专利名称：一种茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH、该基因编码的蛋白以及该基因的应用， 通过茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH基因工程技术的研究，培育氨基酸含量高的茶树新品 种，属于基因工程技术领域。
背景技术：
谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehyd rogenase，⑶H ；EC 1. 4. 1. 2)普遍存在于植物体 内，该酶主要位于植物线粒体内，由两个亚基(α和β)按不同比例组成七种同工酶形式。 GDH既能催化铵与α-酮戊二酸结合生成谷氨酸，也能催化谷氨酸氧化脱羧。GDH曾被认为 是植物同化铵的主要酶，直到1974年证实谷氨酰胺合成酶(GQ-谷氨酸合酶(GOGAT)循环 才是高等植物体内铵同化的主要途径，因此，对于高等植物的GDH功能的研究与解释一直 存在争议。较为普遍的观点认为，GDH在植物体内只要行使同化铵离子的功能，是高等植物 N代谢途径中的一个重要成员。基于⑶H在植物氮素吸收利用过程中的重要作用，近年来关于利用⑶H基因进行 转基因植物的研究比较多。已有研究表明，将大肠杆菌的gdhA转入烟草，提高了烟草产量， 转基因烟草中游离氨基酸和碳水化合物的含量与野生型相比有所提高。将大肠杆菌的gdhA 转入玉米，同样提高了玉米的产量，并且同时提高了玉米对于干旱的耐受力。将小球藻GDH 基因转入烟草内，增加了烟草对于铵离子的吸收和利用，提高了烟草对氮素的利用效率。将 番茄GDH基因Iegdhl转入番茄后，转基因番茄中总游离氨基酸的量是正常番茄的2. 3倍， 特别是谷氨酸的含量明显增加。GDH基因能够显著改变植物生长状态，提高植物的产量以及 对于一些胁迫环境的耐受力，具有重要的应用价值。茶树[Camellia sinensis (L.) 0. Kuntze]属于山茶科山茶属，为多年生常绿木本 植物。茶树是重要的叶用经济植物，因此是喜氮作物，对氮的需求量最大。氮素被茶树吸收 后，在茶树体内主要转化为各类氨基酸。氨基酸是茶叶鲜爽为的主要物质，是决定茶叶香、 味的主要化学成分，尤其对绿茶滋味的影响尤为明显，与茶叶品质呈显著正相关。因此，通 过植物基因工程技术，培育氨基酸含量高的茶树新品种，具有重要的经济价值。
发明内容
本发明所要解决的第一个问题是提供一种茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH，其具有 如序列表SEQ ID NO 1所示的基因序列。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种茶树谷氨酸脱氢酶基因Cs⑶H，通过设计一对简并引物RDOl和RD02进行PCR
扩增，其主要特点是简并引物RD01，其序列为5-CGC CCG GGG CCC NAT GAARGG-3 ；简并引物RD02，其序列为5-TCA CGC CCA GGG TGA ANG CNCCCAT-3 ；茶树谷氨酸脱氢酶基因Cs⑶H保守片段的PCR扩增条件为94°C预变性!Min ；95°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，35个循环；72°C终止延伸IOmin0扩增反应后得到序列长度为的Cs⑶H基因的保守序列片段。对Cs⑶H基因进行5' RACE和3' RACE操作。根据已经获得的Cs⑶H保守片段 设计两个基因特异性引物，其主要特点是基因特性引物5' -GSP，其序列为5' -AGT GAC ATC ACC GGA GCAGTT AAG A-3'；基因特性引物3' -GSP，其序列为5' -ACC ACG TCC AGT TGC AGCCTC CCT A-3'。5' RACE PCR反应循环参数为94°C预变性anin ;95°C变性30s，64°C退火45s， 72°C延伸40s，;35个循环；72°C终止延伸lOmin。3' RACEPCR反应循环参数为94°C预变性 2min ；95°C变性 30s，64°C退火 45s，72°C延伸 40s，;35 个循环；72°C终止延伸 IOmin0通过5' RACE和3' RACE，分别获得了长度为512bp和498bp的Cs⑶H基因的5' 端和3'端序列(图4)。将三段基因片段拼接后获得了 Cs⑶H的cDNA序列，如序列表SEQ ID NO 1 所示。CsGDH 全长 1667bp。本发明所要解决的第二个问题是提供上述基因所编码的蛋白质CsGDH及其制备 方法，其具有如序列表SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本发明解决上述技术问题的技术方案如下通过ORFinder软件预测，Cs⑶H基因编码一个411个氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO 2 所示。本发明所要解决的第三个问题是提供含有茶树Cs⑶H基因的重组质粒 pMAL-Cs⑶H及其构建方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下利用设计的两种扩增引物Cs⑶H-Pl和Cs⑶H-P2进行PCR扩增。所述两种扩增 引物的序列分别为CsGDH-Pl 5' -AAT ATC GCG GATCCA TGA ACG CTC TCG CCG CCA CAA ACC-3‘ ；CsGDH-P2 5' -ATAAGA ATA AGC TTC GCT TCC CAA CCC CTT AAT ACA GTT-3‘。所述PCR扩增反应条件为95°C预变性:3min ；95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延 伸lmin30s，反应35个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物与载体pMAL_p2X分别经BamHI和 HindIII双酶切4小时候后进行连接，获得原核表达质粒pMAL-Cs⑶H。本发明所要解决的第四个问题是提供在大肠杆菌中异源表达的茶树CsGDH蛋白。本发明解决上述技术问题的技术方案如下构建了一种含有茶树Cs⑶H基因的重组质粒pMAL-Cs⑶H。将该重组质粒转化至 E. coliRosetta(DE3)感受态细胞，挑取单克隆于5ml LB液体培养基中，37°C，225rpm，培 养12h。取Iml菌液接种于50ml的LB液体培养基中扩大培养，37°C，225rpm，振荡培养至 OD600 0. 6-0. 8，加入IPTG至终浓度0. 5mM，22°C诱导表达20h。将诱导后的菌液于4°C， 5，OOOrpm,离心5min，收集菌体，超声波破碎后SDS-PAGE检测，发现重组蛋白MBP-Cs⑶H存 在于可溶性的上清蛋白中(图4)。本发明所要解决的第五个问题是提供茶树CsGDH基因在转基因植物中的应用。本发明的有益效果是茶树[Camellia sinensis (L. ) 0. Kuntze]属于山茶科山茶 属，为多年生常绿木本植物。茶树是重要的叶用经济植物，因此是喜氮作物，对氮的需求量最大。氮素被茶树吸收后，在茶树体内主要转化为各类氨基酸。氨基酸是茶叶鲜爽为的主 要物质，是决定茶叶香、味的主要化学成分，尤其对绿茶滋味的影响尤为明显，与茶叶品质 呈显著正相关。因此，通过植物基因工程技术，培育氨基酸含量高的茶树新品种，具有重要 的经济价值。
图1茶树总RNA电泳图。图2茶树总cDNA电泳图。图3Cs⑶H基因的保守片段、5' RACE产物以及3' RACE产物电泳图。M,DNA marker ； lane 1，CsGDH基因的保守片段，965bp ;lane2，CsGDH基因 5 ‘ RACE 产物，512bp ;lane 3，CsGDH 基因 3' RACE 产物，498bp。图4MBP-Cs⑶H融合蛋白SDS-PAGE电泳图。M, protein molecular marker ；lane 1，pMAL_p2X 空载质粒转化 Rosetta (DE3) 菌，诱导表达后的上清蛋白，融合标签MBP蛋白分子量约为43kDa ;lane 3，pMAL_Cs⑶H 重组质粒转化Rosetta(DE3)菌，诱导表达后的上清蛋白，CsGDH本身分子量约为45kDa， MBP-Cs⑶H融合蛋白分子量约为88kDa。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。实施例一一种茶树谷氨酸脱氢酶基因Cs⑶H。采用SV Total RNA Isolation System(Promega)提取茶叶总 RNA(图 1)。提取 的总 RNA利用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)进行反转录，合成 cDNA第一链(图2)。依据谷氨酸脱氢酶蛋白家族的保守性，设计一对简并引物RD01(5-CGC CCG GGG CCC NATGAA RGG-3)和 RD02 (5-TCA CGC CCA GGG TGA ANG CNC CCAT-3)进行 PCR 扩增。PCR反应循环参数为94°C预变性:3min ；95°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin， 35个循环；72°C终止延伸lOmin。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(图3)。使用DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收 PCR 产物。将该 DNA 片段连接到 pMD 19-T 载体(TaKaRa)， 阳性克隆送到上海生工生物工程公司进行测序，得到96^p Cs⑶H基因的保守序列片段。使用GeneRacer Kit (Invitrogen)进行 CsBDP 的 5 ‘ RACE 和 3 ‘ RACE 操作。根 据已经获得的CsBDP的保守片段设计两个基因特异性引物，分别为5' -GSP(5‘ -AGTGAC ATC ACC GGA GCA GTT AAG A-3 ‘)禾口 3 ‘ -GSP (5 ‘ -ACC ACG TCC AGT TGC AGC CTC CCT A-3')。5' RACE PCR反应循环参数为94°C预变性^iiin ；95°C变性30s，64°C退火45s， 72°C延伸40s，;35个循环；72°C终止延伸lOmin。3' RACEPCR反应循环参数为94°C预变性 2min ；95°C变性 30s，64°C退火 45s，72°C延伸 40s，35 个循环；72°C终止延伸 IOmin0琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶回收PCR产物。使用Τ0Ρ0 TACloning Kit(Invitrogen)克隆RACE PCR产物，操作按说明书进行。将阳性克隆送至上海生工生物 工程有限公司测序。通过5' RACE和3' RACE,分别获得了 512bp和498bp的CsBDP的5'端和3'端序列(图3)。将三段基因片段拼接后获得了 CsBDP的全长cDNA序列，如序列表 SEQ ID NO 1 所示。CsBDP 全长 1667bp。实施例二 一种由Cs⑶H基因编码的蛋白质Cs⑶H。通过ORFinder软件预测，CsBDP基因编码一个411个氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO 2 所示。实施例三一种含有茶树Cs⑶H基因的重组质粒pMAL-Cs⑶H。利用CsGDH-P 1 (5 ‘ -AAT ATC GCG GAT CCA TGA ACG CTC TCGCCG CCA CAA ACC-3 ‘)禾口 CsGDH-P2 (5 ‘ -ATA AGA ATA AGC TTCGCT TCC CAA CCC CTT AAT ACA GTT-3')进行PCR扩增，反应条件为95°C预变性:3min ；95°C变性30s，55°C退火30s，72°C 延伸lmin30s，反应；35个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物与载体pMAL_p2X (NewEngland Biolabs)分别经BamHI和HindiII双酶切4小时候后进行连接，获得原核表达质粒 pMAL-CsGDHo实施例四一种含有茶树Cs⑶H蛋白的融合蛋白MBP-Cs⑶H。将pMAL-Cs⑶H重组质粒转化至E. coli Rosetta (DE3)感受态细胞，挑取单克隆于 5ml LB液体培养基中，37 0C，225rpm,培养12h。取Iml菌液接种于50ml的LB液体培养基 中扩大培养，370C，225rpm,振荡培养至OD6tltl ^ 0. 6-0. 8，加入IPTG至终浓度0. 5mM, 22°C诱 导表达20h。将诱导后的菌液于4°C，5，OOOrpm,离心5min，收集菌体，超声波破碎后SDS-PAGE 检测，发现重组蛋白MBP-Cs⑶H存在于可溶性的上清蛋白中(图4)。序列表
SEQUENCE LISTING
<110>安徽师范大学
<120>茶树CsGDH基因序歹Ij
<130>1
<140>1
<141>2009-11-27
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1667
<212>DNA
<213> 茶树(Camellia sinensis)
<400>1
tcgactggag cacgaggaca ctgacatggactgaaggagtagaaaattcc
tttgatccat60
tataatctct cactacacag tttccattta 3. 3. 3. 3. 3.
tttgaactgt120
ttgatccatt ttagtttctg ggtattgcttgtttgagtgattctcacaca
accatgaacg1800068]ctctcgccgccacaaaccgcaactttcgtcgtgcggctcgcattcttgga0069]ttggactcta2400070]ggattgagaagagtcttttgattccgttcagagaaatcaaggtagaatgc0071]acaattccta3000072]aggatgatggaactctggtgtcctacgttggattcagagtccaacatgat0073]aattctcgag3600074]gccccatgaaaggagggatcagataccatcctgaggttgatcctgatgag0075]gtaaatgctc4200076]tagctcaattgatgacatggaagactgctgtagcagacattccttatggt0077]ggagctaagg4800078]gtggaattggatgcaagccaaaggatttaggtaatagtgaattggaacgt0079]ctcactcggg5400080]tcttcactca￡1￡1￡1￡1￡Ι 0￡Ι gatctaattggggttaatagggatgtccct0081]gcgccggaca6000082]tggggactaatgcacagaccatggcttggattttggatgaatactcgaag0083]tttcatggtc6600084]attcaccagctgttgtgaccgggaagcccatagatcttggtgggtccctg0085]ggtagggagg7200086]ctgcaactggacgtggtgttatttatgccacagaagctttactcgctgaa0087]tatggaaaat7800088]caatcaaggatttgacatttgccatacagggttttggcaacgtggggtct0089]tgggcagcaa8400090]ggcttattcatgagagaggtggtaaggtcattgcagtgagtgacatcacc0091]ggagcagtta9000092]agaacccaaatgggattgatattccaattttgcttaatcataaggaagca0093]acggggagct9600094]tgaaaaattttgatggtggagatgccatgcatccaaatgaattgctccta0095]cataaatgtg10200096]atgtcctgattccatgtgccttgggaggagttatcaacagagaaaacgct0097]gataatgtaa10800098]gggccaagttcattgtaggagcggcaaatcatcctactgatccagaggca0099]gatgagattc11400100]tatctaagaaaggagttataatactacctgatatatatgcaaattctgga0101]ggtgtgacgg12000102]tcagctattttgagtgggtccagaatattcaaggtttcatgtgggacgaa0103]gagaaggtga12600104]acaaagagcttcataggtacatgacaagagctttcggtaacatcaaaagc0105]atgtgtcaga13200106]cacacaattgcaacctccgaatgggtgcgttcacgctgggagtgaatcgt0107]gttgcacggg13800108]caactgtattaaggggttgg gaagcgtgat ￡1￡1￡Ι 0￡100 tcacattcta0109]tttctccttt14400110]ttttcgtcttacaaataaat gcatttttgccgctgaagaatgcagcttga0111]tagcggttct15000112]ttgttttttttttttgggta agtaattgatagccgttcttaccctcccatttatagactg0113]15600114]tccgtgacttgaactcacgc tttcaggacgctggtcttaaaaaagttaaa0115]agactgtgta16200116]ctgttgtctgaaaatttgag gatcaaaaaa-&￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡lSLSLSLSLSLSLSL0117]16670118]<210>1<211>4110119]<212>RT0120]<213> 茶树(Camelliasinensis)0121]<400>20122]MetAsnAlaLeuAlaAlaThrAsnArgAsnPheArgArgAlaAla Arg0123]1510150124]IleLeuGlyLeuAspSerArglieGluLysSerLeuLeuliePro Phe0125]2025300126]ArgGlulieLysValGluCysThrlieProLysAspAspGlyThr Leu0127]3540450128]ValSerTyrValGlyPheArgValGlnHisAspAsnSerArgGly Pro0129]5055600130]MetLysGlyGlylieArgTyrHisProGluValAspProAspGlu Val0131]657075800132]AsnAlaLeuAlaGlnLeuMetThrTrpLysThrAlaValAlaAsp lie0133]8590950134]ProTyrGlyGlyAlaLysGlyGlylieGlyCysLysProLysAsp Leu0135]1001051100136]GlyAsnSerGluLeuGluArgLeuThrArgValPheThrGlnLys lie0137]1151201250138]HisAspLeulieGlyValAsnArgAspValProAlaProAspMet Gly0139]1301351400140]ThrAsnAlaGlnThrMetAlaTrplieLeuAspGluTyrSerLys Phe0141]1451501551600142]HisGlyHisSerProAlaValValThrGlyLysProlieAspLeu Gly0143]1651701750144]GlySerLeuGlyArgGluAlaAlaThrGlyArgGlyVallieTyr Ala0145]1801851900146]ThrGluAlaLeuLeuAlaGluTyrGlyLysSerlieLysAspLeuThr0147]1952002050148]PheAlalieGlnGlyPheGlyAsnValGlySerTrpAlaAlaArgLeu0149]2102152200150]IleHisGluArgGlyGlyLysVallieAlaValSerAsplieThrGly0151]2252302352400152]AlaValLysAsnProAsnGlylieAsplieProlieLeuLeuAsnHis0153]2452502550154]LysGluAlaThrGlySerLeuLysAsnPheAspGlyGlyAspAlaMet0155]2602652700156]HisProAsnGluLeuLeuLeuHisLysCysAspValLeulieProCys0157]2752802850158]AlaLeuGlyGlyVallieAsnArgGluAsnAlaAspAsnValArgAla0159]2902953000160]LysPhelieValGlyAlaAlaAsnHisProThrAspProGluAlaAsp0161]3053103153200162]GlulieLeuSerLysLysGlyVallielieLeuProAsplieTyrAla0163]3253303350164]AsnSerGlyGlyValThrValSerTyrPheGluTrpValGlnAsnlie0165]3403453500166]GlnGlyPheMetTrpAspGluGluLysValAsnLysGluLeuHisArg0167]3553603650168]TyrMetThrArgAlaPheGlyAsnlieLysSerMetCysGlnThrHis0169]3703753800170]AsnCysAsnLeuArgMetGlyAlaPheThrLeuGlyValAsnArgVal0171]3853903954000172]AlaArgAlaThrValLeuArgGlyTrpGluAla0173]405410
权利要求
1.一种茶树谷氨酸脱氢酶基因Cs⑶H，其特征在于，含有所述Cs⑶H基因的CDNA全长 1667bp，其包括长度为1236bp的开放阅读框(ORF)以及17!3bp的5'端非翻译区和258bp 的3'端非翻译区。
2.一种由权利要求1所述的茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH编码的蛋白质，其特征在于， 该蛋白质为CsGDH基因编码的含有411个氨基酸的多肽。
3.一种含有如权利要求1所述的茶树谷氨酸脱氢酶基因Cs⑶H的重组质粒 pMAL-Cs⑶H，其特征在于，由两种扩增引物Cs⑶H-Pl和Cs⑶H-P2经过PCR扩增反应后， 扩增产物与载体pMAL-p2X分别经BamHI和HindIII双酶切4小时候后进行连接获得；所 述PCR方法中设计的两种扩增引物Cs⑶H-P1和Cs⑶H-P2的基因型分别为Cs⑶H-P1 5' -AAT ATC GCG GAT CCA TGA ACG CTC TCG CCG CCA CAAACC-3‘禾口 CsGDH_P2 5' -ATA AGA ATA AGC TTC GCT TCC CAACCC CTT AAT ACA GTT-3‘；所述PCR方法反应条件为95°C， 预变性 3min ；95°C，30s，55°C，30s，72°C，Imin 30s，反应 35 个循环；72°C延伸 IOmin0
4.一种含有如权利要求2所述的茶树谷氨酸脱氢酶Cs⑶H的重组蛋白MBP-Cs⑶H，其 特征在于，该重组蛋白是将PMAL-Cs⑶H重组质粒转化至E. coli Rosetta(DE3)感受态细 胞，经过扩大培养和诱导表达并通过超声波破碎的方法获得。
全文摘要
本发明涉及一种茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH。所述茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH含有所述CsGDH基因的cDNA全长1667bp，其包括长度为1236bp的开放阅读框(ORF)以及173bp的5′端非翻译区和258bp的3′端非翻译区。将本发明茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH与表达载体pMAL-p2X连接，转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，经诱导表达，获得了可溶性融合蛋白MBP-CsGDH。本发明茶树谷氨酸脱氢酶基因CsGDH在转基因植物中具有重要的应用价值，可用于茶树的基因改良，通过转入CsGDH基因，可调节茶树体内的氮素代谢，提高茶叶中的氨基酸，特别是谷氨酸的含量。
文档编号C12N15/53GK102121019SQ20101004652
公开日2011年7月13日 申请日期2010年1月8日 优先权日2010年1月8日
发明者宋平, 朱国萍, 王宝娟, 王晖, 王鹏, 葛亚东 申请人:安徽师范大学