专利名称：一种无假阳性平末端克隆载体及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中一种载体构建的方法，特别是涉及一种无假阳性平末端克隆载体及其构建方法。
背景技术：
随着大规模测序技术的发展，越来越多的物种的基因组序列被测定，为了进一步 对未知基因的功能进行研究，需要对所研究的基因进行克隆为下一步的研究提供可能，因 而高效的基因克隆技术应用显得的尤为重要。常规的基因克隆技术，应用含有限制性内切 酶识别序列的引物通过聚合酶链式反应(PCR)对目标基因进行扩增，并对所获得的PCR扩 增产物进行相应的限制性内切酶处理，并连接到相应限制性内切酶处理过的载体中，从而 获得保存该基因的载体。但这种方法步骤繁琐，且受基因序列和限制性内切酶识别序列的 限制。在PCR反应的过程中，会在PCR扩增产物的3’末端多增加一个腺嘌呤碱基，这是 因为非保真性的Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的功能。根据这一特性，开发出一种能克 隆3’末端含有腺嘌呤碱基的PCR产物的在3’末端含有胸腺嘧啶的载体，称之为T载体。由 于无需对PCR产物进行限制性内切酶处理，相对于常规克隆方法省略了多个处理步骤，且 能同时高效地克隆多个PCR产物，因而这种T载体克隆技术广受人们的青睐。制备T载体载体的方法主要有两种(1)平末端载体加T法应用能使克隆载体产 生平末端的限制性内切酶(如EcoRV)进行处理，然后通过末端转移酶或者Taq DNA聚合酶 将脱氧胸腺嘧啶(dTTP)添加到线性平末端克隆载体的3’末端，而形成T载体。(2)限制性 内切酶处理法将串联的两个特定的限制性内切酶(如Xcml，AhdI)识别序列引入到克隆 载体中，通过酶切处理，产生线性化的载体的3’末端含有单个突出的胸腺嘧啶，而成为T载 体。虽然T载体克隆技术应用非常广泛，但也存在较多不如人意的地方。如平末端载 体加T法中，存在对平末端载体加T不充分的情况，这导致了产生严重的载体自连现象，增 加筛选阳性重组子的难度。通过限制性内切酶制备T载体的方法，由于存在不完全酶切的 情况出现，同样也会导致自连现象的存在。尽管τ载体含有可以通过IPTG诱导转化的克隆 表达β半乳糖苷酶在底物X-gal上产生蓝白斑进行筛选的功能，但这些试剂价格比较昂 贵，同时即使采用这种方法筛选得到的白斑克隆也可能是假阳性。在使用非高保真的Taq酶进行PCR扩增，由于Taq酶缺乏校正功能，扩增出来的 PCR产物存在突变的可能，因而为了序列的保真性，通常会选用保真性好的DNA聚合酶，如 pfu。通过高保真DNA聚合酶扩增的PCR产物的3’末端不存在多余的腺嘌呤，所以如果应 用T载体进行克隆此类的PCR产物需要通过对PCR产物进行加A反应或者使用平末端的克 隆载体。平末端载体制备一般是通过使用能使克隆载体产生平末端的限制性酶进行酶切， 线性化的克隆载体通过磷酸酶处理去掉5’端的磷酸基团。同时，如果线性化载体去磷酸基 团不彻底也会产生载体自连的现象，增加筛选阳性克隆工作。现今，使用的克隆载体不论是T载体还是平末端的载体，由于其载体的5’端都含有磷酸基团，因而在连接的过程中都存 在载体自连的风险。因而使用5’端不含有磷酸基团的克隆载体可以避免以上的不足之处。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的目的首先是提供一种无假阳性平末 端的克隆载体的制备方法，该方法获得的克隆载体可以高效地克隆磷酸化的平末端PCR产 物或者其他磷酸化的平末端核苷酸片段。本发明的目的还在于提供由上述方法制备得到的载体。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案一种无假阳性平末端克隆载体的制备方法，其特征在于包括以下步 骤是用高保真DNA聚合酶扩增模板载体，纯化所得PCR产物即为无假阳性平末端克 隆载体。所述模板载体为现有载体(例如pBlusctit II SK)，或在现有载体的基础上引入 了预设的酶切位点和/或引物序列。所述引入序列可以是以克隆的方法将目的片段连入现 有的载体。这样做的好处是例如引入酶切位点方便检测克隆的片段，而引入引物序列是为 了达到更好的扩增效果，诸如此类。所述高保真DNA聚合酶，应具有3' -5'外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生 的错误，所得扩增产物为平末端且5’末端不存在磷酸基团，如pfu或其他具有类似功能的 DNA聚合酶。作为优选，所述模板载体为线性化载体，主要是因为线性模板扩增相对比较容易。本发明以pBlusctit II SK为典型，具体提供了一种无假阳性平末端克隆载体 pBSK-blunt的制备方法，包括以下步骤(1)将来源于酿酒酵母的intein基因克隆进载体pBlusctitll SK，得pBlusctit II SK-intein ；(2)双酶切pBlusctit II SK-intein，并进行纯化得模板载体；(3)使用高保真DNA聚合酶，PCR扩增模板载体，所得PCR产物经纯化后即为无假 阳性平末端克隆载体pBSK-blunt。作为优选，步骤(2)所述双酶切是NotI和EcoRI双酶切。作为优选，步骤(3)所述PCR扩增使用如下引物
R7 5，-GAATTCTCCCTTTAGTGAGGGTTAAT-3，，R3 :5，GAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3，。作为优选，步骤(2)或(3)所述纯化为凝胶电泳纯化或是使用PCR纯化试剂盒纯 化。本发明还提供了一种无假阳性平末端克隆载体，就是由上述方法制备得到的。应用上述载体进行克隆，本发明就提供了一种无假阳性基因克隆方法，其包括将 磷酸化的平末端目的片段与所述载体连接的步骤，其他步骤与一般的克隆类似。本发明的基本原理是以出发载体为模板，通过高保真的PCR扩增过程，得到与载 体序列一致或经过优化的，5’末端不存在磷酸基团的PCR产物，相当于完成了线性化的平 末端载体的去磷酸化过程，解决了直接用去磷酸化酶处理的不彻底性。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果制备本发明的载体无需进行大量的质粒纯化，通过简单的PCR反应就可以产生大 量的载体；无须对线性化克隆载体利用磷酸酶进行去除磷酸基团的步骤，同时由于该平末 端载体5’末端不存在磷酸基团，因而克隆时产生载体自连的几率为零。
图1为平末端克隆载体pBSK-blunt的物理图谱。图2为菌落PCR检测阳性克隆的核酸电泳图；其中，泳道1、12为DNA maker DL2000 (Takara公司)，泳道2_10为不同重组克隆 的PCR检测，泳道11阴性对照。图3为重组质粒EcoRI酶切鉴定核酸电泳图；其中，泳道1，11为DNA makerDL2000 (Takara公司)，泳道2_10为不同重组质粒酶切结果检测。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限 于此。实施例实施例所用主要材料的来源如下pBluscript II SK 质粒来源于 Stratagene 公司，大肠杆菌 Dh5 α、 T4DNApolynucleotide Kinase试剂盒及限制性内切酶和高保真DNA聚合酶购置于Takara 公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒及PCR产物纯化试剂盒购置于Axygen公司。酿酒酵 母EBY100购置于invitrogen公司。酵母提取试剂基因组购置于Omega公司。快速连接缓 冲液购置于promega公司。其它试剂或材料除特别说明为普通市售试剂或材料。1、制备线性化模板载体(1)离心收集在YPD培养基培养至对数期的酿酒酵母EBY100，利用液氮反复冻融 并研磨破碎酵母，使用omega公司的酵母基因组纯化试剂盒对酵母基因组进行纯化，根据 试剂盒说明书操作。(2)根据数据库公布的酿酒酵母intein基因的序列(GenBank :X83276. 1)，设计用 于扩增intein基因的引物，序列如下intein upper 5’ -GGGAATTCTGCTTTGCCAAGGGTACCAATGTTTTAATG-3’intein lower 5’ -ATAAGAATGCGGCCGCTGCATGGACGACAACCTGGGATCCAAGCAAAAAC-3，。(3) PCR扩增反应体系如下酿酒酵母基因组(lOug/μ 1) 2μ 1PrimerSTAR buffer 10 μ 1dNTP (2. 5um) 4 μ 1intein upper (IOuM) 1 μ 1
intein Iower(IOuM) 1 μ 1PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0. 5μ 1无菌水补足至50 μ 1PCR 程序为98 度 2min 预变性，98 度 IOsec, 55 度 30sec, 72 度 2min, 30cycles, 72 度 5min.。纯化intein基因PCR产物，并利用酶切位点NotI及EcoRI克隆至pBluscriptll SK中，并转化至大肠杆菌Dh5 α。通过提取质粒获得前载体pBlusctit IISK-intein。
然后对pBlusctit II SK-intein载体进行EcoRI和NotI双酶切，酶切体系如下pBlusctit II SK-intein :20μ 1H buffer 1 μ 10. 1 % BSA 1 μ 1tritonX-100 1 μ 1EcoRI 1. 5μ 1NotI 1. 5μ 1无菌水补足至30 μ tl37度保温酶切8小时，将全部酶切产物进行凝胶回收，回收3000bp的线性化载体 条带，按照胶回收说明书操作进行纯化。2、制备平末端克隆载体pBSK-blunt设计引物R7 和 R3 (R7 5，-GAATTCTCCCTTTAGTGAGGGTTAAT-3，，R3 5，-GAATTCCCCT ATAGTGAGTCGTATTA-3’)，以步骤1纯化回收的线性化模板载体进行扩增，使用的高保真酶为 TAKARA 公司的 PrimerSTAR HSDNA Polymerase，反应体系如下pBluscript II SK(20ug/y 1) 2μ 1PrimerSTAR buffer 10 μ 1dNTP (2. 5um) 4 μ 1R3 (IOuM) 1 μ 1R7(IOuM) 1 μ 1PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0. 5μ 1无菌水补足至50 μ 1PCR 程序为98 度 2min 预变性，98 度 IOsec, 50 度 30sec, 72 度 3min, 30cycles, 72 度 5min。所扩增的PCR产物进行凝胶回收，或者直接进行PCR纯化。3、pBSK-blunt载体克隆效率验证设计扩增大肠杆菌TRX基因的引物，序列如下TRX upper :5，-ATGAGCGATAAAATTATTCA-3，TRX lower :5，-TGCACCCACTTTGGTTGCCGCCA-3，以pET32A载体(购置于novagen公司)为模板，扩增前对引物进行磷酸化处理， 所用的磷酸激酶为TAKARA公司的T4DNA polynucleotideKinase (PKN)，反应体系如下TRX upper 8. 5 μ 1TRX lower 8. 5 μ 1
T4 DNA polynucleotide Kinase (PKN) buffer :2μ 1T4 PKN 1 μ 1ATP(IOOmM) 0. 5 μ 1于37度保温，后取部分用于PCR反应扩增TRX，反应体系如下。pET32a(20ng/ul) 2μ 1PrimerSTAR buffer 10 μ 1dNTP (2. 5um) 4 μ 1
TRX upper/lower 磷酸化混合物4μ 1PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0. 5μ 1无菌水补足至50 μ 1扩增后的PCR产物回收后取部分进行连接反应，使用promega公司的快速连接 buffer，体系如下rapid ligation buffer 5 μ 1Τ4 ligase 1 μ 1pBSK-blunt(10ug/y 1) 1 μ 1TRX 3μ 1室温连接十分钟后转化大肠杆菌，涂AMP+LB培养板，待长出克隆后，利用T7及T3 引物进行菌落PCR鉴定(图2)，所有克隆过夜培养后进行质粒提取，并用EcoRI进行酶切鉴 定(图3)，任意挑选的9个克隆均为阳性克隆。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南理工大学<120> 一种无假阳性平末端克隆载体及制备方法<130)091230<160>6<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (26)<223>模板载体扩增引物R7<400>1gaattctccc tttagtgagg gttaat 26<210>2
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (26)<223>模板载体扩增引物R3<400>2gaattcccct atagtgagtc gtatta26<210>3<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (38)<223〉扩增 intein 基因的引物 intein upper<400>3gggaattctg ctttgccaag ggtaccaatg ttttaatg38<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (50)<223> 用于扩增 intein 基因的引物 intein lower<400>4ataagaatgc ggccgctgca tggacgacaa cctgggatcc aagcaaaaac50<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (20)<223>扩增大肠杆菌TRX基因的引物TRX upper<400>5atgagcgata aaattattca 20
<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (23)<223>扩增大肠杆菌TRX基因的引物TRX lower<400>6tgcaeccaet ttggttgccg cea2权利要求
一种无假阳性平末端克隆载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤是用高保真DNA聚合酶扩增模板载体，纯化所得PCR产物即为无假阳性平末端克隆载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述模板载体为线性化载体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述模板载体为现有载体，或在现有载体 的基础上引入了预设的酶切位点和/或引物序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述现有载体为pBlusctitIISK0
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将来源于酿酒酵母的intein基因克隆进载体pBlusctitllSK,得pBlusctitll SK-intein ；(2)双酶切pBlusctitII SK-intein，并进行纯化得模板载体；(3)使用高保真DNA聚合酶，PCR扩增模板载体，所得PCR产物经纯化后即为无假阳性 平末端克隆载体pBSK-blunt。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)所述双酶切是NotI和EcoRI双 酶切。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(3)所述PCR扩增使用如下引物 R7 :5’ -GAATTCTCCCTTTAGTGAGGGTTAAT-3’,R3 :5’ -GAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’。
8.根据权利要求5所述的的方法，其特征在于步骤⑵或(3)所述纯化为凝胶电泳 纯化或是使用PCR纯化试剂盒纯化。
9.一种无假阳性平末端克隆载体，就是由权利要求1-8中任一项所述方法制备得到的。
10.一种无假阳性基因克隆方法，其特征在于包括将末端磷酸化的平末端目的片段 与权利要求9所述载体连接的步骤。
全文摘要
本发明公开了一种无假阳性平末端克隆载体及其制备方法。方法是应用高保真DNA聚合酶通过PCR扩增方法制备的线性化克隆载体。得到的线性化平末端克隆载体的两个5’端不含有磷酸基团。本发明的方法无需进行大量的质粒纯化，通过简单的PCR反应就可以产生大量的载体。使用该载体与含有磷酸基团的平末端PCR片段及其他DNA片段连接，克隆过程中产生的载体自连的概率为零。
文档编号C12N15/66GK101818164SQ20101001938
公开日2010年9月1日 申请日期2010年1月14日 优先权日2010年1月14日
发明者吴建华, 杨博, 杨宁, 王小宁, 王文凯, 王永华, 蓝东明 申请人:华南理工大学