专利名称：通过过表达琥珀酸脱氢酶增加甲硫氨酸生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过培养经修饰用于增强涉及琥珀酸脱氢酶合成的基因表达的微生物用于改善甲硫氨酸生产的工艺。将所述微生物以增加甲硫氨酸/碳源得率的方式进行修饰。还请求保护从发酵培养基中分离甲硫氨酸。
现有技术琥拍酸脱氢酶(琥拍酸氧化还原酶 ，SQR)是克雷伯氏循环(Krebs cycle)和需氧呼吸链二者的功能成员。SQR催化细菌细胞质中琥珀酸盐至延胡索酸盐的氧化，具有泛醌在膜中的伴随还原。在大肠杆菌(E. coli)和其他细菌中，该酶包含4个亚基。2个疏水亚基SdhC和SdhD将2个亲水和催化亚基SdhA和SdhB锚定至内膜表面。5种独特辅因子涉及琥珀酸盐至延胡索酸盐的氧化。在SdhA中，存在共价附着的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)分子，以通过氢化物转移机制催化琥珀酸盐氧化。电子随后个别地通过电子转移亚基(SdhB)进行转移，所述SdhB含有[2Fe-2S]、[4Fe_4S]和[3Fe_4S]簇。醌结合位点由来自SdhC、SdhD和SdhB的残基形成，允许泛醌还原成泛醇(ubiquinole)。该酶还含有夹在SdhC和SdhD之间的血红素b分子,其不是酶功能必需的(Yankovskaya等人2003, Science 299,700 ；Cheng 等人 2008Biochemistry 47,6107)。氨基酸L-甲硫氨酸是以大量(600000t/an)生产的重要饲料添加剂。生产专一地依赖于化学生物合成，并且需要原油衍生的前体。随着对这些不可再生资源价格越来越大的压力，可持续性工艺得到越来越多的注意。甲硫氨酸的发酵生产因此已成为该化学工艺在经济上可行的替代者。通过发酵进行的甲硫氨酸生产需要几个前体提供途径的修饰。3个主要途径促成甲硫氨酸生物合成。天冬氨酸盐充当碳骨架的前体，半胱氨酸充当硫供体，并且亚甲基-THF充当末端甲基的供体。此外，天冬氨酸盐衍生的高丝氨酸通过琥珀酰-CoA的活化是甲硫氨酸生物合成中的第一个步骤所需的。琥珀酰-CoA在克雷伯氏循环中生产，并且因此克雷伯氏循环酶的表达增加可以增加甲硫氨酸生产。然而高克雷伯氏循环活性已显示为氨基酸生产的缺点，并且减少克雷伯氏循环酶例如异柠檬酸脱氢酶的活性对于氨基酸生产可以是有利的(W02007017710Metabolic Explorer, W02009133063Evonik Industries)。WO 2009078973 (Glycos Biotechnology)和 EP 1106684(Evonik Industries)公开了 sdh基因的缺失增加氨基酸和工业上感兴趣的其他代谢产物的生产。根据这种技术应当理解减少sdh基因的表达将降低克雷伯氏循环活性并因此降低C02生产，这继而又应对产物得率具有正面影响。存在增加由可再生碳源生产的甲硫氨酸得率的需要。与现有技术的教导(琥珀酸脱氢酶的活性减少增加产物得率)相反，发现琥珀酸脱氢酶的表达增加增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。发明概述本发明涉及用于在发酵工艺中增加甲硫氨酸生产的方法，其包括步骤在包含碳源和硫源的合适培养基中培养经修饰用于甲硫氨酸的改善生产的微生物，和从所述培养基中回收甲硫氨酸，其中所述微生物通过增强编码琥珀酸脱氢酶(Sdh)的一种或多种基因的表达来进一步修饰。这一种或多种基因的表达是通过将编码琥珀酸脱氢酶的所述基因的至少一个补充性拷贝插入微生物内增强的。在本发明的另一个实施方案中，进一步从培养基中分离甲硫氨酸。本发明还涉及通过过表达琥珀酸脱 氢酶而对于甲硫氨酸生产最佳化的微生物，优选肠杆菌科(enterobacteriaceae)、棒状杆菌形细菌(coryneform bacteria)、酵母或真菌。在本发明的工艺中使用的这种微生物允许增加的甲硫氨酸/碳源得率增加。发明详述生产甲硫氨酸的微生物本发明涉及通过培养经修饰的微生物用于在发酵过程中生产甲硫氨酸的方法。根据本发明，术语“培养”、‘发酵’或‘发酵过程/工艺’可互换使用，以指示在含有简单碳源的合适生长培养基上的细菌生长。这种简单碳源通过微生物代谢用于生产甲硫氨酸。本发明的另一个目的是用于在此类用于在发酵过程中生产甲硫氨酸的方法中使用的经修饰的微生物。根据本发明，术语“微生物”指示细菌、酵母或真菌。优选地，细菌选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的菌种。在最优选的实施方案中，细菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。本发明的微生物优选包含编码sdh酶的一种或多种内源基因。术语“经修饰用于甲硫氨酸的改善生产的微生物”指示这样的微生物，与未经修饰的微生物相比较，其经过遗传修饰用于改善通过代谢简单碳源进行的甲硫氨酸生产。此类修饰可以对应于涉及甲硫氨酸生物合成途径的基因的增强的、受调节的或减少的表达。本领域技术人员知道如何调节特定基因的表达。通常的修饰包括用遗传元件转化微生物，包括基因替换、启动子的修饰、和用于表达异源或内源基因的载体的引入。根据本发明经修饰的微生物通过增强编码琥珀酸脱氢酶的亚基之一的至少一种基因的表达加以修饰。优选地，编码琥珀酸脱氢酶的不同亚基的所有基因都是过表达的。琥珀酸脱氢酶一般是含有至少3个亚基的酶复合物。每个亚基由一种基因编码。例如，棒状杆菌属菌种含有编码琥拍酸脱氢酶的3种基因sdhA、sdhB和sdhC (Bussmann等人,2009,J. Biotechnol, 143 (3) , 173),而其他微生物例如大肠杆菌或酿酒酵母(S. cerevisiae)具有用于4个琥珀酸脱氢酶亚基的4种基因。这些sdh基因被组织在操纵子中。术语操纵子描述转录单位，其中几个基因在多顺反子信使RNA中转录(关于sdhA的大肠杆菌登记号P0AC41, sdhB P07014, sdhC P69054, sdhD P0AC44)。术语“增强”或‘增强的’或‘过表达的’或‘增加的表达’、‘增强的表达’或‘过
表达’在正文中可互换使用且具有相似含义。在这个背景中，这些术语描述由相应DNA编码的酶促活性的细胞内活性中的增加，例如通过增加基因的拷贝数，使用更强的启动子或使用具有增加活性的等位基因且可能地组合这些手段。这些启动子可以是诱导型的；它们可以是同源或异源的。本领域技术人员知道哪些启动子是最方便的，例如启动子Ptrc、Ptac、Plac (Dickson 等人，1975, Science 187 (4171), 27 ；de Boer 等人，1983, Proc NatlAcad SciU S A，80 (I)，21 ;Brosius 等人，1985，J Biol Chem，260 (6)，3539)或入启动子cl(Ptashne M,1986,Blackwell Scientific,Cambridge,MA ；Ptashne M,2004,Cold SpringHarbor Lab Press ；Little J,2004,Richard Calendar, ed. Oxford University Press)是广泛使用的。当基因被组织在操纵子中时，通过加入在单个启动子的控制下的这些基因的一个补充性拷贝可以增强其表达。表达还可以通过用强于野生型启动子的人工启动子替换染色体野生型启动子得到增强。本领域专家知道如何测定启动子强度。为了增加基因的表达，它可以是染色体 (chromosomalIy)或染色体外(extrachromosomalIy)编码的。基因的拷贝可以是染色体或染色体外加入的。在染色体方面(chromosomally)，可以存在在基因组上的一个或几个额外拷贝，其可以通过本领域技术人员已知的重组方法引入。基因在染色体外方面可以通过不同类型的质粒或细菌人工染色体携带，其就其复制起点而言不同且因此其在细胞中的拷贝数不同。它们可以作为1-5个拷贝、约20个或高达500个拷贝存在，对应于具有紧密复制的低拷贝数质粒(例如pSClOl、RK2)、低拷贝数质粒(例如pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(例如pSKBluescript II)。在本发明的一个优选实施方案中，sdh基因可以是使用染色体外表达过表达的。在本发明的这个实施方案中，sdh基因由细菌人工染色体携带。酶的表达可以通过稳定或去稳定相应信使RNA的元件(Carrier和Keasling,1998,Biotechnol. Prog. 15,58)或蛋白质(例如 GST 标签,Amersham Biosciences)得到加强或减少。根据本发明，微生物含有基因的一个或几个等位基因，其有待根据本发明增强。优选地，根据本发明，微生物携带编码琥珀酸脱氢酶的基因的一个补充性拷贝。在本发明的一个优选实施方案中，这些基因在细菌人工染色体PCC1BAC中克隆。在本发明的另一个实施方案中，微生物含有大肠杆菌的4种基因sdhA、sdhB、sdhC和sdhD的一个补充性拷贝。在所述补充性拷贝中的基因可以被组织在操纵子中。在本发明的一个特定实施方案中，微生物包含编码大肠杆菌的琥珀酸脱氢酶的基因的至少一个额外拷贝。在本发明的描述中，基因和蛋白质使用相应基因在大肠杆菌中的命名进行鉴定。然而，且除非另有说明，这些命名的使用根据本发明具有更一般的含义，且覆盖在其他生物更具体而言微生物中的所有相应基因和蛋白质。PFAM(比对和隐马尔可夫模型(hidden Markov models)的蛋白质家族数据库；http: //www. sanRer. ac. uk/Software/Pfam/)代表蛋白质序列比对的大集合。每个PFAM使得能够显现多重比对，看见蛋白质结构域，评价在多种生物中的分布，获得对于其他数据库的访问，且显现已知蛋白质结构。COGs (蛋白质的肓向同源物组的簾http://www. ncbi. nlm. nih. rov/COG/)通过比较来自代表30个主要种系发生系的66个完全测序基因组的蛋白质序列获得。每个COG由至少3个系进行定义，其允许鉴定以前保守的结构域。鉴定同源序列及其同源性百分比的方法是本领域技术人员众所周知的，并且特别包括BLAST 程序，其可以由网站http://www. ncbi. nlm. nih. rov/BLAST/使用，使用在那个网站上指示的缺省参数。获得的序列随后可以使用例如程序CLUSTALW(http://www. ebi.ac. uk/clustalw/)或 MULTALIN(http://prodes. toulouse.
inra. fr/multalin/ cgi-bin/multalin. pi)加以利用(例如比对)，使用在那个网站上指示
的缺省参数。使用在GenBank上对于已知基因给出的参考，本领域技术人员能够测定其他生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等价基因。这个常规工作有利地使用共有序列完成，所述共有序列可以这样测定与衍生自其他微生物的基因执行序列比对，并且设计简并探针以克隆另一种生物中的相应基因。分子生物学的这些常规方法是本领域技术人员众所周知的，并且例如在Sambrook等人(1989Molecular Cloning a LaboratoryManual.第 2 版 Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, New York.)中声明。根据本发明经修饰的微生物可以进一步包含其他修饰以增强甲硫氨酸生产。优选地，本发明的微生物另外包含编码sdh酶的一种或多种基因的增强表达，增强甲硫氨酸生产的另外修饰。用于增加甲硫氨酸生产的修饰是本领域众所周知的。这些修饰例如在引入本文作为参考的W02009/043803、W02007/077041、W02005/111202中描述。为了改善甲硫氨酸的生产，微生物可以显示出选自下组的至少一种基因的表达增加 cysP，其编码周质硫酸盐结合蛋白，如W02009/043803中描述的， cysU，其编码硫酸盐ABC转运蛋白的组分，如W02009/043803中描述的， cysW，其编码膜结合的硫酸盐转运蛋白，如W02009/043803中描述的， cysA，其编码硫酸通透酶，如W02009/043803中描述的，*cysM,其编码 0-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(0-acetyl serine sulfhydralase),如W02009/043803 中描述的，*cysl和cysj，分别编码亚硫酸还原酶的a和0亚基，如W02009/043803中描述的。优选地，cysl和cysj是一起过表达的， cysl，其编码亚硫酸还原酶，a亚基，如W02009/043803中描述的， cysH,其编码腺苷酰硫酸还原酶，如W02009/043803中描述的， cysE，其编码丝氨酸酰基转移酶，如W02007/077041中描述的， gcvT，其编码四氢叶酸依赖性氨甲基转移酶，如W02009/043803中描述的， gcvH，其通过编码氨乙基的载体涉及甘氨酸切割，如W02009/043803中描述的， gcvP，其编码甘氨酸脱氢酶，如W02009/043803中描述的， Ipd,其编码硫辛酰胺脱氢酶，如W02009/043803中描述的， serA，其编码磷酸甘油酸脱氢酶，如专利申请W02009/043803中描述的， serB，其编码磷酸丝氨酸磷酸化酶，如专利申请W02009/043803中描述的， serC，其编码磷酸丝氨酸氨基转移酶，如专利申请W02009/043803中描述的， glyA，其编码丝氨酸羟甲基转移酶，如W02009/043803中描述的， metF，其编码5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶，如W02007/077041中描述的， metA等位基因，其编码高丝氨酸琥珀酰转移酶，对于S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有减少的反馈敏感性，如W02005/111202中描述的， thrA或thrA等位基因，其编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶，对于苏氨酸具有减少的反馈抑制，如W02009/043803中描述的，
metH,其编码B12依赖性高半胱氨酸_N5_甲基四氢叶酸转甲基酶，如W02007/077041 中描述的。在本发明的另一个实施方案中，微生 物可以显示出下述基因中的至少一种的表达的抑制 pykA，其编码丙酮酸激酶，如W02009/043803中描述的， pykF，其编码丙酮酸激酶，如W02009/043803中描述的， purU，其编码甲酰四氢叶酸脱甲酰酶，如W02009/043803中描述的， metJ，其编码甲硫氨酸阻遏物，如JP 2000/157267中描述的。在本发明的另一个实施方案中，可以使用编码具有经修饰的反馈抑制性质的酶的下述经修饰的基因-metA突变体，其编码对于甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸具有减少的反馈敏感性的酶，如W02005108561中描述的 thrA突变体，对于苏氨酸具有减少的反馈敏感性，如W02005108561中描述的。根据本发明，微生物可以通过使用改变的metB等位基因进一步修饰用于增加甲硫氨酸生产，所述metB等位基因优选或专一地使用H2S用于自0-琥拍酰高丝氨酸生产高半胱氨酸，如引入本文作为参考的专利申请W02004/076659中描述的。上文公开的涉及甲硫氨酸生产的所有专利和专利申请引入本文作为参考。术语减弱的表达、阻遏的表达或减弱、抑制在正文中可互换使用，并且具有相似含义。在这个背景中，该术语指示基因表达的部分或完全抑制，则称其是“减弱的”。这种表达抑制可以是基因表达的抑制、基因表达所需的启动子区全部或部分的缺失、基因编码区中的缺失、或野生型启动子由更弱的天然或合成启动子的交换。优选地，基因的减弱基本上是那种基因的完全缺失，其可以由选择标记基因替换，所述选择标记基因促进菌株的鉴定、分离和纯化。在本发明的一个具体实施方案中，经修饰的微生物过表达选自下组的至少一种基因cysP> cysU、cysff> cysA、cysM、cysj、cysl、cysH、cysE、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、glyA、metF、metA (具有减少的反馈敏感性)、thrA 和 metH。在本发明的另一个实施方案中，经修饰的微生物具有选自由pykA、pykF、metj和purU组成的组中的至少一种基因的减弱表达。在本发明的另一个实施方案中，经修饰的微生物过表达选自下组的至少一种基因cysP> cysU、cysff> cysA、cysM、cysj、cysl、cysH、cysE、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、glyA、metF、metA(具有减少的反馈敏感性)、thrA(优选具有减少的反馈敏感性)和metH,并且阻遏选自由pykA、pykF、metJ和purU组成的组中的至少一种基因。在本发明的一个优选实施方案中，微生物过表达基因cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysj、cysl、cysH、cysE gcvT、gcvH、gcvP、metF met A (具有减少的反馈敏感性)、thrA(优选具有减少的反馈敏感性)和metH.、serA、serB、serC、glyA,并且阻遏基因pykA、pykF、met J 和 purU。本领域技术人员将知道其他基因可能需要修饰，以最佳化甲硫氨酸生产。这些基因已在引入本文作为参考的W02007/077041和W02007/020295中特别加以鉴定。培养基
在本发明的方法中，将经修饰的微生物在包含碳源和硫源的合适培养基中进行培养。‘合适培养基’是适合于微生物培养和生长的培养基。此类培养基是微生物发酵领域技术人员众所周知的，取决于待培养的微生物。根据本发明，术语‘碳源’指示可 以由本领域技术人员使用以支持微生物的正常生长的任何碳的来源，其可以是己糖(例如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、二糖、寡糖(例如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、糖蜜、淀粉或其衍生物、半纤维素、甘油及其组合。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一种优选的简单碳源是蔗糖。用于L-甲硫氨酸的发酵生产的硫源可以是下述中的任何硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐、甲硫醇、二甲基二硫化物或其组合。在本发明的一个优选实施方案中，硫源是硫酸盐和/或硫代硫酸盐。氮源可以是铵盐或氨气。甲硫氨酸的改善生产在本发明中，甲硫氨酸/碳源得率通过增强编码琥珀酸脱氢酶的基因表达得到增力口。术语“甲硫氨酸/碳源得率”定义在发酵过程中获得的甲硫氨酸数量除以已消耗的碳源数量。它可以以百分比g甲硫氨酸/g碳源或mol甲硫氨酸/mol碳源表示。术语“增强的”在这个背景中描述与不含指定修饰的微生物和/或不含修饰的培养基相比较可测量的增加。在优选的实施方案中，增加是至少l%g/g、优选至少2%g/g、更优选4%。为了测量这种增加，必须测定消耗的葡萄糖和生产的甲硫氨酸的量。通过折射HPLC(refractrometric HPLC)或根据用于分批补料溶液的白利糖度(Brix)法,通过测定在生长培养基中的葡萄糖浓度计算已消耗的碳源的数量。对于分批培养物，消耗的葡萄糖对应于从其中扣除在实验结束时残留葡萄糖的量的在实验开始时残留葡萄糖的量。对于分批补料发酵，消耗的葡萄糖的量对应于分批培养物中的葡萄糖、接种物中加入的葡萄糖和在分批补料阶段过程中注入的葡萄糖的量的总和，从其中扣除在实验结束时残留葡萄糖的量。术语“获得的甲硫氨酸”包括L-甲硫氨酸和可容易回收的甲硫氨酸衍生物NAM。在培养基中获得的甲硫氨酸的数量在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC进行测量，使用L-甲硫氨酸(Fluka，Ref 64319)作为标准。NAM的量使用折射HPLC进行测定，使用NAM(Sigma，Ref01310)作为标准。甲硫氨酸回收在发酵后，回收且最终纯化L-甲硫氨酸、其前体或其衍生的化合物例如N-乙酰甲硫氨酸。用于回收且纯化所生产化合物的方法对于技术人员是众所周知的。(W02005/007862,WO 2005/059155)。
实施例实施例I :MG1655metA*l lPtrc-metH PtrcF-cysPUffAMPtrcF-cys JIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36_ARNmstI7-metF DmetJ DpykF DpykADpurU(pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll)(pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC)和 MG1655metA*llPtrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmstI7-metF DmetJ DpykF DpykADpurU(pME101-thrA*I-cysE-PgapA-metA*11)(pCClBAC-serB-glyA-serA-serC)甲硫氨酸生产菌种已在引入本文作为参 考的专利申请W02009043803、W02007/077041 和 PCT/FR2009/052520 中描述。I.载体 pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC 的构建为了增加在甲硫氨酸生产菌株中琥珀酸脱氢酶SdhCDAB的水平，4种基因sdhCDAB 与其自身启动子一起在拷贝控制载体pCC lBAC-serB-glyA-serA-serC(具有来自Epicentre的pCClBAC载体)先前在专利申请W02009043803中描述)中克隆。为了这个目的，使用寡核苷酸sdhCDAB-F和sdhCDAB-IT02-R (在网站http//ecogene.org/ h的参考序列)，从MG1655大肠杆菌基因组中扩增sdhCDAB_TT02区域，具有作为大肠杆菌的rrnB基因的T1转录终止子的TT02 (Orosz等人，1991, Eur. J. Biochem. 201,653)。将所得到的PCR产物克隆到pSCB载体(Stratagene)中，通过测序加以验证，并且将载体命名为 pSCB-sdhCDAB-TT02。sdhCDAB-FatgcgtGCATGCatctGGCGCCGAATTGGTCAATACTTCCACACTGTTAC具有-含额外碱基的区域(小写情况)，-具有SphI和SfoI位点的区域(大写加下划线的情况)，-与sdhCDAB区域(从753931到753958)同源的区域(大写粗体情况)sdhCDAB-TT02-RaagcgctGCATGCAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGTTTACGCATTACGTTGCAACAACATCG具有-含额外碱基的区域(小写情况)，-具有SphI位点的区域(大写加下划线的情况)，-关于TT02序列的区域(大写斜体情况)，所述TT02序列对应于大肠杆菌的rrnB基因的T1转录终止子序列，-与sdhCDAB区域(从757603到757629)同源的区域(大写粗体情况)。为了将sdhCDAB_TT02基因转移到载体pCClBAC中，用酶SphI限制性切割载体pSCB-sdhCDAB-TT02，并且将sdhCDAB_TT02区域克隆到受相同酶限制性切割的载体pCClBAC-serB-glyA-serA-serC 内。将所得到的载体命名为 pCC lBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA—serA—serC。2 .菌株 MG1655metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF A metJ A pykF DpykA A purU(pME101-thrA*I-cy sE-P gapA-me tA*11)(pCClBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC)的构建随后，通过电穿孔将质粒pME101-thrA*l-cysE-PgapA-metA*ll (先前在专利申请 TO2007/077041 和 PCT/FR2009/052520 中描述)和 pCClBAC-sdhCDAB-IT02-serB-glyA-serA-serC 引入菌株 MG1655 metA*l lPtrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF A metJ A pykF DpykA A purU,得到菌株MG1655metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmstl7-metF AmetJ A pykF DpykA A purU(pMElOl-thrA^l-cysE-PgapA-metA*ll) (pCC lBAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC)。3.菌株 M GI 6 5 5 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmstl7-merF Ametj ApykF DpykA A purU (pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll) (pCClBAC-serB-glyA-serA-serC)的构建
通过电穿孔将质粒pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll (先前在专利申请W02007/077041 和 PCT/FR2009/052520 中描述)和 pCC lBAC-serB-glyA-serA-serC(先前在专利申请 W02009043803 中描述)引入菌株 MG1655 metA*lIPtrcietH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst 17-metF AmetJ ApykFDpykA ApurU，得到菌株 MG1655 metA*llPtrc_metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmstl7_metF AmetJ A pykF DpykA A purU(pME101-thr A*l-cysE-PgapA_metA*ll)(pCC IBAC-serB-glyA-serA-serC)。实施例2.菌株的评价菌株I M G I 6 5 5 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmstI7-metF DmetJ DpykF DpykADpurU(pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll)(pCC lBAC-sdhCDAB-TT02-serB-TT07-glyA-serA-serC) o菌株 2 M G I 6 5 5 metA^l lPtrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmstl7-metF DmetJ DpykF DpykADpurU(pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll)(pCClBAC-serB-glyA-serA-serC)。生产菌株在小锥形瓶中进行评价。将5. 5mL预培养物在37°C在混合培养基(具有2. 5g. L—1葡萄糖的10%LB培养基(Sigma 25%)和90%基本培养基PC I)中生长16小时。将它用于接种50mL培养物至在培养基PCl中0.2的0D6。。。如果需要的话，将壮观霉素和卡那霉素加入至50mg. L—1的终浓度和氯霉素至30mg. L—1的终浓度。培养物的温度是37°C。当培养物已达到5 - 7的0D_时，在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC定量细胞外氨基酸，并且使用HPLC伴随折射计检测(有机酸和葡萄糖)和在硅烷基化之后的GC-MS，来分析其他相关代谢产物。对于每种菌株，进行3次重复。表I :基本培养基组成(PCl)。
化合物浓度(g. L'1)^
ZnSO4. 7H200. 0040
CuCl2. 2H200. 0020
MnSO4. H2O0. 0200
CoCl2. 6H200. 0080
权利要求
1.一种用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸的方法，其包括下述步骤 -在包含碳源和硫源的合适培养基中培养经修饰用于甲硫氨酸的改善生产的微生物，和 -从所述培养基中回收甲硫氨酸， 其中所述微生物通过增强编码琥珀酸脱氢酶的基因的表达来进一步修饰。
2.权利要求I的方法，其中所述琥珀酸脱氢酶包含至少三个亚基，每个亚基由一种基因编码，所述基因各自的表达是增强的。
3.权利要求I或2的方法，其中所述编码琥珀酸脱氢酶的基因的增强表达是通过将所 述基因的至少一个补充性拷贝插入所述微生物内实现的。
4.权利要求I-3的方法，其中所述sdh基因的增强表达是通过将大肠杆菌的四种基因sdhA、sdhB、sdhC和sdhD的至少一个补充性拷贝插入所述微生物内实现的。
5.权利要求I- 4的方法，其中所述培养基中的所述硫源是硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐或所述不同来源的组合。
6.权利要求I- 5的方法，其中所述碳源是葡萄糖或蔗糖。
7.权利要求I- 6的方法，其包括从所述培养基中分离甲硫氨酸的步骤。
8.权利要求I- 7的方法，其中所述微生物选自由细菌、酵母和真菌组成的组。
9.一种经修饰用于在合适培养基中甲硫氨酸的改善生产的微生物，其中所述微生物通过增强编码琥珀酸脱氢酶的基因的表达来进一步修饰。
10.权利要求9的微生物，其中所述琥珀酸脱氢酶包含至少三个亚基，每个亚基由一种基因编码，所述基因各自的表达是增强的。
11.权利要求9或10的微生物，其中所述编码琥珀酸脱氢酶的基因的增强表达是通过将所述基因的至少一个补充性拷贝插入所述微生物内实现的。
12.权利要求11的微生物，其中所述sdh基因的增强表达是通过将大肠杆菌的四种基因sdhA、sdhB、sdhC和sdhD的至少一个补充性拷贝插入所述微生物内实现的。
13.权利要求12的微生物，其包含来自大肠杆菌的sdh操纵子的另外拷贝。
14.权利要求8- 13中任一项的微生物，其中所述微生物是选自下组的细菌肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和棒状杆菌形细菌(Coryneform bacteria)。
15.权利要求14的微生物，其中所述微生物选自由大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌(C. glutamicum)组成的组。
全文摘要
本发明涉及通过培养经修饰用于增强涉及琥珀酸脱氢酶合成的基因表达的微生物用于改善甲硫氨酸生产的工艺。微生物以增加甲硫氨酸/碳源得率的方式进行修饰。还请求保护从发酵培养基中分离甲硫氨酸。
文档编号C12P13/12GK102712941SQ200980163237
公开日2012年10月3日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者R.菲格 申请人:代谢探索者公司