专利名称：一种利用rna干扰技术培育抗虫性提高的转基因植物的方法及其专用dna片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用RNA干扰技术培育抗虫性提高的转基因植物的方法及其专 用DNA片段。
背景技术：
双链RNA在生物体内广泛存在并在基因表达调控中起重要作用，其中最重要的调 控机制是转录后基因沉默也称RNA沉默。目前在抗病毒转基因植物的研发中主要就是利用 了这种沉默机制，通过表达含较长病毒基因组序列的双链RNA或者发卡结构RNA(shRNA)， 并经过植物体内专切双链RNA的Dicer类似酶(DCLs)的加工生成小干扰RNA(siRNAs)，诱 发植物对含有同源序列病毒的抗病性。已经报道的研究结果显示，除了针对病毒，在植物中 表达针对昆虫基因的双链RNA也可以达到提高取食该植物的相关昆虫的死亡率和延缓昆 虫生长发育的结果，但是靶基因的选择是最为关键的问题，筛选到合适的靶基因是获得良 好结果的重要前提(Ying-Bo Mao, et al，Nat. Biotechnol，25，1307-1313 (2007) James A Baum, et al，Nat. Biotechnol, 25,1322-1326 (2007))；另外，这种方法对刺吸式口器类的昆 虫，比如蚜虫、灰飞虱等昆虫是否有效尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一个DNA片段。本发明提供的DNA片段，是式I所示的基因片段SEQ 正向-X-SEQ 反向(I)其中，3￡01自是ATP合酶E亚基基因的全长cDNA片段中的至少包括19bp的任何 一段；SEQ反向与所述向互补；X是3￡01自与SEQ&自之间的间隔序列，X与所述自或者X与SEQ&自均不互补；所述ATP合酶E亚基基因的全长cDNA如序列表中序列1所示。进一步，上述SEQf^的核苷酸序列如序列表中序列2所示。上述X可以是内含子，所述内含子为植物黄顶(Flaveria trinervia)的磷酸丙酮 酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinase)基因内含子，该内含子的核苷酸序列如序 列表中序列3。含有上述DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。上述重组载体是通过如下方法构建的重组表达载体将序列表中序列2所示的DNA片段插入pIPK质粒的EcoRI和Kpnl酶切位点之间 构成中间质粒；将将序列表中序列2所示的DNA片段反向插入所述中间质粒的Xbal和BamHI酶切位点之间，构成重组表达载体。本发明的另一目的在于提供ATP合酶E亚基基因作为RNA干扰靶基因在培育抗虫 性提高的转基因植物中的应用。本发明的又一目的在于提供一种培育抗虫性提高的转基因植物的方法。本发明提供的培育抗虫性提高的转基因植物的方法，是将上述的DNA片段导入目 的植物中得到转基因植物；所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。具体来讲，上述的DNA片段是通过上述的重组表达载体导入目的植物中的。上述抗虫是指抗蚜总科的所有蚜虫，所述蚜总科的所有蚜虫优选是蚜科 (Aphididae)的蚜虫，更优选是桃蚜(Myzus persicae)。上述植物为任何可以被蚜总科的蚜虫感染并且含有蚜虫ATP合酶E亚基基因的植 物，优选是烟草。上述蚜虫ATP合酶E亚基基因的全长cDNA如序列表中序列1所示。实验证明在实验室条件下，接种到野生型烟草上的蚜虫生长繁殖正常，接种到转 基因烟草上的蚜虫可见少量蚜虫脱皮，但是未见繁殖，4天开始死亡，5天后死虫体发黑，7 天后见不到活蚜虫，因此本发明的方法制备的转基因植物抗虫性提高了。
图1中显示针对蚜虫ATP酶E亚基基因的靶位点序列双链RNA表达框架构件图。图2中显示蚜虫在转基因烟草上生长4天后的结果，其中a 对照植物上蚜虫生长 第4天的图片；b和c显示蚜虫在同一转基因植物株系第4天的不同虫子的照片。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。质粒pIPK 中国科学院微生物研究所，记载过该质粒的非专利文献是章俊丽等， 水稻OsCIPK基因的克隆和功能的分析，生物工程学报，2009，25 (9) 1394-1401。蚜科(Aphididae)的桃蚜(Myzus persicae)中国科学院微生物研究所，非专利 文献是刘召华等，2005年遗传学报32 (7) 758-763。烟草(Nicotiana tobacum Xanthi nc)中国科学院微生物研究所，非专利文献 是孙德俊等，2002年自然科学进展7期708-712。实施例1、抗虫转基因植物的培育一、重组表达载体的构建1、目的基因的合成根据http://www. ncbi. nlm. nih. gov网上信息获得蚜虫ATP酶E亚基基因mRNA 的序列(NM_001162178)，其具体的cDNA序列如序列表中序列1所示，根据该序列合成两 对引物并引入内切酶位点(引物1 5 ‘ TTTGAATTCAGCGACTCAAGATCATGGAG3 ‘；引物2 5‘ TTTGGTACCCTGCCACTTCTTCAACTAAT 3'；引物 3 5‘ TTTTCTAGAAGCGACTCAA GATCATGGAG 3'；引物 4 5‘ TTTGGATCCCTGCCACTTCTTCAACTAAT 3')。提取蚜科(Aphididae)的桃蚜(Myzus persicae)的总RNA，反转录成cDNA，以该 cDNA为模板，用上述的引物1和引物2进行PCR扩增，得到片段1 ；用上述的引物3和引物4进行PCR扩增，得到片段2。片段1和片段2的核苷酸序列均具有序列表中序列2所示的 序列。2、重组表达载体的构建将片段1插入pIPK质粒的EcoRI和Kpnl酶切位点之间，得到中间质粒，然后将片 段2反向插入上述中间质粒的Xbal和BamHI酶切位点之间，构成重组表达载体(图1)该重组表达载体中，存在一 DNA片段，是由片段1、间隔序列和片段2依次连接组 成，其中片段1的核苷酸序列如序列表中序列2所示，间隔序列如序列表中序列3所示，片 段2的核苷酸序列是片段1的核苷酸序列的反向互补序列。二、转基因植物的制备采用农杆菌介导的叶盘法将上述重组表达载体转化到烟草(Nicotiana tobacumXanthi nc)细胞中，得到重组细胞。本研究所使用的载体含一个可在植物中表达的抗潮霉素的基因，将上述重组细胞 在含有潮霉素的植物再生培养基(MS培养基的大量元素和微量元素加B5培养的维生素、 IBA 0.5mg/L、潮霉素50mg/L、蔗糖30g/L)上筛选抗潮霉素的再生植株，并转移到土中培 养，收获L代种子。通过将获得的I；转基因烟草的种子在含有潮霉素的培养基上生长，可 初步筛选到转基因阳性烟草，进一步利用PCR方法检测外源基因正向插入片段的PCR检测引物L05 (EcoRI) 5 ’ -AAAGAATTCAGCGACTCAAGATCATGGAGTAT-3 ’Han-intron primer2 ， -TCAACTTTTATCTTCTTCGTCTTACACATCACTTGT-3，正向引物L05 (EcoRI)因为位于序列表中序列2的第1位碱基到第23位碱基；反 向引物Han-intron primer2引物位于序列表中序列3的第155位到190位碱基，这对引物 PCR产物位502bp。反向插入片段的PCR检测引物L08 (BamHI) 5 ’ -AAAGGATCCCTGCCACTTCTTCAACTAATTCT-3 ’Han-TerR2 :5， -CAACGTGCACAACAGAATTGAAAGCAAAT-3，正向引物L08 (BamHI)位于序列表中序列2的290位到312位碱基，反向引物 Han-TerR2位于终止子(0CS)的58位到77位，这对引物PCR产物为389bp。能够扩增出上述大小的外源基因片段的植株被认定为转基因烟草，结果得到14 株阳性株系。三、抗蚜虫检测以非转基因烟草为野生型对照。将10个独立的转基因系(每系3株)烟草和其对 照的无菌苗进行虫试，每株烟草独立培养在一个培养瓶中，在无菌苗长到10厘米左右高， 5片叶子左右时接种蚜虫(桃蚜(Myzus persicae)，采自温室培养的烟苗上自然生长的蚜 虫，并在无菌烟苗上继代培养)，每株烟草接种5头蚜虫，培养条件为24°C，每日光照16小 时，每日观察蚜虫生存状况一次，连续观察一个星期。结果显示野生型对照上接种的蚜虫均能正常繁殖，其中对照上接种蚜虫后第4 天的照片如图2a所示。而接种到转基因烟草上的蚜虫可见少量蚜虫脱皮，但是未见繁殖， 4天开始死亡，5天后死虫体发黑，7天后见不到活蚜虫，死亡率达到100%，其中转基因烟草 上接种蚜虫后第4天的照片如图2b和2c所示。
序列表<110>中国科学院微生物研究所 <120> 一种利用RNA干扰技术培育抗虫性提高的转基因植物的方法及其专用DNA 片段<160>3
<210>1
<211>1198
<212>DNA
<213>桃蚜(Myzus persicae)
<400>1
gattgggcgttggttgttccatttcgctgctcgtcgtccgtttcccaaatctttttttca60
cactctttccgattttccggatttccatctcgtcgatatttttcacgtccagtacacggt120
cccaacatggcgctcagcgatgccgatgtcC 3.3.3.3.3. C 3.3.3.tcaaacacatgatggccttc180
atcgaacaggaagccaatgagaaagccgaggaaatcgacgccaaagccgaagaagaattc240
aacattgaaaagggccgcctggtccaacaccagcgactcaagatcatggagtattttgag300
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<210>2
<211>312
<212>DNA
〈213〉桃蚜(Myzus persicae)
<400>2
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60092]agaaaaatgtcacattacgtgttcgtgaaattgatttatcagttgtggaagaattagttg3000093]aagaagtggcag3120094]<210>30095]<211>7670096]<212>DNA0097]〈213〉黄顶(Flaveria trinervia)0098]<400>30099]gtaaggaaataattattttcttttttccttttagtataaaatagttaagtgatgttaatt600100]agtatgattataataatatagttgttataattgtgaaaaaataatttataaatatattgt1200101]ttacataaacaacatagtaatgtaaaaaaatatgacaagtgatgtgtaagacgaagaaga1800102]taaaagttgagagtaagtatattatttttaatgaatttgatcgaacatgtaagatgatat2400103]actagcattaatatttgttttaatcataatagtaattctagctggtttgatgaattaaat3000104]atcaatgataaaatactatagtaaaaataagaataaataaattaaaataatattttttta3600105]tgattaatagtttattatataattaaatatctataccattactaaatattttagtttaaa4200106]agttaataaatattttgttagaaattccaatctgcttgtaatttatcaat3.3.3. C 3.3.3.3.13.4800107]ttaaataacaagctaaagtaacaaataatatcaaactaatagaaacagtaatctaatgta5400108]acaaaacataatctaatgctaatataacaaagcgcaagatctatcattttatatagtatt6000109]attttcaatcaacattcttattaatttctaaataatacttgtagttttattaacttctaa6600110]atggattgactattaattaaatgaattagtcgaacatgaataaacaaggtaacatgatag7200111]atcatgtcattgtgttatcattgatcttacatttggattgattacag76权利要求
一个DNA片段，是式I所示的基因片段SEQ正向-X-SEQ反向(I)其中，SEQ正向是ATP合酶E亚基基因的全长cDNA片段中的至少包括19bp的任何一段；SEQ反向与所述SEQ正向反向互补；X是SEQ正向与SEQ反向之间的间隔序列，X与所述SEQ正向或者X与SEQ反向均不互补；所述ATP合酶E亚基基因的全长cDNA如序列表中序列1所示。
2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于所述自的核苷酸序列如序列表 中序列2所示。
3.根据权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于所述X是内含子，所述内含子的 核苷酸序列如序列表中序列3所示。
4.含有权利要求1-3任一所述DNA片段的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是通过如下方法构建 的重组表达载体将序列表中序列2所示的DNA片段插入pIPK的EcoRI和Kpnl酶切位点之间构成中间 质粒；将将序列表中序列2所示的DNA片段反向插入所述中间质粒的Xbal和BamHI酶切位 点之间，构成重组表达载体。
6.ATP合酶E亚基基因作为RNA干扰靶基因在培育抗虫性提高的转基因植物中的应用。
7.一种培育抗虫性提高的转基因植物的方法，是将权利要求1-3任一所述的DNA片段 导入目的植物中得到转基因植物；所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求1-3任一所述的DNA片段是通 过权利要求4或5所述的重组表达载体导入目的植物中的。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述抗虫是指抗蚜总科的蚜虫，所述 蚜总科的蚜虫优选是蚜科(Aphididae)的蚜虫，更优选是桃蚜(Myzuspersicae)。
10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于所述植物为任何可以被蚜总科的 蚜虫感染并且含有蚜虫ATP合酶E亚基基因的植物，优选是烟草。
全文摘要
本发明公开了一种利用RNA干扰技术培育抗虫性提高的转基因植物的方法及其专用DNA片段。该DNA片段是式I所示的基因片段，其中，SEQ正向是ATP合酶E亚基基因的全长cDNA片段中的至少包括19bp的任何一段；SEQ反向与所述SEQ正向反向互补；X是SEQ正向与SEQ反向之间的间隔序列，X与所述SEQ正向或者X与SEQ反向均不互补；所述ATP合酶E亚基基因的全长cDNA如序列表中序列1所示。本发明的另一目的在于提供ATP合酶E亚基基因在培育抗虫性提高的转基因植物中作为RNA干扰靶基因的应用。实验证明接种到野生型烟草上的蚜虫生长繁殖正常，接种到转基因烟草上的蚜虫，4天开始死亡，5天后死虫体发黑，7天后见不到活蚜虫。SEQ正向-X-SEQ反向 (I)。
文档编号C12N15/113GK101851622SQ201010034319
公开日2010年10月6日 申请日期2010年1月15日 优先权日2010年1月15日
发明者方荣祥, 郭红艳, 陈晓英 申请人:中国科学院微生物研究所