专利名称：用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物，其特征在于，谷胱甘肽生产性 酵母的培养基内含有肌醇和烟酰胺，在加快谷胱甘肽生产性酵母的生长繁殖速度的同时， 增加菌体内谷胱甘肽积蓄量。
背景技术：
关于谷胱甘肽生产性酵母，自以前起，酵母(Saccharomyces)属的生产率高，菌体 内积蓄量多的情况便为人们所知，据报告显示，其中，酵母属Cystinovolensis与其它具 代表性的谷胱甘肽生产性酵母——酿酒酵母和卡氏酵母——相比，具有生产率更高的菌种 特性(日本特愿昭52-8984)。还有报告显示，遗传基因引入技术可使酿酒酵母中谷胱甘 肽的积蓄量增加(日本特开平6-7075 。此外，通过向培养基内添加锌离子，谷胱甘肽的 生成积蓄量将会增加(日本特开平11-92394)。此外，亦有报告显示，挑选酵母属酵母的 突然变异株，提高锌离子的耐受性，这样便可使谷胱甘肽的生成积蓄量增加(日本特愿平 1-115295)。无论哪项技术，都以增加酵母菌中谷胱甘肽的生成积蓄量，最终增加生产收率 为目的。然而，尽管添加锌离子会产生其相应的效果，但需指出的是，培养基内锌离子的浓 度梯度难以控制，此外，还可能产生种种问题，例如由于菌的不同，在高浓度锌离子存在的 情况下，可能引起繁殖障碍等。虽然通过挑选突然变异株也有得到改观的倾向，但不一定会 收到良好的效果。
发明内容
本发明最重要的目的是提高谷胱甘肽产生菌的生长繁殖速度，进而延长菌的谷胱 甘肽合成活性半衰期，故而致力于培养基的改良。发明者知道，不论动物还是植物，正常细 胞培养中若有肌醇的存在，那么培养基的环境本身便可得到调节，从而保持对葡萄糖这种 养分的稳定吸收，于是发明者尝试向培养基内添加肌醇。此外，液态物质、细胞培养液状态 下，混合液本身的稳定性会对细胞的繁殖率产生巨大影响，发明者认为这是培养基内氧化 物的增加造成的。为此，发明者选出生物体内广泛存在、能对电子的授受进行可逆性操作的 抗氧化物质作为最适宜添加进培养基内的物质，这就是烟酰胺。也就是说，本技术是以通过 向培养基内添加肌醇和烟酰胺，加快谷胱甘肽生成菌生长繁殖速度，进而延长谷胱甘肽合 成活性半衰期为特征的技术。通过利用本技术，可增加谷胱甘肽在细胞内的积蓄量，与锌离 子添加技术、遗传基因重组技术相比，在最终收率上，会得到同等甚至更高的生产率。培养 后的菌体可通过离心分离等方式收集，并用热水提取。提取是指将收集到的菌体的浓度调 节至6 10%后，使其悬浮于95 100°C的热水中，并保持1 10分钟，然后再提取。基于上述目的，本发明提供一种用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物， 其特征在于，含有0. OlmM/IOOmL ImM/lOOmL的肌醇及0. OlmM/IOOmL ImM/lOOmL的烟 酰胺。在本发明前述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物中，含有等摩尔浓度的L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸作为合成谷胱甘肽的原料，其中，L-谷氨酸、L-半胱 氨酸和甘氨酸的浓度均为20 50mM/100mL。在本发明前述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物中，含有浓度为 10 25mM/100mL的硫酸镁作为活性维持辅助剂。在本发明前述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物中，含有从D-葡 萄糖、D-果糖和D-麦芽糖中选出的至少一种物质作为碳源。在本发明前述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物中，上述碳源的浓 度为 5 15mM/100mL。在本发明前述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物中，肌醇含量为 0. 05mM/100mL 0. 5mM/100mL，烟酰胺含量为 0. 05mM/100mL 0. 5mM/100mL。在本发明前述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物中，谷胱甘肽生产 性酵母为酵母属酵母。在本发明前述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物中，谷胱甘肽生 产性酵母为从假丝酵母(Candida)属酵母、德巴利酵母(Debaryomyces)属酵母、红酵母 (Rhodotorula)属酵母、球拟酵母菌(Torulopsis)属酵母、汉逊酵母(Hansenula)属酵 母、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属酵母、毕赤酵母(Pichia)属酵母、克鲁维酵母 (Kluyveromyces)属酵母和法夫酵母(Wiaffia)属酵母组成的菌群中选取的1种或2种以 上的酵母。利用本发明提供的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物，加快了谷胱甘 肽生产性酵母的生长繁殖速度，进一步延长了谷胱甘肽合成活性半衰期，增加了菌体内谷 胱甘肽积蓄量。
具体实施例方式下面通过实施例来具体说明本发明。首先，使用"Saccharomyces cystinovolens KNC-1，，、“酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae IF00021) ”、“卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensisY1068)，，这 3 种菌种。用麦芽糖培养基对它们进行初期培养后，为它们添加3种培养基，分别计算测量 其生长繁殖速度、菌体浓度、菌体内谷胱甘肽浓度、菌体外谷胱甘肽浓度、谷胱甘肽稳定浓 度到达时间、基质中谷胱甘肽稳定收率、谷胱甘肽稳定浓度保持时间、谷胱甘肽合成活性半 衰期，并作比较。培养基中的L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸是由酵母菌生成的谷胱甘肽 的原料，添加D-葡萄糖作为菌体的碳源，还添加日本特开昭53-94089记述的硫酸镁作为菌 生长繁殖的辅助剂。此外，作为原料添加的L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸必须为等摩尔 浓度，这样得以生成谷胱甘肽。当然，为增加产量还可能提高各原料的浓度，但生产上最优 选的浓度是实施例中列举的比例。另外，硫酸镁对该原料的相对浓度优选1/3 1/2，选择 1/3时，判断葡萄糖选定为10/3会产生最佳效果，该结果如实施例1所示。此外，为对它们进行对比，先固定谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、硫酸镁、葡萄糖的浓 度，然后改变肌醇、烟酰胺的添加量，其对比结果如实施例3 5所示。关于谷胱甘肽含量的测定，使用DTNB (BP 5,5- 二硫代双硝基苯甲酸))，通过 比色法(chromogenic technique)测定，待测定稳定浓度后算出各数值。关于合成活性，需自初期值起定时测定谷胱甘肽浓度，标注半衰减时间。谷胱甘肽在初期培养阶段，因D-麦芽糖、糖蜜的作用而繁殖到2倍容量，在下一阶 段添加硫酸镁后，活性提高、繁殖到4倍容量。在最终阶段，添加适量L-谷氨酸、L-半胱氨 酸、甘氨酸这三种原料的同时，添加适量D-葡萄糖、肌醇、烟酰胺，谷胱甘肽可繁殖到6倍容 量。酵母菌发酵产生的谷胱甘肽被高氯酸钠、高氯酸钾高氯酸镁或高氯酸钙这些添加剂氯 化后，使用高速离心机提取澄清部分，向罐内投进ODS树脂，进行搅拌，让其产生吸附作用， 然后用淡盐酸萃取，温风干燥后即得到所需谷胱甘肽。实施例13种培养基的组成如下。(数值单位mM/100ml)表权利要求
1.用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物，其特征在于，含有0.OlmM/lOOmL ImM/IOOmL 的肌醇及 0. OlmM/IOOmL ImM/lOOmL 的烟酰胺。
2.根据权利要求1所述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物，其特征在 于，含有等摩尔浓度的L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸作为合成谷胱甘肽的原料，其中， L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的浓度均为20 50mM/100mL。
3.根据权利要求1所述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物，其特征在 于，含有浓度为10 25m M/100mL的硫酸镁作为活性维持辅助剂。
4.根据权利要求1所述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物，其特征在 于，含有从D-葡萄糖、D-果糖和D-麦芽糖中选出的至少一种物质作为碳源。
5.根据权利要求4所述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物，其特征在 于，上述碳源的浓度为5 15mM/100mL。
6.根据权利要求1所述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物，其特 征在于，肌醇含量为0. 05mM/100mL 0. 5mM/IOOmL,烟酰胺含量为0. 05mM/100mL 0. 5mM/100mL。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合 物，其特征在于，谷胱甘肽生产性酵母为酵母属酵母。
8.根据权利要求1 6中任一项所述的用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合 物，其特征在于，谷胱甘肽生产性酵母为从假丝酵母属酵母、德巴利酵母属酵母、红酵母属 酵母、球拟酵母菌属酵母、汉逊酵母属酵母、裂殖酵母属酵母、毕赤酵母属酵母、克鲁维酵母 属酵母和法夫酵母属酵母组成的菌群中选取的1种或2种以上的酵母。
全文摘要
本发明涉及一种用于培养谷胱甘肽生产性酵母的培养基组合物，其含有0.01mM/100mL～1mM/100mL的肌醇及0.01mM/100mL～1mM/100mL的烟酰胺，在加快谷胱甘肽生产性酵母的生长繁殖速度的同时，增加菌体内谷胱甘肽积蓄量。
文档编号C12R1/86GK102134556SQ201010104159
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月27日 优先权日2010年1月27日
发明者川崎究 申请人:重庆凯林制药有限公司