专利名称：一种水稻热胁迫转录因子在育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物育种，具体涉及水稻热胁迫转录因子0sHsfA2d在培育种子耐储 存和抵御播种期冷害植物品种中的应用。
背景技术：
我国北方大部分地区水稻播种期正处在夏初，容易遭遇低温冷害，使水稻种子萌 发受损，造成农业减产受损。但若延迟播种，容易错过土壤墒情，增加农民生产成本。培育 延迟种子萌发的水稻新品种可以很好的既不使农民错过好的土壤墒情期，又能有效的避开 萌发期低温冷害，保正水稻种子的正常的发芽率，保持农业生产的正常进行。粮食种子贮存过程中会因为一些种子的霉变或者发芽而造成生产上的损失进而 影响粮食安全。故若能找到抑制种子发芽的基因使种子发芽受损或者丧失发芽能力可为种 子贮存提供一个安全保障。故阐明水稻萌发和发芽的分子机制，尽快地分离、鉴定出一批影响水稻萌发和发 芽的基因，是我们利用基因工程手段加快作物品种改良进程的关键因素之一。热胁迫是许多植物在高温夏季每天都必需面临的环境因素，虽然水稻为喜温作 物，但是水稻在开花期和灌浆期对高温非常敏感，容易形成“高温逼熟”，使产量锐减。研究 发现，对高温的耐受差异性是品种固有的遗传特性决定的，含有粳稻基因的亲本组合和含 有早熟基因的亲本组合均表现为不耐高温热害，而常规稻、中等穗型的水稻，其高温热害明 显轻发，主要原因是粳稻基因不耐高温，早熟基因不耐高温，大穗型对营养要求高，对环境 要求严，也不耐高温。陆地植物在长期的进化过程中，产生了一系列的措施以便适应环境的快速变化， 由于陆生植物不能移动，植物对于低温、高温、盐胁迫、重金属和极端缺水干旱的极端环境， 能够迅速做出反应，使它们得以生存和繁衍。其中，热胁迫蛋白(heat stress proteins, Hsps)广泛存在于所有真核生物和原核生物中，它们在各种胁迫反应中都起着重要的作用 组成型表达的热胁迫蛋白是一类分子伴侣(Molecular Chaperones)，它们参与维持蛋白质 的合成、折叠、运输、功能和降解等过程。热胁迫蛋白的表达直接受热胁迫转录因子(heat stress transcriptionfactors，Hsfs)的调控，这些转录因子是热胁迫反应中的关键调节 因子。根据热胁迫转录因子的蛋白结构，高等植物的热胁迫转录因子分为三类，A，B和 C类。和其它的转录因子一样，热胁迫转录因子的大小和序列各不相同，但它们具有一定 的结构模式N末端具有DNA结合结构域(DBD)，它可以特异性地识别热胁迫蛋白启动子上 的序列(heat stress promoter elements，HSE)。HSE由具有二折对称结构的重复序列 (5，-AGAAnnTTCT-3')组成，存在于受热诱导的基因启动子TATABox的上游。与DNA结合 结构域相邻的是HR-A/B区以及核定位信号(NLS)和核输出信号(NES)以及激活肽结构域 (AHA)。在高等植物中，对于热胁迫转录因子只在拟南芥和番茄有着较为系统的研究，对于番茄20多个Hsfs的研究发现，HsfAU A2和Bl代表了三个最重要的家族，它们分别在 热胁迫发生的三个阶段，诱发、维持和恢复中起着不同的作用。在番茄中，HsfAla是热胁迫 反应中最主要的调节蛋白，它参与诱导包括HsfA2和HsfBl在内的热诱导蛋白；过量表达 HsfAla的转基因番茄，比野生型对照耐热性增加；而降低HsfAla表达的番茄，对于高温胁 迫超敏感，并伴有Hsp70转录的减少和果实成熟的延缓，因此HsfAla在耐高温胁迫反应中 是必不可少的；。HsfA2只在热诱导后表达，是最主要的Hsf，在炎热的夏天参与多次的热胁 迫和恢复过程；HsfA2的活性受到一系列蛋白，通过调控其溶解性、细胞内的定位以及激活 功能实现的；Hspl7-CII可以与HsfA2 C末端相互作用，形成特异的共抑制子，两者在胞质 中形成大的颗粒聚合物，该聚合物可以在Hspl7-CI存在下、或者HsfA2与HsfAl形成异源 二聚体进入细胞核后解聚，解聚过程需要依赖于ATP的Hsp70和HsplOl分子伴侣的活性； HsfBl与HsfAl协同作用，招募包括组蛋白乙酰化酶HACl转录共激活子。
发明内容
本发明的目的是提供水稻一种热胁迫转录因子0sHsfA2d在培育种子耐储存和抵 御播种期冷害育种中的应用本发明所提供的热胁迫转录因子，来源于水稻(Oryza sativa L.)，名称为 0sHsfA2d，是如下(a)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；其中，序列表中的序列1由379个氨基酸残基组成。所述热胁迫转录因子0sHsfA2d蛋白的编码基因，具体可为如下1)或2~)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2 ；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码热胁迫转录因子0sHsfA2d蛋白 的DNA分子。所述严格条件可为在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下杂 交，并用该溶液洗膜。序列表中的序列2由1140个脱氧核糖核苷酸组成，是0sHsfA2d的⑶S基因序列。含有上述热胁迫转录因子0sHsfA2d蛋白编码基因的重组表达载体具体可为如图 1 所示的 pCAMBIA2300-W3iqutin-FLAG-0sHsfA2d。所述重组植物表达载体可通过农杆菌介导等常规生物学方法转化水稻细胞或组 织，并将转化的水稻组织培育成植株。实验证明，pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG-0sHsfA2d转基因水稻种子萌发受抑制甚 至丧失发芽能力。说明0sHsfA2d基因能够影响种子萌发和发芽，因此可用于培育种子储存 和播种期抵御低温冷害。下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图 1 为 pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG_0sHsfA2d 的物理图谱图2为pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG_0sHsfA2d转基因株系种子萌发延迟甚至丧 失发芽能力(A:28°C,B:24°C )
具体实施例方式实施例1、植物表达载体的构建以pCAMBIA1302-FLAG(XF0349)为模板，用下面的引物扩增出FLAG的全长片段，用 KpnI和BamHI分别单切此PCR产物和pCAMBIA2302-Ubiqutin_ocs (XF0422)，回收后连接得 到 pCAMBIA2302-Ubiqutin_FLAG(XF0426)水稻过表达载体。扩增后含 FLAG 的 sequence :G GTACCATGGACTACAAGGACGATGATGACAAGGGCGACTATAAGGATGACGACGATAAGACTAGTCCCGGGACGCGT GGATCC以引物 CXO1078 5，-CGCTCTAGA ATGATTAAGAGGAGGAGACCA-3，和 CXO1079 5，-CGT GGATCCCTACTTTTGGCTACTATTGC-3，(含有XbaI和BamHI识别位点)从水稻cDNA中扩增出相 应的osHsfA2d全长cDNA基因，用)(bal和BamHI酶切载体XFO似6，用T4DNA连接酶链接，将 连接产物转化到大肠杆菌JM109，相应抗性平板上筛选抗性菌落，进行PCR鉴定，得到含有 植物表达载体pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG-0sHsfA2d的阳性菌落。提取阳性菌落中的质 粒，得到植物表达载体实施例2、转基因株系种子萌发和发芽受抑制选取野生型和转0sHsfA2d基因各约40粒的水稻种子放在经水浸湿的铺有双层滤 纸的培养皿中，用纱布覆盖，分别置于和培养箱中培养，每天用已经准备好的清 水早晚换水。9天后观察种子萌发情况，如图6可见转0sHsfA2d基因种子萌发迟缓甚至受 抑制，且0sHsfA2d基因纯和的种子萌发受到的抑制程度更强。图6中每一行左侧第一个为 野生型水稻种子，第二为转0sHsfA2d基因Tl代杂合种子，第三个为转0sHsfA2d基因Tl代
纯和的水稻种子。
SEQUENCE LISTING
<110>中科院遗传与发育生物学研究所
<120> 一种水稻热胁迫转录因子在育种中的应用
<130>CXF4
<160>1
<170>PatentIn version 3.,5
<210>1
<211>379
<212>PRT
<213>水稻属水稻(Oryza :sativa L.)
<400>1
Met GluLysMetMetProGlyMet ValLysGlu GluTrp ProProSer
151015
Ser ProGluGluGlyGluAlaPro ArgProMet GluGly LeuHisGlu
202530
Val GlyProProProPheLeuThr LysThrPhe AspLeu ValAlaAsp
354045
Pro AlaThrAspGlyValValSer TrpGlyArg AlaGly SerSerPhe
505560
ValValTrpAspProHisValPheAlaAlaValPheLeuProArgPhe
65707580
PheLysHisAsnAsnPheSerSerPheValArgGlnLeuAsnThrTyr
859095
PheLeuValArgThrAsnTyrLeuAsnLysArgSerHisPheTyrSer
100105110
LeuArgPheGlnGlyPheArgLyslieAspProAspArgTrpGluPhe
115120125
AlaAsnAspGlyPheLeuArgGlyGlnArgHisLeuLeuLysMetlie
130135140
LysArgArgArgProLeuSerTyrLeuProGlySerGlnGlnAlaLeu
145150155160
GlyThrCysLeuGluValGlyGlnPheGlyLeuAspGluGlulieAsp
165170175
ArgLeuLysArgAspLysAsnlieLeuLeuAlaGluValValLysLeu
180185190
ArgHisLysGlnGlnSerThrLysAlaAsnMetArgAlaMetGluGlu
195200205
ArgLeuGlnHisAlaGluGlnLysGlnValGlnMetMetGlyPheLeu
210215220
AlaArgAlaMetGlnAsnProAspPhePheHisGlnLeulieHisGln
225230235240
GlnAspLysMetLysGlyLeuGluAspThrPheSerLysLysArgThr
245250255
ArgSerlieAsplieValProPheLeuAsnProGlyGluValSerGln
260265270
GlyAspGlnLeuGluSerThrLeuLeuPheAspProArgProPheAla
275280285
GluLeuAsnAspGluProAlaLysSerGluLeuGluAsnLeuAlaLeu
290295300
AsnlieGlnGlyLeuGlyLysGlyLysGlnAspValAsnArgThrArg
305310315320
AsnGlnProArgAsnGlnAlaSerAsnGluThrGluLeuThrAspAsp
325330335
PheTrpGluGluLeuLeuAsnGluGlyAlaArgAspAspAlaGlylie
340345350
ProGlyMetGluArgArgArgProArgTyrValAspAlaLeuAlaGln
355360365
Lys Leu Gly Tyr Leu Ser Asn Ser Ser Gln Lys370375<210>1<211>1140<212>DNA<213>7jC稻属水稻(Oryza sativa L.)<400>1
0093]atggagaagatgatgccggggatggtgaaggaggagtggccgccgagctcgccggaggag600094]ggggaggcgccgaggcccatggaggggctgcacgaggtcgggccgccgccgttcctgacc1200095]aagacgttcgacctggtggccgacccggccaccgacggcgtcgtctcgtggggccgcgcg1800096]ggcagcagcttcgtcgtctgggacccccacgtcttcgccgccgtcttcctcccacgcttc2400097]ttcaagcacaacaatttctccagcttcgtccgccagctcaacacctacttCttggtCCgg3000098]acgaattacctgaacaagcgatcacatttctacagtttgagatttcagggtttcagaaag3600099]attgatcctgacagatgggaattcgcgaatgatggtttcctgagaggccagaggcatctt4200100]ctaaagatgattaagaggaggagaccattgtcttatctccctggatctcagcaggcactt4800101]ggcacctgccttgaggttggtcagttcggattagatgaagagatcgacaggctaaagcgt5400102]gacaagaacatcttactcgcggaggttgtgaaactaaggcacaagcagcaaagcacgaaa6000103]gccaatatgcgagccatggaagagaggctgcaacatgcggagcagaagcaggtccagatg6600104]atgggtttcttggcaagagcaatgcagaaccctgacttctttcaccagttgattcaccag7200105]caggataaaatgaaggggctcgaggacacattctcgaagaagaggacgaggtcgatagac7800106]atagtgccatttctcaaccccggggaggtcagccagggcgatcaactcgagtcgacattg8400107]ctgtttgatccaaggccatttgctgaactgaatgatgagcctgcaaagtctgaactggag9000108]aatttagcactgaacatccagggtcttgggaagggcaagcaggatgtcaacaggactcga9600109]aatcagccacgaaatcaggctagcaacgaaaccgagttaaccgacgacttctgggaggag10200110]cttctgaatgaaggagcaagagatgatgctgggattccagggatggagcgaagaagacct10800111]agatatgtcgatgcattagcgcagaagctgggttatctaagcaatagtagccaaaagtag1140
权利要求
1.一种热胁迫转录因子及其编码基因在培育抵耐储存种子育种中的应用，其碱基序列 如SEQID NO 2所示，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一种热胁迫转录因子及其编码基因在培育抵御播种期冷害植物品种中的应用，其碱 基序列如SEQ ID NO 2所示，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO 1所示。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述植物为水稻、玉米、小麦、大豆和番茄。
6.根据权利要求2所述应用，其特征在于所述植物为水稻、玉米、小麦、大豆和番茄。
7.含有权利要求1所述的水稻热胁迫转录因子编码基因的植物表达载体。
8.含有权利要求1所述的水稻热胁迫转录因子编码基因的宿主菌。
全文摘要
本发明公开水稻热胁迫转录因子OsHsfA2d在培育耐储存和抵御播种期冷害育种中的应用。本发明人通过构建过表达OsHsfA2d的水稻突变株，发现该突变株种子萌发和发芽延迟甚至丧失发芽能力。这一结果为培育耐储存和抵御播种期冷害植物新品种提供了一个可利用的新基因资源。
文档编号C12N1/19GK102134273SQ20101010118
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者亓建飞, 冯明姬, 崔霞, 曹守云, 曹晓风, 李杭序 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所