专利名称：一种混合乳蛋白肽的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种利用枯草芽孢杆菌及其产生多种蛋白酶的性 质，以脱脂乳液或乳粉为原料，制备混合乳蛋白肽产品。
背景技术：
牛乳中最重要的营养成分是乳蛋白(约占牛乳干物质的3-3. 7% )，包括酪蛋白、 乳清蛋白(又分为免疫球蛋白Ig、清蛋白、α-乳蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白)及含量较 低的乳脂肪球膜蛋白三类，其中酪蛋白占牛乳蛋白总量的83%。酪蛋白是一类含磷蛋白质， 其丝氨酸羧基与磷酸根之间形成一个酯键，分为as-，β-, κ-, γ-四种构型，其含有人体 必需的8种氨基酸，是一种全价蛋白质。长期以来，人们一直认为蛋白质进入人体以后，是 以氨基酸的形式被吸收入血液的。但近年来研究表明，进入人体小肠后的蛋白质分解物有 许多是以小肽形式被直接吸收入血液，而且对小肽吸收速度快于氨基酸的吸收速度。1979 年德国Brantl等首次报道，在给豚鼠饲喂牛乳酪蛋白后，其小肠中发现具有类似吗啡活性 物质的短肽，自此以后生物活性肽的研究引起越来越多的重视。生物活性肽(Bioactive peptide,BAP)主要指来自于动植物和微生物体的，具有生物活性作用的肽链片段。其分子 结构复杂程度多样，有小分子的二肽，也有环状大分子的多肽，但分子量一般小于6000Da。 一些大分子肽可以通过磷酸化、糖基化或酰基化作用进行修饰或转换成小肽。牛乳是生物 活性肽的主要来源。牛乳中所含的生物活性肽分为游离生物活性肽和酶解释放生物活性 肽。牛乳中游离活性肽包括胰岛素及胰岛素样生长因子I和II (IGF-I和IGF-II)、转化生 长因子(THF-β)、表皮生长因子(EGF)、游离神经生长因子(NGF)等，这些游离的活性肽可 直接作为类似神经递质或间接刺激肠道受体激素或酶的分泌。牛乳中待酶解的活性肽主要 有酪蛋白磷酸肽(CPI^s)、类吗啡肽、抗高血压肽、免疫调节肽、抗血栓肽、抗菌肽等多种生 物活性肽，具有多种生理调节作用。CPI^s含有磷酸丝氨酸残基，可与钙、锌、铁等离子结合形 成可溶性复合物，促进肠道对钙、铁、锌等元素的吸收；类吗啡肽直接作用于神经系统，起到 镇痛、调节人体情绪、呼吸脉搏、体温、消化系统及内分泌等功能；1989年Maruyama等从牛 乳酶解物中分离得到凝血酶原肽和血管紧张素-I转换酶(ACE)的抑制剂-CEI-5，可抑制血 管紧张素-II的产生，起到抗高血压作用；1993年Baker J等的研究证实抗高血压肽是由微 生物酶解酪蛋白的产物。Clare等报道，牛乳β-酪蛋白酶解释放的β-Casokinin-ΙΟ能够 刺激动物产生淋巴细胞或巨噬细胞、淋巴细胞移动和淋巴因子的释放，起到免疫调节作用。 1986年Jolles等发现κ -酪蛋白的106-116残基片段11肽具有抑制ADP诱导血小板凝聚 以及与纤维蛋白结合等抗血栓作用。牛乳α si-酪蛋白经酶解得到一短肽片段，在体内具 有类似抗生素的活性，能抑制小鼠感染致病的金黄色葡萄球菌；研究结果表明抗菌肽有望 成为优于抗生素的新型抗菌剂。总之，牛乳源蛋白肽的研究已成为当今食品医药等领域研究热点。目前，制取乳蛋白肽的方法分为以下三类1.化学水解法将乳蛋白与一定浓度的酸或碱溶液混合，在密闭容器中，在一定温度和压力下使蛋白质的肽链断裂，然后分离纯化水解产物。但化学水解法制备活性肽会 使蛋白质生成有毒物质，所得产物有异味，因此化学水解法已逐渐被酶法所代替。2.外加酶制剂法相对上述方法具有成本低和便于操作的特点，酶水解法已经成 为目前生物活性肽制备的主要的方法。酶解乳蛋白制取乳蛋白肽的酶常用的有胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、植物蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠 萝蛋白酶、无花果蛋白酶)、枯草杆菌蛋白酶等。浙江大学姚婷婷等人用五种蛋白酶(胃蛋 白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)水解牛乳液，得出碱性蛋白酶酶解 乳蛋白效果最佳。天津商学院用动物体内固有的胰蛋白酶酶解牛乳酪蛋白，筛选并获得一 种具有促进免疫和抗菌功能的生物活性肽，命名为Trip。西南农大张勤等人将乳清在胰蛋 白酶作用下，在pH8.0，45°C，酶添加量(E/QSOOOu/g，水解6小时制取乳清多肽饮料。任 国谱在“高蛋白奶粉的研制”中通过对酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶 等多种蛋白酶酶解效果的比较，采用二次酶解工艺，第一步用自制复合酶A(50°C，pH8.5， 60min)水解乳清蛋白，第二步采用自制复合酶B(50°C，pH6. 38,30min)水解高蛋白乳粉体 系，制取高蛋白肽奶粉。3.微生物法由于酶具有专一性强，一种酶要求在特定的PH值与温度下酶解才能 达到最佳酶解效果。并且某种酶仅能专一性地水解一种或几种氨基酸残基的肽键，而形成 的抑制肽往往需要两种或两种以上酶共同参与方可完成对蛋白的水解。由此可见，利用酶 法水解乳蛋白必须根据生物活性肽的结构来选择所用酶的种类，而微生物酶制剂法可在反 应体系中产生包括多种酶在内的复合酶系。采用微生物水解蛋白实际上就是利用微生物代 谢产生的复合酶系共同水解底物，与上述外加复合酶解蛋白相比，节省了购买酶制剂的成 本，酶解程度高，可得到更高浓度的多种蛋白肽产品。近年来的研究报道，在众多乳酸菌中，瑞士乳杆菌(LactcAaciIlus helveticus)被发现有较强的乳蛋白水解活性。1993年，Yamamoto等人对 LactobacillushelveticusCP790 进行研究,他们发现 Lactobacillus helveticusCP790 所 分泌的蛋白酶水解酪蛋白后可产生多种ACE抑制肽，在得到的25条主要肽链中，进行动物 实验后，没有发现有绝对抑制ACE活性的短肽，抑制效果最强的是一种氨基酸残基数达27 的肽片段，由于它不能被直接吸收，可能是进入体内后，水解成其它抑制ACE活性的片段， 从而达到降压的效果。1999年，Yamamoto等人又从Lactobacillus helveticusCPM发酵 的酸奶产品中找到了一条有抗高血压活性的二肽Tyr-Pro，α sl-CN, β _CN、κ -CN中都有 这条二妝的存在° 1995 年，Nakamura 等人用 Lactobacillus helveticus 禾口 Saccharomyces cerevisiae作为发酵剂制作了一种名为Calipas的酸乳饮料，长期服用Calipas后，可抑 制血压上升。随后研究人员从Calipass中提取出具有ACE抑制活性的2种活性短肽-VPP 和 IPP，分别对应于牛乳 β-CN(f84-86), β-CN(f74-76)和 κ-CN(f 108-110)，实验表明， Cal ipas的ACE抑制活性主要是这2种肽的作用。国内南京师范大学潘东从Lactobaci 1 Ius helveticus JCM1004 和 LactobacilluscaseisupATCC393 制作的酸乳中分离获得了 2 种肽 VPP和IPP，经体外实验和体内实验验证，对ACE活性具有较强抑制作用并具有较强降高血 压效果。国内华南理工大学李理、潘进权等报道，采用液体发酵法制备的肽混合物在蛋白水 解度、肽收率、风味、感官色泽方面较酶法制取的产品效果好，可见在制备多肽方法上微生 物法较酶法优越。
资源短缺是当今世界制约一个国家发展的重要因素，因此保护资源、充分利用资 源已成为人们关注的焦点。微生物资源是一类刚刚被人们认识和接受的新型资源，是对 人类具有实际或潜在用途或价值的遗传资源，是一个广博而具极大潜在开发价值的生物 资源。在微生物庞大的系统资源中，芽孢杆菌属是人们认识较早、研究最多的一类。芽孢 杆菌属是一类好氧或兼性厌氧杆状细菌，能产生抗逆性内生孢子，有圆形、椭圆或柱状，能 抵抗热、紫外线、电磁辐射和某些化学试剂的损害而存活下来，能生长在不良环境中。芽 孢杆菌至少有65种菌，根据16SrRNA序列分析至少分为5个组。除个别种，如Bacillus anthracis,Bacillus cereus为致病菌，大多数芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌(B. sublitis)、嗜 热淀粉芽孢杆菌(B. amyloliguefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B. sterethermophilus)、苏 云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)等在工业、农业、医疗保健、环境污染治理、杀灭虫害等 方面具有重要的应用价值。芽孢杆菌属中许多菌株都能分泌多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。制革、丝 绸工业、加酶洗涤剂行业中使用的蛋白酶大多来自地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽 孢杆菌等菌株；嗜热脂肪芽孢杆菌等嗜热细菌大多能产生耐高温且热稳定性强的碱性蛋白 酶；大多数的芽孢杆菌都能够产生胞外淀粉酶，20世纪70年代后期，人们利用巨大芽孢杆 菌，地衣芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌等生产β -淀粉酶，后来采用嗜热脂肪芽 孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌生产耐高温的a-淀粉酶；1970年UNLIVER公司的研 究人员发现嗜碱性芽孢杆菌产生的碱性纤维素酶用在洗涤剂上可增强洗涤效果。综上所 述，芽孢杆菌属菌株具备分泌多种生物酶能力，在实际应用中具有极为广阔的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是利用自我分离的枯草芽孢杆菌(已报道)及其产生多种蛋白酶的 性质，以脱脂乳液或乳粉为原料，采用添加促进因子、前期通风培养、后期升温酶解的工艺， 使乳蛋白高度水解。通过后部膜处理工艺，最大限度保留了生物酶活性，制得的产品含有多 种乳蛋白肽和生物酶。SDS-PAGE分析表明，制备的混合乳蛋白肽主要由低分子量的寡肽构 成。制得产品营养丰富，可直接食用，或作为食品添加剂应用于饲料、食品与医药等领域。1.利用一种枯草芽孢杆菌及其产生多种蛋白酶的性质，制备乳蛋白肽的方法 以脱脂乳液或脱脂乳粉为原料，加水配成浓度8% -15% (W/V)，115°C灭菌5-15分钟； 10-20%辅助因子溶液，115°C灭菌5-15分钟；冷却至37°C以下，无菌条件下，将上述成分按 比例混合，以-10%接种量接入种子培养基，无菌通风培养，30°C _37°C培养M-40小时 后，35°C -60°C保温静止培养2-M小时，培养液经后部处理，得到活性乳蛋白肽混合物。2.以脱脂乳液或脱脂乳粉为原料，加水配成浓度8%-15% (W/V)；添加辅助因子 (W/V)终浓度Ca2+O. 01-0. 5%, VcO. 01-0. IV0o3.枯草芽孢杆菌种子培养基培养方法如下斜面培养基(W/V)葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，琼脂 1-2%, ρΗ7· 0-7. 5，115-121 °C 15-30分钟，摆成斜面，30-37°C空白培养20-24小时，确认斜 面无污染后，无菌条件下接种，30-37 °C培养20- 小时，4 °C备用。种子培养基(W/V)葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏1%，蛋白胨1%， ρΗ7· 0-7. 5,115-121 °C 15—30分钟，冷却至37 °C以下，接入斜面菌种，无菌通风培养，30-37°C培养 18-24 小时。4.在制备乳蛋白肽的工艺中，-10%接种量接种后，先30-37°C无菌通风培养 24-40小时，再:35-60°C保温静止培养2- 小时。5.培养液经后部处理，得到活性乳蛋白肽混合物，其处理工艺是培养液一抽滤 —滤液一膜过滤一无菌滤液一浓缩一冷冻干燥一活性乳蛋白肽。采用上述工艺获得的培养液中10% TCA可溶性氮/总氮的比值可达97. 1%， α-氨基氮含量13.9%，肽含量83.2%。采用膜过滤除菌技术、冷冻干燥技术，最大限度保 持了乳蛋白肽培养液原有多种生物酶的结构和功能，所制乳蛋白肽产品中含有多种寡肽和 蛋白酶等生物活性成分，是新一代乳蛋白肽产品。SDS-PAGE分析乳蛋白肽滤液，结果表明， 采用本工艺所制备的混合乳蛋白肽主要由低分子量的寡肽构成。
图1 :SDS-PAGE测定乳蛋白肽滤液图谱图1中泳道M 标准分子量；泳道1 乳蛋白肽滤液图2 牛乳培养液同工酶图2中泳道1、2、3 :72h培养液、菌体沉淀、上清液；泳道4 标准分子量具体实时方式1.制备乳蛋白肽的工艺流程斜面菌种一种子培养基I配料一灭菌一发酵培养基一通风培养一保温培养一抽滤一滤液一膜过滤—无菌滤液一浓缩一冷冻干燥一乳蛋白肽粉剂2.同工酶电泳将斜面菌种接种于种子培养基30-37 °C，150-200r/min培养16_1 ι，1 %接种 于10%脱脂牛乳培养基，30-37°C，150-200r/min培养72h，取菌液加入2 X SDS Loading Buffer ；再取菌液12000r/min 4 °C离心Imin，上清液、菌体沉淀分别加入等倍体积的 2 X SDS Loading BufferUXSDS Loading Buffer ；不经煮沸直接进行 SDS-PAGE。电泳结 束，将凝胶取下置50°C预热的脱脂牛乳液中浸泡处理数小时后，用纯水清洗2次去掉 游离的乳液。考马斯亮兰R250染色2小时、脱色液脱色至适当程度后照相。3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAEG)(1) 15% SDS-PAGE 胶的制备①清洗胶板，烘干后，组装制胶装置，水平放置②配制15%分离胶，勿产生气泡③加入Iml左右双蒸水封住胶口，静止30min以上至胶凝固，形成一条明显界面 后，用滤纸将水吸干，勿触坏胶界。④灌注积层胶在分离胶上，然后立即插入干净的Teflon梳子，室温放置30min以 上至胶凝固好后，小心移出Teflon梳子。⑤将凝固胶固定于电泳装置上，在电泳槽中加入电泳缓冲液(2) SDS-PAGE 电泳
①加样每个点样孔加入10_15μ 1，最后在所有不加样品的孔中加上等体积的 1X SDSLoading buffer②接通电源，0-30min IOOv ；31-90min 150v，直至溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。③从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃片，取下凝胶进行染色和脱色。(3)考马斯亮蓝染色①染色液配制90ml甲醇水(1 1)和IOml冰乙酸的混合液中溶解0. 25g考 马斯亮蓝R250，用Whatmanl号滤纸过滤染色液。②用至少5倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上45°C染2-3小时。③移出并回收染液，将凝胶浸泡于不加染液的甲醇-乙酸溶液中，45°C脱色2-3小 时，其间更换脱色液3-4次。④脱色后，凝胶用蒸馏水冲洗、照相。
权利要求
1.利用一种枯草芽孢杆菌及其产生多种蛋白酶的性质，制备乳蛋白肽的方法以脱 脂乳液或脱脂乳粉为原料，加水配成浓度8% -15% (W/V)，115°C灭菌5-15分钟；10-20% 辅助因子溶液，115°C灭菌5-15分钟；冷却至37°C以下，无菌条件下，将上述成分按比例 混合，以-10%接种量接入种子培养基，无菌通风培养，30°C _37°C培养M-40小时后， 350C -60°C保温静止培养2-M小时，培养液经后部处理，得到活性乳蛋白肽混合物。
2.根据权利1所述的应用方法，其特征是以脱脂乳液或脱脂乳粉为原料，加水配成浓 ^8% -15% (W/V)；添加辅助因子(W/V)终浓度=Ca2+O. 01-0. 5%, VcO. 01-0. 1%0
3.根据权利1所述的应用方法，其特征是枯草芽孢杆菌种子培养基培养方法如下 斜面培养基(W/ν):葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，琼脂1_2%，ρΗ7· 0-7. 5，115-121°C 15-30分钟，摆成斜面，30°C _37°C空白培养20-24小时，确认斜面无 污染后，无菌条件下接种，30-37 °C培养20-24小时，4 °C备用。种子培养基(W/V):葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，pH7.0-7. 5， 115-121°C 15-30分钟，冷却至37°C以下，接入斜面菌种，无菌通风培养，30°C _37°C培养 18-24小时。
4.根据权利1所述的应用方法，其特征是在制备乳蛋白肽的工艺中，-10%接种量 接种后，先30°C -37°C无菌通风培养M-40小时，再35-60°C保温静止培养2- 小时。
5.根据权利1所述的应用方法，其特征是培养液经后部处理，得到活性乳蛋白肽混合 物，其处理工艺是培养液一抽滤一滤液一膜过滤一无菌滤液一浓缩一冷冻干燥一活性乳 蛋白肽。
全文摘要
本发明涉及的是一种利用枯草芽孢杆菌制备混合乳蛋白肽的工艺。其特点是利用自我分离的枯草芽孢杆菌(已报道)及其产生多种蛋白酶的性质，以脱脂乳液或乳粉为原料，采用添加促进因子、前期通风培养、后期升温酶解的工艺，使乳蛋白高度水解。通过后部膜处理工艺，最大限度保留了生物酶活性，制得的产品含有多种乳蛋白肽和生物酶。SDS-PAGE分析乳蛋白肽滤液，结果表明，采用本工艺所制备的混合乳蛋白肽主要由低分子量的寡肽构成。其优点制备工艺操作简单，易于控制，乳蛋白水解程度高，可工业化生产。产品营养丰富，可直接食用，或作为食品添加剂应用于饲料、食品与医药等领域。
文档编号C12R1/125GK102127579SQ201010032469
公开日2011年7月20日 申请日期2010年1月14日 优先权日2010年1月14日
发明者徐速 申请人:东北农业大学