用于肺癌诊断、预后和提高生存率的方法与组合物的制作方法

专利名称：用于肺癌诊断、预后和提高生存率的方法与组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于microRNA (微RNA)表达的疾病的诊断方法(如肺癌)，确定疾病预后和改善患者生存。
背景技术：
肺癌是世界导致癌症死亡的首要原因。相似的患者肺癌可能会有不同的临床结果，很难预测病人的预后。虽然近年来对肺癌分子生物学的了解有所增加，但仍无法详细地了解潜在的分子机制。临床上需要有精确的预后指标以确定高风险患者，也需要针对性的设计最佳的治疗方法。本文披露的所有出版物，专利，专利申请及专利申请公布已列入本文并作为参考文献。

发明内容
本发明是部分基于发现，特别癌组织样本中微RNA表达增加或减少的水平。因此， 此处依据miRNAs与/或的地位相应的miRNA基因表达水平，提供的诊断癌症方法和成分， 并确定癌症患者的预后(如肺癌)。本文还提供了用探针方法检测miRNA或相应的miRNA 来基因诊断和预后判断的癌症(如肺癌)。一方面，本文件阐述了一种方法，以确定一个人有肺癌，其中包括a)肺组织样本 miRNA表达水平，其中，个人组织是被怀疑是癌症，b)比较miRNA与参考品的表达水平，和 c)如果样品展示至少有一个miRNA的有特征变化，判读个人具有或可能患有肺癌。肺癌可以是小细胞肺癌，肺腺癌，或肺鳞状细胞癌。至少一个的miRNA 可以是hsa-miR-210， hsa-miR-30a, hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p，hsa-miR-140_3p，或者相应的同源性。该方法也可包括至少在三个miRNA有特征变化，其中，至少有三个微RNA均选自组成的 hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p，hsa-miR-140_3p，或其相应的同源。如果样品中 hsa-miR-210，hsa-miR-30a 与 hsa-miR-182 表达增加和 hsa-miR-486_5p， hsa-miR-140-3p表达降低，表明个人患有或可能造成肺癌。可以通过微阵列分析(例如，根据杂交信号的强度，或基于的杂交信号的比值)对来确定miRNA的表达水平。miRNA的表达水平也可以通过Northern blot分析，原位杂交，或定量逆转录聚合酶链反应来确定。检测 miRNA来源于淋巴结样品，血液，血清，或呼吸道拭子。在另一个方面，本文件阐述的一种方法，以确定一个人有肺癌。其中包括分析至少有一个miRNA的特征变化的水平，依次确定个人具有或可能有肺癌。通过miRNA的删除或扩增，或根据miRNA的基因拷贝数的变化来确定基因的变化。在另一个方面，本文件采用了系统检测肺癌，其中包括至少一对引物或多个探针， 其中每对引物，或每个探针能够检测不同的miRNA的样品中，和其中至少约百分之五十的引物和探针序列能够检测 hsa-miR-210，hsa_miR-30a，hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p，
5hsa-miR-140-3p，和其相应的同源miRNA。在另一个方面，本文件阐述系统检测肺癌的方法，其中，系统包括至少一对引物或多个探针，其中每对引物，或每个探针能够检测不同的miRNA或基因的表达状态，在样本，其中至少有百分之五十左右的引物或探针能够检测的hsa-miR-210，hsa-miR-30a, hsa-miR-182，hsa-miR-486-5p，hsa-miR-140-3p，和其相应的同源 miRNA。符合其中的一个 miRNA的表达变化提示肺癌。在另一个方面，本文件使用至少一对引物或多个探针构建制造系统来检测肺癌，其中每对引物，或每个探针能够检测不同的miRNA样品中，和其中至少有50%左右的引物或探针能够检测 hsa-miR-210，hsa_miR-30a，hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p， hsa-miR-140-3p，和其相应的同源miRNA。该文件还使用一种方法诊断肺癌病人，通过肺癌患者miRNA的表达水平来诊断肺癌患者。该方法可包括依据表1或表2的miRNA或同源基因，来确定肺癌分化级别。在另一个方面，本文件阐述的方法确定肺鳞状细胞癌患者的预后生存，其中包括 a)检测肺癌组织样本至少一条miRNA的表达水平，b)比较样品中的miRNA与参考品的表达水平，和c)miRNA的表达水平与个体预后生存。在至miRNA指hsa-miR-31或相应的同源基因。在另一个方面，本文件确定肺鳞状细胞癌病人预后生存期的方法，其中包括分析肺鳞状细胞癌样本中miRNA或对应基因的表达，与对照肺癌样品相比，miRNA基因表达高或低与术后生存密切相关。该miRNA是hsa-miR-31或相应的同源性。miRNA表达水平的确定可通过Northern blot分析，原位杂交，或定量实时聚合酶链反应。检测miRNA来源于淋巴结样品，血液，血清，或呼吸道拭子。在另一个方面，本文件使用的一个或多个引物或探针对确定肺鳞状细胞癌病人预后生存期，其中的一个或多个引物或探针能够被用来检测样品中miRNA，miRNA可以是 hsa-miR-31 或相应的同源 hsa-miR-31。在另一个方面，本文件使用的一个或多个引物或探针用于构建一种试剂或系统来确定肺鳞状细胞癌病人预后生存期，其中的一个或多个引物或探针能够被用来检测样品中 miRNA, miRNA 可以是 hsa-miR-31 或相应的同源 hsa-miR-31。在另一个方面，本文件的方法改善肺癌个人生存，包括应用一种有效的药物剂量减少至少一种miRNA水平。miRNA可以是hsa-miR-31或相应的同源基因，miRNA可以是hsa-miR-210，hsa_miR-30a，hsa-miR-182，或相应的同源性基因。试剂可以是反义 RNA或小分子干扰核糖核酸。该方法可包括应用一种有效的药物剂量减少至少有两种 miRNA 水平，miRNA 可以是 hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p， hsa-miR-140-3p，和其相应的同源基因。应用一种有效的药物剂量减少至少有三种 miRNA 水平，miRNA 可以是 hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p， hsa-miR-140-3p，和其相应的同源基因。在另一个方面，本文件采用的药物改善有肺癌个人生存，药物可以是反义RNA或小分子干扰核糖核酸，可以有效的剂量减少miRNA水平。miRNA可以是hsa-miR-31或相应的同源基因，hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182，或相应的同源性基因。在另一个方面，本文件包含药物载体和试剂包载的成分，成分可以是反义RNA或小分子干扰核糖核酸，降低了 miRNA的水平，可以有效的剂量减少miRNA水平。miRNA可以是 hsa-miR-31 或相应的同源基因，hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182，或相应的同
源性基因。除非另有规定，本发明涉及所有的技术和科学所用词汇具有相同涵义。虽然方法和材料类似或等同于本文所述可用于实践的发明，合适的方法和材料的说明如下。所有出版物，专利申请，专利和其他参考资料本文中提到的以提及方式纳入的全部内容。在发生冲突时，本规范，包括定义，将控制。此外，材料，方法和例子是说明性的，而不是只打算限制。发明细节体现在如下所附的图和说明中。本发明的其他功能，对象和优势在描述、 图和声明中显而易见。


图IA到IF是分类器，可以用来区分正常组织和恶性肺部病变。分类器基于主成分分析(PCA)和支持向量机(SVM)分析来构建。圆点代表癌变组织，十字架代表邻近癌旁组织。所有病理亚型的肺癌，训练集中98. 2% (127/132)可以正确诊断(图1A)，测试集中 92% (92/100)可以正确诊断(图1B)，其中包括60对鳞状细胞癌(鳞癌)，43对腺癌和13 成对小细胞肺癌(SCLC)病人的组织。对鳞状细胞癌患者，训练集中93. 3% (56/60)可以正确诊断(图1C)，测试集中96. 7% (58/60)可以正确诊断(图1C)，其中包含60对鳞状细胞癌组织。对肺腺癌患者，训练集中97.8% (45/46)可以正确诊断(图1E)，测试集中90% (36/40)可以正确诊断(见图1F)，其中包含43对腺癌组织。图2描述的是鳞状细胞癌，腺癌和小细胞肺癌差异表达的微RNA的非监督聚类，差异表达的miRNA由SAM选出，左图基于miRNA在癌组织与相应的癌旁正常组织的比例，右图基于miRNA的在癌组织绝对信号。分析了 60例鳞状细胞癌，43例腺癌，和13例小细胞肺癌样品。这三个病理亚型肺癌在本研究中不能清楚的被分为3组，值得注意的是小细胞肺癌样本单独集中到一个组。图3A和:3B是鳞状细胞癌患者的卡普兰一迈尔生存曲线。生存曲线显示患者在测试集60例鳞状细胞癌病例；图3A)及测试集(20例鳞状细胞癌病例；图:3B)中，高水平的 hsa-miR-31表达的病人生存率较低，而低hsa-miR-31表达的病人生存率高。训练集P值为 0. 007，测试集P值为0.001。
具体实施例方式本文件是根据，部分研究的基因组范围的miRNA表达谱使用配对的冷冻保存正常或癌变肺部组织样本。具体来说，利用DNA寡核苷酸芯片，微RNA的表达，在癌症样本进行比较的miRNA表达相应的非癌样本。五个微RNA被确定为要么过度表达或表达的肿瘤样本相比，相应的非癌样本。某些微RNA也被确定为具有改变各级不同疾病状态。此外，各级一个miRNA的发现和相关的总体无病生存率肺癌患者。因此，本文件提供的方法和成分进行评估诊断及预后的疾病(如癌症，如肺癌)的基础上，各级微RNA或的地位相应的miRNA基因。一方面，有提供方法和成分，以确定一个人有一种疾病(如肺癌)的基础上，各级某些微RNA。在另一个方面，有提供方法和成分进行分类的癌症患者(如肺癌患者)的病理形式，层次的分化，与肿瘤分期的基础上，各级某些微RNA。在另一个方面，有提供方法和成分的确定预后生存个人癌症(如肺癌)的基础上，各级特别是微RNA。方法的改进生存的肺癌患者和药品成分，用于这种方法也还提供了一样，系统和工具包，可用于此处所述的方法。由于此处使用的“a”，“an”和“在“可能意味着单一或复数(即可能意味着一个或多个)除另有说明外。“个人”作为此处使用的是指脊椎动物(例如，哺乳动物，如人类)。哺乳动物包括但不限于人类，非人类的灵长类动物，牛，羊，猪，马，狗，猫，兔子，天竺鼠，仓鼠，沙鼠，小鼠， 大鼠。在一些体现，一个人可以是一个人。在一些体现，一个人可以成为一个动物模型研究的一种疾病，如肺癌。这是可以理解的是，当个人不是人，可以在相应的微RNA同源或垂直家系人类微RNA确定此处。个人可以是男性或女性。一个人可能会或可能不会显示出任何病理表型肺癌。在一些体现，一个人可以有家族病史的肺癌。所谓“肺组织样本”是指组织样品从肺癌。组织样品可以，例如，一个新鲜的标本， 冷冻样品，或保留样本，(如福尔马林保存样品或石蜡包埋样本)。如下所述，并根据具体的方法，组织可用于全部或可以受到一个或多个方法分解样品成小块，细胞集合体，或单个细胞。肺癌，其中包括但不限于，肺鳞癌，小细胞肺癌(非小细胞肺癌)和肺腺癌。miRNAs:微 RNAmicroRNA (微 RNA)是单链非编码的 RNA，通常是约 22 (例如 19，20，21，22，23，24 或25)核苷酸长度。通过部分或全部序列同源性，可以与微RNA的3-端非编码区(3-端非编码区)的靶mRNA分子(Bartel，Cell 2004，116 :281-297)。miRNAs之间的相互作用与目标基因可以阻止翻译成蛋白质的基因。在某些情况下，当目标和miRNA的完全匹配，基因的降解也可能发生。了解微RNA通常可在网上找到在http://miRNA. Sanger, ac. uk/D数据库的问题见 Griffths-Jones et al. ,Nucleic Acids Research，2006，Vol. 34。微 RNA 有牵连广泛的细胞过程，如细胞分化，细胞的生长和细胞死亡(Cheng et al,Nucleic Acids Res 2005,33 1290-1297 John et al, PLoS Biol. 2004，2 :e363)。可能有多达 1000 微 RNA 在人类基因组中(Zamore and Haley, Science 2005，309 :1519-15 )，多达三分之一的人类基因的预测是可能的miRNA标靶(Lewis et al, Cell 2005，115 :787-798)。RNA编辑的发现说明微 RNA 能调控更多的基因(Blow et al, Genome Biology 2006，7:R27)。这份文件披露微RNA的水平，有关联(例如，直接或成反比)肺癌。例如微RNA列于表1，其中包括名称，序列，和染色体定位的微RNA，以及说明是否是上调或下调肺癌。方法诊断的疾病，如肺癌可根据，例如，在基因水平或地位的任何微RNA列于表1。此处所述的系统可用于确定一个或多个微RNA的水平列于表1，和/或用于诊断肺癌的水平基础上的一个或多个微RNA列于表1。虽然仅通过单一的微RNA检测就可以达到可以接受的敏感性和特异性检测，，如果检测本文中所提及的至少两个以上的微RNA，则敏感性和特异性会有所提高。举例，在一些实施例中，表1中至少两个、三个、四个、或五个微RNA用于确定病人是否患有肺癌，能得到明确结果。
在一些实施例中，在编号1-5所列顺序中至少有两个(例如，至少有两个，三个， 四个或五个)的微RNA的表达水平可以确定。例如，在基因水平或地位的微RNA中所列顺序编号1-3才能确定，或水平或基因的地位，至少有两个(例如，两个或三个)微RNA中所列顺序编号4和5才能确定。在一些体现地位，或基因水平至少有一个微RNA选自微RNA 的序列编号1-3和至少一个微RNA选自微RNA的序列编号4和5可以待定。在某些情况下，水平或基因的地位，至少有两个(例如，两个或三个)微RNA的序列编号1-3和水平的序列编号4和第5才能确定。在一些体现基因水平或地位的所有微RNA列于表1来确定。在一些体现水平的一个或多个相应的miRNA的同源此处所述才能确定。一个“相应的同源”的miRNA的说明此处指的miRNA从非人类脊椎动物对应一个人的miRNA。相应的同源通常至少有50 %左右的序列特征(例如，至少有大约50 %，55 %，60 %，65 %，70 %， 75%，80%，85%，90%，95%，98%，或99% )序列身份相应的miRNA所述。例如，一个相应的同源序列的miRNA的ID号1，至少可以有50%左右的序列特征(例如，至少有大约50%， 55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%，或 99% 同源)的序列 ID 号1。当一个miRNA的序列指出至少有大约例如，95%的可能确定一个参考序列(例如， 序列ID号1)，其用意是，该miRNA的序列是相同的参考序列但miRNA的序列可能包括每 100个核苷酸序列多达5点改变。这些多达5个点的变化可能会删除，替换，补充，并可能发生在任何地方的顺序，在一个或多个连续序列。序列之间的特定身份核酸序列和参考序列的特定身份号码顺序确定如下。首先， 核酸序列进行比较的序列中所列的特定序列识别号码使用BLAST2序列(B12seq)程序的独立版本的BLASTZ含同源版本2. 0. 14和BLASTP版本2. 0. 14。这个独立版本的BLASTZ 在万维网上在美国政府的国家生物技术信息中心网站(ncbi.nlm.nih.gov)。解释如何使用Blkeq程序可以在自述文件所附BLASTZ。Blkeq进行比较两个序列的同源性使用或 BLASTP算法。同源性是用来比较的核酸序列，而BLASTP是用来比较的氨基酸序列。要比较两个核酸序列，选项设定如下我是到一个文件中包含的第一个核酸序列的比较(例如C \seql. txt) ；-J的设置到一个文件中包含第二核酸序列的比较(例如:C :\seq2. txt) ；-ρ 是设置为同源；邻设置为任何想要的文件名(例如C Aoutput. txt) ；-Q是设置为-1 ；-R 是设定为2 ；和所有其他选项都留在他们的默认设置。例如，下面的命令可用于产生一个输出文件，其中包含了比较两个序列中:C :\B12seq-i :\seql. txt—j :\seq2. txt-p, blastn-o c:\output.txt-q-l_r 2。要比较两个氨基酸序列，选择Blkeq设定如下我是到一个文件中包含的第一个氨基酸序列的比较(例如C Aseql. txt) ；-J的设置到一个文件载有第二氨基酸序列的比较(例如C :\seq2. txt) ；-ρ是设置为blastp ；邻设置为任何想要的文件名(例如C Aoutput. txt)；和所有其他选择留在他们的默认设置。例如，下面的命令可用于生成一个输出文件包含两种氨基酸序列中C:\Blkeq-i Aseql. txt-j \seq2. txt-p，blastn-o c:\output.txt-q-l_r2。输出文本。如果这两个序列同源，然后指定输出文件将介绍这些同源序列匹配。如果这两个比较序列不同源，然后指定输出文件将不存在一致序列。一旦匹配，匹配的位置相同的核苷酸或氨基酸残基是在这两个序列上。序列身份确定除以匹配的数量也由长度的序列中规定的顺序确定(例如，序列ID号1)，或由一个长度(例如，从连续20个核苷酸序列集提出在一个确定的顺序)，然后乘以所产生的价值100。例如，核酸序列有20匹配，匹配序列中所列顺序识别码1是相同的百分之90. 9的序列中所列顺序编号1(即20 + 22*100 = 90. 9)。据指出，百分之序列特征值四舍五入到最接近的十分之一。例如，75. 11，75. 12，75. 13和75. 14是四舍五入至75. 1，而75. 15，75. 16， 75. 17，75. 18和75. 19是四舍五入至75. 2。人们还注意到，该长度值将永远是一个整数。
评价miRNA水平的方法该方法在一个或多个微RNA的基础上。由于此处使用中，“水平”指的是miRNA的分子或其前体的数额或积累率。这个词可以用来指绝对数量的样品中的miRNA(所代表的杂交信号的强度)，或与对照的miRNA的比值(所代表的与对照的miRNA的杂交信号的比值)。对照可以是从同一样品的不同的miRNA，其水平并没有在肺癌组织样本改变，也可以是从不同的样本同一的miRNA(如癌组织样品来自同一个人，或组织样本另一个人没有患肺癌)。一个“前体”的miRNA的分子，或“miRNA前体”，指的是未经加工的miRNA基因转录， 通常包括一个RNA转录物的大约70个核苷酸长。miRNA的前体通常是RNA酶(如Dicer， Argonaut, or RNAase III)处理的活化的 miRNA 分子，通常是 19-25 (例如，19，20，21，22， 23，24，或25)核苷酸长度。"miRNA在肺组织样本水平”是指的miRNA水平的组织样品。虽然在大多数情况下根据直接测量在肺组织样本的miRNA水平来确定miRNA水平，设想miRNA的水平不仅在肺组织样品而且在其他样品也可以反映出的miRNA的水平，例如在淋巴结样品(如淋巴结或淋巴液)，血清，血液或其他生物流体材料，如痰。一个miRNA的水平可在淋巴结样品(例如，切片或淋巴结针吸)血液或血清，或肺组织拭子的基础上来确定。一个miRNA的水平可从经内镜超声引导下取得的样品来确定(例如用RT-PCR分析)。内镜超声引导下细针穿刺 (活检)是一种微创技术的非手术取样，从而能够进行更加详细的分子标记分析。测定样品中的miRNA水平，不仅可以测肺癌组织，也可以测肺癌组织以外的其他肺癌组织。例如，可以先确定的血清样本miRNA水平，以及后续可以进行区域淋巴结miRNA的分析。这种多步分析可能提供更多的信息，增加诊断可信度。miRNA的水平可从各个阶段来确定。例如，一个miRNA的水平可在手术之前，手术中，手术后，肿瘤治疗前，在肿瘤治疗中，和/或肿瘤治疗后来确定。一个miRNA的水平可在肺组织拭子的基础上来确定。测定微RNA水平的方法包括那些已知的工艺。例如，Northern杂交，原位杂交， RT-PCR技术，和/或微阵列分析来确定miRNA的水平。见，Einat，Methods Mol. Biol. 2006， 342 :139-157 ；and Thompson et al.，Genes Dev. 2006,20 :2202-2207.据示范的方法，细胞总RNA的纯化，在核酸提取缓冲液的细胞离心。沉淀核酸，DNA 酶处理去除DNA和沉淀。根据标准技术RNA分子可以在凝胶电泳琼脂糖凝胶分离，并转移至硝酸纤维素过滤器，例如，Northern杂交技术。RNA然后可以固定在过滤器加热。检测和量化具体的RNA可使用适当的互补RNA的标记DNA或RNA探针。自显影检测探针杂交，以微RNA可将杂交曝光在胶卷上。光密度扫描胶卷可以提供一个准确的衡量RNA转录物的水平。另外，RNA转录物水平可以在计算机化成像杂交印迹量化。除了 Northern和其他核酸杂交技术，原位杂交来衡量RNA的转录水平。这项技术涉及将整个细胞或组织点到微观盖玻片和并制定存在细胞或组织中有放射性标记的核酸探针(如cRNA探针)。微RNA的水平也可在反转录和扩增聚合酶链反应(RT-PCR)确定。微RNA水平可以用内参量化(例如，从存在于同一样本“看家”基因的mRNA表达水平)。合适的“管家”基因用作内参包括肌球蛋白，甘油三磷酸脱氢酶(G3PDH)，和人TO。定量RT-PCR和变异是众所周知的普通的工艺。RT-PCR引物，见表1。在某些情况下，实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析的微RNA可能比传统组织切片和在某些早期癌症染色检测微RNA更敏感。该qRT-PCR检测的miRNA水平，可能提供了敏感和特异的诊断，分类，及预后肺癌的工具。一方面，本文件提供RT-PCR的方法来确定的miRNA个人的水平(例如，一个人有疾病，如癌症)的。miRNA 水平的是由qRT-PCR检测。在某些情况下，微RNA水平可用芯片检测。核酸探针可以用此处所述的方法生产，也可以使用化学合成的方法，是众所周知的工艺。此外，杂交探针可以标记各种探测标签，例如，包括放射性同位素，荧光标记，报告酶，生物素，和其他配体。这种可探测标签可以放大，例如，可用光度法检测热或光指标物质。标记方法和检测这种探测器是众所周知的工艺。核酸探针可用于检测样品中严格的条件下微RNA杂交。根据特别检测，严格的条件可以不同，在某一样本优化检测特定的miRNA。一般情况下，杂交的稳定依赖离子浓度和温度。通常情况下，杂交反应的条件严格性降低，其次是清洗不同，但条件更高，更严格。中度严格的杂交条件允许核酸分子探针等结合互补核酸分子。核酸分子杂交，一般都至少有60%的识别(例如，至少有60%，65%， 70%，75%，80%，85%，90%，95%，或 95% 以上的识别)。低严格条件杂交指是指使用10%甲酰胺，5xDenhart溶液，6xSSPE，0. 2%的SDS， 于22°C进行杂交，然后在lxSSPE，0. 2%的SDS，于37°C进行洗涤。温和的严格条件是指使用 50%甲酰胺，5xDenhart的溶液，5xSSPE，0. 2%的SDS在42°C进行杂交然后使用0. 2xSSPE, 0. 2 %的SDS，在42 °C洗涤后。高苛刻条件是指使用50%甲酰胺，5xDenhart的溶液，5xSSPE， 0.2%的SDS在42°C进行杂交，然后在0. lxSSPE，和0. 的SDS于65°C进行洗涤。其他适合的温和和高苛刻条件是众所周知的。例如，在Sambrook et al. ,Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd ed. , Cold Spring Harbor Press,Plainview,N. Y. (1989) ；and Ausubel et al. , supra, 1999。Denhardt 溶液包含 1 % Ficoll, 1 % polyvinylpyrolidone, 和牛血清白蛋白(BSA)。20xSSPE(氯化钠，磷酸钠，乙烯胺四乙酸(乙二胺四乙酸))包含3M氯化钠，0. 2M磷酸钠和0. 025M(乙二胺四乙酸)。在一些实施例中，一个或多个微RNA水平可从在一个以上的时间点检测。这种“串行”取样可以适合个人肺癌进展监测。串行采样可以执行任何想要的时间，如每半年，每年， 每两年或更多或较少。测量水平和参考水平的miRNA能进行比较，每次一个新的样本测试， 或有关的数据水平可能举行较少分析。对某一特定的miRNA，参考水平一般被视为“正常”的。参考水平根据自同一个体非癌肺组织miRNA水平。参考水平根据个人没有肺癌miRNA水平。参考水平可根据非肺癌的人口 miRNA水平。在某些情况下，参考水平可以从一组样本，包括正在测试的样本，可预先或确定样品进行测试。正如本文中所使用的“参考”价值可以是绝对值，相对值，一个值，有一个上限或下限，一系列的值，平均值，一个中间值，平均值，或比值，尤其是控制或基准值。
参考价值比较可能在任何(例如，一，二，三，四，或五)列于表1微RNA或其相应的同源进行。参考水平和miRNA水平的比较过程可以适当的任何方式的类型测量进行例如， 当杂交信号被用来作为衡量miRNA的水平，水平可以直观定性比较强度的杂交信号。对于定量措施，可通过检查的数值数据和申述的数据(例如，检查图形，如柱状图或线图)进行比较，。比较的过程中可以人工(如目视)，或者可以是自动的。在一些实施例中，比较是确定测量值和参考水平差异之间的规模(例如，比较 “倍”或百分比之间的测量值和参考水平之间差异)。由于此处使用的，“倍的差异”是指 miRNA测量值和参考水平差异之间的规模。一个“特性的变化”中的miRNA水平，与参考水平比较，可以大幅度减少或大量增加。由于此处使用，“大幅度增加”是指增加的miRNA水平至少约5% (例如，至少有5%， 6%，7%，8%，9%，10%，15%，20%，30%，40%，50%，或50% 以上)。同样，“大幅度减少，，作为此处使用指的是减少了 miRNA的水平至少约5 % (例如，至少有5%，6%，7%，8%，9%， 10%，15%，20%，30%，40%，50%，或 50% 以上)。表1列出了微RNA特征的变化。一个或多个微RNA水平的特点变化可作为诊断肺癌依据。例如，至少有一种序列编号1-3微RNA的水平可以决定，至少有一个可以测量微 RNA的数额大幅增加能指示肺癌。至少有一种序列编号4，5，至少有一个可以测量微RNA 的数额大幅增加能指示肺癌。当至少有一种序列编号1_3，至少有一种序列编号4，5微 RNA的水平可以决定时，至少有一个可以测量微RNA的数额大幅增加和少有一个可以测量微RNA的数额大幅减少能指示肺癌。在一些实施例中，各级所有微RNA水平在表1中列出来，至少有一个可以测量序列编号1-3微RNA的数额大幅增加和少有一个可以测量序列编号4，5微RNA的数额大幅减少能指示肺癌，至少有二个可以测量序列编号1-3微RNA的数额大幅增加和少有二个可以测量序列编号4，5微RNA的数额大幅减少能指示肺癌。在一些实施例中，使用一个以上的微RNA，但微RNA水平并不一致建议或表示有诊断肺癌，是“多数”的建议或表示可考虑的结果分析。例如，当该方法利用五个微RNA，其中三个表明肺癌，其结果可能被视为暗示或表明个人可诊断肺癌。但是，一个至少一个或多个特别是微RNA特征性改变可诊断肺癌。例如，当微RNA是hsa-miR-210，大幅度增加的 hsa-miR-210可能是诊断肺癌一个先决条件。评价miRNA基因状态的方法本文还提供了至少有一个微RNA的基因(或其相应的同源性)为基础的诊断肺癌的方法，列于表1。通过分析至少有一个的miRNA基因样品中的删除或扩增，可对基因状态进行评估。相对于对照样品一缺失或扩增中的miRNA基因的减少可以表明个体存在肺癌。通过从疑似个人肺癌组织确定肺组织样品结构或序列，和对照样品结构或序列的比较，可以检测删除或放大了的miRNA基因。适用于任何检测改变基因结构或序列技术可用于本方法。例如，存在的miRNA基因缺失和扩增可利用核酸探针特异性的miRNA序列 Southern杂交检测。序列分析和单链构象多态性分析也可用。缺失或扩增的miRNA的基因也可以用扩增片段的基因的聚合酶链反应(PCR)检测，如果个人的DNA样本不同于样本DNA可通过测序或电泳确定扩增片段序列或长度。 miRNA的基因删除还可以通过密切相关的miRNA的基因染色体标记的缺失来测。
细胞中的个人miRNA基因在也可通过测量的样本中至少一个miRNA的基因拷贝数来评估，其中一个基因拷贝数以外的其他两个为对任何性别体细胞染色体或者女性性染色体miRNA的基因，或一个以上的其他miRNA基因中的性染色体是男性，可以表明个人有肺癌。任何适合于检测基因拷贝数的技术都可用，包括Southern杂交和PCR扩增技术。 另一种来确定的肺组织样本miRNA基因拷贝数的方法依赖于一个事实，即许多微RNA或基因簇与染色体标记或其他基因密切相关。杂合的染色体标记或其他基因密切相关的基因的丢失说明染色体标记或其他基因密切相关的基因有杂合性。测定缺失的染色体标记的方法技本文也说明了。可用于确定miRNA基因其他技术，例如，等位基因特异性引物延伸的芯片，聚合酶链反应/低剂量辐射普遍阵列，微球的单碱基链延伸，序列标签分子探针反演和组合序列杂交。在一些实施例中，“对照样品”可以是一个个人没有肺癌组织样品。另外，对照样品可以是一个人群组织样本的集合(例如，已知没有肺癌的个人)。至少有一个(例如，一，二，三，四，五)的微RNA列于表1或其相应的同源才能确定基因状态。在体现在基因状态的一个以上的微RNA的使用，但没有一致建议或表示有诊断肺癌的“多数”的建议或表示可考虑的结果分析。例如，当该方法利用基因五个微RNA，其中三个表明肺癌，其结果可能被视为暗示或表明诊断肺癌。然而，在某些情况，诊断为肺癌要求一个或多个特定的miRNA基因的改变。诊断疾病方法本文件提供的方法，以确定一个人有一种疾病(如癌症)，其中包括a)确定的水平至少一个miRNA的生物样品中的个人，和b)与参考水平比较，其中的一个特点变化的水平，这表明疾病。可疾病诊断包括，但不仅限于，癌症(如肺癌，乳腺癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，胰腺癌，白血病，淋巴瘤，肾癌，膀胱癌，子宫颈癌癌，子宫内膜癌，卵巢癌和睾丸癌)，心血管疾病(如冠心病，高血压和动脉粥样硬化)，以及与年龄有关的疾病(如帕金森氏症，阿尔茨海默氏症，糖尿病)。例如，该文件提供的方法诊断肺癌的个人，其中包括a)确定的水平至少一个 miRNA的(例如，至少有一个miRNA的表1中所列，或相应的同源基因)的肺组织样本从个人，其中，组织是被怀疑是癌症，和b)与参考水平比较，其中的一个特点变化的水平，表明 miRNA的是肺癌。在一些实施例中，一种方法诊断肺癌的个人可以包括1)比较的参考水平，至少有一个miRNA的(例如，至少有一个miRNA的表1中所列，或相应的同源基因)的水平，至少在一个miRNA的肺组织样品从个人，其中，组织是被怀疑是癌症，和b)确定是否个人肺癌基于特征变化的水平，至少有一个miRNA的。该方法可以进一步提供了包括肺组织样本从个人和/或孤立微RNA的组织样品。该文件还设想了一种提供信息的诊断肺癌的个人，其中包括a)确定的水平至少一个miRNA的表1中所列，或相应的同源性，在肺组织样本个人，其中该组织被怀疑癌变，并 b)提供信息的水平的miRNA的诊断肺癌，其中一级的miRNA的作为基础，诊断肺癌，和其中的一个特点变化的水平至少有一个指示性的miRNA是肺癌。
在一些实施例中，在水平至少有一个(例如，一个，两个或三个)的微RNA的序列编号1-3才能确定，并大幅度增加的数额至少一个测量微RNA可指示肺癌。在水平至少有一个(例如，一个或两个)的微RNA的序列编号4和5来确定，并大幅度减少的水平至少有一个可衡量的指示微RNA肺癌。在水平至少有一个(例如，一个，两个或三个)的微RNA 的序列编号1-3和至少有一个(例如，一个或两个)的微RNA的序列编号的4和5才能确定，并大幅度增加的数额至少有一种微RNA的序列编号1-3和大幅度减少的水平至少有一种微RNA的序列编号4和5可以表明肺癌。在一些实施例中，各级各微RNA表1中列出来确定，并大幅度增加的数额至少有一种微RNA的序列编号1_3，结合大量减少的水平上至少有一个微RNA的序列编号4和5可以表明肺癌。在某些情况下，大幅度增加各级至少有两个(例如，两个或三个)的微RNA的序列编号1_3，结合大量减少的水平微RNA酶的序列编号4和5可以表明肺癌。在某些情况下，大幅度增加各级微RNA的序列编号1-3，结合大幅度减少的水平微RNA的序列编号 4和5可以表明肺癌。改变各级的miRNA的一个组织样品也可能反映了变化中的miRNA基因。基因状态可以反映，例如，删除或扩增的miRNA基因，或通过改变拷贝数的miRNA的基因。因此，在一些提供了一个方法诊断肺癌的个人，包括分析基因状况至少有一个 miRNA的基因(例如，至少有一个基因编码的miRNA列于表1)在肺组织样本被怀疑是癌变在个人，其中一个特点改变基因的相对地位的相应的miRNA基因对照样品可以表明肺癌。 在改变基因的地位来决定的基础上删除或放大了的miRNA基因。在某些情况下，基因的变化来确定地位的基础上改变了拷贝数的miRNA基因。该文件还提供了一个方法诊断个人肺癌，包括分析删除或扩增miRNA的基因编码的miRNA列于表1，其中的miRNA基因分析在肺组织样本，被怀疑癌变。缺失或扩增的miRNA 基因与相应的miRNA基因控制样品可以表明肺癌。例如，一种方法可以包括分析，至少有一个相应的miRNA基因的miRNA到了核苷酸序列中所列顺序识别码1，2，3的扩增，其中扩增的miRNA基因与相应的miRNA基因控制样品可以表明肺癌。在一种方法可以包括分析，至少有一个相应的miRNA基因至少有一个miRNA的核苷酸序列中所列顺序识别码4，5删除， 其中删除了相对的miRNA基因相应的miRNA基因控制样品可以表明肺癌。在某些情况下， 一种方法可以进一步提供了包括肺组织样本被怀疑癌细胞从个人和/或孤立DNA的肺组织样本。该文件还提供了一个方法诊断肺癌的个人，包括确定基因拷贝数的至少有一个相应的miRNA基因的miRNA列于表1 (或相应的同源基因)的肺组织样本，是从个人和被怀疑癌变。其他的副本数目超过两个的miRNA基因位于染色体两种性别或性染色体为女性，以及其他超过的miRNA基因位于性染色体为男性，可以表明肺癌。例如，一个方法可以包括确定该基因拷贝数的至少有一个相应的miRNA基因中的至少一个微RNA中所列顺序编号1_3 样品中的个人，以及拷贝数超过两个对miRNA的基因位于染色体两种性别或性染色体为女性，或一个以上的miRNA的基因位于性染色体为男性，可以表明肺癌。在一些体现，一种方法可以包括确定基因拷贝数的至少有一个相应的miRNA基因中的至少一个微RNA中所列顺序编号4和5中的示例，并拷贝数少于两个为miRNA的基因位于染色体两种性别或性染色体为女性，或少于1个miRNA的基因位于性染色体为男性，可以表明肺癌。在一些体现，一种方法可以进一步提供了包括肺组织样本被怀疑癌细胞从个人和/或孤立DNA的肺组织样本。此处所述的微RNA也可用于一个或多个如下分类肺癌患者，预测风险，肺癌，监测肿瘤进展肺癌患者，并监测治疗的肺癌患者的基础上，各级或更多的微RNA在肺组织样本，或者根据基因地位的一个或多个微RNA在肺组织样本。任何方法可以进一步披露包括录音或安排记录(例如，通过手写，电脑，或音频手段)有关的个人状况的评估。例如，一个方法可以包括记录有关的信息是否是个人被确定为具有肺癌预后生存的个人，或个人分类到特定的肺癌组。这些步骤将更为详细地讨论如下。用于确定肺癌患者预后的材料与方法这份文件提供的方法来确定预后的肺癌患者，其中包括，例如，确定的生存预后的个人有肺癌方法。预后的方法可用于确定一个适当的疗程为个别有肺癌。例如，测定存活的可能性可以帮助确定是否更为保守或更激进的方法来治疗，应考虑，还是治疗方式应合并。 此外，这种预后可以帮助确定是否为改善生存(如所述)可能是必要的和/或有效的。在一些实施例中，一种方法，确定预后生存个别有肺癌可以包括(a)数额确定至少一个的miRNA在肺癌组织样本个人，和(b)水平的比较在样品中的miRNA —个阈值水平， 其中的水平相比，miRNA的阈值的相关性或相关成反比的预期生存的个体。由于此处使用 “关联”是指一个低级别的miRNA的比较阈值表明低的生存机会为个别有肺癌，反之亦然。 由于此处使用“反向关联”是指高水平的miRNA的比较阈值表明成活率低，反之亦然。某些方法，并使用本文描述可以包括确定预后生存的miRNA水平的基础上相对阈值水平。一个起点水平可通过任何一个多元化的方法，但由此产生的阈值水平提供某种程度的miRNA的上述存在的第一批病人的存活率有不同的存活率第二组患者miRNA的水平低于阈值水平。阈值可以用以下方法来确定，例如，测量的miRNA水平的一个或多个非癌肺癌组织样本。一个起点水平还可以通过分析确定了各级的miRNA在一个人口的个人肺癌。这可以，例如，直方图分析，在整个队列的考验个人介绍，其中一轴代表的水平的miRNA，第二轴代表的存活率个人。两个或多个独立的个人团体可评价鉴定子人口的队列是有着相同或相似的水平的一个特定的miRNA。确定一个阈值然后可以根据miRNA的水平，最好的区分这些不同的群体，或miRNA的水平，最好的区分不同的群体。例如，一个阈值可根据平均值的 miRNA的平均水平，一批具有高存活率和平均水平的miRNA的一组存活率低。一个起点水平还可以代表水平的两个或两个以上的微RNA。两个或两个以上的微RNA可以代表，例如，该比例值为每个miRNA的水平。阈值可以是一个单一的数字，也同样适用于每个人有肺癌，或依特定亚群的个人。 例如，老年男子可能比年轻男人有不同的阈值，女人可能有高于男子不同的阈值水平。此外，阈值可以是一个级别确定的每一个人。例如，一个阈值可在一定比例的miRNA的肺癌组织中的miRNA的相对水平的非癌组织内的同一个人。核查的阈值水平区分的可能性生存肺癌患者表达低于阈值水平与患者表达上述阈值可以进行单变量或使用多变量分析。这些方法可以用来确定的可能性之间的关系的一个或多个变量和一个特定的结果。在本案中，该方法可以判断的可能性之间的相关性的miRNA水平和无病或总生存率的癌症病人。任何一个多元化的方法，众所周知，那些普通的技巧进行这些分析都可以使用。例子是单变量分析的Kaplan-Meier法和Cox回归模型。人口为基础的测定阈值水平(例如，通过直方图分析)可以进行使用队列的患者是足够的规模，以确定两个或多个独立团体的患者有不同的miRNA水平。通常情况下，这样一个队列包括，至少有25例(例如，至少有25，30，40，50，60，75，100，125，150，200，或超过 200例)。同样，一个队列核查确定阈值水平也至少有25例(例如，至少有25，30，40，50， 60，75，100，125，150，200，或超过 200 例)。此外，尽管一个单一的阈值可以单独两组患者，有几个可能存在阈值，可以单独多数人口。例如，两个不同的阈值可以第一批患者高水平的miRNA的从第二组病人的中间水平的miRNA，并从第三组病人的低层次的miRNA的。在许多不同的阈值水平就足以取缔曲线，如连续线，它可以描述的可能性，无病或整体存活率的病人作为一个功能的miRNA水平。这种曲线可以构成一个“持续的IiRNA的水平，在那里的可能性，无病或整体存活率的病人是成正比的miRNA水平。两个或两个以上的miRNA水平可以代表这样的曲线。在一些实施例中，微RNA可以结合使用，以确定此处提供的生存预后的癌症病人。 利用相结合的两个或两个以上的微RNA可以提供更多的预后意义或预后。miRNA水平还可以肺癌患者无病或整体存活率的统计学的一个指标，包括病理指标(如年龄，肿瘤大小，肿瘤组织学，临床分期，家族病史等)。例如，在临床阶段的癌症可能是一个统计学指标无病或总生存率和阈值可以根据不同的临床阶段。因此，阈值的不同的 miRNA可以作为一个功能的指标，统计无病或整体存活率。在某些情况下，卡普兰曲线分析可以用来确定存活率和miRNA的水平之间的相关性。一种方法可以包括(a)确定的水平，至少有一名的miRNA在肺癌组织中的个人， (b)分类个人属于不是第一或第二组的个人的肺癌，其中第一批的个人水平低的至少一个的miRNA被列为有一个生存的可能性增加，而第二组的个人高水平的至少一个的miRNA。在某些情况下，至少有一名的miRNA可以是hsa-miR-31。根据各级一个或多个微RNA在病人样本已被确定并比较了阈值的微RNA水平，病人可以分为有一定无病或整体存活率的可能性一组。病人无病或整体存活率的可能性可以在该组无病或整体存活率的病人基础上评估。例如，一个病人样本可确定某一特定的miRNA为低水平。病人然后可分为一组低水平的miRNA。如果已经建立患者表达水平低的miRNA可增加无病或整体存活率的可能性， 具体的癌症患者将被视为有无病或整体存活率的可能性。此处所述的方法可以进一步包括为个人确定适当的治疗过程的步骤。这些技能可能在估计早期阶段的癌症患者生存预后指标不同于估计晚期阶段的癌症患者生存预后指标。例如，I期预后可能是癌症患者面向持续增长的可能性和/或转移的癌症，而IV期预后病人可面向有效力的治疗方法治疗癌症。因此采取确定适当的治疗要把这些变数考虑进去。在某些情况下，肺癌预后的测定方法可以包括(a)确定至少一个miRNA在肺癌组织样本的水平，和(b)miRNA水平与阈值水平比较，其中的水平相比，miRNA的阈值与个人生存反向相关。至少有一名的miRNA可以是hsa-miR-31或相应的同源性。
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所述的各级微RNA变化也可能反映在微RNA基因状态(如表1和2中列出的微 RNA)。在一些实施例中，这里提供了一个确定个别有肺癌预后生存方法，其中包括分析至少有一个miRNA基因的基因状况(如编码基因的hsa-miR-31或相应同源)，与对照样本相比，表明个人相对偏高或偏低的生存机会。例如，提供了一个确定预后生存方法，其中包括分析了相应的miRNA基因hsa-miR-31的扩增，其中一个扩增的miRNA基因与照样品关联提示低存活率。在一些实施例中，提供了一个确定的生存预后方法，包括确定该miRNA基因相应hsa-miR-31的拷贝数，其中拷贝数量高在表明成活率低。本文还提供了利用探针，能够探测微RNA水平(或相应的miRNA基因)，并利用包括一个或多个探针确定预后生存。例如，利用一个或多个探针(或一个系统，包括一个或多个探针)，以确定生存的预后，其中探针能检测样品中的miRNA，miRNA的阈值水平的相关性或反向关联可预测个体的生存。一个或多个探针可用于确定预后生存，miRNA的阈值水平的相关性或反向关联可预测个体的生存，其中至少有一个miRNA是hsa-miR-31或相应的同源。在一些实施例中，提供了一个利用一个或多个探针用于制造试剂或系统确定为生存预后的个人有肺癌，其中探针能够检测样品中的miRNA，并在其中的水平相比，miRNA的阈值水平的相关性或反向关联可预测个体的生存。提供了一个利用一个或多个探针用于制造试剂或系统，以确定生存预后的个人有肺癌，其中的水平相比，miRNA的阈值水平的相关性或反向关联可预测个体的生存，其中至少有一人hsa-miR-31或相应的同源。协助医疗和专业人士研究的材料与方法该文件还提供了方法和材料，协助医疗或研究人员为确定是否一个人罹患肺癌。 医疗专业人员可以，例如，医生，护士，医疗化验师和药剂师。研究人员可以，例如，调查员， 研究技术人员，博士后研修生，本科生和研究生。专业可以协助(1)确定的水平的miRNA在肺组织样本个人，和( 沟通信息，专业水平。在miRNA水平(或地位的相应的miRNA基因)报告后，医疗专业可以采取可能会影响病人的护理一个或一个以上的行动。例如，医疗专业可以在病人的医疗纪录记录miRNA 的水平。在某些情况下，医疗专业可以记录诊断肺癌，或以其他方式改变了病人的医疗纪录，以反映患者的医疗条件。在某些情况下，专业医疗可以审查和评价病人的全部医疗记录，并评估多种治疗策略，为临床干预的病人的病情。得到病人的miRNA的水平后，医疗人员可以启动或修改治疗肺癌的资料，。在某些情况下，医疗专业可以比较以前的报告中miRNA的水平与最近通报的miRNA的水平，并建议改变治疗。在某些情况下，可以招收医学专业的病人在临床试验新的治疗来干预肺癌。在某些情况下，医疗专业可以选择等待，直到开始治疗的病人症状需要临床干预。医学人员可以与病人或病人家属就miRNA的水平(或相应的miRNA基因)沟通。 在某些情况下，医疗专业人员可以提供一个病人和/或病人家属与肺癌有关得信息，其中包括治疗方法，预后，并转介到专家，如肿瘤学家。在某些情况下，医疗专业可以为专家提供一份患者病历，与病人或病人家属就miRNA的水平(或相应的miRNA基因)沟通。研究的人员可以应用有关的miRNA的水平和/或的miRNA基因的地位信息，推动肺癌研究。例如，研究人员可以编译数据，miRNA的水平和/或的miRNA基因地位有关疗效的药物治疗肺癌的症状，以确定一种有效的治疗。在某些情况下，研究的人员能获得一个miRNA的水平来评价一个入组，或继续参与研究或临床试验。在某些情况下，研究的人员进行分类的严重性，基于一个或多个微RNA水平。在某些情况下，可以研究专业有关的题目的 miRNA的水平和/或地位的miRNA基因医学专业。在某些情况下，可以参考专业研究的主题，以医疗专业的临床评价肺癌，治疗肺癌的症状。任何适当的方法可用于将信息传达给其他人。例如，信息可以得到直接或间接地向专业人员。例如，一个实验室技术员的miRNA水平可以输入到一个基于计算机的纪录。在某些情况下，传达的信息是做出实际改变的医疗或研究记录。例如，医疗人员可以与其他医疗专业人员就医疗记录进行沟通。此外，任何类型的通信可以用来沟通信息。例如，邮件， 电子邮件，电话和面对面的互动都可以使用。这些信息还可以传递给一个专业的决策信息， 以电子方式提供的专业。例如，信息可以传达一个专业的信息给计算机上的数据库，例如， 该专业可获取信息。此外，该信息可以传达给医院，诊所，或研究机构作为代理人的医师。为改善肺癌患者生存的材料和方法本文提供使用药物改变(例如，增加或减少)的某些微RNA水平改进肺癌患者的生存的方法，包括列在表1和表2微RNA。在此处提供了任何可以增加或减少微RNA的水平的方法。例如，可以用来抑制基因表达的miRNA包括，但不仅限于，双链RNA(例如，短链或小分子干扰RNA或“RNA干扰”)，反义核酸，酶的RNA分子，如核酶，小分子化合物和蛋白质。这些可用于单独或与其他联合应用。可以减少直接的miRNA的水平(例如，通过抑制 miRNA的表达或功能)或间接(例如，通过影响的相应的miRNA基因)。改善个人肺癌生存的方法可以包括，例如，应用有效剂量降低了 miRNA的水平，与 miRNA的阈值水平相比，成反比生存的个体。miRNA的制造药物应用有效剂量降低了 miRNA 的水平，与miRNA的阈值水平相比，成反比生存的个体。在一些实施例中，应用有效剂量降低了 miRNA的水平改善个人肺癌生存，降低了水平的 miRNA 选自 hsa-miR-31，hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182，及其相应的同源。miRNA的制造药物应用有效剂量降低了 miRNA的水平，其中，miRNA选自hsa-miR-31， hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182,及其相应的同源。降低 hsa-miR-31，或降低 hsa-miR-31 结合的一个或多个 hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182 可特别有用。此处所述的方法可以进一步包括确定的生存预后的个人(例如，此处所述的方法)之前。在一些实施例中，微RNA以上水平可以减少，以改善肺癌病人生存。能做到这一点，例如，一个试剂，降低了两个或两个以上的微RNA水平。另外，两个或两个以上的试剂可以用来减少两个或两个以上的微RNA水平。例如，提供了一个方法，提高肺癌生存，包括减少至少有两个微 RNA 选自 hsa-miR-31，hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182，其相应的同源。提供利用一个或多个制造药物改善肺癌生存，其中减少至少有两个微RNA 选自 hsa-miR-31，hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182，其相应的同源。在一些实施例中，提供了提高个人肺癌生存的方法，包括减少至少有三个微RNA选自hsa-miR-31， hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182，其相应的同源。提供利用一个或多个制造药物改善肺癌生存，包括减少至少有三个微RNA选自hsa-miR-31，hsa-miR-210, hsa_miR-30a， hsa-miR-182，其相应的同源。在一些实施例中，在某些情况下，这为促进肺癌患者的存活提供了一个方法，包括个体化使用一种或多种药物的有效剂量，降低hsa-miR-31，hsa-miR-210, hsa_miR-30a，和 hsa-miR-182 的水平。在某些情况下，这为降低 hsa-miR-31，hsa-miR-210, hsa_miR-30a， 和hsa-miR-182的水平，促进肺癌患者的存活的药物生产应该使用一种还是多种成分提供了依据。在一些实施例中，在某些情况下，这里提供了一个药物组成，包括能够降低某个miRNA的水平的药剂和一种在治药学上可接受的载体，其中至少有一个miRNA是 hsa-miR-31, hsa-miR-210, hsa_miR-30a，或 hsa-miR-182。在某些情况下，至少一个 miRNA 是hsa-miR-31。在某些情况下，至少一个miRNA是hsa-miR-210。在某些情况下，至少一个 miRNA是hsa-miR-30a。在某些情况下，至少一个miRNA是hsa-miR-182。在某些情况下，此药剂可以是双链RNA(例如，短的或小干扰RNA，或“siRNA”)，核酸的反义链，或具有酶活性性的RNA分子比如核酶。促进存活的方法和药物将在此详述。存活的情况可以分为两种一种是无疾病的存活，另一种是全面存活。“无疾病存活”指的是个体诊断后没有肿瘤复发和/或发展，例如，一个肿瘤没有复发的患者。“全面存活”指的是个体诊断后的存活时间，无论其肿瘤复发与否。在某些情况下，一个特定的miRNA的表达能被诱导的针对此miRNA的RNA干扰抑制。RNA干扰是通过加入分离的与miRNA基因的一部分有至少70% (例如至少70%，75%， 80%，85%，90%，95%，98%，99%，或100%)同源性的双链RNA(dsRNA)产品来实现的。在某些情况下，这个dsRNA分子可以是“短的或小干扰RNA”或“siRNA”。可以有效用于当前这些方法的siRNA可以是10-30个核苷酸长度的短双链 RNA (例如，约12-28，14-26，16-24，或18-22核苷酸)。siRNA可以含有一条正义RNA链和一条互补配对的反义RNA链，二者按照Watson-Crick碱基互补配对原则通过退火形成双链。 正义链含有与靶标miRNA基本相同的核酸序列。siRNA的正义链和反义链可以由互补配对的两条单链RNA组成，也可以由一个分子互补配对的两个部分通过单链的“发卡”结构连在一起组成。通过一个或多个核苷酸的插入、缺失、替换和/或转换，siRNA可能与自然形成的 RNA不同。这些改变包括非核苷酸物质的加入(如加在siRNA的末端或内部)，导致siRNA 能抵抗核酶消化的修饰，或者将siRNA中的一个或多个核苷酸替换为脱氧核苷酸。在某些情况下，siRNA的一条或两条链可以包含3’突出末端。siRNA可以通过化学或生物学的方法得到，或者从重组的质粒或病毒载体表达得到，这将在下文进行阐述。一个特定的miRNA的表达也能被反义核酸抑制。在此，“反义核苷酸”指的是能够通过RNA-RAN或RNA-DNA相互作用的方式结合目标RNA，从而改变目标RNA活性的核酸分子。适用于当前方法的反义核苷酸可以是包含与miRNA毗邻序列互补的单链核酸(如RNA， DNA, RNA-DNA嵌合体，PNA和LNA)。在某些情况下，反义核酸包含与miRNA毗邻序列至少有 70% (例如至少 70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%，99%，或 100% )互补配对的核酸序列。在某些情况下，反义核酸的长度大约为10-30核苷酸(例如约12-28，14-26，16-24， 或18-22核苷酸)。反义核酸也可以包含对核酸骨架或糖和碱基(或它们的等价物)的修饰，从而增强靶标特异性、核酸酶抵抗能力、运输或其他功效相关的特征。这些修饰包括胆固醇半族， 双螺旋插入物如吖啶，或者一个或多个具有核酸酶抗性的组分。
反义核酸可以通过化学或生物学的方法得到，或者从重组的质粒或病毒载体表达得到，这将在下文进行阐述。一个特定的miRNA的表达也能被具有酶活性的核酸抑制。在此，“具有酶活性的核酸”指的是含有地物结合区域的核酸，该区域与miRNA的毗邻序列互补配对，可以特异性地剪切miRNA。在某些情况下，具有酶活性的核酸结合区域与miRNA毗邻序列有50-100%的互补性(例如75-95%互补性或95-100%互补性)。一个酶活性的核酸也可以在碱基、糖、 磷酸组分上有修饰。一个典型的可以用于当前方法的具有酶活性的核酸就是核酶。酶活性的核酸可以通过化学或生物学的方法得到，或者从重组的质粒或病毒载体表达得到，这将在下文进行阐述。当前有很多方法可以将核酸分子导入到细胞中，包括癌细胞。这些方法包括显微注射，电穿孔，脂质体转染，磷酸钙介导的转染，DEAE葡聚糖介导的转染，微粒子轰击法，通过胶态分散体运输(例如大分子复合物，凝胶颗粒，水油乳化剂，胶态离子，混合胶态离子和脂质体)，以及与抗体、短杆菌肽、人造病毒外壳或其它细胞内载体如TAT偶联。核酸药剂也可以通过文献中已知的载体导入到或体外或活体内的哺乳动物细胞中。合适的载体有病毒载体和非病毒载体，如质粒载体。这些载体在提供诸如反义RNA或 siRNA等药剂的治疗剂量上很有帮助。基于病毒的系统的优势在于能够相对高效地导入异源的核酸到各种各样的细胞中。导入核酸的合适的病毒载体有单纯疱疹病毒载体，牛痘病毒载体，细胞巨化病毒载体， 鼠莫洛尼氏白血病毒载体，腺病毒载体，腺关联病毒载体，逆转录病毒载体和慢病毒。病毒载体的趋向性可以通过使用其它病毒的包膜蛋白或表面抗原来控制。例如，腺关联病毒载体可以假借口腔小泡病毒，狂犬病毒，埃博拉病毒，Mokola等病毒的表面蛋白来假冒这些病
ο核酸或载体中可以含有任意一种可诱导的启动子或增强子，从而可以通过刺激或添加分子诱导反义RNA或siRNA的表达。这些诱导系统包括诸如四环素诱导系统，重金属诱导的金属硫蛋白启动子，蜕皮激素或相关的类固醇如鼠留酮应答的昆虫类固醇激素，类固醇如糖皮质激素和雌激素诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒，以及温度改变诱导的热激启动子。如果一个药物的剂量能够足以改变其靶标miRNA的水平(如降低)，那么这个剂量可以说是此药物的有效剂量。在某些情况下，一种药物可以将靶标miRNA的水平至少降低miRNA水平与极限水平间差异的10% (例如，至少10%，20%，30%，40%，50%，或大于 50% )0此处提供的药物(如核酸药物)的典型剂量包括0. l-3000mg/kg体重，10-2000mg/ kg体重，50-1000mg/kg体重，以及100_500mg/kg体重，但并不局限于这些范围。在某些情况下，药物(如核酸药物)的剂量是100_500mg/g肿瘤重量(例如大约20-300mg/g肿瘤重量，50-200mg/g肿瘤重量，或100-150mg/g肿瘤重量)。在此领域内一个常用的技巧可以确定给个体一种或多种药物的合适剂量。典型的给药频率包括并仅限于，至少每月一次，至少每三周一次，每两周一次，每周一次，每周两次，每周三次，每周四次，每周五次，每周六次，或每天一次，或更频繁。在某些情况下，两次给药的间距可以少于一周(例如少于每六、五、四、三、二或一天)。在某些情况下，两次给药的间距是固定的。例如，可以每天，每两天，每三天，每四天，每五天，每六天或每周给药一次。在某些情况下，可以每天给药两次，三次或更频繁。
一种药物的给药可以是长期的，诸如从大约一个月到到三年。例如一个给药体系可以长达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30或36个月。在某些情况下，在给药期间给
药不能停。在某些情况下，每两次给药的间距不能长于一周。此处描述的药物可以通过此领域内的任意途径给个体给药，包括并仅限于，静脉内，腹腔内，眼内，动脉内，肺内，口服，肺泡内，肌肉，呼吸管，皮下，脑脊髓膜内，跨皮肤，跨胸膜，局部的，吸入(如喷剂)，跨粘膜(如通过鼻粘膜)，通过肠胃，关节内，尿道内，心室内，直肠内(如通过栓剂)，阴道内(如通过阴道栓剂)，颅骨内，肝内，以及肿瘤内。在某些情况下，可以全身性的给药。在某些情况下，可以局部给药。这里还提供了由治药学尚可接受的载体和能改变(如下调)miRNA水平的试剂组成的复合药物。在某些情况下，药物复合物包含一种成分，此成分可以降低hsa-miR-210或 hsa-miR-30a或它们的同源物的水平，它可以是siRNA，反义RNA或核酶。在某些情况下，药物复合物是无菌的。在某些情况下，药物复合物是无热源的。合适的治药学上可接受的载体有水、水溶液、标准盐溶液，0.4%的盐溶液，0.3%的甘氨酸和透明质酸。药物复合物还可以包含传统的药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透性调节剂、缓冲液、PH调节剂。合适的添加剂包括，并仅限于，生理学上不排斥的缓冲液，螯合掩蔽剂(如DTPA和DTPA双酰胺)以及钙螯合复合物(如钙 DTPA和CaNaDTPA双酰胺)，钙盐或钠盐(如氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙和乳酸钙)。 药物复合物可以是液体包装也可以是冻干品。对于固体药物复合物，可以使用制药学上可接受的传统的无毒固体载体。药学上可接受的固体载体包括制药级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等等。miRNA表达水平和/或miRNA基因状况检测系统这里还提供了包含用于检测表1和表2中的miRNA的引物和探针(如寡核苷酸) 的系统(如实时定量PCR(qPCR)引物，原位杂交，或微阵列)。包含引物和/或探针的系统 (qPCR引物，原为杂交，或微阵列)可以检测相应的miRNA基因或它们的同源物的状况。这些系统在确定表1和表2中的miRNA或它们的同源物的表达水平以及肺癌评定中很有帮助。这里的一些讨论集中在miRNA的检测系统上，但是熟悉此领域的常用技巧的人很容易理解这些描述同样适用于miRNA的基因状况检测。这里提供的系统包括检测miRNA和/或检测其基因状况的引物和/或探针。这里的一些讨论集中在miRNA的检测系统上，但是熟悉此领域的常用技巧的人很容易理解这些描述大部分同样适用于包含检测基因缺失、扩增和/或miRNA基因拷贝数的变化(这里统称为miRNA的基因状况)的引物和/或探针的系统。至少检测样品中表1和表2所列的一个miRNA(或相应miRNA的基因状况)的系统(例如多引物混合物)可以包括一对或多对引物，其中每对引物可以扩增样品(如生物学样品)中的一个特定的miRNA，假设此miRNA在样品中存在的话。至少检测样品中表1和表2所列的一个miRNA(或相应miRNA的基因状况)的系统(例如定量PCR的引物、原位杂交和微阵列芯片的探针)可以包括多对引物和/或探针， 其中每对引物和/或探针可以检测肺组织样品中的一个miRNA(或相应的miRNA基因状况)，同时，至少 15% (例如至少 15%, 20%, 25%, 30%,40%, 50%,60%, 70%,80%,90%,95%，或大于95% )的引物和/或探针可以检测表1和表2所列的miRNA或它们的同源物 (或确定相应miRNA的基因状况)。在某些情况下，一对引物和/或探针可以检测肺组织样品中不同的miRNA(或相应miRNA的基因状况)。在某些情况下，用于诊断个体肺癌的系统(如微阵列)可以包括多对引物和/或探针，其中每对引物和/或探针可以检测个体样品中的一个miRNA(或相应的miRNA基因状况)，同时，至少 15% (例如至少 15%，20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%， 95%，或大于95% )的引物和/或探针可以检测表1和表2所列的miRNA或它们的同源物 (或相应miRNA的基因状况)。在某些情况下，肺癌诊断系统可以包括至少一(如一、二、 三、四或五)对引物，其中每对引物可以检测表1和表2所列的miRNA或它们的同源物，或相应miRNA的基因状况。在某些情况下，肺癌诊断系统(如微阵列)可以包括至少一(如一、二、三、四或五)种探针，其中每种探针可以检测表1和表2所列的miRNA或它们的同源物，或相应miRNA的基因状况。在某些情况下，系统中的一对引物或探针可以检测肺组不同的miRNA或不同miRNA的基因状况(例如表1和表2所列的不同miRNA或相应的同源物， 或相应的基因)。这里提供的系统(如微阵列)将在下文进行详细的阐述。这里还提供了多种系统用于肺癌诊断。例如，使用一个系统进行肺癌诊断，此系统中包括至少一(如一、二、三、四或五)对引物和/或探针(如寡核苷酸)，其中每对引物或探针可以检测表1和表2所列的miRNA或它们的同源物，或相应miRNA的基因状况。在某些情况下，系统中的一对引物或探针可以检测表1和表2所列的不同的miRNA或其对应的同源物的水平，或不同miRNA的基因水平。至少一个表1和表2中所列的miRNA或其同源物，或相应miRNA基因的表达水平的特征性变化都可能预示着肺癌。这里还提供了将系统(如用于qPCR的一对或多对引物，用于原位杂交的探针混合物，或微阵列)用于肺癌诊断的方法。这些系统由多对引物和/或探针组成，其中每对引物和/或探针可以检测样品中的不同miRNA (或相应的miRNA基因状况)，同时，至少15 % (例如至少 15%，20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，或大于 95% )的引物和/或探针可以检测表1和表2所列的miRNA或它们的同源物，或相应miRNA的基因状况。至少一个miRNA或其同源物，或相应miRNA基因的表达水平的特征性变化都可能预示着肺癌。这里还提供了运用检测miRNA的引物和探针制造系统的方法。在某些情况下，这里提供了一个将一对或多对引物或探针(如寡核苷酸)用于制造肺癌个体检测系统的方法。其中每对引物或探针可以检测表1和表2所列的一个miRNA或其对应的同源物的水平， 或不同miRNA的基因水平。在某些情况下，这里提供了一个将一对或多对引物或探针(如寡核苷酸)用于制造肺癌检测系统(如微阵列)的方法。其中每对引物或探针可以检测样品中不同的miRNA或其对应的同源物的水平，或不同miRNA的基因水平，至少15% (例如至少 15%，20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，或大于 95% )的探针可以检测表1和表2所列的miRNA或它们的同源物，或相应miRNA的基因状况。这里提供的系统可以包含两个或多个检测相同miRNA的引物。例如，在某些情况下(当系统是微阵列时)，微阵列中的探针可以是多拷贝的(可以是二、三、四、五、六、七或更多拷贝)。在某些情况下，一个系统可以包含检测相同miRNA的不同探针。例如，两个或多个引物可能结合于同一个miRNA的不同(重叠或不重叠)的区域。
能够检测miRNA水平的任意引物或探针都可以使用。在某些情况下，引物或探针可以是寡核苷酸。希望能被理解的是检测miRNA的一些序列有所变化是可以接受的。因此，寡核苷酸序列(或它们的互补序列)可能会与此处描述的miRNA序列有所不同。熟悉此领域的技术的人很容易理解序列变化并不会显著影响寡核苷酸检测miRNA的水平。例如，当用上文描述的方法比较时，同源的和改变的寡核苷酸分子可以持有相对高度的序列相同性。这里包含的寡核苷酸序列与此处描述的miRNA至少具有40% (如至少40%，50%， 60%,70%,80%,90%,95%,或大于95 % )的序列同源性。在某些情况下，寡核苷酸可以包含两部分，第一部分用来检测miRNA，而第二部分连接到基质上。在某些情况下，第二部分可能包含非特异的序列(如PolyT)来增加互补序列与基质表面间的距离。这里描述的系统中的寡核苷酸可以包含DNA、RNA、PNA、LNA、联合其中几种、和/或联合后加以修饰。寡核苷酸还可以包括修饰后的骨架。在某些情况下，寡核苷酸包括至少 9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或多于20个连续的核苷酸片段，这些片段与此处描述的miRNA序列互补或相同。一个寡核苷酸可以包含两个或多种这种互补序列。在某些情况下，寡核苷酸的5’或3’末端可以有一个活性基团(如胺)，将寡核苷酸连接到基质上。在某些情况下，一个系统可以包含一对或多对qPCR(也称为real time PCR(RT-PCR)或动力学聚合酶链式反应)的引物。qPCR可以同时对样品中特异的DNA序列进行检测和定量，定量是绝对的拷贝数或者用加入的DNA总量或其它校正基因校正后相对的量。qPCR的一个重要特征就是实时定量在扩增过程中随着循环增加的DNA产物。定量的方法包括使用插入双链DNA的荧光染料，以及当与互补DNA杂交是发荧光的修饰的DNA寡核苷酸探针。qPCR的方法在此领域内是广为人知的。在某些情况下，一个系统可以包含用于原位杂交检测组织样品中一个或多个 miRNA的一个或多个探针。对于原位杂交，一个标记的探针用于定位组织中某部分一个特异的DNA或RNA序列。细胞和组织样品可以通过处理固定目标核酸序列，从而便于与探针杂交。探针可以是标记的DAN互补链或互补RNA(核酸探针)。探针可以在较高温度下与靶标序列杂交，然后将过剩的探针清洗干净(要先用RNA酶水解，以防有未杂交的过剩RNA 探针)。通过调整溶液的参数，如温度、盐和/或去垢剂浓度，去除任何非特异结合的探针。 探针可以用放射性元素、荧光、抗原标记，从而可以通过放射自显影、荧光显微镜或免疫组织化学在组织中定位和定量。原位杂交还可以通过两种或多种标记的探针同时检测两种或多种序列。在某些情况下，一个系统可以是引物的微阵列。这里的“微阵列”和“阵列”可以交替使用，指的是包含具有未知特征的生化样品(靶标)推测的结合(如杂交)位点的阵列 (如有序的阵列)。在某些情况下，微阵列指的是特定的寡核苷酸探针集合固定在基质上确定的位置上。在某些情况下，一个微阵列可以包含多种探针，其中每种探针可以检测样品中的一个特定 miRNA，其中至少 15% (例如至少 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%，90%，95%，或大于95% )的探针可以检测表1所列的miRNA或它们的同源物。在某些情况下，这里提供了检测miRNA相应的miRNA基因状况的微阵列。检测基因状况的微阵列包含了此领域内已知的基因。例如，一个系统可以包含序列标记的分子倒置探针，用于检测基因状况。
阵列可以置于纸、玻璃、塑料(如聚丙烯、尼龙、聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺、硝化纤维、硅、光纤或其它合适的固体或半固体物质制成的基质上，形成平面(如玻璃盘子、硅芯片)或三维(如光纤、珠子、粒子、微孔、毛细管)的造型。在某些情况下，探针可以是寡核苷酸。寡核苷酸形成的阵列通过任意几种技术连在基质上。这些技术包括(i)使用照相平版印刷技术原位合成(如高密度寡核苷酸阵列)； (ii)在介质中点/印低密度探针于玻璃、尼龙或硝化纤维上；(iii)通过掩蔽和(iv)圆点印迹在尼龙或硝化纤维杂交膜上。寡核苷酸序列也可以通过磁珠或流动相如微孔或毛细管的方式与锚杂交非共价固定在基质上。有几项此领域内著名的将核酸连接到固体基质如玻片上的技术。例如，其中一个方法是将扩增的核酸混入到修饰的基质或包含能够结合固体基质的表位，如氨基、氨基衍生物或其它具有正电荷的基团，的类似物中。然后扩增产物可以与固相基质(如玻片)偶联。固相基质是经过乙醛或其它活性基团包被的，它们与扩增产物间形成共价连接，这样扩增产物就共价连在了玻片上。包含扩增产物的微阵列可以用诸如Biodot (BioDot Jnc.， Irvine,CA)点样仪和乙醛包被的玻片(CEL Associates,Houston,TX)来制作。扩增产物可以点在乙醛包被的玻片上，也可以通过报道的方法加工(Schena et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. Α. (1995)93:10614-10619)。阵列也可以通过机械手印刷在玻璃、尼龙(Ramsay, Nature Biotechnol. (1998), 16 :40-44), polypropylene (Matson et al.，Anal. Biochem. (1995) ,224(1) :110-6)及硅胶片上(Marshall and Hodgson,Nature Biotechnol. (1998)， 16 :27-31)。其它集合阵列的方式包括电动的精细微吸管(Marshall and Hodgson, supra), 和多核苷酸直接点样于正电包被的片子上。诸如使用氨基丙烷基硅表面化学之类的方法在此领域内也广为人知，如在万维网cmt. corning, com禾口 cmgm. Stanford, edu/pbrown/上有所描述。制造微阵列的方法之一是通过制造高密度的核酸阵列。所用的技术是快速多核苷酸沉积(Blanchard et al.，Biosenesors&Bioelectronics, 11 :687-690)。制造微阵列的另一个方法是使用掩蔽的方法(Maskos and Southern, Nucleic. Acids. Res. (1992),20 1679-1684)。原则上，上述的任意一种阵列(如在尼龙杂交膜上点阵)都可以使用。然而， 非常小的阵列具有独特的优势，因为其杂交体系很小，这将被此领域内的专业人员认可。试剂盒此文件还提供了用于此处描述的方法的试剂盒。在某些情况下，试剂盒包括检测 miRNA水平的系统(如qPCR的一对或多对引物，原位杂交的一个或多个探针，或微阵列)。 在某些情况下，试剂盒还可以额外包括用于检测的试剂。试剂盒还包括详细描述此处提到的操作方法的说明书，和/或提供具有此类说明的网址。在某些情况下，试剂盒包含此处描述的用于肺癌诊断的系统(如qPCR的一对或多对引物，原位杂交的一个或多个探针，或微阵列)。此外还可以包括一个或多个对照样品来决定参考水平，和/或如何得到参考水平的信息。在某些情况下，试剂盒还可以包括使用此试剂盒进行肺癌诊断的说明书。在某些情况下，试剂盒可以包含此处描述的肺癌患者的分类系统(如qPCR的一对或多对引物，原位杂交的一个或多个探针，或微阵列)。此外还可以包括一个或多个对照样品来决定个体分类，和/或关于对照样品的信息，以及在某些情况下，含有个体分类的试剂盒使用说明。在某些情况下，这里提供了为肺癌患者存活预后的试剂盒。这种试剂盒包括检测一个或多个miRNA (如表1和表2所列的一个或多个miRNA)的引物和/或探针。在某些情况下，试剂盒可以包含决定极限水平的对照样品，和/或如何获得极限水平的信息。在某些情况下，还包括用此试剂盒为患者存活预后的使用说明。在某些情况下，试剂盒可以包括改变(如降低)miRNA水平的一个或多个试剂，或包含这种试剂的药物复合物，从而促进存活。此处提到的试剂盒还可以包括一些试剂，如底物，标记物，引物，标记miRNA的试剂，分离miRNA的试剂，杂交和检测的阴性或阳性对照，管子和/或其它附件，收集组织样品的试剂，缓冲液，杂交盒，盖片等等，还有可能包含软件包(如使用此处提到的统计学方法分析miRNA水平和/或miRNA水平特征性变化)，和用于获得汇集数据库的任意一个密码和 /或用户名。在某些情况下，试剂盒可以包含改变(如降低)表1中所列的一个miRNA水平的药物复合物，及其用它促进肺癌患者存活的使用说明。在某些情况下，试剂盒还可以包括用来输送药物复合物的一个或多个载体或其它试剂。在某些情况下，试剂盒还包括药物复合物的使用说明。此发明将在以下案例中进行详述，这并不限制此发明的申请范围。案例1——miRNA水平分析样品准备病人和样品随机选取116对原发性肺癌组织与匹配的非癌肺组织。在这116例样本中，有60例是鳞状细胞癌，43例是腺癌，13例是小细胞肺癌。这些样本都来源于尚未进行治疗就进行外科手术的病人。样品在切下后用液氮速冻，并一直保存于_80°C (大于等于5年)，直到提取RNA。另外具有跟踪信息的20例肺原癌组织与匹配的非癌肺组织样本 (储存至少5年)用于独立地确认存活分析。切下的肺样品外围部分用常规的方法进行石蜡包埋，切片，然后用苏木精和曙红染色。两个病理学者对肿瘤细胞的浓度进行了评估，并对肿瘤的组织学进行了独立的确认。跟踪信息从跟踪登记处获得。所有样品都具有临床病理学信息(抽烟、年龄、性别、病理亚型、 !分类、肿瘤阶段、淋巴结阶段、分化状态和存活者术后存活时间)。 miRNA微阵列制作miRNA微阵列设计包括509条成熟的miRNA序列。其中包括来自英国剑桥 Wellcome Trust Sanger 研究所(网址 http"microrna. sanger. ac. uk)登记的435条人成熟miRNA (包括报道的122条预测miRNA序列(Xie et al.，2005))，196条大鼠成熟miRNA，261条小鼠成熟miRNA。此外，我们设计了 8条与RNA序列无同源性的寡核苷酸，并用 Ambion 的 miRNA 引物构建试剂盒(Cat. No. 1550 ；Ambion, Inc. ,Austin, TX)活体外合成了它们相应的miRNA。这些合成的miRNA作为内参以不同量在分析前加入到人miRNA 样品中。 所有的miRNA探针序列设计都与它们相应的成熟的miRNA的全长完全互补配对。 为了使探针易于固定到乙醛表面修饰的玻片上(CapitalBio Corp.，Bei jing，China)，我们将探针序列连接到40nt(3’末端miRNA加5’末端19聚polyT)的C6 5’氨基修饰基。寡核苷酸探针在MWG Biotech (Ebersberg, Germany)合成，用 EasyArray 点样液(CapitalBio Corp.)溶解,浓度 40 μ Μ。使用 SmartArray microarrayer (CapitalBio Corp.)每个探针点三个重复。
目标 RNA 标记用 Trizol 试剂(Invitrogen ；Carlsbad, CA)提取总 RNA,然后用 Ambion的miRNA分离试剂盒分离小分子量RNA。根据Hiomson的方法(Thomson etal.， 2004)用T4RNA连接酶标记法标记目标RNA。简单地说2单位T4RNA连接酶(New England Biolabs，Beijing, China)将4μ g小分子量RNA用500ng的5，-磷酸-胞嘧啶-脲嘧啶_cy3-3’ (Dharmacon ；Lafayette, CO)标记。标记反应在4°C进行2小时。标记的RNA用 0. 3M的醋酸钠和2. 5体积乙醇沉淀，乙醇清洗、空气干燥后，用含有3 X SSC，0. 2% SDS和 15%的甲醛的杂交液15 μ 1重悬标记的RNA。玻片杂交杂交在置于三阶段倾斜的混合仪BIOMIXER-(CapitalBio Corp.)中的杂交盒内，并于LIFTERSLIP-(Erie ；Portsmouth, NH)下进行，以便持续提供杂交液，从而使杂交在整个玻片表面更均勻，避免了边缘效应。在42°C水浴中进行过夜杂交。然后将阵列连续清洗两次第一次在0. 2% SDS, 2 X SSC的清洗液中42°C清洗5分钟，第二次在0. 2% SSC的清洗液中室温清洗5分钟。然后用共聚焦扫描仪LUXSCAN-对阵列进行扫描，得到的图片用LUXSCAN3. O-软件分析(都来源于CapitalBio Corp.)。数据分析对于所有的样品，每个miRNA的重复点都减去平均背景值。表达信号< 1500的点将被过滤掉。信号都使用中值法校准。差异表达的miRNA通过 SAM (Significance Analysis of Microarrays,在万维网上可以找至Ij stat. Stanford, edu/ tibs/SAM/index. html.)辨别。足够区分癌和癌旁组织的最小数量的标志性miRNA 是通过 PCA (Principal Component Analysis)禾口 SVM(Support Vector Machine)方法分析得到的。预测最显著的miRNA靶标是通过四个公开的软件分析得到的miRBaSe (网址 microrna. Sanger, ac. uk/sequences/), MIRANDA(available on the World Wide Web at microrna. org/)，TARGETSCAN(网址:targetscan. org/)，禾口 PICTAR(网址:pictar. bio. nyu.edu/)。为了减少假阳性，只有至少被三个软件预测到的靶标才计算。患者的存活曲线使用Kaplan-Meier的方法评估。协变量的共同作用使用CoxProportional Hazard Regression Model 检测。定量聚合酶链式反应分析为了验证miRNA表达谱，我们使用定量聚合酶链式反应的方法(qRT-PCR)用特异的miRNA引物对总的细胞RNA进行分析。总RNA提取，逆转录， PCR的操作如前所述。案例2——miRNA表达可以区分肺癌中的恶性组织与附近正常组织为了研究miRNA表达是否可以区分肺癌、鳞状细胞癌和腺癌中的恶性组织与附近正常组织，我们使用了 116对原发性肺癌(60例鳞状细胞癌，43例腺癌，13例小细胞肺癌)，60对鳞状细胞癌和43对腺癌样品进行研究，这些样品都有相应的邻近正常肺组织，至少距离肿瘤5厘米。组织先用液氮速冻，然后于-80°C保存至少5年。116对原发性肺癌，60对鳞状细胞癌和43对腺癌样品被随机分成训练组(66对原发性肺癌，30 对鳞状细胞癌和23对腺癌)和检验组(50对原发性肺癌，30对鳞状细胞癌和20对腺癌)。表达信号< 1500的点被过滤掉，通过SAM分析训练组的数据，以q值等于0，变化大于等于2倍的条件筛选到四个miRNA。为了建立一个分类器，我们使用了 PCA-SVM策略，并获得了取得最高分值的一组 miRNA(hsa-miR-486-5p，hsa-miR-210, hsa_miR-30a， hsa-miR-140-3p,和hsa-miR-182)这些分析在最初的训练组中的准确性如下对肺癌98. 2 %，对鳞状细胞癌93. 3 %，对腺癌97. 8% (Figures 1A，1C，和IE)。在这五个miRNA 中，三个 miRNA(hsa-miR-210，hsa_miR-30a，和 hsa-miR-182)在肿瘤中上调，两个 miRNA(hsa-miR-486-5p和hsa-miR-140-3p)下调(Table 1)。建立分类器后，检验组被用来评估策略模型。在检验组中的准确性如下对肺癌92%，对鳞状细胞癌96. 7 %，对腺癌90% (Figures IB, 1D，和IF)。总的来说，结果显示分类器可以利用少至5个标志性的miRNA有
效地将肺癌、鳞状细胞癌和腺癌的恶性组织与正常组织分开。
权利要求
1.一种诊断个体患有肺癌的方法，包括a)检测个体被怀疑有癌变的肺组织样品中至少一个miRNA的水平，b)至少将一个miRNA的水平与参考水平相比较，c)如果样品中至少有一个miRNA水平有特征性变化，则对个体是已患肺癌还是有患肺癌的倾向进行分类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于肺癌指的是小细胞肺癌，肺腺癌或肺鳞状细胞癌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于至少一个miRNA指的是hsa-miR-210， hsa-miR-30a, hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p，hsa-miR-140_3p，或相应的同源体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括至少将个体的三个miRNA的水平与参考水平相比较，其中至少三个miRNA选自于hsa-miR-210，hsa_miR-30a，hsa-miR-182, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-140_3p，或它们相应的同源体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括hsa-miR-210，hsa-miR-30a, hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p和hsa-miR-140_3p的表达水平检测，以及，如果样品显示 hsa-miR-210，hsa_miR-30a 和 hsa-miR-182 表达水平增高，同时 hsa-miR-486_5p 和 hsa-miR-140-3p表达水平降低，则对个体是已患肺癌还是有患肺癌的倾向进行分类。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于miRNA水平使用微阵列分析进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于miRNA水平决定于微阵列上miRNA的杂交信号。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于miRNA水平决定于微阵列上miRNA的杂交信号与参考样品的信号的比值。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于miRNA水平使用Northernblot，原位杂交或定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)的方法检测。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于miRNA水平决定于淋巴结样品，血液，血清或肺组织拭样中的miRNA水平。
11.辨别个体患有肺癌的一个方法包括以下步骤分析此个体肺组织样品中至少一个 miRNA基因的状况，其中肺组织是怀疑有癌变的组织，如果样品展示出该基因与对照样品对比有特征性变化，则对个体是已患肺癌还是有患肺癌的倾向进行分类。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于基因状况的改变决定于miRNA基因的缺失或扩增。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于基因状况的改变决定于miRNA基因拷贝数的变化。
14.肺癌检测的系统包括至少一对引物或众多探针，其中每对引物或每个探针可以检测样品中的一个miRNA，其中至少50 %的引物和探针可以检测以下miRNA hsa-miR-210， hsa-miR-30a, hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p，hsa-miR-140_3p 以及它们的同源体。
15.使用系统检测肺癌，系统包括至少一对引物或众多探针，其中每对引物或每个探针可以检测样品中的一个miRNA，或其相应的miRNA基因状况，其中至少50 %的引物和探针可以检测以下 miRNA :hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p， hsa-miR-140-3p以及它们的同源体，其中至少一个miRNA或其同源体的水平发生特征性变化都预示着肺癌。
16.制作肺癌检测系统至少使用一对引物或众多探针，其中每对引物或每个探针可以检测样品中一个miRNA，至少50 %的引物或探针可以检测以下miRNA hsa-miR-210， hsa-miR-30a, hsa-miR-182, hsa-miR-486_5p，hsa-miR-140_3p 以及它们的同源体。
17.对肺癌患者进行分类的方法包括检测个体肺癌组织样品中至少一个miRNA水平或相应基因的状况，然后以miRNA水平或相应基因的状况为基础对肺癌患者进行分类。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于包括检测Table1或Table 2中的 miRNA或相应的同源体的水平，然后以miRNA水平为基础决定个体肺癌的分化水平。
19.肺鳞状细胞癌存活患者预后的方法，包括a)检测个体肺组织样品中至少一个miRNA的水平，b)将miRNA的水平与极限水平相比较，c)miRNA的水平与极限水平直接或负向关联，为存活个体预后。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于至少一个miRNA是hsa-miR-31或其同源体。
21.为肺鳞状细胞癌存活个体预后的方法包括分析个体肺鳞状细胞癌样品中至少一个 miRNA基因的状况，将此miRNA基因在肺癌样品与对照样品中的状况进行比较，然后对个体存活的几率是高还是低做出评估。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于至少一个miRNA基因是编码 hsa-miR-31的基因或其同源体。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其特征在于进一步包括决定适合个体的治疗方案。
24.根据权利要求21-23任一所述的方法，其特征在于miRNA水平通过 Northernblot，原位杂交，或定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)进行检测。
25.根据权利要求21-23任一所述的方法，其特征在于miRNA水平决定于淋巴结样品， 血液，血清或肺组织拭样中的miRNA水平。
26.使用一对或多对引物或探针为肺鳞状细胞癌患者预后，其中一对或多对引物或探针可以检测样品中的miRNA，miRNA的水平与极限水平的比值与个体的存活概率正相关或负相关。
27.根据权利要求沈所述的方法，其特征在于至少一个miRNA是hsa-miR-31或其同源体。
28.使用一对或多对引物或探针制造为肺鳞状细胞癌患者预后的试剂或系统，其中一对或多对引物或探针可以检测样品中的miRNA，miRNA的水平与极限水平的比值与个体的存活概率正相关或负相关。
29.根据权利要求观所述的方法，其特征在于至少一个miRNA是hsa-miR-31或其同源体。
30.为改善肺癌患者生存状况的方法，包括给予个体有效剂量的能够降低一个miRNA 水平的试剂，其中miRNA的水平与极限水平的比值与个体的存活概率负相关。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于至少一个miRNA是hsa-miR-31或其同源体。
32.根据权利要求30所述的方法，其特征在于至少一个miRNA是hsa-miR-210， hsa-miR-30a, hsa-miR-182 或它们的同源体。
33.根据权利要求30所述的方法，其特征在于其中的试剂是反义RNA。
34.根据权利要求30所述的方法，其特征在于其中的试剂是siRNA。
35.根据权利要求30所述的方法，其特征在于包括给予个体有效剂量的能够降低至少两个miRNA水平的一种或多种试剂，其中这两个miRNA选自于hsa-miR-31，hsa-miR-210， hsa-miR-30a, hsa-miR-182 或它们的同源体。
36.根据权利要求30所述的方法，其特征在于包括给予个体有效剂量的能够降低至少三个miRNA水平的一种或多种试剂，其中这三个miRNA选自于hsa-miR-31，hsa-miR-210， hsa-miR-30a, hsa-miR-182 或它们的同源体。
37.根据权利要求30所述的方法，其特征在于包括给予个体有效剂量的能够降低 hsa-miR-31, hsa-miR-210, hsa_miR-30a，hsa-miR-182 或它们的同源体的水平的一种或多种试剂。
38.使用可以降低miRNA水平的试剂制造用来改善肺癌患者生存状况的药物，其中 miRNA的水平与极限水平的比值与个体的生存状况负相关。
39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于至少一个miRNA是hsa-miR-31或其同源体。
40.根据权利要求38所述的方法，其特征在于至少一个miRNA是hsa-miR-210， hsa-miR-30a, hsa-miR-182 或它们的同源体。
41.根据权利要求38所述的方法，其特征在于其中的试剂是反义RNA。
42.根据权利要求38所述的方法，其特征在于其中的试剂是siRNA。
43.药物复合物包括制药学上可接受的载体和降低miRNA表达水平的试剂，其中至少一个miRNA是hsa-miR-31或其同源体。
44.药物复合物包括制药学上可接受的载体和降低miRNA表达水平的试剂，其中至少一个 miRNA 是 hsa-miR-210，hsa_miR-30a，hsa-miR-182 或它们的同源体。
45.根据权利要求43或44所述的药物复合物，其特征在于试剂是反义RNA。
46.根据权利要求43或44所述的药物复合物，其特征在于试剂是siRNA。
全文摘要
本发明公开了基于特定microRNA(miRNA)的水平或基因状况的肺癌诊断与分类以及为肺癌患者预后的方法与药物复合物。药物复合物包括降低miRNA水平的试剂，还提供了将其用于促进患者存活的使用方法。
文档编号C12Q1/68GK102272330SQ200980157270
公开日2011年12月7日 申请日期2009年2月23日 优先权日2009年2月23日
发明者张亮, 程京, 谭晓刚, 赫捷, 郭永 申请人:中国医学科学院肿瘤医院, 博奥生物有限公司, 清华大学