专利名称：一种检测dna碱基突变的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测DNA中是否存在碱基突变的方法。
背景技术：
近年来，DNA碱基错配受到了大家的广泛关注，研究表明，人类基因大约含有109个 碱基对。对DNA的物理和化学破坏都有可能导致DNA在复制过程中产生碱基错配或误配， 虽然生物体自身存在强大的修复系统用于修复错配，但是仍有部分错配未被修复。由于一 个碱基突变都有可能引发致命的癌症以及基因相关疾病，所以对于DNA碱基错配的检测对 于临床诊断，基因表达分析和治疗以及生物医药研究都具有重要的意义。目前已有多种方法可用于DNA碱基错配的检测，其中大部分是基于DNA错配会对 DNA双螺旋的稳定性产生较大影响的原理，利用寡核苷酸的特异性杂交来检测DNA碱基错 配。基于上述原理的方法具有原理简单的优点，但存在步骤繁琐、成本较高、灵敏度低的缺 点，而且由于非特异性杂交的影响，导致上述方法选择性降低，很难实现单个碱基突变的检 测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测DNA中是否存在碱基突变的方法。本发明提供的检测DNA中是否存在碱基突变的方法，依次包括以下步骤1)用荧光素标记单链多核苷酸M ；所述M与待测DNA的正常序列完全互补且可以 形成G-四聚体结构；2)使荧光素标记的M形成G-四聚体结构；3)将形成G-四聚体结构的M和溴乙锭混合，加入待测DNA和下述式(I)的化合 物、同时设置加入由待测DNA的正常序列组成的DNA片段和下述式(I)的化合物的对照体 系，按照如下方法确定待测DNA是否存在突变若待测DNA反应体系的1_ /1422 小于等于 对照体系的1. 5士0. 08，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的“。-/、^等于对 照体系的2. 0士0. 07，待测DNA不存在碱基突变；所述为发射波长为600nm的发射峰 的荧光强度；所述I422nm为发射波长为422nm的发射峰的荧光强度；
式(I)中 所述式(I)中，m= 6、n = 6、队=H、R2 = H、R3 = H、R4 = H、R5 = CH3、R6 = Br。所述式(I)中，m= 6、n = 6、^ = H、R2 = H、R3 = H、R4 = H、R5 = CH2CH3、R6 = I。本发明提供的检测DNA中是否存在碱基突变的方法，还可依次包括以下步骤1)制备单链多核苷酸D1，所述D1与待测DNA的正常序列完全互补；2)制备单链多核苷酸D2，用荧光素标记序列D2 ；所述D2能形成发卡DNA，茎环与 D1完全互补，茎干与D1至少有6nt不互补，且茎干区含有限制性内切酶的酶切位点；3)将D1和D2混合，再加入待测DNA，然后加入与D2茎干区的酶切位点相应的限 制性内切酶，再加入下述式(I)的化合物；同时设置用待测DNA的正常序列组成的DNA片段 取代待测DNA的体系作为对照；按照如下方法确定待测DNA是否存在突变若待测DNA反应体系的I424nm/I527nm小 于等于对照体系的2. 57 士0. 05，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的I424nm/I527nm 于对照体系的3. 8士0. 11，待测DNA不存在碱基突变；所述I424nm为发射波长为424nm的发 射峰的荧光强度；所述I527nm为发射波长为527nm的发射峰的荧光强度； 式(I)中，m= 1 10，n = 2 100 ；礼，民，民，礼=CXH2X+1 或 _0(CXH2X+1)，x = 1 10 ;R5 = CXH2X+1, x = 1 3 ;R6 = Br、CI、I、CF3C00 或 CH3C00。所述式(I)中，
所述式(I)中，m= 6、n = 6、队=H、R2 = H、R3 = H、R4 = H、R5 = CH2CH3、R6 = I。本发明提供的检测DNA中是否存在碱基突变的方法，还可依次包括以下步骤1)制备单链多核苷酸K1，所述K1与待测DNA的正常序列完全互补；2)制备单链多核苷酸K2，所述K2的中间部分具有脱氧核酶活性(其中活性部分 的序列为5，-AGGCTAGCTACAACGA-3，)，K2与K1至少有15nt完全互补，且包含有至少10nt 的脱氧核酶(DNAzyme)序列，K2与K1头尾至少各有6nt不互补；3)制备脱氧核酶底物S，用荧光素标记S ；底物S的DNA部分与K2完全互补，底物 S中间有包含两个特异的RNA碱基的酶切位点；4)将K1和K2混合，然后加入底物S，加入待测DNA和下述式(I)的化合物，同时 设置加入由待测DNA的正常序列组成的DNA片段和下述式(I)的化合物的对照体系，按照 如下方法确定待测DNA是否存在突变若待测DNA反应体系的I424nm/I527nm小于等于对照体 系的1. 595士0. 06，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的I424nm/I527nm等于对照体 系的3. 08士0. 1，待测DNA不存在碱基突变；所述I424nm为发射波长为424nm的发射峰的荧 式(I)中，m= 1 10，n = 2 100 ；礼，民，民，礼=CXH2X+1 或 _0(CXH2X+1)，x = 1 10 ;R5 = CXH2X+1, x = 1 3 ;R6 = Br、CI、I、CF3C00 或 CH3C00。所述式(I)中，m= 6、n = 6、队=H、R2 = H、R3 = H、R4 = H、R5 = CH3、R6 = Br。所述式(I)中，m= 6、n = 6、^ = H、R2 = H、R3 = H、R4 = H、R5 = CH2CH3、R6 = I。本发明提供的方法克服了现有的检测DNA碱基突变方法步骤繁琐、成本较高、灵 敏度低和选择性低等缺点，具有简单、经济、灵敏度高且可靠的优点。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为使用G-四聚体DNA检测碱基突变的结果图。图2为使用发卡结构DNA检测碱基突变的结果图。图3为使用脱氧核酶DNA检测碱基突变的结果图。
具体实施例方式本发明是通过如下的技术方案实现的
首先，合成聚2，7-[9，9_ 二(6，-N，N，N-三甲基溴化胺)己烷-芴]-共_(1， 4-苯)(PFP)。按照参考文献(Stork,M. ；Gaylord, B. S. ；Heeger, A. J. ；Bazan, G. C. Adv. Mater. 2002，14，361-366.)合成上述式(I)的阳离子发光共轭聚合物，命名为PFP。PFP是 一种新型的荧光探针，与小分子的荧光探针相比，它具有高度共轭的分子结构，由许多重复 单元组成，这种结构导致它具有荧光放大的效果，可以高灵敏的检测到光学信号从而大大 提高检测灵敏度。PFP的最大吸收值为380nm，最大发射峰在427nm。依据F6rster能量转
移理论，在一定距离条件下它可以和荧光素发生能量转移(最大吸收峰为480nm，最大发射 峰为527nm)。荧光素被标记在寡核苷酸上，带正电荷的PFP和带负电荷的寡核苷酸通过静 电相互作用形成复合物。PFP和标记的荧光素的距离被拉近，从而能量转移发生。由于DNA 结构或长度变化对电荷密度影响，静电作用强度发生变化从而造成能量转移效率的变化。然后，利用PFP和寡聚核苷酸通过静电相互作用形成复合物后和标记的染料发生 能量转移以及DNA的构象变化来检测DNA中的碱基突变。DNA具有多种构象，其中比较常见的有双螺旋结构，另外还有三螺旋结构和特殊的 G-四聚体，发卡式结构等。本发明提供了三种检测方法，方法一主要是基于DNA的G-四聚体 结构到双链的转化影响了从PFP到荧光素再到溴乙锭(EB)的双重能量转移；方法二主要是 利用发卡结构DNA (beacon)的保护和释放，通过加入目标DNA驱动DNA发生交换，从而释放 出限制性内切酶的发卡结构的底物DNA，底物被酶切后变成短链的荧光素片段降低能量转 移效率，由于碱基突变阻碍交换，所以通过能量转移来检测DNA酶切和交换可以检测到DNA 的碱基突变；方法三主要是基于脱氧核酶(DNAzyme)的保护和释放，通过加入目标DNA驱 动DNA发生交换，释放出脱氧核酶对标记有荧光素的底物S进行酶切，底物被酶切后变成短 链的荧光素片段降低能量转移效率，由于碱基突变阻碍交换，所以通过能量转移来检测DNA 酶切和交换可以检测到DNA的碱基突变。结果证明，以上的三种方法对于DNA的碱基突变 检测具有简单、经济、灵敏度高而且可靠的优点。本发明提供的三种方法，具体如下方法一、利用G-四聚体结构DNA和PFP检测DNA中的碱基突变本方法主要基于DNA的G-四聚体结构到双链的转化。DNA的G_四聚体结构是一 类特殊的构象。一些富含碱基G的DNA在钾离子或凝血酶存在时可以被诱导形成G-四聚 体结构。1)合成 PFP。2)设计并制备G-四聚体DNA序列M。设计一段DNA序列M，M可以形成G_四聚体结构且与待测DNA的正常序列完全互 补，在M的末端(5’或3’ )标记荧光素。3)检测待测DNA中的碱基突变。①将荧光素标记的M和PFP、EB混合，加入钾离子或凝血酶DNA，M形成G_四聚体结构。②加入待测DNA序列，得到反应体系；同时，在步骤①的混合溶液中，加入与待测 DNA等量的正常序列，作为对照体系。对于不含有碱基突变的DNA(即与M完全互补)，G-四 聚体被破坏，双链结构形成，EB嵌入dsDNA ；对于含有碱基突变的DNA(即不能与M完全互补)，突变的碱基会大大影响G-四聚体和双链DNA的平衡。③lOmin后，在380nm激发下得到激发光谱。对于不含有碱基突变的DNA，会发生 从PFP到荧光素再到EB的双重能量转移；对于含有碱基突变的DNA，从PFP到荧光素再到 EB的能量转移效率降低，随着突变碱基数的增加，从PFP到荧光素再到EB的能量转移效率 降低幅度增加。所以，若待测DNA反应体系的U^/Im 小于等于对照体系的1. 5士0. 08， 待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的I6(l(lmi/I422nm等于对照体系的2. 0 士0. 07，待 测DNA不存在碱基突变。为发射波长为600nm的发射峰的荧光强度；I422nm为发射波长 为422nm的发射峰的荧光强度。此方法中，双链DNA嵌入剂溴乙锭(EB)被引入。EB的最大吸收峰在520nm，最大 发射峰为610nm。当加入钾离子或凝血酶DNA形成G-四聚体结构，DNA的电荷密度增大，造 成PFP和荧光素之间的很高的能量转移效率，但由于EB分子不能嵌入到G-四聚体中，所以 不能观察到从荧光素到EB的能量转移。而当与G-四聚体序列互补的DNA加入后，G-四聚 体被破坏而双链结构形成。EB嵌入dsDNA后就会发生从PFP到荧光素再到EB的双重能量 转移。DNA的碱基突变会大大影响G-四聚体和双链DNA的平衡，通过观察被放大的EB的荧 光强度就可以检测DNA的碱基突变。利用此方法可以实现DNA中碱基突变的检测，而且可 被检测的最低DNA浓度可达到50nM。因此，本方法可以实现高灵敏度和高选择性检测DNA 中的碱基突变。方法二、利用发卡结构DNA和PFP检测DNA中的碱基突变主要是利用发卡结构DNA (beacon)的保护和释放。发卡结构DNA —般含有25 35个核苷酸，含有两部分(1)环区为单链状态，一般由10 30个核苷酸组成，用于与目 标DNA特异结合；(2)茎干区为双链结构，用于稳定发卡结构。稳定的发卡结构DNA—般 茎干区碱基对的数目应大于8个。1)合成 PFP。2)设计并制备DNA序列D1和D2。设计两段DNA序列D1和D2，D1与待测DNA的正常序列完全互补；D2为发卡DNA， 且在茎干区含有限制性内切酶的酶切位点，D2的茎环与D1完全互补，D2的茎干与D1至少 有6nt不互补，用荧光素标记D2 ；3)检测待测DNA中的碱基突变。①将D1和D2混合，破坏D2的发卡结构，形成稳定的dsDNA。②加入待测DNA，同时，在步骤1的混合溶液中，加入与待测DNA等量的正常序列， 作为对照体系。再加入与D2茎干区的酶切位点相应的限制性内切酶。对于不含有碱基突 变的DNA，则与D2发生交换而形成D1和待测DNA的dsDNA，D2被释放，重新形成发卡结构， 产生酶切位点，D2的茎干从酶切位点被切断，释放出带有荧光素的短链DNA片段；对于含有 碱基突变的DNA，DNA之间的交换能量禁阻，D2的酶切位点被D1保护。③加入PFP，在380nm激发下得到激发光谱。对于不含有碱基突变的DNA，由于 短链DNA片段的电荷密度较小，PFP和荧光素之间只有弱的能量转移；对于含有碱基突变 的DNA，PFP和荧光素之间发生较强的能量转移，随着突变碱基数的增加I424nm/I527nm逐渐降 低，能量转移效率逐渐增大。所以，若待测DNA反应体系的I424mi/I527nm小于等于对照体系的 2. 57士0. 05，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的I424nm/I527nm等于对照体系的3. 80士0. 11，待测DNA不存在碱基突变；所述I424nm为发射波长为424nm的发射峰的荧光强 度；所述I527nm为发射波长为527nm的发射峰的荧光强度。利用此方法可以实现高灵敏度和高选择性检测DNA中的碱基突变。目标DNA的最 低检测浓度可以达到75nM。另外此方法还具有很好的普适性，可以检测多个序列的DNA。方法三、利用脱氧核酶(DNAzyme)和PFP检测DNA中的碱基突变主要是基于脱氧核酶的保护和释放。脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一 种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段。本方法中主要选用的是具有RNA切 割活性的脱氧核酶。1)合成 PFP。2)设计并制备DNA序列K1和K2。设计两段DNA序列K1和K2，K1与待测DNA的正常序列完全互补；K2的中间部分 具有脱氧核酶活性(其中活性部分的序列为5’ -AGGCTAGCTACAACGA-3’)，K2与K1至少有 15nt完全互补，且包含有至少10nt的脱氧核酶(DNAzyme)序列，K2与K1头尾至少各有6nt 不互补；3)设计脱氧核酶底物S，底物S的DNA部分与K2完全互补，底物S中间有包含两 个特异的RNA碱基的酶切位点，用荧光素标记S ；4)检测待测DNA中的碱基突变。①将K1和K2混合，形成部分双链，头尾各有小部分的核苷酸不匹配。②加入底物S，再加入待测DNA、同时在步骤1的混合溶液中加入与待测DNA等量 的正常序列作为对照体系，37°C反应。对于不含有突变碱基的DNA，则与K2发生交换而形成 K1和待测DNA的dsDNA，K2被释放，与底物S结合，底物S被酶切释放出标记有荧光素的短 链DNA ；对于含有突变碱基的DNA，DNA之间的交换能量禁阻，从而不能释放脱氧核酶K2，底 物S不能被切除。③加入PFP，在380nm激发下得到激发光谱。对于不含有突变碱基的DNA，只能观 察到弱的能量转移；对于含有碱基突变的DNA，可以观察到强的能量转移。所以，若待测DNA 反应体系的I424nm/I527nm小于等于对照体系的1.595士0. 06，待测DNA存在碱基突变；若待 测DNA反应体系的I424nm/I527nm等于对照体系的3. 08 士0. 1，待测DNA不存在碱基突变；所述 1424 为发射波长为424nm的发射峰的荧光强度；所述I527nm为发射波长为527nm的发射峰 的荧光强度。利用此方法同样可以实现高灵敏度和高选择性检测DNA中的碱基突变。目标DNA 的最低检测浓度可以达到20nM。此方法对目标DNA的序列也没有严格的限制，而且操作更 加方便、简单。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所有的标记和未标记的寡聚核苷酸都由上海生工生物工程技术服务有限公司以 及宝生物工程(大连)有限公司合成。本发明使用的紫外光谱仪型号为Jasco V-550型。荧光光谱仪的型号为Hitachi F-4500，激发光源为氙灯。所用的荧光比色皿为3mL的一次性聚苯乙烯比色皿。实验中所 用的水都需经过Millipore纯化系统过滤。本发明中的寡聚核苷酸的浓度都是通过检测260nm处的吸收值得到的。
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实施例1、应用PFP和G-四聚体检测DNA中的碱基突变一、PFP1 的合成
式(II)PFP1的结构如式(II)所示，合成方法如下向100mL的单口瓶加入50mL甲苯、5. 2克新戊二醇和0. 5克对甲苯磺酸，回流24 小时，蒸除溶剂后硅胶柱分离(洗脱剂二氯甲烷)后得到4.8克1，4_苯二硼酸新戊二酯。
NMR (400MHz, CDC13) 6 (ppm) 7. 78 (4H, s)，3. 77 (8H, s)，1. 02(12H, s)。向25mL的二口瓶中加入5. 4mL甲苯和3. 6mL 2M碳酸钾，鼓入氮气30分钟后，加 入325毫克2，7-二溴-9，9-二(6-溴己基)芴，165毫克1，4-苯二硼酸新戊二酯和20毫 克四(三苯基膦)钯，于氮气下95°C搅拌反应24小时，冷却后加入氯仿和水，取氯仿层水洗 后用无水硫酸镁干燥，旋蒸浓缩，丙酮沉淀，得到210毫克浅黄色固体。将固体溶于20毫升 二氯甲烷，加入1毫升三甲胺于室温搅拌24小时后离心，收集沉淀并干燥，得到208毫克聚 合物 PFPl，Mn = 3. 5X104。NMR(400MHz, DMSO) 8 (ppm) 7. 3-8. 0 (10H，m)，2. 9-3. 2 (16H， m)，2. 2-2. 3 (4H, m)，1. 5-1. 6 (4H, m)，0. 9-1. 2 (30H, m)。二、待测样本的制备合成DNA序列如下序列1 (无碱基突变 DNA 序列 ssDNAc) :5，-CCCTAACCCTAACCCTAACCC-3，；序列2 (单碱基突变 DNA 序列 SSDNA1nc) :5，-CCCTAACCCTAACACTAACCC-3，；序列3 (三个碱基突变 DNA 序列 ssDNA3NC) :5，-CCCAAACCCAAACCCAAACCC-3，；序列4 (六个基突变 DNA 序列 ssDNA6NC) :5，-CCCAATCCCAATCCCAATCCC-3，。三、检测序列的碱基突变1)设计序列M，用荧光素标记M。序列M 5，-FAM-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3，。2)在1900 u L离子强度为50mM的磷酸缓冲溶液(pH = 7. 4)中加入100 u L浓度 为1M的KC1，使KC1的终浓度为50mM。3)将在4°C诱导的荧光素标记的M加入步骤2)得到的溶液中，至终浓度为 [G-quadruplex-Fl] = 5. OX 1(T8M。4)将PFP和EB加入步骤3)得到的溶液中，至终浓度为[PFP] = 1. 25 X 10_6M，重 复单元浓度；[EB] = 1. 5X 10_6M。5)在步骤4)得到的溶液中加入待测DNA，制备反应液，分如下两种情况①反应液A 在步骤4)得到的溶液中加入序列1所示的DNA，至终浓度为[ssDNAc] =5.0X10_8M，即为对照体系甲。②反应液B 在步骤4)得到的溶液中加入序列2所示的DNA，至终浓度为[ssDNA1nc] = 5. 0X10_8M。③反应液C:在步骤4)得到的溶液中加入序列3所示的DNA，至终浓度为 [ssDNA3nc] = 5. 0X1(T8M。④反应液D 在步骤4)得到的溶液中加入序列4所示的DNA，至终浓度为 [ssDNA6nc] = 5.0X1(T8M。⑤反应液E 步骤4)得到的溶液，作为对照乙。6)荧光光谱的测定lOmin后，分别取10 y L步骤5)得到的两种反应液，在380nm激发下得到激发光谱进行3次重复试验，图中的数据和结果均为平均值。图1为使用G-四聚体DNA检测碱基突变的结果图；la为反应液A和反应液E的 荧光光谱，实线为反应液A，虚线为反应液E ；lb为反应液A、B、C和D的FRET效率柱状图， [ssDNAc] = [ssDNA擺]=[ssDNA3nc] = [ssDNA6NC] = 5.0X1(T8M。由图可见，反应液E只能观察到PFP和荧光素的荧光而不能观察到EB的荧光；反 应液A出现了 EB的发射峰，发生了从PFP到荧光素再到EB的双重能量转移，且1_ /1422 =1.6士0. 08 ；反应液B出现从PFP到荧光素再到EB的能量转移，1_ /1422 = 1.2士0. 07， 效率比反应液A降低了 25%;反应液C出现从PFP到荧光素再到EB的能量转移，I600nm/I422nm =0. 8 士 0. 06，效率比反应液A降低了 50% ；反应液D出现从PFP到荧光素再到EB的能量 转移，16。。《/1422 = 0.8士0. 04，效率比反应液A降低了 50%。实施例2、利用PFP和G-四聚体检测DNA中的碱基突变一、PFP2 的合成 PFP2的结构如式(III)所示，合成方法如下向lOOmL的单口瓶加入50mL甲苯、5. 2克新戊二醇和0. 5克对甲苯磺酸，回流24 小时，蒸除溶剂后硅胶柱分离(洗脱剂二氯甲烷)后得到4.8克1，4_苯二硼酸新戊二酯。
NMR (400MHz, CDC13) 6 (ppm) 7. 78 (4H, s)，3. 77 (8H, s)，1. 02(12H, s)。向50mL的单口瓶加入lOmL干燥的四氢呋喃和0. 65克2，7-二溴芴(郑州太平洋 化源公司)，低温冷却至_78°C后加入2mL 2M 丁基锂溶液(Alfa Aesar公司)低温搅拌1小 时，加入1.0克1，6_ 二碘己烷(北京偶合公司)于室温反应过夜，结束反应。向反应液加入 10mL水和15mL氯仿，分液，有机层经水洗、无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂，硅胶柱分离(石油 醚/乙酸乙酯20/l，v/v)得到0.8克2，7-二溴-9，9-二(6-碘己基)芴。咕NMR(400MHz, CDC13) 6 (ppm) 7. 82 (d, 2H)，7. 42 (m, 4H)，3. 39 (m, 4H)，2. 06 (m, 4H)，1. 67 (m, 4H)，1. 22 (m, 8H)，0. 69 (m, 4H)。向25mL的二口瓶中加入6mL四氢呋喃和3mL 2M碳酸钠，鼓入氮气30分钟后，加入390毫克2，7- 二溴-9，9- 二(6-碘己基)芴，182毫克1，4_苯二硼酸新戊酯和23毫克 四(三苯基膦)钯，于氮气下80°C搅拌反应48小时，冷却后加入氯仿和水，取氯仿层水洗 后用无水硫酸镁干燥，旋蒸浓缩，丙酮沉淀，得到230毫克浅黄色固体。将固体溶于25毫升 二氯甲烷，加入1毫升33%三甲胺醇溶液于室温搅拌24小时后离心，收集沉淀并干燥，得 到 222 毫克聚合物 PFP2, Mn = 4. 1 X 104。'HNMR (400MHz, DMSO) 8 (ppm) 7. 1-8. 0 (10H, m)， 3. 2 (4H, m)，3. 1 (12H, m)，2. 1 (4H, m)，1. 2 (16H, m)。二、待测样本的制备合成DNA序列如下序列5 (无碱基突变 DNA 序列 ssDNAc) :5，-CCAACCACACCAACC-3，；序列6 (单碱基突变 DNA 序列 ssDNA1nc) :5，-CCTACCACACCAACC-3，三、检测序列的单碱基突变1)设计序列M，用荧光素标记M。序列M 5，-FAM-GGTTGGTGTGGTTGG-3，。2)在1900 u L离子强度为50mM的磷酸缓冲溶液(pH = 7. 4)中加入100 u L浓度 为1M的KC1，使KC1的终浓度为50mM。3)将在4°C诱导的荧光素标记的M加入步骤2)得到的溶液中，至终浓度为 [G-quadruplex-Fl] = 5. OX 1(T8M。4)将PFP和EB加入步骤3)得到的溶液中，至终浓度为[PFP] = 1. 25X 10_6M，重 复单元浓度；[EB] = 1. 5X 10_6M。5)在步骤4)得到的溶液中加入待测DNA，制备反应液，分如下两种情况①反应液A 在步骤4)得到的溶液中加入序列5所示的DNA，至终浓度为[ssDNAc] =5. OX 10_8M，作为对照体系甲。②反应液B 在步骤4)得到的溶液中加入序列6所示的DNA，至终浓度为[ssDNAj =5. 0X1(T8M。③反应液C 步骤4)得到的溶液，作为对照乙。6)荧光光谱的测定lOmin后，分别取10 y L步骤5)得到的两种反应液，在380nm激发下得到激发光
■；並进行3次重复试验，结果数据为平均值。反应液C只能观察到PFP和荧光素的荧光而不能观察到EB的荧光；反应液A 出现了 EB的发射峰，发生了从PFP到荧光素再到EB的双重能量转移，且I6(l(lmi/I422nm = 1. 86士0. 05 ；反应液B出现从PFP到荧光素再到EB的能量转移，I600mi/I422nm = 1. 56士0. 08， 效率比反应液A降低了 16%。实施例3、利用发卡结构DNA和PFP检测DNA中的碱基突变一、PFP 的合成同实施例1的步骤一。二、待测样本的制备合成DNA序列如下序列7 (无碱基突变DNA序列Tc)
5， -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATAATGTCAC-3，；序列8 (单碱基突变DNA序列T1NC)5， -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATAATATCAC-3’ ；
序列9 (2个碱基突变DNA序列T2NC)5， -GATTGCGTAAAGAAGGTATGAGATAATATCAC-3，序列10 (3个碱基突变DNA序列T3NC)5， -GATTGCGTAAAGAAGGTATGAGACAATATCAC-3，；序列11 (5个碱基突变DNA序列T5NC)5 ’ -GATTACGGAAAGTAGGTCTGAGATCATGCCAC-3’。三、检测序列的碱基突变1)设计D1和D2，用荧光素标记D2，D1和D2的序列如下D1 :5，-GTGACATTATCTCATACCTTCTTTCCGCAATCGGA-3，；D2 5 ’ -FAM-CTGGCCTCCGATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATCGGAGGCCAG-3’。2)将 7. 5iiL 的 Dl(lOiiM)和 5. 0 y L 的 D2 (10 y M) 80°C杂化 20min 后降至室温得 到双链结构。3)制备反应液反应液A 将2. 5uL的限制酶缓冲液，1. 5ii L的限制酶内切酶Haelll (lOunit/ U L) (NEB 公司),7. 5uL 序列 7 的 DNA (10 ii M)禾口 1. 0 ii L 的 Millipore 水一同加入于 37 °C 反应50min，即为对照体系甲。反应液B 将2. 5uL的限制酶缓冲液，1. 5ii L的限制酶内切酶Haelll (lOunit/ U L) (NEB 公司),7. 5u L 序列 8 的 DNA (10 ii M)禾口 1. 0 ii L 的 Millipore 水一同加入于 37 °C 反应50min。反应液C 将2. 5ii L的限制酶缓冲液，1.5UL的限制酶内切酶Haelll (lOunit/ U L) (NEB 公司),7. 5uL 序列 9 的 DNA (10 ii M)禾口 1. 0 ii L 的 Millipore 水一同加入于 37 °C 反应50min。反应液D 将2. 5uL的限制酶缓冲液，1. 5ii L的限制酶内切酶Haelll (lOunit/ U L) (NEB 公司)，7. 5 i! L 序列 10 的 DNA(10 ii M)禾口 1. 0 ii L 的 Millipore 水一同加入于 37°C 反应50min。反应液E 将2. 5uL的限制酶缓冲液，1. 5ii L的限制酶内切酶Haelll (lOunit/ U L) (NEB 公司)，7. 5 i! L 序列 11 的 DNA(10 ii M)禾口 1. 0 ii L 的 Millipore 水一同加入于 37°C 反应50min。反应液F 将2. 5uL的限制酶缓冲液，1. 5ii L的限制酶内切酶Haelll (lOunit/ U L) (NEB公司)和1. Oil L的Millipore水一同加入于37°C反应50min，作为对照乙。反应液G 将2. 5 ii L的限制酶缓冲液，7. 5uL序列7的DNA(10 y M)禾口 1. 0 y L的 Millipore水一同加入于37°C反应50min，作为对照丙。4)荧光光谱的测定分别取10 uL步骤3)得到的四种反应液，分别加入到2. OmL的HEPEs缓冲液(含 HEPEs 25mM,pH = 8. 0)中，分别加入1. 5 y L的PFP (2X 10_3M)后，在380nm下激发，检测荧
光光谱。
进行重复试验三次，图中的数据和结果均为3次试验的平均值。图2为使用发卡结构DNA检测碱基突变的结果图；2a为反应液A、B、F、G的荧光 光谱；2b 为反应液 A、B、C、D 和 E 的 FRET 效率柱状图。[Tc] = [T1NC] = [T2NC]] = [T3NC]]= [T5NC]] = 15nM。结果表明，反应液G的I424nm/I527nm约为0. 42 士 0. 05 (平均值士标准差)；反应液 A 的 I424nm/I527nm 约为 1. 597 士0. 107 ；反应液 B 的 I424nm/I527nm 约为 1. 08 士0. 046，比反应液 A 降低了 32% ；反应液C的I424mi/I527nm约为0. 69 士0. 046，比反应液A降低了 57% ；反应液 D 的 I424nm/I527nm 约为 0. 503 ±0. 006，比反应液 A 降低了 69% ；反应液 E 的 I424nm/I527nm 约为 0. 46士0.01，比反应液A降低了 72%。实施例4、利用发卡结构DNA和PFP检测DNA中的碱基突变一、PFP2 的合成同实施例2的步骤一。二、待测样本的制备合成DNA序列如下序列12 (无碱基突变DNA序列Tc)5， -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATAATGTCAC-3，；序列13 (单碱基突变DNA序列T1NC)5 ’ -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATATTGTCAC-3’。三、检测序列12和序列13的单碱基突变1)设计D1和D2，用荧光素标记D2，D1和D2的序列如下D1 :5，-GTGACATTATCTCATA CCTTCTTTCCGCAATCGGA-3，；D2 5 ’ -FAM-CTGGCCTCCGATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATCGGAGGCCAG-3’。2)将 7. 5iiL 的 Dl(lOiiM)和 5. 0 y L 的 D2 (10 y M) 80°C杂化 20min 后降至室温得 到双链结构。3)制备反应液反应液A 将2. 5ii L的限制酶缓冲液，1. 5ii L的限制酶内切酶Haelll (lOunit/ U L) (NEB 公司)，7. 5 i! L 序列 12 的 DNA (10 ii M)禾口 1. 0 ii L 的 Millipore 水一同加入于 37°C 反应50min，即为对照体系甲。反应液B 将2. 5uL的限制酶缓冲液，1. 5ii L的限制酶内切酶Haelll (lOunit/ U L) (NEB 公司)，7. 5 i! L 序列 13 的 DNA (10 ii M)禾口 1. 0 ii L 的 Mi] lipore 水一同加入于 37°C 反应50min。反应液C 将2. 5 ii L的限制酶缓冲液，1.5UL的限制酶内切酶Haelll (lOunit/ U L) (NEB公司)和1. Oil L的Millipore水一同加入于37°C反应50min，作为对照乙。4)荧光光谱的测定分别取10 UL步骤1得到的三种反应液，分别加入到2. OmL的HEPEs缓冲液(含 HEPEs 25mM,pH = 8. 0)中，分别加入1. 5 y L的PFP (2X 10_3M)后，在380nm下激发，检测荧
光光谱。进行重复试验三次，数据结果为3次试验的平均值。反应液C 的 I424nm/I527nm 约为 0. 45士0. 04 ；反应液 A 的 I424nm/I527nm 约为 1. 65士0. 08 ；反应液B的I424nm/I527nm约为1. 12士0. 045，比反应液A降低了 32%。结果表明，反应液A的 能量转移效率比对照的转移效率降低达3倍。随着突变碱基数的增加I424nm/I527nm逐渐降低， 能量转移效率逐渐增大。对于单碱基突变的DNA可以观察到非常明显的变化。实施例5、利用脱氧核酶和PFP检测DNA中的碱基突变一、PFP1 的合成同实施例1的步骤一。二、待测样本的制备合成DNA序列如下序列14 (无碱基突变 DNA 序列 Mc) :5，-CGGTGAAGCTACAACGAGAGC-3，；序列15 (单碱基突变 DNA 序列 M1NC) :5，-CGTTGAAGCTACAACGAGAGC-3，；序列16 (2 个碱基突变 DNA 序列 M2NC) :5，-CGTTGAAGCAACAACGAGAGC-3，；序列17 (3 个碱基突变 DNA 序列 M3NC) :5，-CGGAGAAGCTTCAACGTGAGC-3，；序列18 (5 个碱基突变 DNA 序列 M5NC) :5，-CGGAGAAGCTTGAGCGAGTGC-3，。三、检测序列的碱基突变1)设计K1和K2，K1和K2的序列如下K1 :5，-GCTCTCGTTGTAGCTTCACCG-3，；K2 :5， -TACAGCTAATAGGCTAGCTACAACGAGAGC-3，。设计底物S，用荧光素标记S，S的序列如下5，-FAM-GCTCrArUATTAGCTGTA-3 。2) 2. 0 ii L 的 K1 (10 y M)和 2. 0 y L 的 K2 (10 y M)在 80°C杂化 20min 后降至室温得 到双链结构。3)制备反应液反应液A 将双链DNA加入到lmL的HEPEs缓冲溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7. 5)中，然后加入0. 5iiL的底物S(10iiM)禾口 2. 0 y L序列14的DNA (10 y M)，即为对 照体系甲。反应液B 将双链DNA加入到lmL的HEPEs缓冲溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7.5)中，然后加入 0. 5ii L 的底物 S(10iiM)禾口 2. 0 y L 序列 15 的 DNA(lOiiM)。反应液C 将双链DNA加入到lmL的HEPEs缓冲溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7.5)中，然后加入 0. 5ii L 的底物 S(10iiM)禾口 2. 0 y L 序列 16 的 DNA(lOiiM)。反应液D 将双链DNA加入到lmL的HEPEs缓冲溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7.5)中，然后加入 0. 5iiL 的底物 S(10iiM)禾口 2. 0 y L 序列 17 的 DNA(lOiiM)。反应液E 将双链DNA加入到lmL的HEPEs缓冲溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7.5)中，然后加入 0. 5ii L 的底物 S(10iiM)禾口 2. 0 y L 序列 18 的 DNA(lOiiM)。反应液F 将双链DNA加入到lmL的HEPEs缓冲溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7.5)中，然后加入0. 5iiL的底物S(10iiM)，作为对照乙。4)荧光光谱的测定将上一步的溶液在37°C诱导lh，加入10iiL的PFP(0. ImM)和3. 0 y L的K1 (10 y M，
为了去除非特异性相互作用)后在380nm下激发得到荧光光谱。进行重复试验三次，图中的数据和结果均为3次试验的平均值。
图2为使用脱氧核酶DNA检测碱基突变的结果图；3a为反应液A、B和F的荧光 光谱；3b 为反应液 A、B、C、D 和 E 的 FRET 效率柱状图，[Mc] = [M1NC] = [M2NC]] = [M3NC]]= [M5NC]] = 20nM。结果表明，反应液F 的 I424nm/I527nm = 0. 6士0. 10，反应液 A 的 I424nm/I527nm = 1. 847 士0. 121 ；反应液 B 的 I424nm/I527nm = 0. 957 士0. 035 ；反应液 C 的 I424nm/I527nm = 0. 78 士 0. 07 ；反应液 D 的 I424nm/I527nm = 0. 71 士 0. 04 ；反应液 E 的 I424nm/I527nm = 0. 67 士 0. 04， 可以观察到非常明显的变化。随着突变碱基数的增加I424rai/I527nm逐渐降低，能量转移效率 逐渐增大。实施例6、利用脱氧核酶和PFP检测单碱基突变一、PFP2 的合成同实施例2的步骤一。二、待测样本的制备合成DNA序列如下序列19 (无碱基突变 DNA 序列 Mc) :5，-CGGTGAAGCTACAACGAGAGC-3，；序列20 (单碱基突变 DNA 序列 M1NC) :5，-CGGTGTAGCTACAACGAGAGC-3，。三、检测序列的单碱基突变1)设计K1和K2，K1和K2的序列如下K1 :5，-GCTCTCGTTGTAGCTTCACCG-3，；K2 :5， -TACAGCTAATAGGCTAGCTACAACGAGAGC-3，。设计底物S，用荧光素标记S，S的序列如下5， -FAM-GCTCrArUATTAGCTGTA-3，。2) 2. 0 ii L 的 K1 (10 y M)和 2. 0 y L 的 K2 (10 y M)在 80°C杂化 20min 后降至室温得 到双链结构。3)制备反应液反应液A 将双链DNA加入到lmL的HEPEs缓冲溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7. 5)中，然后加入0. 5iiL的底物S(10iiM)禾口 2. 0 y L序列19的DNA (10 y M)，即为对 照体系甲。反应液B 将双链DNA加入到lmL的HEPEs缓冲溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7.5)中，然后加入 0. 5ii L 的底物 S(10iiM)禾口 2. 0 y L 序列 20 的 DNA(lOiiM)。反应液C 将双链DNA加入到lmL的HEPEs缓冲溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7.5)中，然后加入0. 5iiL的底物S(10iiM)，作为对照乙。4)荧光光谱的测定将上一步的溶液在37°C诱导 lh，加入 10iiL 的 PFP(0. ImM)和 3. 0 ii L 的 K1 (10 ii M，
为了去除非特异性相互作用)后在380nm下激发得到荧光光谱。进行重复试验三次，数据结果为3次试验的平均值。结果表明，对照乙的I424nm/I527nm = 0. 58士0. 08 ；反应液 A 的 I424nm/I527nm = 1.95士0. 12 ；反应液B的I424nm/I527nm = 1.02士0.08，比反应液A降低了 48%。可以观察到 非常明显的变化。随着突变碱基数的增加142411111/152711111逐渐降低，能量转移效率逐渐增大。序列表
15
<110>中国科学院化学研究所<120> 一种检测DNA碱基突变的方法<130>CGGNARZ102004<160>20<210>1<211 >21<212>DNA<213>人工序列<400>1ccctaaccct aaccctaacc c 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2ccctaaccct aacactaacc c 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3cccaaaccca aacccaaacc c 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4cccaatccca atcccaatcc c 21<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>5ccaaccacac caacc 15<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>6
16cctaccacac caacc 15
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gattgcggaa agaaggtatg agataatgtc ac 32
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gattgcggaa agaaggtatg agataatatc ac 32
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gattgcgtaa agaaggtatg agataatatc ac 32
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
gattgcgtaa agaaggtatg agacaatatc ac 32 <210>11 <211>32 <212>DNA <213>人工序列 <400>11
gattacggaa agtaggtctg agatcatgcc ac 32
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
gattgcggaa agaaggtatg agataatgtc ac 32
<210>13
<211>32
<212>DNA<213>人工序列<400>13gattgcggaa agaaggtatg agatattgtc ac 32<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>14cggtgaagct acaacgagag c 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>15cgttgaagct acaacgagag c 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16cgttgaagca acaacgagag c 21<210>17<211 >21<212>DNA<213>人工序列<400>17cggagaagct tcaacgtgag c 21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>18cggagaagct tgagcgagtg c 21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>19
cggtgaagct acaacgagag c
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
cggtgtagct acaacgagag c
权利要求
一种检测DNA中是否存在碱基突变的方法，依次包括以下步骤1)制备单链多核苷酸D1，所述D1与待测DNA的正常序列完全互补；2)制备单链多核苷酸D2，用荧光素标记序列D2；所述D2能形成发卡DNA，茎环与D1完全互补，茎干与D1至少有6nt不互补，且茎干区含有限制性内切酶的酶切位点；3)将D1和D2混合，再加入待测DNA，然后加入与D2茎干区的酶切位点相应的限制性内切酶，再加入下述式(I)的化合物；同时设置用待测DNA的正常序列组成的DNA片段取代待测DNA的体系作为对照；按照如下方法确定待测DNA是否存在突变若待测DNA反应体系的I424nm/I527nm小于等于对照体系的2.57±0.05，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的I424nm/I527nm等于对照体系的3.8±0.11，待测DNA不存在碱基突变；所述I424nm为发射波长为424nm的发射峰的荧光强度；所述I527nm为发射波长为527nm的发射峰的荧光强度；式(I)；式(I)中，m＝1～10，n＝2～100；R1，R2，R3，R4＝CXH2X+1或-O(CXH2X+1)，x＝1～10；R5＝CXH2X+1，x＝1～3；R6＝Br、Cl、I、CF3COO或CH3COO。F2010100026037C00011.tif
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述式(I)中，m= 6、η = 6、R1 = H、R2 = H、R3 = H，、R4 = H、R5 = CH3、R6 = Br0
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述式(I)中，m= 6、η = 6、R1 = H、R2 = H、R3 = H，、R4 = H、R5 = CH2CH3、R6 = 10
全文摘要
本发明公开了一种检测DNA中碱基突变的方法。本发明提供的检测DNA中碱基突变的方法为首先，合成式(I)的化合物；然后通过式(I)的化合物与单链寡聚核苷酸通过静电相互作用形成复合物后和标记的染料发生能量转移以及DNA的构象变化来检测DNA中的碱基突变。本发明提供的方法克服了现有的检测DNA中碱基突变的方法步骤繁琐、成本较高、灵敏度低和选择性低等缺点，具有简单、经济、灵敏度高且可靠的优点。式(I)
文档编号C12Q1/68GK101851670SQ20101000260
公开日2010年10月6日 申请日期2008年4月7日 优先权日2008年4月7日
发明者王树, 贺芳 申请人:中国科学院化学研究所