专利名称：一种大豆aoc类酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆AOC类酶及其编码基因与应用，属于植物基因工程领域。具 体涉及与抗虫相关信号物质茉莉酸合成途径关键酶丙二烯氧化物还原酶(Allene oxide cyclase, AOC)及其编码基因与应用，并涉及来源于大豆的与茉莉酸合成相关AOC类酶 GmAOC及其编码基因与其在培育抗虫植物品种中的应用。
背景技术：
虫害是造成农作物减产的主要因素之一，据世界粮农组织(FAO)统计，在全世界 范围内，每年因虫害造成的农作物损失约占总收获量的14%，损失约数千亿美元。大豆 [Glycine max (L.)Merr.]作为一种重要的粮食及经济作物，多种害虫严重能够影响其产量 和品质。使用至今的化学杀虫剂，即增加了农业成本，又致使许多害虫抗药性迅速增强，同 时环境，食物链和水资源也受到严重污染。 目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物抗虫性的重要方法之一。研 究表明茉莉酸能激活植物体内与抗虫相关的防御基因，使植物产生蛋白酶抑制剂、次生化 合物以及释放挥发物等(Ryan and Pearce， 1998) 。 Allene oxidecyclase (AOC)是茉莉酸 (EC 5.3.99.6)合成途径关键酶，它可以将不稳定底物催化成茉莉酸途径第一个稳定五环 化合物。AOC类酶广泛存在于植物中，目前主要从拟南芥、苜蓿、水稻等克隆出此基因。
提高大豆抗虫性，减少虫害对大豆产量和品质的影响，对提高农业经济效益和改 善人类生活质量具有积极而深远的现实意义。
发明内容
技术问题 本发明的目的是提供一种大豆AOC类酶及其编码基因与应用。
技术方案 本发明所提供的大豆AOC类酶，名称为GmAOCl，来源于大豆属大豆 [Glycinemax(L.)]，是具有序列表中的SEQ ID NO. 2所述氨基酸序列的蛋白质。
上述大豆AOC类酶的编码基因，其cDNA基因具有序列表中GmAOCl基因SEQ IDNO. 1的DNA序列；其中，序列表中的GmAOCl基因SEQ ID NO. 1由脱氧核苷酸，本序列为 GmAOCl基因的读码框，编码具有序列表中SEQ ID NO. 2的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明GmAOCl基因SEQ ID NO. 1的表达载体是指pMDC83-GmA0Cl植物过量 表达载体，宿主菌是指将GmAOCl基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。
扩增GmAOCl基因的引物GmAOCl 0RF正向引物5 '-ATGGCTTCCATGGGCTCTC—3'
GmAOCl 0RF反向引物5 '-GTTGGTGAAGTTTGGCAAA-3'; 上述大豆GmAOCl酶及其编码基因GmAOCl基因可在培育抗虫植物中得到应用。
有益效果
过量表达GmA0Cl的烟草与野生型烟草相比，其抗虫性显著提高，说明GmA0Cl基因 在提高植物抗虫性方面起着重要作用。 本发明的GmA0Cl对培育抗虫农作物，减少虫害对农作物产量的影响特别是对大 豆产量的影响具有重要意义。 利用植物表达载体，将本发明的GmA0Cl的编码基因导入植物细胞，可获得抗虫转 基因植株。 使用GmA0Cl构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强 型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用 植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基 因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物 的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明GmA0Cl的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载 体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并 将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植 物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。
图1为GmA0Cl基因在大豆染色体位置结构示意图
图2为含有GmA0Cl的植物表达载体的部分结构示意图 图3为转GmA0Cl烟草株系与野生型烟草的叶片同时饲喂斜纹夜蛾结果示意图
第一行转基因烟草叶片，第二行野生型烟草叶片
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。 —、大豆GmA0Cl及其编码基因的cDNA克隆与鉴定大豆(Glycine max(L. )Merr.) 材茅斗黄皮小青豆(juanjuan Wu， et al. Constitutive overexpression ofAOS-l ike gene from soybean enhanced tolerance to insect attack intransgenic tobacco. Biotechnology letters, 2008)，材料种植于网室，常规田间管理。 以已报道的植物苜蓿(Medicago truncatula)中鉴定的A0C基因 MtAOCl (AJ308489)和MtA0C2 (AJ866733)，根据物种间氨基酸序列的同源性，搜索大豆的 TIGR数据库和NCBI (WGS)数据库，经过拼接，延伸后获得一条高度同源序列。其序列5'端 均不完整。分别设计了 5'RACE的特异性引物(GSP)和巢式引物(NGSP)，扩增后克隆测序， 拼接得到包含完整0RF的序列。 设计特异引物分别以大豆基因组及大豆嫩叶的cDNA为模板进行克隆验证。用
Peimer3程序设计包含完整0RF序列的引物A0C0RF正向引物5 '-ATGGCATCATCCTCATCAA—3'
A0C ORF反向引物5 ' -GTCAGTGAAGCCAGCAATA-3';应用RT-PCR方法，以大豆总 RNA反转合成的cDNA为模板扩增GmAOCl基因。取黄皮小青豆叶片，置于液氮中研碎，RNA 提取依据TIANGEN总RNA提取试剂盒RNA Plant Extraction kit DP417进行。cDNA第一 链合成依据TaKaRa试剂公司cDNA第一链合成试剂盒TaKaR a PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis KitD6110A，具体详见操作说明。以得到的cDNA片段为模板，分别用1对 引物进行PCR扩增反应。25iU ill PCR反应体系为1 ill 一链cDNA (0.05 iig)、l ill引物 (10iiM)、2. 5ii 1 10XPCR缓冲液、2. 5ii 1 Mg2+、4iil dNTP(10mM)禾P 1. 25U LA TaqDNA聚 合酶，用超纯水补足25iU。反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上进行，其程序为95。C变性 5min ;再94°C 30sec，56。C 50sec，72。C lmin，共30个循环；然后72。C延伸10min ;4。C保存。 PCR产物回收后经链接PMD19-T载体(TaKaRa)、转化大肠杆菌DH5 a 、蓝白斑筛选、摇菌、测 序、序列分析，结果表明PCR产物具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，命名为GmAOCl 基因。将ORF序列与基因组序列比对后发现，如图1所示GmAOCl基因含有两个外显子，一 个内含子。 二、GmAOCl基因编码蛋白的功能鉴定 利用Invitrogen公司的Gateway Technology with Clonase II试剂盒， 将GmAOCl基因正向插入到表达载体pMDC83(Sokolov et al(2005)A redox-regulat ed chloroplast protein phosphatase binds to starch diurnally andf皿ctions in its accumulation, PNAS， 103 :9732-9737)中，得到pMDC83-GmA0Cl植物过量表达载体，图2 显示了 pMDC83-GmA0Cl部分序列。用冻融法分别将pMDC83-GmA0Cl转入根癌农杆菌菌株 EHA105(Avsian-Kretchmer et al，TheSalt-Stress Signal Transd uction Pathway That Activates the gpxl Promoterls Mediated bylntracell ular H202， Diff erent from the Pathway Inducedby Extracellular H202，2004，Plant Physiology, 135 :1685-1696) 中。pMDC83-GmA0Cl通过农杆菌EHA105介导转化烟草，PCR检测结果表明获得56阳性植 株。用转基因烟草株系和野生型烟草的叶片同时饲喂斜纹夜蛾(购于江苏省农科院)，结果 如图3所示转基因烟草叶片的损失量显著少于野生型烟草叶片的损失量，说明转基因株 系与野生型烟草相比抗虫性显著提高，过量表达GmAOCl基因能提高转基因烟草的抗虫性。
序列表
〈110〉南京农业大学 〈120〉 一种大豆AOC类蛋白及其编码基因与应用
〈130〉说明书
〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211>765
〈212>DNA 〈213〉大豆属大豆(Glycine max L.)
〈220〉 〈221〉GmA0Cl基因读码框(ORF)
〈222〉 (1) . (765)
〈223〉 〈400>1 atggcttcca tctatctctc
朋gaccacte
CC3gCC3朋g
gcatecctte 朋c朋gatet ctcatccagc tttggaaact ctggcagtte caacttgtgt cctcctgaac gctetggcte 〈210>2 〈211>255 〈212>PRT
〈213>大豆属大豆(Glycine max L.) 〈220〉
〈221〉GmA0Cl蛋白序列 〈222〉 (1) (255) 〈223〉 〈400>2 Met Ala
tgggctctctg皿gatgatttcgtccctcaaactctcccg ttcaagttgt60
cccttcaaaccc皿皿gc皿gteggttc皿gtctctttca atccttccca120
teaaattctcagctecccctcaagtetctecatcc3g皿g皿gtecc皿c180
ccactgcattcttcttcaat皿cc皿皿gcagcatcaaga ttcctcacag240
ttcaagaactctttgtctecgagatc皿cg皿cgcgaccg agg皿gtcct300
ggcteagccag皿gccagttaactctcteggagacttegt gccattcagc360
3gacteggg3teactgcagg cttgtgtgtg420
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atggccacatggagcctetctcacattcca agacacatet540
caggaggctctggaatctttg皿ggtgcttctggac皿gt g皿gcttcac600
tccctttcaagctgttctecaccttctetttgaagggtgt tcctgatttg660
tgcttggg皿acctgttgaaccttcaccaagtgttgagcc ttctcctgct720
ccgagcctcatgcctgtttgccaaacttcacc皿c780
Ser Met
1
Arg
Ser Ser
Ser Ser
Thr
Thr
65
Pro
Arg
Leu
Pro
50
Ala
Leu
35
Gin
Cys
20
Phe
Gly 5
Ser
Ser Leu Lys Met
lie Ser Pro
Gin Ser Phe
Val Ser Thr
Phe Phe Phe
Ala Lys Val
Gly Gly
Ser
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Pro 100 Leu
Gin
85
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55
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40
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25
Thr
lie
10
Gin
Ser Ser Leu Lys
Thr Gin Lys
Lys Thr Leu
Arg Ser Thr Lys
Lys
45
Lys
Gin
30
Phe
Leu
15
Val
Ser
Gly
Ser Ala
Leu Phe Val
Tyr Leu Arg
Val Pro Phe Ser
Leu 105 Asn
Gin
Tyr 90
Ser
His 75 Glu
Gin
Asn
60
Gin
lie Asn Glu
Thr Thr Thr
Asp Ser Ser Gin 80 Asp
Lys lys lie Tyr
Pro
Ser
Val 110 Gly
Arg 95 Asn
Ser
Asp Leu
115120125Gin Lys Arg Leu Gly lieThrAlaGlyLeuCysValLeulieGinHis130135140Glu Pro Glu Lys Lys GlyAspArgTyrGluAlalieTyrSerPheTyr145 150155160Phe Gly Asn Tyr Gly HislieSerValGinGlyAlaTyrLeuThrPhe165170175Gin Asp Thr Tyr Leu AlaValThrGlyGlySerGlyliePheGluGly180185190Ala Ser Gly Gin Val LysLeuHisGinLeuValPheProPheLysLeu195200205Phe Tyr Thr Phe Tyr LeuLysGlyValProAspLeuProProGluLeu210215220Leu Gly Lys Pro Val GluProSerProSerValGluProSerProAla225 230235240Ala Met Ala Thr Glu proHisAlaCysLeuProAsnPheThrAsn245250255〈210>3〈211>19〈212>DNA<213>人工合成〈220〉 [o川]〈221〉GmA0Cl ORF正向引物 〈222〉 (1) . (19)〈223〉〈400>3atggcttccatgggctctc〈210>4〈211>19〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221X;mAOCl ORF反向引物〈222〉 (1) . (19)〈223〉〈400>4gttggtgaagtttggcaaa
权利要求
一种大豆茉莉酸合成途径关键酶丙二烯氧化物还原酶，命名为GmAOC酶，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。
2. 编码权利要求1所述的大豆A0C类酶的基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，为大豆A0C类酶的cDNA基因，具有序列表中 GmAOCl基因SEQ ID NO. 1的DNA序列。
4. 含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5. 根据权利要求4所述的表达载体，是指pMDC83-GmA0Cl植物过量表达载体。
6. 含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。
7. 根据权利要求6所述的宿主菌，是指将GmAOCl基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。
8. 扩增权利要求2或3所述基因的引物，其特征是， GmAOC 1 ORF正向引物5 ' -ATGGCTTCCATGGGCTCTC-3' GmAOC 1 ORF反向引物5 ' -GTTGGTGAAGTTTGGCAAA-3'。
9. 权利要求1所述的大豆AOC类酶在培育抗虫植物中的应用。
10. 权利要求2或3所述的大豆AOC类酶编码基因在培育抗虫植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种大豆茉莉酸生成途径的重要催化酶-AOC类酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该大豆AOC类酶，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。其编码基因为GmAOC1基因SEQ ID NO.1的DNA序列。本发明大豆AOC类酶及其编码基因可用于培育抗虫植物品种特别是大豆品种。烟草叶片伺喂斜纹夜蛾，转基因烟草叶片损失率显著低于野生型叶片的损失率，说明GmAOC1基因对提高植物抗虫性方面起重要作用。
文档编号C12N15/53GK101792747SQ201010018299
公开日2010年8月4日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者吴倩, 喻德跃 申请人:南京农业大学