专利名称：丙型肝炎病毒基因分型及il28位点多态性检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测丙型肝炎病毒基因型及IL28位点多态性的试剂盒，特别是涉及 使用核酸反向斑点杂交技术制备一种丙型肝炎病毒基因型及IL28位点多态性检测试剂 盒，本发明的试剂盒可以快速准确地区分样品中丙型肝炎病毒基因型及IL28位点多态性。
背景技术：
丙型肝炎病毒Q^patitis C virus, HCV)是严重危害人类健康的肝炎病毒之，是 重要的肝脏疾病致病因子。目前，全球有超过1. 7亿人感染HCV，其中每年超过10万例丙 型肝炎患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹水。根据WHO 2002年年报报道，在2001 年，慢性肝病共引起1，400万例死亡，其中79. 6万例由肝硬化引起、61. 6万例由原发性肝癌 引起。而在2001年，因慢性肝病引起死亡的病例中就有20% (超过2. 8万)是由HCV感染 引起。目前已经有大量病例可以证明在大多数国家由肝癌引起的死亡数量的增加是由于丙 型肝炎感染造成。HCV不同基因型感染者的重症化程度和几率存在明显差异，因此HCV分型检测具 有重要的临床意义。研究报道在慢性HCV感染者中，与其他基因型相比，HCV Ib型感染与 更严重的肝脏疾病、更迅速的疾病恶化相关(Nousbaum JB, et al. Ann Intern Med，1995， 122:161-168)。Zein 等(Zein NN, et al. Ann Intern Med，1996，125 :634_639)发现 HCV lb基因型在肝硬化和肝脏失代偿要求肝移植的慢性活动性丙型肝炎患者中的感染率远远 高于其他基因型。有证据表明，在HCV Ib感染率较高的日本，肝细胞肝癌的发生率远远高 于HCV Ib感染率低的欧洲或美国，且发生时间也更早。另外，Zein等(Zein NN, et al.Ann Intern Med，1996，125 :634_639)发现，在美国，感染HCV Ib基因型的患者年龄普遍高于 感染其他型别的患者，HCV Ib基因型的患者感染时间更早且病程更长；相同研究结果在法 国和西班牙也有报道(PolS, et al. Gastroenterology, 1995,108 :581_583 ；Davis GL, et al.H印atology，1997，26 :122S_127S)。因此，HCV Ib基因型是更严重的HCV相关性肝脏疾 病的标志物。HCV基因分型另一个重要的临床意义在于有助于预测治疗效果。丙型肝炎病毒分 为急性和慢性，急性丙型肝炎虽然有部分患者可以自愈，但对所有的急性丙型肝炎患者应 给予积极治疗且疗效好，其中最主要的治疗当属抗病毒治疗；慢性丙型肝炎的治疗，目前国 内外公认有效的也只有干扰素。大量临床试验表明，HCV Ib及Ia基因型比HCV 2型或3 型对干扰素治疗的持续病毒学应答(SVR)更差(Pawlotsky JM, et al. Science, 2001 ；292 2323-2325)。HCV2型感染患者有60-70%在干扰素治疗6个月后有应答，而HCV 1型感染 者只有10-15%有应答反应。这种差别在干扰素治疗的持续性应答方面经常出现，并且不受 肝脏组织学特点或治疗前HCV RNA水平的影响。相同的治疗方法对不同基因型HCV感染的 治疗效果确实存在差异，检测HCV基因型将有助于HCV感染的临床诊断并预测治疗效果，为 调整用药剂量及治疗时间，制定个体化抗病毒治疗方案提供指导。此外慢性丙型肝炎患者在治疗过程中呈现很大的差异，即个体对药物的应答程度不同。一项最新的研究表明(DL Thomas, et al. Nature. 2009，461 (7265) :798_801)人体 DNA(脱氧核糖核酸)分子中有一个与防感染基因IL28B相连的基因，当这一基因的碱基T 被碱基C替换时，人们接受丙肝疗法的效果便会发生显著变化。研究者研究了 1600多名丙 肝患者后发现，碱基T被碱基C替换后，丙肝患者比没有变化的患者的治疗效果要好得多。 IL28B基因该位点具有C碱基的丙肝患者80%都被治愈，而T基因的丙肝患者只有30%被 治愈。这一研究结果解释了为什么有些丙肝患者的治疗效果很好，有些人却治疗无效。此 前科学家一直不知道造成疗效差异的原因，将来丙肝患者可根据他们的基因来选择适当的 治疗方法。针对HCV基因型及IL28位点多态性检测目前已有一些试剂盒报道。Trugene HCV 5' NCGenotyping kit (Canada)，这一试剂盒是通过测序完成的，而测序的费用及 测序对混合感染的区分能力仅能达到20%左右仍无法满足临床的要求；Irmo LiPA HCV II(Innogenetics)使用的反向杂交的方法，但是病毒具有分布的区域性和民族差异，检测 中国人群可能存在漏检的情况。DL Thomas检测IL28B多态性使用的是Illunina human 610-quad beadchip进行检测，即对全基因组的SNPs进行检测，检测的费用仍然是临床使 用的重要考虑。综上所述，有必要开发一种即能对HCV进行基因分型同时能对个体的治疗效果进 行评估的试剂盒，通过个体化治疗提高临床疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测丙型肝炎病毒基因型及IL28B多态性的试剂盒， 该试剂盒利用核酸反向斑点杂交技术可以快速准确的区分样品中丙型肝炎病毒基因型及 患者的IL28B多态性。为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为1)利用全血进行提取，可使用商品化提取试剂盒(如Roche的High Pure ViralNucleic Acid Kit，等)，提取的结果为RNA和DNA的混合物。2)根据HCV基因组设计HCV基因分型的逆转录引物和PCR扩增引物，设计的引物 能够包括HCV不同基因型的检测位点，IL28B多态性根据人的19号染色体基因组设计PCR 扩增引物。设计的引物由专业的合成公司合成，如上海生工等。3)在逆转录过程中，因温度尚不足以激活耐热DNA聚合酶的活性，仅RNA参与逆 转录反应；在完成逆转录反应之后进行双重不对称扩增反应，同时扩增HCV基因和IL28B 基因。因此在包含所述引物的PCR试剂中，使用双重不对称PCR，扩增产物可直接用于杂交 实验。PCR反应体系涉及的组分可以使用商品化试剂盒，如NEB的Taq 5XMaster Mix, Fermentas的热启动酶等。4)根据NCBI Gene Bank已有的HCV基因组不同型别之间的同源性和区分能力设 计HCV基因分型检测探针，设计的探针可以在正义链和/或反义链。IL28B多态性探针根据 人的19号染色体基因组IL28B基因rsl2979860位点进行设计。设计的探针由专业的合成 公司合成，如上海生工等。5)将上述探针点在经过活化的杂交膜上，并加入扩增产物，在杂交体系中，通过高 浓度的盐离子溶液非选择性的结合靶基因，然后通过低浓度的盐离子浓度进行选择性的洗脱，随后交联特性结合的酶，最后加入酶的底物显色。为了达到上述检测步骤，本发明提供的丙型肝炎病毒基因型及IL28B多态性检测 试剂盒由扩增试剂、以尼龙膜为载体的低密度芯片、杂交试剂三部分组成。根据本发明一个优选的实施方案，扩增试剂可以是RT-PCR试剂，即利用一步法 RT-PCR (逆转录-聚合酶链式反应)技术，在RT-PCR反应体系中加入提取好的核酸、逆转录 引物HCV-RT、HCV分型PCR扩增引物HCV-F和HCV-R、IL28B多态性PCR扩增引物IL28B-F 和IL28B-R，其特征在于所述引物的序列如下
权利要求
1.一种检测丙型肝炎病毒基因型及IU8B多态性的试剂盒，由扩增试剂、以尼龙膜为 载体的低密度芯片、杂交试剂三部分组成，其特征在于扩增试剂中逆转录引物HCV-RT、HCV 分型PCR扩增引物HCV-F和HCV-R、II^8B多态性PCR扩增引物IL28B-F和II^8B_R的序列 分别是HCV-RT 5‘ -GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3‘ HCV-F 5 ‘ -TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3‘ HCV-R 5‘ -CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3‘ IL28B-F 5' -AGTCTGGGATTCCTGGACGTGG-3‘ IL28B-R 5' -GGCTCAGGGTCAATCACAGAAGGGAG-3，。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于扩增试剂中逆转录引物HCV-RT终浓度 为200 μ M，引物HCV-F和II^8B-F终浓度均为10 μ M，引物HCV-R和II^8B_R终浓度均为 100 μ M0
3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于点在低密度芯片的HCV基因型特异性探针 的序列为HCV-I 5' -CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3‘ HCV-Ib-I 5' -CCGCGAGACTGCTAGCCG-3‘ HCV-lb-2 5' -GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3‘ HCV-2-1 5' -AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG-3， HCV-2-2 5‘ -GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3‘ HCV-2a-l 5' -GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3‘ HCV-2a-2 5‘ -CCCACTCTATGCCCGGCCA-3‘ HCV-3-1 5' -CCCGCGAGATCACTAGCCG-3‘ HCV-3-2 5‘ -AATCGCTGGGGTGACCGGG-3‘ HCV-3b 5 ‘ -CGCGCTCAATGCCCGGAAAT-3‘ HCV-PCl 5' -ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3‘ HCV-PC2 5‘ -CGGAACCGGTGAGTACACC-3‘ HCV-IC 5' -GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3‘。
4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于点在低密度芯片的IL28B多态性位点的特 异性探针的序列为rsl2979860-C 5' -CGAAGGCGCGAACCAGGG-3， rsl2979860-T 5' -GAAGGCGTGAACCAGGGTTG-3，。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于点在低密度芯片上的HCV基因型特异性探 针和IU8B多态性位点的特异性探针的工作浓度均为5 μ Μ。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于杂交试剂中杂交液I的组成为2XSSC， 0. 5% SDS，杂交液II的组成为0. 5XSSC,0. 5% SDS，辣根过氧化物酶的用量为0. IU。
7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于杂交试剂中显色底物包括TMB或0PD。
全文摘要
本发明涉及检测丙型肝炎病毒基因型及IL28位点多态性的试剂盒，特别是涉及使用核酸反向斑点杂交技术制备一种丙型肝炎病毒基因型及IL28位点多态性检测试剂盒，该试剂盒由扩增试剂、以尼龙膜为载体的低密度芯片、杂交试剂三部分组成，可同时检测HCV基因型及与HCV治疗密切相关的IL28B基因多态性，为丙型肝炎个体化治疗提供更为可靠的依据。
文档编号C12Q1/68GK102127603SQ20101001944
公开日2011年7月20日 申请日期2010年1月19日 优先权日2010年1月19日
发明者张帆, 林炳生, 程钢, 陈华云 申请人:中山大学达安基因股份有限公司