D-氨甲酰水解酶突变体的制作方法

专利名称：D-氨甲酰水解酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明属于酶学领域。具体地说，本发明涉及新的D-氨甲酰水解酶突变体。
背景技术：
D-对羟基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine，D-HPG)做为侧链，是羟氨苄青 霉素(即阿莫西林，Amoxycillin)、头孢羟氨苄(Cefadroxil)等多种半合成广谱β -内酰 胺类抗生素、杀虫剂和甜味剂中间体的重要中间体，具有广泛的应用价值和重要的商业价值。D-HPG可以通过化学水解、菌体转化及固定化酶等方法制备。化学水解法中涉及 到有毒物质如HNO2的使用及消旋体手性拆分等工艺，因此反应总收率不高且能耗较大。菌 体转化法呈现出转化反应进程缓慢与中间体氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(N-carbamoyl-D-hydroxyphenylglycine,NC-D-HPG)积累现象或者该法涉及到双菌分别发酵并两次转化，因 而制备工艺复杂，成本也相对较高。D-HPG也可由D-海因酶(D-hydantoinase，DHase)和 D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase，DCase)水解混旋型对羟基苯海因(D，L-HPH)而得到， 酶法转化反应过程中化学合成的D，L-5-取代乙内酰脲在D-Hase催化下得到氨甲酰_D_对 羟基苯甘氨酸，后者在DCase的催化下生成光学纯D-HPG，该方法得率及产品光学纯度高， 且具有环境友好及成本低廉的优势。而固定化酶法又因为其稳定性突出，可重复回收利用 等优点，受到越来越多的重视(Olivieri, Fascetti et al. 1979 ；Olivieri, Fascetti et al. 1981)。而在固定化双酶法工艺中DCase的稳定性和可溶性不佳，成为固定化酶法制备 D-HPG的制约因素。对此，研究人员为改善D-氨甲酰水解酶的稳定性做了大量的研究工 作。Giuliano 等将来源于 Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 的 D-氨甲酰水解 酶的243，250，279位的半胱氨酸残基定点突变，发现243和279位突变为丙氨酸后，酶稳 定性可以提高6倍(Giuliano et al. 1995)。Kaneka公司以羟胺和亚硝酸钠对来源于 Agrobacterium sp. KNK712的D-氨甲酰水解酶进行随机突变，获得热稳定性提高约5°C的 突变体酶，测序结果为57位的组氨酸突变为酪氨酸；203位的脯氨酸突变为亮氨酸或丝氨 酸(Ikenaka et al. 1998a)。Kaneka公司还发现236位的缬氨酸突变为丙氨酸后，热稳定 性可提高10°C (Ikenaka et al. 1998b)。进一步对上述3个位点进行定点突变发现57位 的组氨酸变为亮氨酸；203位的脯氨酸突变为天冬酰胺，谷氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，组氨酸 或苏氨酸；236位的缬氨酸突变为苏氨酸或丝氨酸后，酶的热稳定性均可提高。三突变酶 455M(H57Y、P203E、V236A)的热稳定性比野生型酶提高了 19°C (Ikenaka et al. 1999)。本实验室从国内D-HPG工业转化菌株皮氏罗雷斯顿菌CGMCC1596(简称皮氏菌) 中克隆并在E. coli中表达了 DCase和DHase，通过易错PCR及DNA改组的方法获得了可 溶性表达提高数倍的突变体 DCase-M3(A18TA30N/K34E) (Jiang，S，Li 等，“Directed evolution and structural analysis of N-carbamoyl-D-amino acidamidohydroIase provide insights into recombinant protein solubility in Escherichiacoli.“，Biochem J 402 :似9_37，2007)，这为固定化酶工艺制备D-HPG的工业化的实现进一步提供 了帮助。在DCase可溶性表达得到提高的基础上，通过易错PCR，辅以高通量筛选体系获得 的突变体F7 0il2L)的热稳定性提高了 7°C左右，而比活力、酶动力学及高可溶性表达特点 保持不变，使得固定化酶制备D-HPG具有更好的产业化前景(Hong YU等，"Improving the thermostability of N-carbamyl-D-amino acidamidohydrolase by error-prone PCR", App1. Microbiol. Biotechnol. D0I10. 1007/s00253-008-1748-z, 2009)。

发明内容
本发明通过随机突变、DNA改组、半理性设计等酶分子工程方法对皮氏罗雷斯顿菌 CGMCC1596来源的DCase进行改造，获得了稳定性进一步提高的突变体，为固定化酶法制备 D-HPG的产业化提供更有利支持。具体地说，本发明提供了一种D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，其中的突变 包括D-氨甲酰水解酶第262位和第248位上的氨基酸取代，所述突变体具有D-氨甲酰水 解酶活性，其热稳定性高于取代前。本文中，若非另外说明，所有的突变的定位都是基于与 皮氏罗雷斯顿菌CGMCC 1596来源的DCase-M3序列(SEQ ID NO :26)的最大同源性比对 (alignment)，DCase-M3的核酸编码序列如SEQ ID N0:25所示。实施方式之一中，本发明 的D-氨甲酰水解酶突变体具有含突变的SEQ ID NO J6所示氨基酸序列，所述突变包括第 262位和第248位上的突变。突变方式之一是氨基酸取代，例如，第262位氨基酸可以是丙 氨酸或其保守性取代，第248位可以是谷氨酰胺或其保守性取代。本发明的突变体还可以含有其它突变。例如，实施方式之一，本发明的突变体还含 有第沈3位、第23位和第12位上的氨基酸取代，例如第沈3位可以是丝氨酸或其保守性取 代、第23位可以是亮氨酸或其保守性取代，第12位可以是亮氨酸或其保守性取代。更进一步，本发明的突变体还可以含有以下位点的突变第31位、第207位、第 242位、第271位、第273位，或它们的组合。例如，所述组合可以是第31位和第207位， 第271位和第273位，第242位和第207位，第31位和第242位，第242位和第273位。所 述突变方式之一是氨基酸取代，例如，第31位可以是亮氨酸或其保守性取代，第207位可以 是谷氨酸或其保守性取代，第242位可以是甘氨酸或其保守性取代，第271位可以是异亮氨 酸、亮氨酸或它们的保守性取代，第273位可以是赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或它们的保守性 取代。本发明所述D-氨甲酰水解酶及其突变体不限于特定的物种来源，可以源自例如 罗雷其J 顿菌(Ralstonia sp.)、根瘤菌(Ensifer sp. )、土壤杆菌(Agrobacterium sp.)、 假单胞菌O^eudomonas sp.)等。例如，本发明的突变体可以是源于皮氏罗雷斯顿菌 CGMCC1596、土壤杆菌 KNK712、放射土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) NRRLBl 1291 或 土壤杆菌IP 1-671的D-氨甲酰水解酶的突变体。实施方式之一中，所述突变体源自皮氏罗 雷斯顿菌CGMCC1596 D-氨甲酰水解酶的突变体M3 (DCase_M3)，DCase_M3与来源于皮氏罗 雷斯顿菌 CGMCC1596、土壤杆菌 KNK712、放射土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) NRRL B11291或土壤杆菌IP 1-671的D-氨甲酰水解酶相比，同源性分别高达约99. 0%,99. 0%, 96. 3%或 92. 8%。作为举例，本发明的突变体可具有选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或M所示的氨基酸序列。此外，本发明还提供一种核酸分子，其编码本发明的D-氨甲酰水解酶突变体，或 与所述编码序列互补。例如，本发明的核酸分子或其互补序列的核苷酸序列可以选自SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 或 23。本发明还提供一种载体，其含有本发明的核酸分子。本发明还提供一种宿主细胞， 其含有本发明核酸分子。实施方式之一中，所述宿主细胞是用本发明载体转化的。本发明还提供一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括用D-海因酶和本发明的 D-氨甲酰水解酶突变体水解混旋型对羟基苯海因。


图1 不同温度处理对初始酶M3和突变酶稳定性影响。在不同温度下处理15min 残余酶活分析，残余酶活以最适反应温度下酶活的百分比计算表示。图2.不同温度处理对出发酶E6和突变酶稳定性影响。在不同温度下处理15min 残余酶活分析，残余酶活以最适反应温度下酶活的百分比计算表示。图3.不同温度处理对出发酶B5和突变酶稳定性影响。在不同温度下处理15min 残余酶活分析，残余酶活以最适反应温度下酶活的百分比计算表示。图4.不同温度处理对出发酶B5和突变酶稳定性影响。在不同温度下处理15min 残余酶活分析，残余酶活以最适反应温度下酶活的百分比计算表示。图5.不同温度处理对出发酶B5、C18和突变酶稳定性影响。在不同温度下处理 15min残余酶活分析，残余酶活以最适反应温度下酶活的百分比计算表示。
具体实施例方式本发明通过DNA改组方法(DNA shuffling)对随机突变后筛得的突变位点随机组 合，通过高效筛选方法筛得热稳定性(以表观半残余酶活时处理温度Tm表征)比突变前的 初始酶提高至少8°C的一组合突变。所述组合突变发生在第262位和第248位氨基酸残基。 这些突变体的比酶活和可溶性与DCase-M3相比基本相同。由此可知，至少该两位点上的联 合突变可显著提高DCase酶的稳定性，尤其是热稳定性。本领域技术人员明白，就氨基酸序列或核苷酸序列而言，所述突变包括氨基酸或 碱基的插入、取代、缺失或它们的组合。本发明实施方式之一中，DCase突变体氨基酸序列中 的突变为氨基酸取代，即某一位点的氨基酸被改变为与野生型或模板中相应位点上原有氨 基酸不同的氨基酸(本文中称为“取代氨基酸”)。本领域技术人员通过简单的试验和筛选， 很容易确定合适的取代氨基酸。作为实施方式之一，取代氨基酸可选自一系列互为保守性 取代的氨基酸。所为保守性取代即氨基酸之间的相互置换不至于影响所得蛋白质的活性。 例如，就本发明而言，当突变位点上的某一取代氨基酸被保守性取代时，所得新的保守性取 代突变体保留原突变体的酶活性、可溶性和热稳定性等特征。本领域技术人员借助现有技 术手段，通过简单的试验和筛选，很容易确定这样的保守性取代。例如，保守性氨基酸取代 可以考虑符合以下分组的类似氨基酸一.中性氨基酸脂肪族氨基酸甘氨酸(G)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)；
芳香族氨基酸苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；含羟基氨基酸丝氨酸( ，苏氨酸(T)；含硫氨基酸半胱氨酸(C)，胱氨酸，甲硫氨酸(M)；亚氨基酸脯氨酸(P)，羟脯氨酸；二 .酸性氨基酸天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)，及其酰胺(中性)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；三.碱性氨基酸精氨酸( ，赖氨酸(K)，组氨酸(H)。进一步分析各来源DCase上与稳定性相关的位点，并通过DNA改组方法对这些位 点再组合、再筛选，本发明获得了 Tm比初始酶提高更多，例如提高10°C以上的组合突变，即 第沈2、对8、沈3、23和12位063Λ62Λ48/23/υ)氨基酸残基联合发生突变。作为实施方 式之一，所述突变为氨基酸取代。这些突变体的比酶活和可溶性与DCase-M3相比基本相 同。由此可知，某些位点例如上述位点的组合突变对于提高DCase酶稳定性尤其热稳定性 而言可产生叠加、甚至协同效应。然后，本发明通过醇结构共义性方法(structure guided consensus concept) M 不同来源DCase氨基酸序列进行比对和DCase结构特点分析，通过半理性设计，获得了 Tm 进一步提高的组合突变，并发现以下位点与DCase的稳定性尤其热稳定性显著相关第31 位，第207位，第242位，第271位和第273位。并且，本发明还进一步发现，这些位点的组合 能够进一步提高DCase酶的稳定性，尤其是热稳定性，这样的组合包括第31位和第207位 (31/207)，第 271 位和第 273 位(271/273)，第 242 位和第 207 位(242/207)，第 31 位和第 242 位(31/ 或第242位和第273位042/273)。本发明发现，点突变的叠加亦即新的联合 突变对于提高DCase酶稳定性尤其热稳定性而言可产生叠加、甚至协同效应。所述新的联 合突变包括:263/262/248/23/12/31,263/262/248/23/12/207,263/262/248/23/12/242, 263/262/248/23/12/271,263/262/248/23/12/273,263/262/248/23/12/31/207, 263/262/248/23/12/271/273,263/262/248/23/12/242/207,263/262/248/23/12/31/242 或^3Λ62/Μ8/23/12Λ42/273。这些组合突变能进一步提高酶的稳定性，例如将Tm提高 约11_14°C或更多，甚至提高约17°C或更多。作为实施方式之一，所述突变为氨基酸取代。 这些突变体的比酶活和可溶性与DCase-M3相比基本相同。基于本申请公开的序列信息，本发明的酶突变体可以用化学合成或基因重组等方 法来生产，这些都是本领域技术人员所熟悉的。例如，在采用重组法进行生产的实施方式 中，可将本发明突变体的编码核酸克隆到合适的载体中，用所述载体转染或转化合适的宿 主细胞，在适宜的条件下培养宿主细胞并诱导表达，然后用合适的已知方法由宿主细胞裂 解物或培养液分离、纯化目标产物。为此，本申请内容之一是提供编码本发明突变体的核酸分子。所述核酸分子可以 是单链或双链DNA或RNA。本发明还包括编码链的互补链。此外，就编码同一突变体的核酸 分子而言，可以包括多种基于简并密码子的变体。这些变体可能提供例如优化表达等有利 特性。本发明的另一项内容是包含本发明核酸分子的载体。所述载体可以是质粒、粘粒、 噬菌体等基因工程常用载体。本发明实施方式之一中，所述载体是表达载体。载体可以以游 离形式稳定存在于宿主中并自主表达，也可以整合到宿主的基因组内稳定遗传并表达。本领域技术人员完全能够根据转染/转化目的(例如是扩增、重组还是表达)自主选择合适 的宿主和相宜的载体。本发明的另一项内容是包含本发明核酸分子的宿主细胞，包括原核细胞或真核细 胞，例如细菌(如大肠杆菌)或真菌(如酵母细胞)等。根据转染/转化目的(例如是扩 增、重组还是表达)、回收、纯化等多种因素，选择合适的宿主细胞属于本领域技术人员的常 规技能。本发明的酶突变体可以用各种已知的蛋白质分离和纯化方法来回收，例如但不 限于渗透压裂解、超声裂解、离心、盐析、和各种层析技术，例如分子筛层析、高效液相层析 (HPLC)、亲和力层析、离子交换层析等等。本发明D-氨甲酰水解酶突变体提供了热稳定性，比活力、酶动力学及高可溶性表 达特点保持不变，与其适合用于通过固定化酶法制备D-HPG，从而提供显著的技术进步。以下，通过实施例进一步说明本发明的各项特点和优点。需要说明是，以下实施例 仅以阐释本发明为目的，不应将其理解为对本发明范围的任何限定。实施例一 DCase-E6突变体的获得皮氏罗雷斯顿菌CGMCC1596来源突变酶DCase-M3(A18TA30N/K34E)的可溶性 表达水平显著提高，在其基础上又得到7个与稳定性相关的突变位点及相应的突变体 F7(Q12L)、C8(E22G/T262A)、F8(A36V)、B3(A36E)、C6 (A164T)、A8 (T263S)、E2 (H248Q)(Hong YU 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. D0I10. 1007/s00253-008-1748_z，2009 和中国专利申 请 200810035067. 3)。本发明以它们为模板进行 DNA 改组(DNA shuffling) (Crameri et al.，1998 ；Ness et al.，2002 ；Stemmer，1994)，通过热稳定性筛选获得高稳定性突变体。具体地说，合成以下引物对pet_DC_M3_U GCTTTCAGAGTTCCGCGATCA(SEQ ID NO :27)pet_DC_M3_D TATGACACGTCAGATGATACTTGC (SEQ ID NO :28)用上述引物对扩增DCase突变体F7、C8、F8、B3、C6、A8、E2的基因。胶回收 后用DNaseI酶切，跑2 %琼脂糖凝胶，回收50-100bp的DNA片段。先无引物PCR扩增 (94 V，30S ；55 °C, 30S ；72 °C, Imin ；30个循环)，再用上述引物PCR扩增目的片段(94°C， 30S ;55°C，30S72°C，Imin ;15个循环)。胶回收目的基因大小(915bp)的片段。通过 MegaprimerPCR(94°C, 30S ；55°C，30S ；68°C,7min ； 18 个循环)克隆至表达载体 pET28b (+) (购自N0VAGEN)。电转化到E. coli BL21 (E3)(购自N0VAGEN)中，涂平板，建立突变库。选取突变体库中的转化子接种到含200μ 1 LB培养基的96孔深孔培养板中，含 100 μ g/ml卡那霉素，37°C培养过夜，加入IPTG，使IPTG的终浓度为0. 8mM，继续37°C培养 4小时后将培养物转移到96孔细胞板取出。将96孔细胞板置于-70°C冷冻lh，55°C热激 5min, 68°C热处理15min，然后转移到96孔板显色。取4 μ 1经过以上高温失活处理所得菌液 或粗酶液加入到96孔显色反应液中(5g/L的NC-D-HPG，ImM乙二胺四乙酸(EDTA)，0. 01% 酚红，PH 5.8-6.0。)并置于37°C观察颜色变化，将颜色变化的突变子从对应的母板上检 出。挑取突变体单菌落接种到4毫升试管LB培养基中，37°C培养至0D600 = 0. 6的时 候，进行IPTG诱导(终浓度0. 8mM)。继续培养4小时后，SOOOrpm离心，收集菌体，菌体重 悬于Iml的0. 1M，ρΗ8· 0磷酸钠缓冲液中，超声波破碎(25X6秒)12000rpm离心30分钟。取上清做为稳定性分析的粗酶液。酶热稳定性的评价将以上所得粗酶液在不同的温度(50-82°C )保温15分钟后在50°C测定其剩余酶 活。剩余酶活与初始酶活的比率为评价酶热稳定性的依据。酶活测定 1 %底物NC-D-HPG溶解到pH8. 00. IM磷酸钠缓冲液。50 μ 1酶液与400 μ 1 底物溶液混勻，50°C，120rpm转速条件下反应20分钟，加入等体积的10 %盐酸终 止酶促反应。反应液稀释10倍，12000rpm离心30分钟，取上清进行高效液相色 谱(HPLC，Agilent Technologies 1100)分析，测定反应液中产物D-HPG的含量。IU 酶活定义为每分钟产生lymol D-HPG所需的酶量。其中，HPLC测定条件为使用 Z0RBAXEclipseXDB-C8(4. 6X150mm)柱子。以水甲醇1. % 乙酸=85 12 3 为流 动相，流速为1. Oml/min，监测器波长设为230nm。由此筛得一 DCase突变体，其Tm(表观半残余酶活时处理温度)比初始酶 (DCase-M3)提高 8°C，比 DNA Shuff ling 模版中稳定性较好的 F7 0)12L) RkS (T263S)的 Tm 分别提高2°C和4°C (见图1)。与初始酶相比，该突变体的比酶活及可溶性基本相同。经测 序，该突变体的氨基酸序列及其编码序列分别如SEQ ID NO 2和SEQ IDNO 1所示，将其标 识为 DCase-E6 (T262A/H248Q)。实施例二 DCaSe-B5突变体的获得以实施例一所得DCase-E6的编码序列(SEQ ID NO 1)为模板通过定点诱变制造 以下突变Q23L、V40A、H58Y、G75S、C243A、C279A、A302C、A222C、M220L、M184L、M239L、M244L、 M5L、M73L、N173A、P295C、F304C、Q12L、E22G、A36V、A164T 或 T263S。然后，以所得各突变体的编码序列为模板，按照实施例一所述方法进行DNA改组 和筛选。所不同的是，在转化子诱导表达后的高温失活处理为-70°C冷冻lh、55°C热激 5min、70°C热处理15min。由此，筛得另一 DCase突变体，比初始酶(DCase_M3)提高10°C， 比出发酶DCase-E6提高2°C (见图2)。与初始酶相比，该突变体的比酶活及可溶性基本相 同。经测序，该突变体的氨基酸序列及其编码序列分别如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :3所 示，将其标识为 DCase-B5(T263S/T262A/H248Q/Q23L/Q12L)。实施例三基于酶结构共义性方法(structure guided consensus concept)的 DCase-突变体半理性设计以罗雷斯顿菌CGMCC1596的DCase氨基酸序列为调查模版通过PDB数据库进行蛋 白序列比对(P-Blast)，各种来源的DCase序列同源性为34-99%。将氨基酸同源排比结 果倒入数据库(http://coot. embl. de/Alignment/consensus. html)进行氨基酸共义性分 析。设定共义数值70%，并根据调查结果及共义排比表确定DCase上各个位置氨基酸的共 义性，确定氨基酸共义位点。以实施例二所得突变体DCase-B5为模板，在相应位点制造定 点突变或半饱和突变(即采用兼并引物引入共义类氨基酸中任何一种构建成某位点的一 小突变库)，构建突变库。表1.定点突变位点及引物
权利要求
1.一种D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所含突变包括D-氨甲酰水解酶的第262 位和第248位上的氨基酸被取代，且所述突变体具有D-氨甲酰水解酶活性，其热稳定性高 于取代前。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，第262位氨基酸是丙氨酸或其保守性取 代，第248位是谷氨酰胺或其保守性取代。
3.如权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，还含有第263位、第23位和第12位 上的氨基酸取代。
4.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，第263位是丝氨酸或其保守性取代、第23 位是亮氨酸或其保守性取代，第12位是亮氨酸或其保守性取代。
5.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，还含有以下位点的取代第31位、第207 位、第242位、第271位、第273位，或它们的组合。
6.如权利要求5所述的突变体，其特征在于，所述组合是第31位和第207位，第271 位和第273位，第242位和第207位，第31位和第242位，第242位和第273位。
7.如权利要求5或6所述的突变体，其特征在于，第31位是亮氨酸或其保守性取代第 207位是谷氨酸或其保守性取代，第242位是甘氨酸或其保守性取代，第271位是异亮氨酸、 亮氨酸或它们的保守性取代，第273位是赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或它们的保守性取代。
8.如权利要求1-7中任一项所述的突变体，其特征在于，它是源于皮氏罗雷斯顿菌 CGMCC1596、土壤杆菌KNK712、放射土壤杆菌NRRL Bl 1291或土壤杆菌IPI-671的D-氨甲酰 水解酶的突变体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的突变体，其氨基酸序列如SEQID N0:2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22 或 24 所示。
10.一种核酸分子，其编码权利要求1-9中任一项所述的D-氨甲酰水解酶突变体，或与 编码权利要求1-9中任一项所述的D-氨甲酰水解酶突变体的核酸分子互补。
11.如权利要求10所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、13、 15、17、19、21 或 23 所示，或者是 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 或 23 所示序 列的互补序列。
12.—种载体，含有权利要求10或11所述的核酸分子。
13.一种宿主细胞，含有权利要求10或11所述的核酸分子。
14.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括用D-海因酶和权利要求1-9中任一项所 述的D-氨甲酰水解酶突变体水解混旋型对羟基苯海因。
全文摘要
本发明涉及高稳定性尤其是热稳定性提高的D-氨甲酰水解酶突变体及其应用。
文档编号C12N1/21GK102146365SQ20101010680
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月8日 优先权日2010年2月8日
发明者姜卫红, 张大龙, 杨晟, 杨蕴刘, 范文超, 陶荣盛 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心