %，更优选不少于95 %的同一性的氨基酸序列的蛋白。此处，氨基酸序列之间的同一性(％ )意思是氨基酸序列之间的最大同一性 (%)，其是通过比对两个待比较的氨基酸序列并视需要向其中引入空隙(比对)而获得的。可以使用本领域技术人员熟知的多种方法进行用于确定氨基酸序列之间同一性的目的的比对。例如，可以使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN和 Megalign(DNASTAR)软件和商业上可获得的软件，例如Gene Works 2. 5. 1软件(Teijin System Technology, Inc.)禾口 GENETIX-WIN(Software Development Co. , Ltd)。本发明中的编码野生型种子贮藏蛋白的基因的实例包括编码构成大豆IlS球蛋白的各个亚基的基因、编码构成大豆7S球蛋白的各个亚基的基因、编码菜豆中的arcelin 的基因、编码水稻中的谷醇溶蛋白的基因、编码水稻中的球蛋白的基因，以及编码其它作物中的种子贮藏蛋白的基因。所述基因的优选的实例包括编码大豆中的IlS球蛋白的AlaBlb 亚基的基因和编码7S球蛋白的α亚基和β亚基的基因，其中编码大豆中的IlS球蛋白的 AlaBlb亚基的基因更为优选。此外，本发明中的编码野生型种子贮藏蛋白的基因的实例包括含有SEQ ID NO=U SEQ ID N0:36和SEQ ID NO :44所示的核苷酸序列的基因，以及含有与这些核苷酸序列具有不少于80%，优选不少于90%，更优选不少于95%的同一性的核苷酸序列的基因。此处，核苷酸序列之间的同一性(％ )意思是核苷酸序列之间的最大同一性 (%)，其是通过比对两个待比较的核苷酸序列并视需要向其中引入空隙(比对)而获得的。可以使用本领域技术人员熟知的多种方法进行用于确定核苷酸序列之间的同一性的目的的比对。例如，可以使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN和 Megalign(DNASTAR)软件和商业上可获得的软件，例如Gene Works 2. 5. 1软件(Teijin System Technology, Inc.)禾口 GENETIX-WIN(Software Development Co. ,Ltd)。2.编码修饰的种子贮藏蛋白的基因本发明中的编码修饰的种子贮藏蛋白的基因意思是通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而不发生移码所产生的基因。此处，“插入编码阿尔茨海默病疫苗的基因而不发生移码”意思是将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区，以致除了所述阿尔茨海默病疫苗的氨基酸序列之外，修饰的种子贮藏蛋白的氨基酸序列与对应的野生型种子贮藏蛋白的氨基酸序列是相同的。此外，“插入编码阿尔茨海默病疫苗的基因”意思是，插入编码阿尔茨海默病疫苗的基因而不引起编码可变区的核苷酸序列的缺失，以及编码可变区的全部或部分核苷酸序列被置换为编码阿尔茨海默病疫苗的基因。在本发明中，编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区意思是这样的区域即使向其中插入异源基因而不发生移码时，该区域也允许从所产生的基因表达而来的蛋白保持与野生型种子贮藏蛋白等同的稳定的空间结构，从而允许维持野生型种子贮藏蛋白的性质。例如，当编码野生型种子贮藏蛋白的基因是编码含有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的大豆IlS球蛋白的AlaBlb亚基的基因时，已知SEQ ID NO :2中有5个部分是可变区，包括编码氨基酸位置20-28的区域(可变区I)、编码氨基酸位置111-1 的区域(可变区 II)、编码氨基酸位置198-216的区域(可变区III)、编码氨基酸位置沈8_315的区域(可变区IV)和编码氨基酸位置490-495的区域(可变区V)(图1)。此外，当编码野生型种子贮藏蛋白的基因是含有编码与SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列具有一定的同一性的氨基酸序列的核苷酸序列的基因时，即，SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，只不过其中一个或多个氨基酸被置换、插入、添加和/或删除，可变区是编码对应于氨基酸位置20-28的氨基酸序列的区域、编码对应于氨基酸位置111-1 的氨基酸序列的区域、编码对应于氨基酸位置198-216的氨基酸序列的区域、编码对应于氨基酸位置 268-315的氨基酸序列的区域和编码对应于氨基酸位置490-495的氨基酸序列的区域。此处，当两个待比较的氨基酸序列彼此比对以达到氨基酸序列之间的最大同一性 (% )并视需要引入空隙时，“对应于特定氨基酸序列的氨基酸序列”意思是对应于其它特定的部分氨基酸序列的部分氨基酸序列。此类氨基酸序列可以由本领域技术人员容易地指定。当在编码野生型种子贮藏蛋白的基因中存在多个可变区时，可以通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至一个或多个可变区来制备编码修饰的种子贮藏蛋白的基因。例如，当编码包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的大豆IlS球蛋白的AlaBlb亚基的基因被用作编码野生型种子贮藏蛋白的基因时，可以选择可变区II、III、IV和V中的任一项作为可变区，以向其中插入编码阿尔茨海默病疫苗的基因，更优选将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至可变区III。此外，作为插入编码阿尔茨海默病疫苗的基因的可变区， 可以选择可变区II、III、IV和V中的两个或更多个区域，例如，同时插入至三个可变区II、 III和IV，同时插入至四个可变区II、III、IV和V，等类似操作可以进行。此处，编码阿尔茨海默病疫苗的基因的导入需要以在编码野生型种子贮藏蛋白的核苷酸序列中不引起移码的方式进行。此外，当编码包含SEQ ID NO :37所示的氨基酸序列的菜豆arcelin 5的基因被用作编码野生型种子贮藏蛋白的基因时，由于该基因的可变区是未知的，所以需要将其DNA 序列与AlaBlb亚基的DNA序列进行比较以确认混乱的区域，并且将其氨基酸序列及空间结构与其它相似的贮藏蛋白的氨基酸序列及空间结构进行比较以确认序列的空隙中的差异和结构差异，从而假设可变区。优选的是，将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至编码SEQ ID NO 37中的氨基酸位置149-150的区域(可变区A)和/或编码SEQ ID NO 37中的氨基酸位置250-251的区域(可变区B)，这些区域可以通过此类假设来指定。此外，当编码野生型种子贮藏蛋白的基因含有编码与SEQ ID NO :37所示的氨基酸序列具有一定的同一性的氨基酸的核苷酸序列时，即，SEQ ID NO :37所示的氨基酸序列，只不过其中一个或多个氨基酸被置换、插入、添加和/或删除，优选将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至编码对应于SEQ ID NO :37中的氨基酸位置149-150的氨基酸序列的区域，编码对应于SEQ ID NO 37中的氨基酸位置250-251的氨基酸序列的区域。此外，当编码包含SEQ ID NO :45所示的氨基酸序列的水稻谷醇溶蛋白的基因被用作编码野生型种子贮藏蛋白的基因时，由于该基因的空间结构和可变区是未知的，所以需要将其氨基酸序列与其它类似的贮藏蛋白的氨基酸序列进行比较以确认空隙结构，从而假设可变区。优选的是，将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至编码SEQ ID N0:45中的氨基酸位置110-111的区域(可变区a)，该区域可以通过此假设来指定。此外，当编码野生型种子贮藏蛋白的基因含有编码与SEQ ID NO :45所示的氨基酸序列具有一定的同一性的氨基酸的核苷酸序列时，即，SEQ ID NO :45所示的氨基酸序列，只不过其中一个或多个氨基酸被置换、插入、添加和/或删除，优选将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至编码对应于SEQ ID NO 45中的氨基酸位置110-111的氨基酸序列的区域。3.编码阿尔茨海默病疫苗的基因本发明中的编码阿尔茨海默病疫苗的基因是不受限的，只要其是编码具有针对阿尔茨海默病的疫苗的功能的蛋白或肽的DNA，并且优选为编码构成β -淀粉状蛋白的一部分的、包括大约5至25个氨基酸的肽的β -淀粉状蛋白抗原决定簇的DNA。所述DNA的实例包括编码SEQ ID NO 3的氨基酸序列的DNA。由于编码β -淀粉状蛋白的核苷酸序列是已知的(GenBank登记号ΑΒ113349)，所以，可以通过基于该核苷酸序列信息的筛选操作，从cDNA文库中分离编码β -淀粉状蛋白或淀粉状蛋白抗原决定簇的DNA。也可以通过化学合成来制备编码淀粉状蛋白抗原决定簇的DNA。此外，在本发明中，也可以将阿尔茨海默病疫苗以多个编码疫苗的基因彼此串联的方式插入至编码种子贮藏蛋白的基因的可变区，从而允许表达所述疫苗。例如，可以将编码β-淀粉状蛋白抗原决定簇的基因，以1至20的整数个、优选1至5的整数个、更优选1 至3的整数个、特别优选为2个拷贝的基因彼此连接的方式插入至可变区但不发生移码。此外，当把编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至编码野生型种子贮藏蛋白的基因时，也可以在编码阿尔茨海默病疫苗的基因的5’-末端和/或3’-末端添加编码被蛋白酶识别的序列的核苷酸序列。由此，可以通过蛋白酶将阿尔茨海默病疫苗从种子中产生的修饰的种子贮藏蛋白中切除。此类蛋白酶的实例包括嗜热菌蛋白酶。4.用于基因转移的载体本发明的用于基因转移的载体可以具有这样的结构其中诱导大豆种子特异性表达的启动子连接于所述基因的上游。此外，终止子也可以连接于所所述基因的下游。诱导大豆种子特异性表达的启动子的实例包括大豆IlS球蛋白启动子和菜豆 arcelin启动子，终止子的实例包括大豆IlS球蛋白终止子、菜豆arCelin2终止子、花椰菜花叶病毒的35S终止子和NOS终止子。大豆IlS球蛋白启动子的实例包括具有SEQ ID NO 18所示序列的大豆IlS球蛋白AlaBlb亚基的启动子，并且大豆IlS球蛋白启动子可以是与该序列具有不少于95%的同一性的启动子，只要其具有种子特异性启动子活性。大豆IlS球蛋白终止子的实例包括具有SEQ ID NO :21所示序列的大豆IlS球蛋白AlaBlb亚基的终止子，并且大豆IlS球蛋白终止子可以是与该序列具有不少于95%的同一性的终止子，只要其具有种子特异性终止子活性。菜豆arcelin启动子的实例包括具有SEQ ID NO :56中核苷酸位置1399-3860的序列的菜豆arcelin 2的启动子，并且菜豆arcelin启动子可以是与该序列具有不少于95% 的同一性的启动子，只要其具有种子特异性启动子活性。菜豆arcelin终止子的实例包括具有SEQ ID NO :59所示序列的菜豆arcelin 2终止子，并且菜豆arcelin终止子可以是与
9该序列具有不少于95%的同一性的终止子，只要其具有种子特异性终止子活性。
可以向本发明的载体中插入用于选择重组体的选择性标志物基因和用于确认所导入的基因之表达的报道基因。选择性标志物基因的实例包括潮霉素抗性基因、膦丝菌素抗性基因等，报道基因的实例包括β-葡糖醛酸酶(GUQ基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、萤光素酶(LUC)基因和GFP基因等。 还可以通过将DNA片段插入至包含上述选择性标志物基因和/或报道基因的载体中来获得本发明的载体，其中所述DNA片段包含用于诱导种子特异性表达的启动子、连接于该启动子下游的编码修饰的贮藏蛋白的基因和连接于更下游的终止子。5.能够被转化的大豆植物本发明中的能够被转化的大豆的实例包括一般用于食物、用于饲料或用于生产油的品种。待转化的大豆优选为部分或全部缺失内源性种子贮藏蛋白，大豆的实例包括部分或全部缺失大豆lis球蛋白和/或大豆7S球蛋白的大豆。此处，“部分缺失”意思是指其中的表达水平低于野生型的情况，以及仅有一部分亚基完全缺失的情况，和仅一部分的亚基的表达水平低于野生型的情况。大豆的具体实例包括突变系EnBl，其缺失大豆IlS球蛋白；突变系QY2，其缺失大豆7S球蛋白；和突变系QF2，其缺失IlS球蛋白和7S球蛋白二者。 大豆的另外的实例包括通过此类缺陷型品系和常见品种(例如Jack等)杂交而衍生的子代品系。可以通过进行从种子制备而来的贮藏蛋白的电泳来确认大豆部分或全部缺失内源性大豆lis球蛋白和/或大豆7S球蛋白的事实。6.转化的大豆植物的制备可用于制备转化的大豆植物的材料的实例包括植物组织，例如根、茎、叶、种子、 胚、胚珠、子房、茎端、花药和花粉，及其切片；以及植物培养细胞，例如未分化的胼胝体 (callus)、不定胚和原生质体等。可以通过已经报道和建立的多种方法将编码修饰的种子贮藏蛋白的基因导入上述材料，优选使用农杆菌方法、PEG方法、电穿孔方法、基因枪方法、须状物超声法等导入上述的载体以用于基因转移。使用选择性标志物基因赋予的抗性效应作为指标，可以从材料中选择转化的大豆植物的细胞，所述材料是导入了编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的材料。从选择的细胞中， 可以通过再生出植物体的步骤获得转化的大豆植物体，已经针对每个植物物种报道了所述步骤。通过栽培由此获得的转化的大豆植物体以允许种子成熟，可以获得本发明的转化的大豆的种子，可以在转化的种子中获得目标阿尔茨海默病疫苗。可以通过PCR方法、DNA杂交方法、RNA杂交方法、蛋白质印迹方法等来确认编码阿尔茨海默病疫苗的基因是否已经被导入植物体中。例如，通过从转化的大豆植物体的种子中提取蛋白，进行蛋白质印迹，使用特异于阿尔茨海默病疫苗的一抗和辣根过氧化物酶 (HRP)等标记的二抗来进行免疫染色，由此可以确认编码阿尔茨海默病疫苗的基因的适当的导入、阿尔茨海默病疫苗在种子中的积累，以及所积累的疫苗的量。可以通过例如使用具有阿尔茨海默病的疾病模型小鼠来评价转化的大豆植物的种子中积累的修饰的种子贮藏蛋白中包含的阿尔茨海默病疫苗的性能。更具体而言，通过皮下注射或口服给药方式向上述模型小鼠施用包含阿尔茨海默病疫苗的修饰的种子贮藏蛋白或使用蛋白酶从所述修饰的种子贮藏蛋白中切下来并加以纯化的阿尔茨海默病疫苗。 可以通过研究小鼠中的针对阿尔茨海默病疫苗的抗体的产生、淀粉状蛋白的量、脑组织、和/或行为异常来评价阿尔茨海默病疫苗的性能。可以作为与佐剂的混合物来施用包含阿尔茨海默病疫苗的修饰的种子贮藏蛋白或使用蛋白酶从所述修饰的种子贮藏蛋白中切下来并加以纯化的阿尔茨海默病疫苗。可以通过在室外田地或封闭的栽培设施(其中环境是人工控制的)中栽培然后收集积累包含疫苗的修饰的种子贮藏蛋白的转化的大豆的种子来大量生产阿尔茨海默病疫苗。作为包含阿尔茨海默病疫苗的组合物，其中积累了包含阿尔茨海默病疫苗的修饰的种子贮藏蛋白的种子可用于预防和/或治疗阿尔茨海默病。例如，通过粉碎等加工过的种子可以制成片剂、颗粒、粉末、胶囊、饮料等形式。此外，上述组合物可以包含在种子中积累的修饰的种子贮藏蛋白，所述蛋白经过了提取和纯化。例如，种子的磨碎产物经过脱脂和加热处理后，可以通过例如液相色谱的装置纯化包含目标阿尔茨海默病疫苗的修饰的种子贮藏蛋白。此外，上述组合物还可以包含通过以蛋白酶处理修饰的种子贮藏蛋白并纯化得到的产物、从而从修饰的种子贮藏蛋白中部分或全部除掉野生型种子贮藏蛋白的部分而制备的阿尔茨海默病疫苗。现在将通过实施例的方式更具体地描述本发明，但是本发明不限于这些实施例。除非另有指明，否则以下实施例中实施的实验方法的程序是根据“Molecular Cloning，，第二片反·(J· Sambrook 等人，Cold Spring Harbor Laboratory press，1989 年出版)。实施例实施例1用于修饰的大豆IlS球蛋白AlaBlb的表达质粒的构建构建了用于在大豆种子中表达编码包含具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的肽的修饰的AlaBlb的基因的表达质粒，SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列(以下简称为 A β 4-10)已知为β-淀粉状蛋白抗原决定簇。该构建的程序显示于图2。使用FASMAC Co.，Ltd.提供的订制的DNA合成服务来合成具有3个拷贝的编码 Aβ 4-10的核苷酸序列彼此串联的寡核苷酸(有义链，SEQ ID NO 4)和具有其互补序列的寡核苷酸(反义链，SEQ ID NO 5)(有义链和反义链在下文中分别被称作410F和410R)。 除非另有指明，否则下文中提及的寡核苷酸是使用上述生产商提供的订制的DNA合成服务来合成的寡核苷酸。在最终浓度为ImM的ATP的存在下，各IOOpmol的410F和410R与"Γ4 多核苷酸激酶(由TAKARA BIO INC.生产)进行磷酸化反应，将反应后的反应溶液混合在一起，然后将得到的混合物在94°C加热10分钟，然后允许该混合物逐渐冷却至37°C，持续1 小时，从而实现退火。通过该过程，获得了编码肽的双链DNA片段，在所述肽中3个拷贝的 Aβ 4-10 彼此串联((Aβ 4-10) X3)。使用质粒pBSK-AlaBlb(获自 Kyoto University，其中在 pBluescript II SK(-) (由Stratagene生产)的SmaI位点克隆了已知的AlaBlb基因(GenBank登记号ABl 13349) 的cDNA)作为模板，进行PCR以扩增包含载体部分的片段，从而该片段的5’-末端和3’-末端定位于编码AlaBlb基因的特定可变区。将获得的DNA片段与编码(Α β 4_10) X 3的双链 DNA片段连接，以制备编码修饰的AlaBlb的基因。该方法更具体的叙述见下文。制备了编码具有SEQ ID NO 1所示序列的AlaBlb的基因的总共5个引物组，即 用于插入至可变区II的由SEQ ID NO :6和7的引物对组成的引物组(PS-I)、用于插入至可变区III的由SEQ ID NO :8和9的引物对组成的引物组(PS-2)、用于插入至可变区IV的由 SEQ ID NO 10和11的引物对组成的引物组(PS-3)和由SEQ ID NO 12和13的引物对组成的引物组(PS-4)，以及用于插入至可变区V的由SEQ ID NO 14和15的引物对组成的引物组(PS-幻。合成引物使得导入用于在紧接插入区的下游导入氨基酸置换的核苷酸置换， 以允许使用一种蛋白酶即嗜热菌蛋白酶从修饰的AlaBlb蛋白切除(Αβ4-10)Χ3。使用各个引物组在显示为SEQ ID NO :1的核苷酸序列中插入了编码 (Αβ 4-10) Χ3的DNA的区域在下文中分别被称作PS-I区域、PS-2区域、PS-3区域、PS-4区域和PS-5区域。使用IOng pBSK-AlaBlb作为模板和50yL/反应的反应溶液，通过以下循环来进行PCR 1个循环的“94°C变性2分钟”；然后25个循环的“94°C变性30秒、57 °C退火30 秒、68°C延伸5分钟”。所述反应溶液含有200 μ M dNTP混合物，1. 5mM MgSO4溶液，浓度为 1 μ M的上述各引物，和KOD-Plus-Ver. 2缓冲液，所述缓冲液含有1个单位的KOD-Plus-(由 Toyobo Co. Ltd.生产)。除非另有指明，否则除了引物之外，下文提及的PCR均使用相同的成分进行。使用DNA连接试剂盒(由TAKARA BIO生产)，使50fmol由此获得的每种DNA片段和150fmol编码上述(Α β 4-10) X 3的双链DNA片段在16°C进行连接反应40分钟。反应产物用于转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(由TAKARA BIO生产)，以获得多个转化的大肠杆菌细胞。从所获得的大肠杆菌细胞中提取并纯化质粒DNA，然后使用FASMAC Co.，Ltd的 DNA测序服务来分析它们的核苷酸序列。在使用PS-I的情况下，转化的大肠杆菌的12个克隆的核苷酸序列分析结果显示1个克隆具有1分子的编码(Α β 4-10) X 3双链DNA片段，其状态为该片段以正向正确地插入。另外，在使用PS-2、PS-3、PS-4和PS-5的情况下，分别分析了 M个克隆、M个克隆、30个克隆和12个克隆，并且获得了每种1个克隆，其具有1分子的编码(Αβ4-10)Χ3双链DNA片段，其状态为该片段以正向正确地插入。可以获得其中正确插入了片段的修饰的AlaBlb基因的概率在插入位点之间是不同的，在使用PS-3的情况下，片段的插入尤其困难。将所有由此制备的编码修饰的AlaBlb的基因进行关于它们的核苷酸序列的确认。除非另有指明，否则使用FASMAC Co.，Ltd.的DNA测序服务进行下文提及的核苷酸序列的测定。然后，为了制备在多个可变区中插入了编码(Αβ4_10) X3的DNA的修饰的AlaBlb 基因，使用上述制备的编码修饰的AlaBlb的基因作为模板，使用如上所述的相同的引物组进行PCR。重复进行所获得的DNA片段与编码上述(Α β 4-10) X 3肽的双链DNA片段的连接反应，以制备编码修饰的AlaBlb的基因。通过该过程，制备了含有编码修饰的AlaBlb的基因的质粒，其中在AlaBlb基因的多个可变区插入了编码(Αβ4-10) Χ3的DNA。具体的插入区和对应于它们的编码修饰的AlaBlb的基因的名称显示于表1。表 权利要求
1.转化的大豆植物，其中导入了编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，其中，通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而不发生移码，从而获得所述的编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，并且其中所述修饰的种子贮藏蛋白在种子中表达并积累。
2.根据权利要求1的转化的大豆植物，其中，所述阿尔茨海默病疫苗是淀粉状蛋白抗原决定簇。
3.根据权利要求2的转化的大豆植物，其中，所述β-淀粉状蛋白抗原决定簇具有如下序列含有彼此相连的1至3个拷贝的具有SEQ ID NO 3所示序列的肽。
4.根据权利要求1至3任一项的转化的大豆植物，其中，缺失内源性大豆IlS球蛋白和 /或大豆7S球蛋白。
5.根据权利要求1至4任一项的转化的大豆植物，其中，所述野生型种子贮藏蛋白是大豆IlS球蛋白的AlaBlb亚基、菜豆的arcelin或水稻的谷醇溶蛋白。
6.根据权利要求5的转化的大豆植物，其中，所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQID NO :2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有不少于90%同一性的氨基酸序列，并且所述编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码选自对应于SEQ ID NO 2的氨基酸位置111-128、氨基酸位置198-216、氨基酸位置沈8_315和氨基酸位置 490-495的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列的区域。
7.根据权利要求5的转化的大豆植物，其中，所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQID NO :37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO :37所示的氨基酸序列具有不少于90%同一性的氨基酸序列，并且所述编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码对应于SEQ ID NO 37的氨基酸位置149-150和/或氨基酸位置250-251的氨基酸序列的区域。
8.根据权利要求5的转化的大豆植物，其中，所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQID NO :45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO :45所示的氨基酸序列具有不少于90%同一性的氨基酸序列，并且所述编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码对应于SEQ ID NO 45的氨基酸位置110-111的氨基酸序列的区域。
9.根据权利要求1至8任一项的转化的大豆植物，其中，所述编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的表达由菜豆arcelin 2的启动子或大豆IlS球蛋白的AlaBlb亚基的启动子调节。
10.根据权利要求1至9任一项的转化的大豆植物的细胞。
11.根据权利要求1至9任一项的转化的大豆植物的种子。
12.通过加工根据权利要求11的种子而产生的加工的大豆种子。
13.使用根据权利要求1至9任一项的转化的大豆植物产生阿尔茨海默病疫苗的方法， 其中，在所述转化的大豆植物的种子中产生阿尔茨海默病疫苗。
14.载体，其包含诱导大豆种子特异性表达的启动子；和连接于所述启动子下游的编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，其中通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而不发生移码，从而获得所述编码修饰的种子贮藏蛋白的基因。
15.根据权利要求14的载体，其中，所述启动子是菜豆arcelin2的启动子或大豆IlS 球蛋白的AlaBlb亚基的启动子。
全文摘要
产生了通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区中而获得的其中导入了编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的转化的大豆植物，在其种子中产生并积累了所述疫苗。
文档编号C12N15/09GK102307995SQ20098015594
公开日2012年1月4日 申请日期2009年11月26日 优先权日2008年11月28日
发明者东海林干夫, 内海成, 寺川辉彦, 瓦林毅, 石本政男, 长谷川久和 申请人:北兴化学工业株式会社